JP3695596B2 - 生体成分の測定方法および測定用試薬組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は生体成分の測定方法及び測定用試薬組成物に関する。さらに詳しくは、生体成分を酸化酵素を用いて測定する方法およびその測定用試薬組成物において、アスコルビン酸による誤差のない正確な測定を可能とする。
【０００２】
【従来の技術】
血清、尿などの生体試料中のグルコース、コレステロール、尿酸などの成分の存在及びその量の測定は、臨床検査の分野において有益な情報をもたらす。その測定方法として、それぞれの成分に対して、高い基質特異性を有する酵素を使用した酵素的測定方法が急速に普及している。その中でも測定対象である生体成分に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法が多く用いられている。代表的な成分と直接作用させる酸化酵素の組み合わせとしては、グルコースとグルコースオキシダーゼ、遊離コレステロールとコレステロールオキシダーゼ、尿酸とウリカーゼなどが挙げられる。
【０００３】
また測定対象である生体成分に直接、酸化酵素が作用できない場合は、予め生体成分にある酵素を作用させて、酸化酵素の基質となる物質を生成させた後、該物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法が用いられる。このような代表例としては、中性脂肪とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、無機リンとキサンチンオキシダーゼ、リン脂質とコリンオキシダーゼ、クレアチニンとザルコシンオキシダーゼなどが挙げられる。
【０００４】
酸化酵素の作用により生成した過酸化水素は公知の種々の方法で測定することができるが、最も一般的に利用されている方法は、ペルオキシダーゼの存在下、色原体を酸化し、４−アミノアンチピリンなどのカップラーと縮合させて色素を形成させて比色定量する方法が挙げられる。
この方法に用いられる色原体としては、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体が挙げられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような生体成分の測定方法において、生体試料中に含まれる還元物質、特にアスコルビン酸によって測定に負誤差を生じ、正しい測定結果が得られないことがしばしば経験されている。この問題を解決する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼを試薬中に共存させることにより、効率的にアスコルビン酸を分解し、生体成分の測定への干渉を回避する方法が用いられている。しかしながらアスコルビン酸オキシダーゼは溶液中では容易に失活しやすいため、試薬保存中にアスコルビン酸の分解能が低下する欠点があった。アスコルビン酸の分解能の低下を防止する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼに種々の安定化剤を添加することが行われている。安定化剤の例としては、硼酸、シュクロースなどがあげられる。しかしながら、これらの方法によってアスコルビン酸オキシダーゼの溶液中での安定性は改善されるが、アスコルビン酸の測定値への干渉を完全に回避するには至らなかった。
【０００６】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは、上記現状に鑑みアスコルビン酸の測定値への干渉を回避する方法を鋭意検討した結果、アスコルビン酸オキシダーゼと有機酸または無機酸のマンガン塩を共存させることによって、上記課題を解決するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を測定することにより生体成分を測定する方法において、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を作用させて、生体成分中の妨害物質を除去することを特徴とする生体成分の測定方法である。
【０００８】
また本発明は酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする生体成分の測定用試薬組成物である。
【０００９】
さらに本発明は生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする生体成分の測定用試薬組成物である。
【００１０】
本発明において測定する生体成分としては、グルコース、遊離コレステロール、エステル型コレステロール、中性脂肪、リン脂質、無機リン、遊離脂肪酸、尿素窒素、ピルビン酸、クレアチン、クレアチニンまたは尿酸などが挙げられる。本発明において測定しようとする成分はこれらの成分に限らず、酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、その量を測定することにより測定可能な成分を包含する。
【００１１】
本発明において測定しようとする生体成分に由来する物質としては、中性脂肪に由来するグリセロールまたはグリセロール−３−リン酸、リン脂質に由来するコリン、クレアチン、クレアチニンに由来するザルコシン、α−アミラーゼに由来するグルコースなどが挙げられる。また本発明において測定しようとする成分としては、α−アミラーゼなどの酵素類も包含される。
本発明において測定しようとする成分は、これらの成分に限らず、酸化酵素の基質となる物質を例えば化学反応によって生成するものであって、該物質に酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、その量を測定することにより測定可能な成分も包含する。
【００１２】
生体成分に直接作用する酸化酵素としては、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。
【００１３】
生体成分から酸化酵素の基質となる物質を得る酵素としては、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ホスフォリパーゼＤ、コレステロールエステラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンセターゼ、ウレアアミドリアーゼなどが挙げられる。
【００１４】
本発明において測定する生体成分、生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素、使用する酸化酵素をまとめると以下の通りである。
【００１５】
【表１】
【００１６】
本発明に使用するカプラーとしては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどが挙げられる。
【００１７】
本発明に使用する色原体としては、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体などが挙げられる。
【００１８】
本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のもの、遺伝子組換えにより製造されたもの、これらの酵素が化学修飾されたものなどを挙げることができる。
【００１９】
また使用する有機酸のマンガン塩としては、酢酸マンガン、乳酸マンガン、エチレンジアミン四酢酸マンガンなどが挙げられる。無機酸のマンガン塩としては、塩化マンガン、臭化マンガン、リン酸マンガン、硼酸マンガン、炭酸マンガンなどが挙げられる。
【００２０】
本発明の生体成分測定用試薬組成物は、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むものである。該組成物は測定対象である成分によっては、酸化酵素の基質となる物質を生成する酵素などを含む。該組成物の形状としては、液状試薬であっても、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせてもよい。液状試薬には適当な緩衝剤が含まれ、一液でも二液でもよい。
【００２１】
試薬組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの含有量は特に限定されるものではないが、好適には試薬組成物中、０．１〜５０単位（Ｕ）／ｍｌである。
有機酸または無機酸のマンガン塩の含有量は、試薬組成物中、０．０１〜１ｍＭであることが好ましい。マンガン塩の含有量が１ｍＭを越えると、ブランク発色が大きくなる傾向にあり、それに伴い測定の精密性に問題が生じる。またマンガン塩が０．０１ｍＭ未満であると、アスコルビン酸の影響を回避する効果は十分でない。
試薬組成物が二液である場合、アスコルビン酸オキシダーゼは第１試薬に存在することが好ましく、有機酸または無機酸のマンガン塩は、第１試薬または第２試薬のいずれに存在してもよい。
酸化酵素、酸化酵素の基質となる物質を生成する酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラーの添加量は測定に支障を来さない限り特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明の測定方法では、生体試料に上記試薬組成物を作用させ、生体成分中の妨害物質を除去すると同時、または除去して後、酸化酵素が生成する過酸化水素にペルオキシダーゼ、色原体、カプラーが作用して生成する色素の吸光度を測定することによって、生体試料中の生体成分を測定する。したがってアスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を作用させて、生体成分中の妨害物質を除去する操作は、試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させる操作、生成した過酸化水素を測定する操作のいずれにおいて実施してもよい。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、生体試料中に含まれるアスコルビン酸が及ぼす生体成分の測定への影響を、試料の前処理をすることなく、回避することが可能となる。アスコルビン酸オキシダーゼと他の金属塩、例えば銅塩または亜鉛塩などを組み合わせても、同様の効果は得られない。またアスコルビン酸のみの添加に比べて、高濃度までアスコルビン酸が及ぼす生体成分の測定への影響を回避することが可能である。また安定化剤を含有するアスコルビン酸オキシダーゼを使用する場合に比べても、高濃度までアスコルビン酸が及ぼす生体成分への測定への影響を回避することができる。また本発明による効果はアスコルビン酸の測定値に及ぼす干渉を回避することにあり、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化については顕著な効果を奏するものではない。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例をもって詳細に説明する。
なお、実施例中、略号は以下のものを示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
ＴＡＰＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
ＥＤＴＡ・Ｚｎ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・亜鉛
ＥＤＴＡ・Ｃｕ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・銅
ＥＤＴＡ・Ｍｎ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・マンガン
【００２５】
実施例１ 血清中の遊離コレステロールの測定
下記試薬Ａ〜Ｃを調製した。
試薬Ａ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｂ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｃ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００２６】
サンプルとしては下記サンプル１〜６を用意した。
サンプル１ 人プール血清：蒸留水＝９：１
サンプル２ 人プール血清： 200mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル３ 人プール血清： 400mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル４ 人プール血清： 600mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル５ 人プール血清： 800mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル６ 人プール血清：1000mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
【００２７】
各サンプル４μｌに各試薬Ａ〜Ｃの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ａ〜Ｃの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から遊離コレステロール濃度を求めた。
その結果を表２に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
表１から明らかなように、試薬Ａではアスコルビン酸の影響を受けて遊離コレステロールを正確に測定できない。またアスコルビン酸オキシダーゼのみを作用させる試薬Ｂではアスコルビン酸濃度が高いサンプルではアスコルビン酸の影響を受ける。しかし本発明の試薬Ｃではアスコルビン酸濃度が高いサンプルでもその影響を回避することできる。
【００３０】
実施例２ 血清中の尿酸の測定
下記試薬Ｄ〜Ｆを調製した。
試薬Ｄ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｅ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｆ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３１】
各サンプル６μｌに各試薬Ｄ〜Ｆの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｄ〜Ｆの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
その結果を表３に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
表２から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｆは妨害物質の影響を回避することできる。
【００３４】
実施例３ 中性脂肪の測定
下記試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
試薬Ｇ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｈ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
【００３５】
試薬Ｉ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３６】
各サンプル３μｌに試薬Ｇ〜Ｉの第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｇ〜Ｉの第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線から中性脂肪濃度を求めた。
その結果を表４に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
表３から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｉは妨害物質の影響を回避することできる。
【００３９】
実施例４ 血清リン脂質の測定
下記試薬Ｊ〜Ｌを調製した。
試薬Ｊ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
【００４０】
試薬Ｋ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｌ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４１】
各サンプル３μｌに試薬Ｊ〜Ｌの第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｊ〜Ｌの第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からリン脂質濃度を求めた。
その結果を表５に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
表４から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｌは妨害物質の影響を回避することできる。
【００４４】
実施例５ 血清クレアチニンの測定
下記試薬Ｍ〜Ｏを調製した。
試薬Ｍ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｎ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
【００４５】
試薬Ｏ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４６】
各サンプル６μｌに試薬Ｍ〜Ｏの第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｍ〜Ｏの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチニン濃度を求めた。
その結果を表６に示す。表中、数値は単位 mg/dlを示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
表５から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｏは妨害物質の影響を回避することできる。
【００４９】
実施例６ 血清尿酸の測定
下記試薬Ｐ〜Ｓを調製した。
試薬Ｐ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｑ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｚｎ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００５０】
試薬Ｒ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｃｕ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｓ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｍｎ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５１】
各サンプル６μｌに各試薬Ｐ〜Ｓの第１試薬試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｐ〜Ｓの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
その結果を表７に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５２】
【表７】
【００５３】
表６から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、ＥＤＴＡ・Ｍｎを含む本発明の試薬Ｓはその影響を回避することができる。
【００５４】
実施例７ 血清尿酸の測定
下記試薬Ｔ〜Ｖを調製した。
試薬Ｔ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００５５】
試薬Ｕ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．５ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｖ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．５ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（試薬２）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５６】
サンプル６μｌに各試薬Ｔ〜Ｖの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｔ〜Ｖの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
同様にして調製した各試薬Ｕ〜Ｖを３７℃で３日間保存後、測定を行なった。
その結果を表８に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５７】
【表８】
【００５８】
表７から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｖはその影響を回避することができる。また３７℃で３日間保存した試薬については、よりその効果が顕著である。
【産業上の利用分野】
本発明は生体成分の測定方法及び測定用試薬組成物に関する。さらに詳しくは、生体成分を酸化酵素を用いて測定する方法およびその測定用試薬組成物において、アスコルビン酸による誤差のない正確な測定を可能とする。
【０００２】
【従来の技術】
血清、尿などの生体試料中のグルコース、コレステロール、尿酸などの成分の存在及びその量の測定は、臨床検査の分野において有益な情報をもたらす。その測定方法として、それぞれの成分に対して、高い基質特異性を有する酵素を使用した酵素的測定方法が急速に普及している。その中でも測定対象である生体成分に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法が多く用いられている。代表的な成分と直接作用させる酸化酵素の組み合わせとしては、グルコースとグルコースオキシダーゼ、遊離コレステロールとコレステロールオキシダーゼ、尿酸とウリカーゼなどが挙げられる。
【０００３】
また測定対象である生体成分に直接、酸化酵素が作用できない場合は、予め生体成分にある酵素を作用させて、酸化酵素の基質となる物質を生成させた後、該物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法が用いられる。このような代表例としては、中性脂肪とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、無機リンとキサンチンオキシダーゼ、リン脂質とコリンオキシダーゼ、クレアチニンとザルコシンオキシダーゼなどが挙げられる。
【０００４】
酸化酵素の作用により生成した過酸化水素は公知の種々の方法で測定することができるが、最も一般的に利用されている方法は、ペルオキシダーゼの存在下、色原体を酸化し、４−アミノアンチピリンなどのカップラーと縮合させて色素を形成させて比色定量する方法が挙げられる。
この方法に用いられる色原体としては、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体が挙げられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような生体成分の測定方法において、生体試料中に含まれる還元物質、特にアスコルビン酸によって測定に負誤差を生じ、正しい測定結果が得られないことがしばしば経験されている。この問題を解決する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼを試薬中に共存させることにより、効率的にアスコルビン酸を分解し、生体成分の測定への干渉を回避する方法が用いられている。しかしながらアスコルビン酸オキシダーゼは溶液中では容易に失活しやすいため、試薬保存中にアスコルビン酸の分解能が低下する欠点があった。アスコルビン酸の分解能の低下を防止する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼに種々の安定化剤を添加することが行われている。安定化剤の例としては、硼酸、シュクロースなどがあげられる。しかしながら、これらの方法によってアスコルビン酸オキシダーゼの溶液中での安定性は改善されるが、アスコルビン酸の測定値への干渉を完全に回避するには至らなかった。
【０００６】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは、上記現状に鑑みアスコルビン酸の測定値への干渉を回避する方法を鋭意検討した結果、アスコルビン酸オキシダーゼと有機酸または無機酸のマンガン塩を共存させることによって、上記課題を解決するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を測定することにより生体成分を測定する方法において、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を作用させて、生体成分中の妨害物質を除去することを特徴とする生体成分の測定方法である。
【０００８】
また本発明は酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする生体成分の測定用試薬組成物である。
【０００９】
さらに本発明は生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする生体成分の測定用試薬組成物である。
【００１０】
本発明において測定する生体成分としては、グルコース、遊離コレステロール、エステル型コレステロール、中性脂肪、リン脂質、無機リン、遊離脂肪酸、尿素窒素、ピルビン酸、クレアチン、クレアチニンまたは尿酸などが挙げられる。本発明において測定しようとする成分はこれらの成分に限らず、酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、その量を測定することにより測定可能な成分を包含する。
【００１１】
本発明において測定しようとする生体成分に由来する物質としては、中性脂肪に由来するグリセロールまたはグリセロール−３−リン酸、リン脂質に由来するコリン、クレアチン、クレアチニンに由来するザルコシン、α−アミラーゼに由来するグルコースなどが挙げられる。また本発明において測定しようとする成分としては、α−アミラーゼなどの酵素類も包含される。
本発明において測定しようとする成分は、これらの成分に限らず、酸化酵素の基質となる物質を例えば化学反応によって生成するものであって、該物質に酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、その量を測定することにより測定可能な成分も包含する。
【００１２】
生体成分に直接作用する酸化酵素としては、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。
【００１３】
生体成分から酸化酵素の基質となる物質を得る酵素としては、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ホスフォリパーゼＤ、コレステロールエステラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンセターゼ、ウレアアミドリアーゼなどが挙げられる。
【００１４】
本発明において測定する生体成分、生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素、使用する酸化酵素をまとめると以下の通りである。
【００１５】
【表１】
本発明に使用するカプラーとしては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどが挙げられる。
【００１７】
本発明に使用する色原体としては、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体などが挙げられる。
【００１８】
本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のもの、遺伝子組換えにより製造されたもの、これらの酵素が化学修飾されたものなどを挙げることができる。
【００１９】
また使用する有機酸のマンガン塩としては、酢酸マンガン、乳酸マンガン、エチレンジアミン四酢酸マンガンなどが挙げられる。無機酸のマンガン塩としては、塩化マンガン、臭化マンガン、リン酸マンガン、硼酸マンガン、炭酸マンガンなどが挙げられる。
【００２０】
本発明の生体成分測定用試薬組成物は、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むものである。該組成物は測定対象である成分によっては、酸化酵素の基質となる物質を生成する酵素などを含む。該組成物の形状としては、液状試薬であっても、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせてもよい。液状試薬には適当な緩衝剤が含まれ、一液でも二液でもよい。
【００２１】
試薬組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの含有量は特に限定されるものではないが、好適には試薬組成物中、０．１〜５０単位（Ｕ）／ｍｌである。
有機酸または無機酸のマンガン塩の含有量は、試薬組成物中、０．０１〜１ｍＭであることが好ましい。マンガン塩の含有量が１ｍＭを越えると、ブランク発色が大きくなる傾向にあり、それに伴い測定の精密性に問題が生じる。またマンガン塩が０．０１ｍＭ未満であると、アスコルビン酸の影響を回避する効果は十分でない。
試薬組成物が二液である場合、アスコルビン酸オキシダーゼは第１試薬に存在することが好ましく、有機酸または無機酸のマンガン塩は、第１試薬または第２試薬のいずれに存在してもよい。
酸化酵素、酸化酵素の基質となる物質を生成する酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラーの添加量は測定に支障を来さない限り特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明の測定方法では、生体試料に上記試薬組成物を作用させ、生体成分中の妨害物質を除去すると同時、または除去して後、酸化酵素が生成する過酸化水素にペルオキシダーゼ、色原体、カプラーが作用して生成する色素の吸光度を測定することによって、生体試料中の生体成分を測定する。したがってアスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を作用させて、生体成分中の妨害物質を除去する操作は、試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させる操作、生成した過酸化水素を測定する操作のいずれにおいて実施してもよい。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、生体試料中に含まれるアスコルビン酸が及ぼす生体成分の測定への影響を、試料の前処理をすることなく、回避することが可能となる。アスコルビン酸オキシダーゼと他の金属塩、例えば銅塩または亜鉛塩などを組み合わせても、同様の効果は得られない。またアスコルビン酸のみの添加に比べて、高濃度までアスコルビン酸が及ぼす生体成分の測定への影響を回避することが可能である。また安定化剤を含有するアスコルビン酸オキシダーゼを使用する場合に比べても、高濃度までアスコルビン酸が及ぼす生体成分への測定への影響を回避することができる。また本発明による効果はアスコルビン酸の測定値に及ぼす干渉を回避することにあり、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化については顕著な効果を奏するものではない。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例をもって詳細に説明する。
なお、実施例中、略号は以下のものを示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
ＴＡＰＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
ＥＤＴＡ・Ｚｎ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・亜鉛
ＥＤＴＡ・Ｃｕ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・銅
ＥＤＴＡ・Ｍｎ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・マンガン
【００２５】
実施例１ 血清中の遊離コレステロールの測定
下記試薬Ａ〜Ｃを調製した。
試薬Ａ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｂ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｃ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
コレステロールオキシダーゼ １．５ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００２６】
サンプルとしては下記サンプル１〜６を用意した。
サンプル１ 人プール血清：蒸留水＝９：１
サンプル２ 人プール血清： 200mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル３ 人プール血清： 400mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル４ 人プール血清： 600mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル５ 人プール血清： 800mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
サンプル６ 人プール血清：1000mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１
【００２７】
各サンプル４μｌに各試薬Ａ〜Ｃの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ａ〜Ｃの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から遊離コレステロール濃度を求めた。
その結果を表２に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００２８】
【表２】
表１から明らかなように、試薬Ａではアスコルビン酸の影響を受けて遊離コレステロールを正確に測定できない。またアスコルビン酸オキシダーゼのみを作用させる試薬Ｂではアスコルビン酸濃度が高いサンプルではアスコルビン酸の影響を受ける。しかし本発明の試薬Ｃではアスコルビン酸濃度が高いサンプルでもその影響を回避することできる。
【００３０】
実施例２ 血清中の尿酸の測定
下記試薬Ｄ〜Ｆを調製した。
試薬Ｄ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｅ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｆ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３１】
各サンプル６μｌに各試薬Ｄ〜Ｆの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｄ〜Ｆの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
その結果を表３に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００３２】
【表３】
表２から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｆは妨害物質の影響を回避することできる。
【００３４】
実施例３ 中性脂肪の測定
下記試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
試薬Ｇ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｈ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
【００３５】
試薬Ｉ：
（第１試薬）
グリセロールキナーゼ １ｕ／ｍｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＡＴＰ ３ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
リポプロテインリパーゼ ３ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３６】
各サンプル３μｌに試薬Ｇ〜Ｉの第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｇ〜Ｉの第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線から中性脂肪濃度を求めた。
その結果を表４に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００３７】
【表４】
表３から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｉは妨害物質の影響を回避することできる。
【００３９】
実施例４ 血清リン脂質の測定
下記試薬Ｊ〜Ｌを調製した。
試薬Ｊ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
【００４０】
試薬Ｋ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｌ：
（第１試薬）
ホスフォリパーゼＤ ０．５ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
コリンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
トリス緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４１】
各サンプル３μｌに試薬Ｊ〜Ｌの第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｊ〜Ｌの第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からリン脂質濃度を求めた。
その結果を表５に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００４２】
【表５】
表４から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｌは妨害物質の影響を回避することできる。
【００４４】
実施例５ 血清クレアチニンの測定
下記試薬Ｍ〜Ｏを調製した。
試薬Ｍ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
試薬Ｎ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
【００４５】
試薬Ｏ：
（第１試薬）
クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４６】
各サンプル６μｌに試薬Ｍ〜Ｏの第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｍ〜Ｏの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチニン濃度を求めた。
その結果を表６に示す。表中、数値は単位 mg/dlを示す。
【００４７】
【表６】
表５から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｏは妨害物質の影響を回避することできる。
【００４９】
実施例６ 血清尿酸の測定
下記試薬Ｐ〜Ｓを調製した。
試薬Ｐ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｑ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｚｎ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００５０】
試薬Ｒ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｃｕ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｓ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．２Ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
ＥＤＴＡ・Ｍｎ ０．２ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５１】
各サンプル６μｌに各試薬Ｐ〜Ｓの第１試薬試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｐ〜Ｓの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
その結果を表７に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５２】
【表７】
表６から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、ＥＤＴＡ・Ｍｎを含む本発明の試薬Ｓはその影響を回避することができる。
【００５４】
実施例７ 血清尿酸の測定
下記試薬Ｔ〜Ｖを調製した。
試薬Ｔ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
【００５５】
試薬Ｕ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．５ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
（第２試薬）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
試薬Ｖ：
（第１試薬）
ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ
ＴＯＯＳ ２．０ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ０．５ｕ／ｍｌ
（カボチャ由来）
塩化マンガン ０．２ｍＭ
（試薬２）
ウリカーゼ １ｕ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン ０．６ｍＭ
リン酸緩衝液 １００ｍＭ
サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５６】
サンプル６μｌに各試薬Ｔ〜Ｖの第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｔ〜Ｖの第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。
同様にして調製した各試薬Ｕ〜Ｖを３７℃で３日間保存後、測定を行なった。
その結果を表８に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５７】
【表８】
表７から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｖはその影響を回避することができる。また３７℃で３日間保存した試薬については、よりその効果が顕著である。
Claims (14)
- 試料中の生体成分または該生体成分に由来する物質に酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素を測定することにより生体成分を測定する方法において、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を作用させる（ただし、このとき、さらに次の中から１つ以上選択される物質を同時に作用させる場合を除く；ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩）、生体成分中の妨害物質を除去することを特徴とする生体成分の測定方法。
- 生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ、色原体およびカプラーを用いて定量することを特徴とする請求項１項記載の生体成分の測定方法。
- 有機酸または無機酸のマンガン塩が、酢酸マンガン、乳酸マンガン、エチレンジアミン四酢酸マンガン、塩化マンガン、臭化マンガン、リン酸マンガン、硼酸マンガンまたは炭酸マンガンであることを特徴とする請求項１記載の生体成分の測定方法。
- 有機酸または無機酸のマンガン塩の含有量が、試薬組成物中、０．０１〜１ｍＭであることを特徴とする請求項１項記載の生体成分の測定方法。
- 生体成分がグルコース、遊離コレステロール、エステル型コレステロール、中性脂肪、リン脂質、無機リン、クレアチン、クレアチニン、遊離脂肪酸、尿素窒素、ピルビン酸または尿酸であることを特徴とする請求項１記載の生体成分の測定方法。
- 酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする生体成分の測定用試薬組成物（ただし、このとき、さらに次の中から１つ以上選択される物質を含む場合を除く；ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩）。
- 生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラー、アスコルビン酸オキシダーゼおよび有機酸または無機酸のマンガン塩を含むことを特徴とする請求項６記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 有機酸または無機酸のマンガン塩が、酢酸マンガン、乳酸マンガン、エチレンジアミン四酢酸マンガン、塩化マンガン、臭化マンガン、リン酸マンガン、硼酸マンガンまたは炭酸マンガンであることを特徴とする請求項６または７記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 有機酸または無機酸のマンガン塩の含有量が、試薬組成物中、０．０１〜１ｍＭであることを特徴とする請求項６または７項記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 生体成分がグルコース、遊離コレステロール、ピルビン酸または尿酸であることを特徴とする請求項６記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 酸化酵素がグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼまたはウリカーゼであることを特徴とする請求項６記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 生体成分がエステル型コレステロール、中性脂肪、リン脂質、無機リン、クレアチン、クレアチニン、遊離脂肪酸または尿素窒素であることを特徴とする請求項７記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 生体成分から酸化酵素の基質を生成する酵素が、コレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ、グリセリンキナーゼ、ホスフォリパーゼＤ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、アシルＣｏＡシンセターゼまたはウレアミドリアーゼであることを特徴とする請求項７記載の生体成分の測定用試薬組成物。
- 酸化酵素がコレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼまたはピルビン酸オキシダーゼであることを特徴とする請求項７記載の生体成分の測定用試薬組成物。
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