JP5188111B2 - アニリン誘導体、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量用試薬及び定量用キット - Google Patents

Description

本発明は、アニリン誘導体又はその塩、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量用試薬及び定量用キットに関する。

疾病を診断するため、例えば血液、血漿、尿等の生体試料中に含まれる、種々の生体成分、例えばグルコース、総コレステロール、尿酸等の生体成分が定量されている。これら生体成分の定量方法としては、例えばオキシダーゼを用いて、試料中の生体成分を直接又は間接的に過酸化水素に変換し、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、生成した過酸化水素を酸化発色剤と反応させて色素を生成させ、生成した色素を光学的に測定することにより試料中に含まれる生体成分を定量する酵素学的定量方法があげられる。

オキシダーゼにより生成した過酸化水素を過酸化活性物質の存在下に色素に変換する際に使用される酸化発色剤としては、例えばロイコ型発色試薬やカップリング型発色試薬等が知られている。ロイコ型発色試薬はそれ自体が酸化されて色素を生成する発色試薬である。カップリング型発色試薬は、２成分が酸化縮合反応して色素を生成する発色試薬であり、２つの成分を、別々の試薬容器中に含有させて保存できることから、定量用キットに汎用されている。カップリング型発色試薬における２つの成分は、４−アミノアンチピリン等のカップラーと、フェノール誘導体又はアニリン誘導体である。

生成した色素の水溶液中での安定性が高い誘導体としては、Ｎ−スルホアルキルアニリン誘導体が報告されている（特許文献１参照）。また、高感度で長波長側の吸収極大を有する誘導体としては、ｐ−フルオロアニリン誘導体が報告されている（特許文献２参照）。
しかしながら、酸化発色剤を用いた色素の形成反応は、試料中に含まれるビリルビンなどの還元性物質の影響を受けやすいという問題点が存在する。還元性物質の影響を回避する方法としては、例えば、過剰の４−アミノアンチピリンを添加する方法、フェロシアン化カリウムを添加する方法等が知られている。

更に、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン ナトリウム（略名：ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＤＡＰＳ）等の３，５−ジアルコキシアニリン誘導体がビリルビンの影響を受けにくいことが報告されている（特許文献３参照）。

しかしながら、これらのアニリン誘導体においては、酵素反応停止剤又は防腐剤等の目的で使用されるアジ化ナトリウムにより着色し、正確な測定ができない場合がある。アニリン誘導体であるＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリンは、この影響を受けにくいことが報告されている（特許文献４参照）。
特公昭５７-２７１０６号公報 特開平５−２６２７１６号公報 特開平１０−１６５１９８号公報 特開２０００−３１９２３８号公報

本発明の目的は、試料中のビリルビンによる影響、及び、試薬液等に共存するアジ化ナトリウム等のアジ化物による影響を受けにくい酸化発色剤等として有用なアニリン誘導体又はその塩、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量用試薬及び定量用キットを提供することにある。

本発明は下記［１］〜［１５］に関する。
［１］ 下記の一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^１は水素原子又は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ^２はアミド置換アルキル基を表し、Ｒ^５は水素原子又はフッ素原子を表し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル基又は置換若しくは非置換のアルコキシル基を表し、ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７からなる群より選ばれる少なくとも１つの基は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、残りの基のうち少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルコキシル基を表す）で表されるアニリン誘導体又はその塩。

[２] Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルコキシル基であり、Ｒ^６及びＲ^７の少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルキル基である、[１]に記載のアニリン誘導体又はその塩。
[３] Ｒ^３が、置換若しくは非置換のアルコキシル基であり、Ｒ^６が置換若しくは非置換のアルキル基である、[１]又は[２]に記載のアニリン誘導体又はその塩。

[４] アミド置換アルキル基が、２−アミドエチル基である、[１]〜[３]のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩。
[５] ２−アミドエチル基が、２−（サクシニルアミノ）エチル基である、[４]に記載のアニリン誘導体又はその塩。
[６] Ｒ^５が、水素原子である[１]〜[５]のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩。

[７] 試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換し、又は、試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させ、過酸化活性物質の存在下、該過酸化水素を、［１］〜［６］のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩、及び、カップラーと反応させ、生成する色素を測定することを特徴とする試料中の定量すべき成分の定量方法。

[８] カップラーが、４−アミノアンチピリンである、[７]記載の定量方法。
[９] 過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである、[７]又は[８]記載の定量方法。
[１０] ［１］〜［６］のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩、カップラー、過酸化活性物質、及び、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬を含有することを特徴とする試料中の定量すべき成分の定量用試薬。

[１１] カップラーが、４−アミノアンチピリンである[１０]記載の定量用試薬。
[１２]過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである[１０]又は[１１]記載の定量用試薬。
[１３] 第１試薬及び第２試薬を含有する、試料中の定量すべき成分の定量用キットであって、［１］〜［６］のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩が第１試薬に含有され、カップラーが第２試薬に含有され、過酸化活性物質、及び、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬が、それぞれ第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されることを特徴とする定量用キット。

[１４] カップラーが、４−アミノアンチピリンである[１３]記載の定量用キット。
[１５] 過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである[１３]又は[１４]記載の定量用キット。

本発明により、試料中のビリルビンによる影響、及び、アジ化ナトリウム等のアジ化物を含有する試薬による影響を受けにくい酸化発色剤等として有用なアニリン誘導体又はその塩、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量試薬及び定量用キットが提供される。

本発明のアニリン誘導体又はその塩は、下記の一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ^１は水素原子又は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ^２はアミド置換アルキル基を表し、Ｒ^５は水素原子又はフッ素原子を表し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル基又は置換若しくは非置換のアルコキシル基を表し、ここで、Ｒ ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７からなる群より選ばれる少なくとも１つの基は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、残りの基のうち少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルコキシル基を表す）で表されるアニリン誘導体又はその塩である。以下、一般式（Ｉ）で表されるアニリン誘導体又はその塩を、化合物（Ｉ）と称する。

置換若しくは非置換のアルキル基及び置換若しくは非置換のアルコキシル基におけるアルキル基としては、例えば直鎖又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられ、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、３−メチル−１−ブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチル−１−プロピル基、１−ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、４−メチル−１−ペンチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、１，１−ジメチル−１−ブチル基等があげられる。

置換アルキル基及び置換アルコキシル基における置換基としては、同一又は異なって、例えば置換数１〜３の、水酸基、アルコキシル基、アシルオキシ基、置換若しくは非置換のアミノ基、アミド基、アシル基、エステル基、カルボキシル基、シアノ基、シリル基等があげられる。置換アミノ基における置換基としては、例えば前述のアルキル基等があげられ、置換アミノ基がジアルキル置換アミノ基である場合、該２つのアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。

アミド置換アルキル基としては、例えば２−アミドエチル基、３−アミドプロピル基、２−アミドプロピル基、４−アミドブチル基、２−アミドブチル基、３−アミドブチル基等があげられるが、２−アミドエチル基が好ましい。２−アミドエチル基としては、例えば２−アセトアミドエチル基、２−マロニルアミノエチル基、２−サクシニルアミノエチル基等があげられるが、水溶性官能基を有する２−マロニルアミノエチル基、２−サクシニルアミノエチル基等が好ましく、２−サクシニルアミノエチル基等がより好ましい。

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７からなる群より選ばれる少なくとも１つの基は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、残りの基のうち１つは置換若しくは非置換のアルコキシル基を表す。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７の組み合わせとしては、例えば第１表に示す組み合わせがあげられる。

上記の組み合わせの中でも、Ｒ^３及びＲ^４（Ｒ^６及びＲ^７）の少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルコキシル基であり、かつ、Ｒ^６及びＲ^７（Ｒ^３及びＲ^４）の少なくとも１つは置換若しくは非置換のアルキル基である組み合わせ（第１表で、番号１及び４以外の組み合わせ）が好ましい。また、Ｒ^３（Ｒ^７）が、置換若しくは非置換のアルコキシル基であり、かつ、Ｒ^６（Ｒ^４）が置換若しくは非置換のアルキル基である組み合わせ（第１表で、番号２、７、１０、１４、１７、２０、２１、２３及び２４の組み合わせ）がより好ましい。さらに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６及びＲ^７が、それぞれ、置換若しくは非置換のアルコキシル基、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル基、水素原子である組み合わせ（第１表で、番号２の組み合わせ）が特に好ましい。

塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマール酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩、例えばトリエチルアミン塩等の有機アミン付加塩、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩等があげられる。
本発明の化合物（Ｉ）の具体例としては、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等があげられる。

本発明の化合物（Ｉ）は、実施例１、実施例２に記載の方法又は当該実施例に準じた方法により、製造することができる。すなわち、置換若しくは非置換のアルキル基及び置換若しくは非置換のアルコキシル基がベンゼン環上に置換された４位無置換若しくはフッ素置換アニリン（例えば、市販品）、又は、置換若しくは非置換のアルキル基及び置換若しくは非置換のアルコキシル基がベンゼン環上に置換された４位無置換若しくはフッ素置換Ｎ−アルキルアニリンを原料とし、アミド基含有アルキルハライドとの反応により、アニリン窒素原子上にアミド基含有アルキル基を１つ導入し、Ｎ−（アミド置換アルキル）アニリン化合物、又は、Ｎ−アルキル−Ｎ−（アミド置換アルキル）アニリン化合物を合成することができる。置換若しくは非置換のアルキル基及び置換若しくは非置換のアルコキシル基がベンゼン環上に置換された４位無置換若しくはフッ素置換Ｎ−アルキルアニリンは、置換若しくは非置換のアルキル基及び置換若しくは非置換のアルコキシル基がベンゼン環上に置換された４位無置換若しくはフッ素置換アニリンとアルキルハライドとの反応により、または、当該アニリンを(1)アニリン窒素のアシル化、(2)Ｎ−アシルアニリン窒素のアルキル化、(3)脱アシル化により得ることができる。

アニリン窒素原子上へのアミド基含有アルキル基導入反応は、例えば、無溶媒又は有機溶媒中で行うことができる。有機溶媒は、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン等であるが、これに限定されない。反応温度は、例えば室温〜１５０℃であり、反応時間は、例えば１０分〜２０時間であるがこれに限定されない。

アニリン窒素のアシル化は、Ｎ，Ｎ−無置換アニリン化合物とアシルハライド若しくは酸無水物とを、無溶媒又は有機溶媒中、塩基存在下で反応させることにより行うことができる。有機溶媒は、例えばジクロロメタン、クロロホルム等であるが、これに限定されない。アシルハライドは、例えばアセチルハライド、トリフルオロアセチルハライド等であるが、これに限定されない。酸無水物は、例えば無水酢酸、トリフルオロ酢酸無水物等であるが、これに限定されない。塩基は、例えばピリジン、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等であるが、これに限定されない。反応温度は、例えば−７８℃〜１５０℃であり、反応時間は、例えば１０分〜２０時間であるがこれに限定されない。

Ｎ−アシルアニリン窒素のアルキル化は、上記反応で得たＮ−アシルアニリン化合物をアルキルハライドと、無溶媒又は有機溶媒中、塩基存在下で反応させることにより行うことができる。有機溶媒は、例えばアセトン、ジクロロメタン、クロロホルム等であるが、これに限定されない。塩基は、例えばピリジン、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等であるが、これに限定されない。反応温度は、例えば−７８℃〜１５０℃であり、反応時間は、例えば１０分〜２０時間であるがこれに限定されない。

脱アシル化は、上記で得られたＮ−アシル−Ｎ−アルキルアニリン化合物に、無溶媒又は有機溶媒中、酸又は塩基を作用させることにより行うことができる。有機溶媒は、例えばメタノール、エタノール、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等であるが、これに限定されない。酸は、例えば塩酸、臭化水素酸等であるが、これに限定されない。塩基は、例えばピリジン、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等であるが、これに限定されない。反応温度は、例えば−７８℃〜１５０℃であり、反応時間は、例えば１０分〜２０時間であるがこれに限定されない。

本発明の試料中の定量すべき成分の定量方法は、試料中の定量すべき成分から直接又は間接的に過酸化水素を生成させ、生成する過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下、化合物（Ｉ）及びカップラーと反応させ、生成する色素を測定することを特徴とする。
本定量方法における反応は、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。化合物（Ｉ）の濃度は、０．０５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。カップラーの濃度は、０．０５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。また、過酸化活性物質の濃度は、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましく、２〜５０ｋＵ／Ｌがより好ましい。

色素の定量は、例えば反応液の特定波長での吸光度を分光光度計により測定することにより行うことができる。
本発明の定量すべき成分の定量方法において使用される試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液、ヒト若しくは動物の膵臓、肝臓等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液、ヒト若しくは動物の糞便の抽出液又は懸濁液、細胞の抽出液、植物の抽出液等があげられる。

本発明における過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ、モノフェノールモノオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ様活性を持つ酵素類、ペルオキシダーゼ様活性を持つ金属錯体等があげられ、ペルオキシダーゼ様活性を持つ酵素類が好ましく、中でも、ペルオキシダーゼが好ましい。
本発明におけるカップラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フェニレンジアミン誘導体、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等があげられるが、４−アミノアンチピリンが好ましい。

本発明を用いて定量できる成分としては、酵素反応により直接若しくは間接的に過酸化水素に変換される成分、又は、酵素反応により直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる成分であれば、特に制限はない。
酵素反応により直接過酸化水素に変換される成分としては、例えば１つの酵素反応により過酸化水素に変換されるようなオキシダーゼの基質等が挙げられる。本発明における、試料中の定量すべき成分を直接、過酸化水素に変換する試薬としては、例えば該オキシダーゼを含有する試薬等が挙げられる。

酵素反応により間接的に過酸化水素に変換される成分としては、例えば２つ以上の酵素反応により過酸化水素に変換されるような酵素の基質等が挙げられる。本発明における、試料中の定量すべき成分を間接的に過酸化水素に変換する試薬としては、例えば該基質と反応する酵素、該基質が変換されて生成する物質を対応するオキシダーゼが存在する物質へ変換する酵素又は酵素とその基質、及び、該オキシダーゼを含有する試薬等が挙げられる。

酵素反応により直接過酸化水素を生成させる成分としては、例えば１つの反応により過酸化水素を生成させるようなオキシダーゼ等が挙げられる。本発明における、試料中の成分から直接過酸化水素を生成させる試薬としては、例えば該オキシダーゼの基質を含有する試薬等が挙げられる。
酵素反応により間接的に過酸化水素を生成させる成分としては、例えば２つ以上の反応により過酸化水素を生成させるような酵素等が挙げられる。本発明における、試料中の成分から間接的に過酸化水素を生成させる試薬としては、例えば該酵素の基質、該酵素と該基質との反応により生成する物質を対応するオキシダーゼが存在する物質へ変換する酵素又は酵素とその基質、及び、該オキシダーゼを含有する試薬等が挙げられる。

酵素反応により直接過酸化水素に変換される成分としては、例えばコリン、尿酸、グルコース、ピルビン酸、乳酸、グリセロール、ザルコシン、アシルＣｏＡ、キサンチン、フルクトシルアミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸、遊離型コレステロール、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）中の遊離型コレステロール（ＨＤＬ−ＦＣ）、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）中の遊離型コレステロール（ＬＤＬ−ＦＣ）、超低密度リポタンパク（ＶＬＤＬ）中の遊離型コレステロール（ＶＬＤＬ−ＦＣ）、中間密度リポタンパク（ＩＤＬ）中の遊離型リポタンパク（ＩＤＬ−ＦＣ）、レムナントリポタンパク中の遊離型コレステロール、スモールデンス（small-dense）低密度リポタンパク（ｓｄＬＤＬ）中の遊離型コレステロール（ｓｄＬＤＬ−ＦＣ）等のオキシダーゼの基質が挙げられる。

酵素反応により間接的に過酸化水素に変換される成分としては、例えばクレアチニン、クレアチン、シアル酸、総コレステロール（全てのリポタンパク中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの：ＴＣ）、エステル型コレステロール、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの：ＨＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ中のエステル型コレステロール（ＨＤＬ−ＥＣ）、ＬＤＬ中のコレステロール（ＬＤＬ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの：ＬＤＬ−Ｃ）、ＬＤＬ中のエステル型コレステロール（ＬＤＬ−ＥＣ）、ＶＬＤＬ中のコレステロール（ＶＬＤＬ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの：ＶＬＤＬ−Ｃ）、ＶＬＤＬ中のエステル型コレステロール（ＶＬＤＬ−ＥＣ）、ＩＤＬ中のコレステロール（ＩＤＬ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの：ＩＤＬ−Ｃ）、ＩＤＬ中のエステル型コレステロール（ＩＤＬ−ＥＣ）、レムナントリポタンパク中のコレステロール、レムナントリポタンパク中のエステル型コレステロール、ｓｄＬＤＬ中のコレステロール（ｓｄＬＤＬ−Ｃ）、ｓｄＬＤＬ中のエステル型コレステロール（ｓｄＬＤＬ−ＥＣ）、トリグリセライド、Ｌ−アスパラギン酸、デンプン、マルトース、リン脂質、遊離脂肪酸、無機リン酸、グリコアルブミン、ＨｂＡ１ｃ等が挙げられる。

酵素反応により直接過酸化水素を生成させる成分としては、例えばコリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）、グルコースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の各種オキシダーゼが挙げられる。

酵素反応により間接的に過酸化水素を生成させる成分としては、例えばコリンエステラーゼ、グアナーゼ、γ−ＧＯＴ，γ−ＧＴＰ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ピルビン酸キナーゼ等が挙げられる。
定量すべき成分が、オキシダーゼが作用する基質の場合は、該基質と該基質のオキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させることにより、該基質を直接過酸化水素に変換することができる。

定量すべき成分がオキシダーゼの場合は、該オキシダーゼの基質と該オキシダーゼとの反応により、該オキシダーゼから直接過酸化水素を生成させることができる。
定量すべき成分が、オキシダーゼが作用する基質でない場合には、該基質と、該基質と反応する酵素との反応により生成した物質を、対応するオキシダーゼが存在する物質へ変換した後、該対応するオキシダーゼが存在する物質と該オキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させることにより、該基質を間接的に過酸化水素に変換することができる。

定量すべき成分がオキシダーゼ以外の酵素の場合は、該酵素と、該酵素の基質との反応により生成した物質を、対応するオキシダーゼが存在する物質へ変換した後、該対応するオキシダーゼが存在する物質と該オキシダーゼとの反応により過酸化水素を生成させることにより、該酵素から間接的に過酸化水素を生成させることができる。
試料中の定量すべき成分と、試料中の定量すべき成分を直接、過酸化水素に変換する試薬との組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせを挙げることができる。
・コリン：コリンオキシダーゼを含有する試薬
・尿酸：ウリカーゼを含有する試薬
・グルコース：グルコースオキシダーゼを含有する試薬
・ピルビン酸：ピルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
・乳酸：乳酸オキシダーゼを含有する試薬
・グリセロール：グリセロールオキシダーゼを含有する試薬
・ザルコシン：ザルコシンオキシダーゼを含有する試薬
・アシルＣｏＡ：アシルＣｏＡオキシダーゼを含有する試薬
・キサンチン：キサンチンオキシダーゼを含有する試薬
・フルクトシルアミノ酸：フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有する試薬
・Ｌ−アスパラギン酸：Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼを含有する試薬
・遊離型コレステロール：コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
・各種リポタンパク中の遊離型コレステロール：コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
なお、各種リポタンパクとは、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、レムナントリポタンパク、ｓｄＬＤＬ等をいう。以下、同様である。

試料中の定量すべき成分と、試料中の定量すべき成分から直接、過酸化水素を生成させる試薬との組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせを挙げることができる。
・コリンオキシダーゼ：コリンを含有する試薬
・尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）：尿酸を含有する試薬
・グルコースオキシダーゼ：グルコースを含有する試薬
・ピルビン酸オキシダーゼ：ピルビン酸を含有する試薬
・乳酸オキシダーゼ：乳酸を含有する試薬
・グリセロールオキシダーゼ：グリセロールを含有する試薬
・ザルコシンオキシダーゼ：ザルコシンを含有する試薬
・アシルＣｏＡオキシダーゼ：アシルＣｏＡを含有する試薬
・キサンチンオキシダーゼ：キサンチンを含有する試薬
・フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：フルクトシルアミノ酸を含有する試薬
・モノアミンオキシダーゼ：アリルアミンを含有する試薬
・ポリアミンオキシダーゼ：ポリアミンを含有する試薬
・コレステロールオキシダーゼ：遊離型コレステロールを含有する試薬
・コレステロールオキシダーゼ：各種リポタンパク中の遊離型コレステロールを含有する試薬
試料中の定量すべき成分と、試料中の定量すべき成分を間接的に過酸化水素に変換する試薬との組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせを挙げることができる。
・クレアチニン：クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、及び、ザルコシンオキシダーゼを含有する試薬
・クレアチン：クレアチナーゼ、及び、ザルコシンオキシダーゼを含有する試薬
・シアル酸：ノイラミニダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、及び、無機リンを含有する試薬
・総コレステロール（全てのリポタンパク中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの）：コレステロールエステラーゼ、及び、コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
・各種リポタンパク中のコレステロール（各種リポタンパク中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたもの）：コレステロールエステラーゼ、及び、コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
・総エステル型コレステロール（全てのリポタンパク中のエステル型コレステロール）：コレステロールエステラーゼ、及び、コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
・各種リポタンパク中のエステル型コレステロール：コレステロールエステラーゼ、及び、コレステロールオキシダーゼを含有する試薬
・総トリグリセライド：リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、及び、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを含有する試薬
・各種リポタンパク中のトリグリセライド：リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、及び、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを含有する試薬
・総トリグリセライド：リポプロテインリパーゼ、及び、グリセロールオキシダーゼを含有する試薬
・各種リポタンパク中のトリグリセライド：リポプロテインリパーゼ、及び、グリセロールオキシダーゼを含有する試薬
・デンプン：アミラーゼ、及び、グルコースオキシダーゼを含有する試薬
・マルトース：アミラーゼ、及び、グルコースオキシダーゼを含有する試薬
・リン脂質：ホスホリパーゼＤ、及び、コリンオキシダーゼを含有する試薬
・遊離脂肪酸：アシルＣｏＡシンテターゼ、及び、アシルＣｏＡオキシダーゼを含有する試薬
・無機リン酸：イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び、キサンチンオキシダーゼを含有する試薬
・グリコアルブミン：プロテアーゼ、及び、ケトアミンオキシダーゼを含有する試薬
・ＨｂＡ１ｃ：プロテアーゼ、及び、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ若しくはフルクトシルペプチドオキシダーゼを含有する試薬
試料中の定量すべき成分と、試料中の定量すべき成分から間接的に過酸化水素を生成させる試薬との組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせを挙げることができる。
・コリンエステラーゼ：２，４−ジメトキシベンゾイルコリン、及び、コリンオキシダーゼを含有する試薬
・グアナーゼ：グアニン、キサンチンオキシダーゼ、及び、ウリカーゼを含有する試薬
・ＧＯＴ：Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸脱炭酸酵素、ピルビン酸オキシダーゼ、及び、無機リンを含有する試薬
・ＧＰＴ：Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、及び、無機リンを含有する試薬
・Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド、及び、Ｎ−アセチルグルコサミンオキシダーゼを含有する試薬
・ピルビン酸キナーゼ：ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、及び、ピルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
本発明の、試料中の定量すべき成分の定量用試薬は、化合物（Ｉ）、カップラー、過酸化活性物質、並びに、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬を含有することを特徴とする。

本発明の定量用試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてもよい。キットの形態としては特に制限は無く２試薬系、３試薬系等があげられるが、２試薬系が好ましい。
第１試薬と第２試薬とからなる２試薬系の定量用キットにおいては、化合物（Ｉ）とカップラーとは別々の容器に収納されたキットの形態が好ましい。すなわち、化合物（Ｉ）が第１試薬に含有される場合には、カップラーは第２試薬に含有され、化合物（Ｉ）が第２試薬に含有される場合には、カップラーは第１試薬に含有される形態が好ましい。

試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてよい。過酸化活性物質は、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されてよい。
本発明の定量用試薬及び定量キットにおけるカップラー、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬、並びに、過酸化活性物質としては、それぞれ、前述のカップラー、前述の試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬、並びに、前述の過酸化活性物質が挙げられる。

本発明の試薬及びキットは、凍結乾燥された状態、予め水性媒体に溶解された状態、試験片、フィルム状等いかなる形態で提供されていてもよい。凍結乾燥された状態の試薬及びキットは、本発明の試料中の定量すべき成分の定量に際して、水性媒体に溶解されて使用される。
本発明の試薬及びキットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、干渉物質消去剤、反応促進剤、界面活性剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜１０．０であり、ｐＨ６．０〜８．０が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。

グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等があげられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等があげられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、等の塩類があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン（ＰＯＥ）系界面活性剤等が挙げられる。

本発明の化合物（Ｉ）は、これまで述べてきたように、試料中の定量すべき成分の定量に使用され得るが、本酵素学的定量法以外にも、例えばペルオキシダーゼを標識として用いた標識化抗体を利用した酵素免疫測定法や、血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しくは過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化性物質を用いて測定する場合等にも用いることができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
尚、本実施例、比較及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＨＥＰＥＳ（ＢＤＨ ラボラトリー社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ＥＭＳＥ｛Ｎ−エチル−Ｎ−[２−（サクシニルアミノ）エチル]−３−メチルアニリン；ダイトーケミックス社製｝、ＤＯＳＥ｛Ｎ−[２−（サクシニルアミノ）エチル]−３，５−ジメトキシアニリン ナトリウム；ダイトーケミックス社製｝、ＨＤＡＯＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン ナトリウム；同仁化学研究所社製］、ＡＴＰ・二ナトリウム塩（協和発酵工業社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、カチオンＢＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド；日本油脂社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（ファルマシア社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；プロライアント社製）、フェロシアン化カリウム（関東化学社製）、アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）、エマルゲン７０９（ＰＯＥ高級アルコールエーテル；花王社製）、トリトンＤＦ−１６（ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；シグマ社製）、アデカトールＰＣ−８（特殊フェノールエトキシレート；旭電化工業社製）、エマルゲンＡ−６０（ＰＯＥジスチレン化フェニルエーテル；花王社製）、エマルゲンＡ−９０（ＰＯＥジスチレン化フェニルエーテル；花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５（ＰＯＥラウリルアミン；青木油脂社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、アスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成社製）、リポプロテインリパーゼ（東洋紡社製）、グリセロールキナーゼ（東洋紡績社製）、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２（コレステロールエステラーゼ；天野エンザイム社製）、ＣＨＯ−ＰＥＬ（コレステロールオキシダーゼ；キッコーマン社製）。

ＭＡＳＥの合成
（１）Ｎ−｛２−［Ｎ−（２−メトキシ−５−メチルフェニル）アミノ］エチル｝フタルイミド
２−メトキシ−５−メチルアニリン（２５ｇ；０．１８ｍｏｌ；東京化成工業社製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１００ｍＬ；東京化成工業社製）に、炭酸カリウム（３７．８ｇ；０．２７４ｍｏｌ；和光純薬工業社製）及びＮ−（２−ブロモエチル）フタルイミド（４６．３ｇ；０．１８２ｍｏｌ；東京化成工業社製）を加え、溶液を約１１０℃で２．５時間加熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、全体物を酢酸エチルで抽出した。得られた抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−｛２−［Ｎ−（２−メトキシ−５−メチルフェニル）アミノ］エチル｝フタルイミドを含有する残渣（５７ｇ）を得た。
（２）Ｎ−（２−アミノエチル）−２−メトキシ−５−メチルアニリン
（１）で得た反応混合物（５７ｇ）をエタノール（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、ヒドラジン・１水和物（９．１２ｇ；０．１８２ｍｏｌ）を加え、混合液を約８０℃で２時間加熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸（２００ｍＬ）を注ぎ、全体物を酢酸エチルで抽出した。抽出後の水層を氷冷後、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（２５０ｍＬ）をゆっくりと添加した。添加後、全体物をジエチルエーテルで抽出し、得られた抽出液を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。ジエチルエーテル抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−（２−アミノエチル）−２−メトキシ−５−メチルアニリンを含有する残渣（３０ｇ）を得た。
（３）Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）
（２）で得た反応混合物（３０ｇ）をジクロロメタン（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、無水コハク酸（１６．６ｇ；０．１６６ｍｏｌ；東京化成工業社製）を添加し、混合液を約６０℃で２時間過熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、そこへ、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（２００ｍＬ）を添加し、全体物をジクロロメタンで抽出した。抽出後の水層を氷冷し、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸（２５０ｍＬ）をゆっくり注ぎ、全体物をジエチルエーテルで抽出した。抽出後のジエチルエーテル溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。ジエチルエーテル抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−［（２−サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）（４０ｇ；０．１４３ｍｏｌ；通算収率７８％）を無色アメ状物質として得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３）δ：２．２５（３Ｈ，ｓ），２．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，６．５ Ｈｚ），２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，６．５ Ｈｚ），３．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６，６ Ｈｚ），３．５２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６，６，５．５ Ｈｚ），３．８１（３Ｈ，ｓ），６．１３（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１ Ｈｚ），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，１ Ｈｚ），６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８ Ｈｚ），６．７５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）．

Ｅｔ−ＭＡＳＥの合成
（１）２−メトキシ−５−メチルトリフルオロアセトアニリド
約−２０℃に冷却した２−メトキシ−５−メチルアニリン（２５ｇ；０．１８ｍｏｌ；東京化成工業社製）のピリジン溶液（５０ｍＬ；東京化成工業社製）に、無水トリフルオロ酢酸（５０ｍＬ；０．３６ｍｏｌ）を滴下し、混合物を室温（２５℃）にて２時間攪拌した。反応混合液を氷水にゆっくりと注いだ後、全体物をジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、２−メトキシ−５−メチルトリフルオロアセトアニリドを含有する残渣（４５ｇ）を得た。
（２）１−［（Ｎ−エチル−Ｎ−トリフルオロアセチル）アミノ］−２−メトキシ−５−メチルベンゼン
（１）で得た２−メトキシ−５−メチルトリフルオロアセトアニリドを含有する残渣（４５ｇ）をアセトン（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、炭酸カリウム（３７．８ｇ；０．２７４ｍｏｌ；和光純薬工業社製）及びヨードエタン（３０ｍＬ；０．３７ｍｏｌ；東京化成工業社製）を加え、溶液を約１１０℃で２時間加熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、全体物を酢酸エチルで抽出した。得られた抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、１−［（Ｎ−エチル−Ｎ−トリフルオロアセチル）アミノ］−２−メトキシ−５−メチルベンゼンを含有する残渣（４８ｇ）を得た。
（３）２−メトキシ−５−メチル−Ｎ−エチルアニリン
（２）で得た１−［（Ｎ−エチル−Ｎ−トリフルオロアセチル）アミノ］−２−メトキシ−５−メチルベンゼンを含有する残渣（４８ｇ）をメタノール（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、炭酸カリウム（６３ｇ；０．４６ｍｏｌ；和光純薬工業社製）を加え、溶液を室温（２５℃）で５時間攪拌した。反応後、反応液を氷水に注ぎ、全体物をジエチルエーテルで抽出した。得られた抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、２−メトキシ−５−メチル−Ｎ−エチルアニリンを含有する残渣（３２ｇ）を得た。この残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１０：１）で精製し、２−メトキシ−５−メチル−Ｎ−エチルアニリン（２８ｇ；収率９３％）を淡黄オイル状物質として得た。
（４）Ｎ−｛２−［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−メトキシ−５−メチルフェニル）アミノ］エチル｝フタルイミド
（３）で得た２−メトキシ−５−メチル−Ｎ−エチルアニリン（２８ｇ；０．１７ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１００ｍＬ；東京化成工業社製）に、炭酸カリウム（３５．１ｇ；０．２５４ｍｏｌ；和光純薬工業社製）及びＮ−（２−ブロモエチル）フタルイミド（４３．１ｇ；０．１７０ｍｏｌ；東京化成工業社製）を加え、溶液を約１１０℃で２．５時間加熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、全体物を酢酸エチルで抽出した。得られた抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−｛２−［Ｎ−エチル−Ｎ−（２−メトキシ−５−メチルフェニル）アミノ］エチル｝フタルイミドを含有する残渣（５８ｇ）を得た。
（５）Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−エチル−２−メトキシ−５−メチルアニリン
（４）で得た反応混合物（５８ｇ）をエタノール（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、ヒドラジン・１水和物（８．５ｇ；０．１７ｍｏｌ）を加え、混合液を約８０℃で２時間加熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸（２００ｍＬ）を注ぎ、全体物を酢酸エチルで抽出した。抽出後の水層を氷冷後、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（２５０ｍＬ）をゆっくりと添加した。添加後、全体物をジエチルエーテルで抽出し、得られた抽出液を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。ジエチルエーテル抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−エチル−２−メトキシ−５−メチルアニリンを含有する残渣（３０ｇ）を得た。
（６）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）
（５）で得た反応混合物（３０ｇ）をジクロロメタン（１００ｍＬ；和光純薬工業社製）に溶解し、無水コハク酸（１４．４ｇ；０．１４４ｍｏｌ；東京化成工業社製）を添加し、混合液を約６０℃で２時間過熱した。反応後、溶液を室温にまで放冷後、反応液を氷水に注ぎ、そこへ、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（２００ｍＬ）を添加し、全体物をジクロロメタンで抽出した。抽出後の水層を氷冷し、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸（２５０ｍＬ）をゆっくり注ぎ、全体物をジエチルエーテルで抽出した。抽出後のジエチルエーテル溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。ジエチルエーテル抽出液を無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で乾燥後、硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液を減圧下で留去し、Ｎ−エチル−Ｎ−［（２−サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）［４０ ｇ；０．１３ ｍｏｌ；（４）〜（６）の通算収率７７％］を無色アメ状物質として得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３）δ：０．９９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７ Ｈｚ），２．２７（３Ｈ，ｓ），２．４８〜２．５８（２Ｈ），２．６２〜２．７１（２Ｈ），３．０７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７ Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６ Ｈｚ），３．３１（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４，６ Ｈｚ），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８ Ｈｚ），６．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，２ Ｈｚ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２ Ｈｚ）．

総トリグリセライド定量用キット
以下の第１試薬（試薬Ａ）及び第２試薬（試薬ａ）からなる総トリグリセライド測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭＡＳＥ ０.３ ｇ／Ｌ
ＡＴＰ・二ナトリウム塩 ２．５ ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １ ｋＵ／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ８ ｋＵ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３ ｋＵ／Ｌ
エマルゲン７０９ ０．１％
トリトンＤＦ−１６ ０．０６７％
アデカトールＰＣ−８ ０．１％
第２試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １ ｋＵ／Ｌ
エマルゲンＡ−６０ ０．３０％
エマルゲンＡ−９０ ０．３５％
比較例１
以下の第１試薬（試薬Ｂ）及び第２試薬（試薬ａ）からなる総トリグリセライド測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬Ｂ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０.３ ｇ／Ｌ
ＡＴＰ・二ナトリウム塩 ２．５ ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １ ｋＵ／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ８ ｋＵ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３ ｋＵ／Ｌ
エマルゲン７０９ ０．１％
トリトンＤＦ−１６ ０．０６７％
アデカトールＰＣ−８ ０．１％
第２試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １ ｋＵ／Ｌ
エマルゲンＡ−６０ ０．３０％
エマルゲンＡ−９０ ０．３５％
比較例２
以下の第１試薬（試薬Ｃ）及び第２試薬（試薬ａ）からなる総トリグリセライド測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬Ｃ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＯＳＥ ０.３ ｇ／Ｌ
ＡＴＰ・二ナトリウム塩 ２．５ ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １ ｋＵ／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ８ ｋＵ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３ ｋＵ／Ｌ
エマルゲン７０９ ０．１％
トリトンＤＦ−１６ ０．０６７％
アデカトールＰＣ−８ ０．１％
第２試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １ ｋＵ／Ｌ
エマルゲンＡ−６０ ０．３０％
エマルゲンＡ−９０ ０．３５％

試料中の総トリグリセライドの定量
実施例３のキットを用いて、以下の手順により試料中の総トリグリセライドを定量した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（総トリグリセライド濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）及び血清（総トリグリセライド：２２８．０ｍｇ／ｄＬ）を用いて、実施例３のキットを用いて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置により測定し、総トリグリセライド濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。

ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１及びＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（２．５μＬ）と第１試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第２試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体における「吸光度」の測定
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体（５０検体）を用いる以外は（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、それぞれの検体に対して、「吸光度」を測定した。
（３）ヒト血清検体中の総トリグリセライド濃度の決定
（２）で測定した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中の総トリグリセライド濃度を決定した。

（２）の測定で使用したヒト血清検体（５０検体）中の総トリグリセライド濃度を、総トリグリセライド定量用キットであるデタミナーＬ ＴＧＩＩ（協和メデックス社製）を用いて同様に決定した。実施例３のキットを用いた測定における値とデタミナーＬ ＴＧＩＩを用いた測定における値との間の相関を図１に示す。図１より明らかなように、実施例３のキットを用いることにより、ヒト血清検体中の総トリグリセライドを正確に定量できることが判明した。

ＨＤＬ−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬（試薬Ｄ）及び第２試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐH７．６） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ２ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１２ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＭＡＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
第２試薬（試薬ｂ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．７） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム ０．０３ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２ １００ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ ２ ｇ／Ｌ
比較例３
以下の第１試薬（試薬Ｅ）及び第２試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬ−Ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬（試薬Ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ２ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５ ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １ ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１２ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
第２試薬（試薬ｂ）
ＭＥＳ（ｐＨ６．７） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム ０．０３ ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２ １００ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ ２ ｇ／Ｌ

試料中のＨＤＬ−Ｃの定量
実施例５のキットを用いて、以下の手順により試料中のＨＤＬ−Ｃを定量した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＨＤＬ−Ｃ：０ｍｇ／ｄＬ）及び血清（ＨＤＬ−Ｃ：７８．０ｍｇ／ｄＬ）を、実施例５のキットを用いて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置により、ＨＤＬ−Ｃ濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。

ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１及びＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（２．０μＬ）と第１試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長５４０ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第２試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長５４０ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体における「吸光度」の測定
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体（４０検体）を用いる以外は（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、それぞれの検体に対して、「吸光度」を測定した。
（３）ヒト血清検体中のＨＤＬ−Ｃ濃度の決定
（２）で測定した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＨＤＬ−Ｃ濃度を決定した。

（２）の測定で使用したヒト血清検体（４０検体）中のＨＤＬ−Ｃ濃度を、ＨＤＬ−Ｃ定量用キットであるデタミナーＬ ＨＤＬ−Ｃ Ｋ（協和メデックス社製）を用いて同様に決定した。（２）で決定した各検体中のＨＤＬ−Ｃ濃度とデタミナーＬ ＨＤＬ−Ｃ Ｋを用いた測定により決定した各検体中のＨＤＬ−Ｃ濃度との間の相関を図２に示す。図２から明らかなように、両測定間で良好な相関関係が認められ、従って、実施例５のキットを用いることにより、検体中のＨＤＬ−Ｃを定量できることが判明した。
試験例１ ビリルビンの影響
実施例３及び比較例１のキットを用いて、以下の手順により、色原体によるビリルビンの影響抑制効果の相違を比較、検討した。
（１）ビリルビン添加試料の調製
ヒト血清（８ｍＬ）に、ビリルビン濃度が２００ｍｇ／ｄＬの干渉チェックＡ・ビリルビンＣ（国際試薬社製）（２ｍＬ）を混合し、ビリルビン添加試料（ビリルビンＣ：４０ｍｇ／ｄＬ）を調製した。
（２）対照試料の調製
（１）で用いたヒト血清（８ｍＬ）と純水（２ｍＬ）とを混合して、対照試料を調製した。
（３）ビリルビンの影響
定量キットとして、実施例３及び比較例１のキットを用いて、検体として、（１）のビリルビン添加試料及び（２）の対照試料を用いて、実施例４に記載の方法と同様の方法により、それぞれの検体中の総トリグリセライド濃度を決定した。その結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、被酸化性発色試薬としてＭＡＳＥを用いたキット（実施例３）においては、被酸化性発色試薬としてＥＭＳＥを用いたキット（比較例１）に比較して、ビリルビンの影響を受け難いことが判明した。
試験例２ アジ化ナトリウムに起因する試薬の着色
アジ化水素の発生源であるアジ化ナトリウム含有試薬及び本発明の測定キットの組み合わせにおける、気化して発生するアジ化水素の溶け込みによる測定試薬の発色、劣化の程度を確認した。
（１）アジ化ナトリウム含有試薬の調製
以下の成分からなるアジ化ナトリウム含有溶液を調製した。

ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０.５ ｇ／Ｌ
（２）試薬の保存
実施例３で調製した試薬Ａ及び比較例２で調製した試薬Ｃを、それぞれ試料カップ（自動分析機使用）に分注し、（１）で調製したアジ化ナトリウム含有試薬を底面に散布したフリージングラックに静置した状態で、ポリ袋（２６．０ｍｍ×１６．５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、１０℃にて１０日間保存した。なお、各試料カップの口に栓はしなかった。
（３）保存試薬の安定性の判定
保存開始時及び保存１０日後に、試薬Ａ及び試薬Ｃが発色しているか否かを試薬の吸収スペクトルを測定して判定した。

試薬の吸収スペクトルの測定は、日立製作所社製Ｕ−３０００分光光度計にて行い、実施例３の試薬Ａ或いは比較例２の試薬Ｃ（３ｍＬ）を測光用キュベットに入れて測定した。測定波長は３５０ｎｍから８００ｎｍまでの範囲であり、アジ化物による試薬の着色の色調から、５００ｎｍにおける吸光度を比較した。なお、それぞれ、アジ化ナトリウム含有試薬の無い状態で保存した試薬を吸光スペクトル測定の対照として用いた。
（４）安定性の判定結果
アジ化ナトリウム含有試薬の無い状態で保存した各試薬を対照として、アジ化ナトリウム含有試薬の存在下で保存した各試薬の５００ｎｍにおける吸光度を測定した結果を第３表に示す。

第３表より、比較例２の試薬Ｃは、保存１０日後にして既に着色しているのに対して、本発明の化合物（Ｉ）を含有する実施例３の試薬Ａは、保存１０日後も着色が認められなかった。
以上から、本発明の化合物（Ｉ）を含有する定量用試薬では、アジ化ナトリウム含有試薬から気化して発生するアジ化水素が本発明の測定試薬に溶け込んでも試薬の劣化を防ぐことが出来ることが示された。
試験例３ ビリルビンの影響
実施例５及び比較例３のキットを用いて、以下の手順により、色原体によるビリルビンの影響抑制効果の相違を比較、検討した。
（１）ビリルビン添加試料の調製
ヒト血清（７ｍＬ）に、ビリルビン濃度が２００ｍｇ／ｄＬの干渉チェックＡ・ビリルビンＣ（国際試薬社製）（３ｍＬ）を混合し、ビリルビン添加試料（ビリルビンＣ：６０ｍｇ／ｄＬ）を調製した。
（２）対照用試料の調製
（１）で用いたヒト血清（７ｍＬ）と純水（３ｍＬ）とを混合して、対照試料を調製した。
（３）ビリルビンの影響
定量キットとして、実施例５及び比較例３のキットを用いて、検体として、（１）のビリルビン添加試料及び（２）の対照試料を用いて、実施例６に記載の方法と同様の方法により、それぞれの検体中のＨＤＬ−Ｃ濃度を決定した。ただし、比較例３のキットを用いた測定においては、測定波長の主波長を６００ｎｍとした。その結果を第４表に示す。

第４表から明らかなように、被酸化性発色試薬としてＭＡＳＥを用いたキット（実施例５）においては、被酸化性発色試薬としてＥＭＳＥを用いたキット（比較例３）に比較して、ビリルビンの影響を受け難いことが判明した。

本発明により、臨床診断分野において有用な新規アニリン誘導体又はその塩、試料中の定量すべき成分の定量用方法、定量試薬及び定量用キットが提供される。

実施例３のキットを用いた定量と、デタミナーＬ ＴＧＩＩ（協和メデックス社製）を用いた定量との相関関係を示す図である。 実施例５のキットを用いた定量と、デタミナーＬ ＨＤＬ−Ｃ Ｋ（協和メデックス社製）を用いた定量との相関関係を示す図である。

Claims (12)

1. 下記の一般式（Ｉ）
   （式中、Ｒ^１は水素原子又は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ^２はアルカノイルアミノ置換アルキル基を表し、Ｒ^５は水素原子を表し、Ｒ ^３ は非置換のアルコキシル基を表し、Ｒ ^４ は水素原子を表し、Ｒ ^６ は非置換のアルキル基を表し、Ｒ ^７ は水素原子を表す）で表されるアニリン誘導体又はその塩。
2. アルカノイルアミノ置換アルキル基が、２−（アルカノイルアミノ）エチル基である、請求項１記載のアニリン誘導体又はその塩。
3. ２−（アルカノイルアミノ）エチル基が、２−（サクシニルアミノ）エチル基である、請求項２記載のアニリン誘導体又はその塩。
4. 試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換し、又は、試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させ、過酸化活性物質の存在下、該過酸化水素を、請求項１〜３のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩、及び、カップラーと反応させ、生成する色素を測定することを特徴とする試料中の定量すべき成分の定量方法。
5. カップラーが、４−アミノアンチピリンである、請求項４記載の定量方法。
6. 過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである、請求項４又は５記載の定量方法。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩、カップラー、過酸化活性物質、及び、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬を含有することを特徴とする試料中の定量すべき成分の定量用試薬。
8. カップラーが、４−アミノアンチピリンである請求項７記載の定量用試薬。
9. 過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである請求項７又は８記載の定量用試薬。
10. 第１試薬及び第２試薬を含有する試料中の定量すべき成分の定量用キットであって、請求項１〜３のいずれかに記載のアニリン誘導体又はその塩が第１試薬に含有され、カップラーが第２試薬に含有され、過酸化活性物質、及び、試料中の定量すべき成分を直接若しくは間接的に過酸化水素に変換する試薬又は試料中の定量すべき成分から直接若しくは間接的に過酸化水素を生成させる試薬が、それぞれ第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含有されることを特徴とする定量用キット。
11. カップラーが、４−アミノアンチピリンである請求項１０記載の定量用キット。
12. 過酸化活性物質が、ペルオキシダーゼである請求項１０又は１１に記載の定量用キット。