JPS60241899A - 過酸化水素定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は過酸化水素、水素供与体、電子もしくはラジカ
ル受容体をパーオキシダーゼの存ｔＥドに反応せしめて
色素を生成せしめる反応系を利用する過酸化水素、又は
電子もしくはラジカル受容体の定量法の改良に関する。

さらに詳しくはこの反応系で水素供与体として一般式（
Ｉ）：Ｒ４、 （但し、Ｒ１はＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，ＣＩ＋２０８．　Ｃ
１１２ＣＨ，ＤＨ。

ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２又はＣＯＣＨ３，Ｒ２はＣ１１２Ｄ
　Ｈ、ＣＩＩ　２ＣＨ２０Ｈ。

ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，Ｃｌ２ＮＩＩＣＯＣＨ３，Ｃｌ２
（：８２ＮＨＣＯＣ１１３又はＣ１１（：１１３゜Ｒ３
はＨ，（：Ｒ３，Ｃ２Ｈ５又はＯＣＨ３，Ｒ，は）１又
はＣＨ３を示ず） で表される置換アニリン化合物を用いる方法に関する。

最近試料中のある化合物に、この化合物に１１用するオ
キシダーゼを作用せしめて生成する過酸化水素を定ｌす
ることによって試料中のその化合物を定量する方法が多
く用いられる、この目的のために過酸化水素をより迅速
且つより正確に定量する方法が望まれている。

従来過酸化水素はこれと反応することによって定量的に
色素を生成しうる化合物（水素供与体および電子もしく
はラジカル受容体）と反応けじめて色素を生成せしめ、
この色素の生成量と可視部における吸収度との関係から
定量する方法が行われる。

かかる定量方法において用いられる水素供与体としてフ
ェノール、ジメチルアニリン５ジエチルアニリン、オル
トトリジン、オルトトルイジン。

ｐ−）ルイジン、０−フェニルレンジアミン。

Ｎ、Ｎ’−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン。

ベンジジン、Ｏ−アニシジン、ｐ−アニシジン。

ジアニンジン、０−クレゾール、ｍ−クレゾール５αお
よびβ−ナフトール、カテコール、グアムコール。ピロ
ガロール、２．７−ジンミツフルオレン。

ロイコインドフェノールなどの化合物が用いられる。

しかるにこれらの化合物を用いる場合（１）微量成分の
定量に際して感度が低い　（２）試料中のヘモグロビン
、ビリルビン、アスコルビン酸等の色素生成阻害成分の
影響を受けやすい、あるいは（３）色素生成後の呈色安
定性が悪い等の欠点があり、さらに優れた発色系がめら
れている。

この目的のために発明者らが検討した結果、前記一般式
（１）で表される化合物を発色系に用いる場合には過酸
化水素、又は電子もしくはラジカル受容体の濃度を正確
に定量することができるこ（３） とを見出した。

本発明によれば過酸化水素が存在もしくは生成する系に
前記一般式（１）で表される置換アニリン化合物、電子
もしくはラジカル受容体、及びパーオキシダーゼを加え
て生成する色素による呈色の可視部における吸収を測る
ことによって過酸化水素を定量できる。

本発明で用いられる置換アニリン化合物の具体例は第１
表に示されるが、これらはいずれも既知化合物である。

第　ｌ　表 （１） 電子もしくはラジカル受容体としては４−アミノアンチ
ピリン、２−チオフェンヵルボキシリックアシッドヒド
ラザイド、ベンチジン、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン等が用いられる。

本発明方法を実施するに際しては、通常、予想される過
酸化水素の生成量と反応するに充分な量、通常２〜５倍
当量の置換アニリン化合物および電子もしくはラジカル
受容体にパーオキシダーゼを加えて反応させることによ
って色素が反応液中に生成する。色素の生成によって生
ずる色の吸収を可視部４５０〜６２０ｎｍにおいて測定
し、標準試料による標準曲線と比較することによって元
の過酸化水素量を知ることができる。

第１表に示される具体的化合物を用いて以下に示される
方法によって呈色した液についての呈色の度合、安定性
、血清中の成分の影響について調べた結果を第２表に示
す。

試験は第２表の置換アニリン化合物０．４ｍｇ、４−ア
ミツアンチビリン０．６　ｍｇ　、パーオキシダーゼ（
８） ３０Ｕを０．００４ｍＭの過酸化水素液に加えて３ｍｌ
として反応させる。反応式は次式で示される。

反応後、反応液の５５０ｎｍにおけるＯＤ値をフェノー
ルを水素供与体として用いた場合のＯＤ値を１００とし
たときの比較で呈色の度合を示す。

血清中の成分の影響はビリルビン４μｇ／３ｍｌもしく
はアスコルビン酸２μｇ　／　３ｍｌ存在するとき３〜
６％の影響を士、６〜２０％を＋、２０％以上を科とじ
て示す。色素安定性については、Ａは呈色完了直後とそ
の１時間後における呈色の度合に変化がないことを意味
し、Ｂは上記１時間後における呈色の度合が低下してい
る場合を示す。

呈色の度合の数が大きい程、且つ安定性がＡのランクの
ものが水素供与体として優れている。

第　２　表 化合１勿　呈色。度合　阻害成分０影響、。　Ｌ’！Ｊ
ＩＬｋ’：ｚ　ｅｌよ、Ｃ呈色安定性１２００　士　±
　Δ ２１６０〃ｌ／Ｂ ５７０〃〃Ｂ ４１５０〃〃Ｂ ５２００／／７７Ａ ６　１５０　／ｌ　〃　Δ ７５５〃ｌ／Ｂ ８１６０〃〃　Δ ９４５〃〃Ｂ １０　７０　”　”　Ｂ １１３００〃〃　Δ １２　３２０　〃〃Ａ １３　３２０　”　”　Ａ １４　３００　”　”　Ａ １５　３００　〃〃Ａ １６　２００　〃〃Ａ １７　１６０　〃〃Ｂ １８　８０　”　〃Ｂ １９　１９０　”　〃　Ａ ２０　１８０　”　〃Ａ （Ｉｆ　Ｊ 本発明方法によれば従来用いられているフェノール等を
用いる場合に比べ過酸化水素あるいは電子もしくはラジ
カル受容体の定量が阻害物の影響を受けることが少なく
正確に行える。

特に種々のオキシダーゼを用いて過酸化水を生成せしめ
生成した過酸化水素を定量する臨床検査薬への応用にお
いて著しい効果を示す。

例エバコレステロールの定量にコレステロール・オキシ
ダーゼ、リン脂質の定量にコリン・オキシダーゼ、グル
コースの定量にグルコース・オキシダーゼ、尿素にウリ
カーゼ等の酵素を用いて生成する過酸化水素を発色系に
導いて呈色した反応液の可視部吸収を測ることによって
コレステロール、リン脂質等の含量を定量することが知
られている。この発色系に本発明に係る置換アニリン化
合物を用いることは公知方法に比べて有利をもたらす。

かかる臨床検査薬は生体成分もしくはその処理物に作用
するオキシダーゼ、生成する過酸化水素を色素へ導く発
色系からなるキットを意味する。

オキシダーゼは生体成分もしくはその処理物に作用して
定量的に過酸化水素を生成するオキシダーゼを意味する
。

生体成分の処理物とは生体成分を化学的、あるいは酵素
的処理等によってオキシダーゼの作用によって定量的に
過酸化水素を生成するように変換された物質をいう。

発色系は一般式（１）で表される化合物、電子もしくは
ラジカル受容体およびパーオキシダーゼからなる。ラジ
カル受容体としては前述のものが用いられる。

以下に本発明の態様を示す実施例を示す。

但し、用いられる酵素の活性表示は国際単位である。

実施例１゜ （イ）試薬の調整 （１）酵素溶液 ウリカーゼ３０単位、パーオキシダーゼ５．００　（１
位、　４−アミノアンチピリン３００ｍｇ、）リドンＸ
１００　（イソオクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール、ローム・アンド・ハース社製）３００ｍを０．１
Ｍリン酸ナトリウム−カリウム緩衝液（ｐＨ６，６）に
溶解して３００ｍｌとする。

（２）発色液 ■フェノール６００ｍｇ、■ジメチルアニリン６００ｍ
ｇ、■ジエチルアユ９２６００ｍｇ。

■ｍ−メチルー（Ｎ−エチル−Ｎ′−アセトアミノエチ
ル）アニリン（化合物Ｎｏ、２８　）　２０（１５） ｍｇをそれぞれ３０ｍ！のＯ，Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸ナトリ
ウム−カリウム緩衝液に溶解する。

（３）標準液 尿酸１０ｍｇを０．１　Ｍリン酸ナトリウト　カリウム
緩衝液（ｐ　Ｈ６，６）に溶解して１００ｍ１とする。

（Ｉｌｌ）操作法 酵素溶液３＋ｎｌずつを含有する試験管に発色液■〜■
のそれぞれＱ、３ｍｌをとり、５種類の血清０．０２ｍ
１を別々に加えて、３７℃１５分反応させる。反応液フ
ェノールの場合は５００ｎｍで他は５５０ｎｍで吸光度
を測定し比色する。別に標準液（０，０２ｍ１）の吸光
度及び試薬のブランクテストによる検査線を作成し血清
中の尿酸量を算出する。

比較対象のためにウリカーゼ紫外分光光度法で測定した
値を併せ第３表に示す。

（１６） 第３表においてウリカーゼＵ■法は複雑であるための臨
床検査薬等に応用されないが正確な分析が可能であり、
化合物Ｎα２８を用いる場合の結果はウリカーゼＵ■法
と比較して遜色がない。

実施例２゜ （り試薬の調整 （１）酵素溶液 コレステロール・エステラーゼ３００単位。

コレステロール・オキシダーゼ５５（１位。

バー・オキシダーゼ１．７００単位、４−アミノアンチ
ピリン６００ｍｇ、）リドン×１００３００ｍｇを０．
１　Ｍ　）リスアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，
８）に溶解して正確に３００ｍ１にする。

（２）発色液 ■フェノール６００ｎ＋ｇ、■ジメチルアニリン６００
ｍｇ、■ジエチルアユ９２６００ｍｇ。

■ｍ−）リル、Ｎ、Ｎ’−ジェタノール（化合物Ｎｏ、
４５　）　２５ｍｇをそれぞれ３９ｍ１の０．１Ｍトリ
スアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）に溶解す
る。

（３）標準液 コレステロール３００ＩＩ１ｇをイソプロピルアルコー
ル１０部、トリトン×１００部、蒸留水８０部からなる
溶媒に溶解して正確に１０　Ｑｍ！にする。

（ロ）操作法 酵素溶液３ｍ３発色液Ｑ、３ｍｌをとり、５種類の血清
（検体）０．０２ｍ１を加え３７℃、１５分反応を行わ
せる。

フェノール発色液の場合は５００ｎｍで、他の発色液の
場合は５５０ｎｍの吸光度を測定し比色する。別に、標
準液の比色結果および試薬ブランクを用いて、検量線を
作成し、これに前記測定結果を用いて検体中のコレステ
ロール含量を測定する。結果をガスクロマド法を用いて
測定した結果と対比して第４表に併記する。

第４表　コレステロール含！（ｍｇ／ｄ）実施例３゜ （イ）試薬の調整 （１）酵素溶液 フォスフォリパーゼーＤ　３６ｊｌｌＬコリンオキシダ
ーゼ１．０００単位、パーオキシダーゼｌ、　８００単
位、４−アミノアンチピリン６００ｍｇ、）リドンＸ１
００　３００ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム−カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、３００ｍ１ｌ：する
。

（２）発色液 ■フェノール６００ｍｇ、■ジメチルアニリン６００ｍ
ｇ、■ジエチルアユ９フ６００ｍｇ。

■２−（Ｎ−エチル−ｍ−トルイジノ）−エタノール（
化合物ｋｌ？）２０ｍｇをそれぞれ３０ｍ１の０．１　
Ｍリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０＞
に溶解する。

（３）標準液 リン脂質換算として３００ｍｇとなるように塩化コリン
を０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）に
溶解して、正確に１０３ｍｌとする。

（０）操作法 酵素液３ｍｌ、発色液Ｑ、３ｍｌをとり、血清（検体）
０．０２ｍ１を加え、３７℃、５分反応を行わ（１９） せる。フェノール発色液の場合は５００ｎｍで、他の場
合は５５０ｎｍの吸光度を測定する。別に、標準液（０
，０２ｍ１）の１ヒ色および試薬盲検の結果を用いて検
量線を作成し、これを用いて検体中のリン脂質含量を計
算でめる。

ガスクロマド法を用いて測定したリン脂質含量を対照に
結果を第５表に示した。

第５表　リン脂質含量（ｍｇ／ａｌ’）実施例２．３に
おいて本発明方法■はいずれもガスクロマド法の結果と
返信し正確であることが理解される。

（２０）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ビリルビンを含有する試料中の過酸化水素を定量する方
   法において、試料に４−アミノアンチピ、リン、パーオ
   キシダーゼ及び一般式（Ｉ）：（式中、ｔ＋、ハＣＨ３
   ，Ｃ２Ｈ５，Ｃ１ｌ、ＯＲ，ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ。 ＣＨ２ＣＨ２Ｎ　Ｈ２又ハＣＤＣｌ＋３を示し、Ｒ２は
   ＣＨ２０Ｈ。 ＣＩｌ、Ｃｌｌ、０１１．　ＣＨ，ＣＨ，ＮＨ，、ＣＨ
   ２ＮＨＣＯＣＩ＋３．　Ｃ１１２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＩ＋
   。 又ハＣＯＣＨ３を示し、Ｒ３Ｉｔ　Ｈ，Ｃ１１ａ、　Ｃ
   ２＋１Ｓ又Ｌｉ　０ＣＲ３を示し、Ｒ，ｌｔＨ又ハＣＨ
   ，、を示す。但し、Ｒ，がＣＲ３゜Ｃ，Ｒ５，ＣＭ、口
   Ｈ又Ｉｔ　Ｃ１１２ＣＨ２０ＨテＲ２がＣＨ２０Ｈ又は
   Ｃ１２ＣＤ、ＯＨの場合にはＲ３がＨのときはＲ１もＨ
   であり、Ｒ８がＣＨ，又Ｌｉ　Ｃ２Ｈ３（７）ときハＲ
   ，ｌ；ｉ　ＣＨｌを示す）で表される水素供与体を加え
   て反応させて生成する色素を定量することを特徴とする
   試料中の過酸化水素の定量法。