KR20100065272A - 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법 - Google Patents

아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법 Download PDF

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Abstract

측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키는 것을 포함하는 측정 대상 성분의 정량 방법에 있어서, 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차를 저감하는 방법이 개시되어 있다. 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법은 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키고, 이어서 측정 대상 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 정량함으로써 상기 측정 대상 성분을 정량할 때에 카탈라아제로서 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제를 이용한다.

Description

아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법{METHOD OF REDUCING MEASUREMENT ERROR CAUSED BY CATALASE INHIBITION BY AZIDE}
본 발명은 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법에 관한 것이다.
임상검사의 분야에 있어서 측정 대상 성분으로부터 과산화수소를 생성시키고, 이 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상 성분의 시료 중 농도를 측정하는 방법이 널리 이용되고 있다. 이러한 방법에 있어서는 측정 대상 성분 이외의 물질로부터 생성되는 과산화수소가 측정값의 오차 요인이 되기 때문에 측정 대상 성분 이외의 물질로부터 생성된 과산화수소를 카탈라아제를 작용시켜 물과 산소로 분해하는 방법이나, 퍼옥시다아제를 이용하여 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과 반응시켜 무색 퀴논으로 전화시키는 방법에 의해 소거하는 방법이 일반적으로는 이용되고 있다. 예를 들면, 중성지방 측정용 시약에서는 내인성 유리 글리세롤의 소거계에, 크레아티닌 측정 시약에서는 크레아틴과 사르코신의 소거계에, HDL-콜레스테롤 또는 LDL-콜레스테롤 측정용 시약에서는 목적 성분 이외의 리포단백 중 콜레스테롤의 소거계에 사용되고 있다. 또한, 종래부터 카탈라아제를 이용하는 측정계에 있어서 이용되는 카탈라아제로서는 소 유래의 카탈라아제가 일반적으로 이용되고 있다.
이 중, 카탈라아제에 의한 소거계는 자주 사용되고 있지만, 카탈라아제를 저해하는 성분의 혼입에 의해 방해를 받는 경우가 있다. 특히, 아지화물의 혼입은 극히 미량이어도 카탈라아제를 강력하게 저해하기 때문에 소거계가 방해되어 측정 대상 성분 이외로부터 발생하는 과산화수소를 충분하게 소거할 수 없기 때문에 측정값에 오차가 발생한다.
아지화나트륨과 같은 아지화물는 임상검사 분야에 있어서 널리 방부제로서 사용되고 있고, 측정계에 혼입될 가능성은 매우 높다. 측정계로의 아지화물의 혼입은 측정 시료 자체에 함유되어 있는 경우나, 근방에 존재하는 아지화물 함유 시약으로부터 아지화물이 아지화수소로서 기화되어 측정 시약에 용해되는 경우, 자동 분석 장치의 시약 채취 프로브를 통해 다른 아지화물 함유 시약으로부터 아지화물이 측정 시약에 도입되는 경우 등이 알려져 있다.
일본 특허 공개 평10-14596호 공보 일본 특허 제 3164829호 게재 공보 일본 특허 제 3058602호 게재 공보
따라서, 본 발명의 목적은 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키는 것을 포함하는 측정 대상 성분의 정량 방법에 있어서, 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차를 저감하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원 발명자들은 예의 연구의 결과, 종래부터 이용되고 있는 소 유래의 카탈라아제에 비해 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제는 아지화물에 의한 저해를 훨씬 받기 어렵다는 것을 발견하였고, 측정계에 이용되는 카탈라아제로서 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제를 이용함으로써 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차를 저감할 수 있다는 것에 상도하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키고, 이어서 측정 대상 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 정량함으로써 상기 측정 대상 성분을 정량할 때에 상기 카탈라아제로서 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차를 저감하는 방법이 처음으로 제공되었다. 본 발명에 의해 예를 들면 중성지방, LDL콜레스테롤, HDL콜레스테롤, 크레아티닌 등의 측정 대상 성분을 종래보다 정확하게 정량할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 출원 발명자들은 종래부터 이용되고 있는 소 유래의 카탈라아제에 비해 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제가 아지화물에 의한 저해를 훨씬 받기 어렵다는 놀랄만한 지견을 얻었다. 본 발명은 이 신 지견에 기초하는 것이다.
헴(heme) 함유 카탈라아제인 단일 기능 카탈라아제는 작은 서브유닛(55~69kDa)을 갖는 카탈라아제와, 큰 서브유닛(75kDa 이상)을 갖는 카탈라아제로 분류할 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 카탈라아제는 상기 큰 서브유닛(75kDa 이상)을 갖는 카탈라아제이다.
본 발명의 방법에 이용되는 상기 카탈라아제가 유래되는 미생물로서는 곰팡이, 세균 및 일부 고세균 유래의 것이고, 보다 구체적으로는 Podospora anserina, Neurospora crossa, Cladosporium fulvum, Emericella nidulans, Pleurotus ostreatus, Deinococcus radiodurans, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas putida, Psuedomonas putida, Bacillus subtilis, Bacillus subtillis, Bacillus firmus, Mycobacterium avium, Botryotinia fuckeliana, Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus, Ajellomyces capsulatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Nosema locustae, Xanthomonas oryzae, Xanthomonas campestris 등을 예시할 수 있다. 세균 등은 복수 종의 카탈라아제를 생산하는 것이 알려져 있지만, 큰 서브유닛(75kDa 이상)을 갖는 카탈라아제가 본 발명의 방법에 이용되는 카탈라아제이다. 단, 상기 큰 서브유닛을 갖는 카탈라아제에 상기 작은 서브유닛을 갖는 카탈라아제가 혼입되어 있어도 본 발명의 실시에 지장은 없다.
상기 미생물이 생산하는 카탈라아제 중 큰 서브유닛(75kDa 이상)을 갖는 카탈라아제이고 공지의 것으로서는 Podospora anserina CatA, Aspergillus fumigatus CatA, Emericella nidulans CatA, Ajellomyces capsulatus CatA, Escherichia Coli KatE, Escherichia coli K12, Pseudomonas putida CatC, Bacillus subtilis catalase 2, Bacillus subtillis KatE, Bacillus firmus KatA, Mycobacterium avium KatE, Aspergillus fumigatus CatB, Ajellomyces capsulatus CatB, Aspergillus nidulans CatA, Aspergillus niger CatR, Agrobacterium tumefaciens CatC, Sinorhizobium meliloti CatC, Nosema locustae, Xanthomonas oryzae KatX, Xanthomonas campestris KatE를 들 수 있다. 이들 카탈라아제는 유전자적으로 유연(類緣)인 것이 「Bacterial Catalase in the Microsporidian Nosema locustae: Implications for Microsporidian Metabolism and Genome Evolution」Naomi M. Fast et al., EUKARYOTIC CELL, Oct.2003, p.1069-1075에 기재되어 있고, 또한 이들 카탈라아제는 헴 d를 갖는 것이 알려져 있다. 유전자적으로 유연인 효소가 유사한 특징을 갖는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 이용하는 카탈라아제는 상기 열기한 카탈라아제에 한정되지 않고, 유전자적으로 유연이고, 헴 d를 가지며, 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 카탈라아제이면 어떠한 것이어도 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 큰 서브유닛의 분자량의 상한에 관해서는 84kDa로 하는 보고나, 90kDa로 하는 보고가 있지만, 유전자적으로 유연인 것은 모두 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 또한, 「유전자적으로 유연」이란 아미노산 배열에 기초하는 상법에 의한 계통 해석에 의해 근연의 것으로서 동일 그룹으로 분류되는 것을 말하고, 예를 들면 상기한 Fast들의 문헌에 기재되는 방법에 의해 그룹 Ⅱ로 분류되는 카탈라아제끼리를 유전자적으로 유연이라고 한다. 카탈라아제는 1종류의 카탈라아제만을 이용해도 되고, 2종류 이상의 카탈라아제를 혼합하여 이용해도 된다. 또한, 카탈라아제를 2종류 이상 이용할 경우에는 동일 종류의 미생물 유래의 카탈라아제여도 되고, 다른 종류의 미생물 유래의 카탈라아제여도 된다.
이들 미생물 유래 카탈라아제는 여러가지 시판되고 있고, 시판품을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 당업자에게 주지의 상법에 의해 미생물을 배양하고, 상기 배양물로부터 정제함으로써 얻을 수도 있다.
측정계에 혼입되어 카탈라아제를 저해하는 아지화물 중 각종 성분의 정량 측정에 있어서 문제가 되는 것은 주로 방부제로서 다용되고 있는 아지화나트륨과 같은 아지화금속이나, 그것으로부터 유래되는 아지화수소 등이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키고, 이어서 측정 대상 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 정량함으로써 상기 측정 대상 성분을 측정하는 모든 정량 방법에 적용 가능하다. 이러한 정량 방법 자체는 다양한 것이 이 분야에 있어서 주지이다. 측정 대상 성분으로서는 중성지방(트리글리세리드), HDL(고밀도 리포단백질)콜레스테롤, LDL(저밀도 리포단백질)콜레스테롤 및 크레아티닌 등을 예시할 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 카탈라아제로서 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제를 이용하는 것을 제외하고 종래의 각 측정 대상 성분의 정량 방법을 그대로 실시함으로써 실시 가능하다.
본 발명의 방법은 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 미생물 유래의 카탈라아제로 분해시킨 후에 아지화물를 첨가하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 이용하는 카탈라아제는 아지화물에 의한 저해를 받기 어렵지만, 충분한 양의 아지화물를 작용시킴으로써 카탈라아제의 과산화수소 분해 반응을 정지시킬 수 있다. 이 방법에 의해, 정량 반응에 의해 생성되는 과산화수소가 카탈라아제에 의해 분해되지 않도록 할 수 있다.
앞서 예시한 각종 측정 대상 성분의 카탈라아제를 이용한 측정 방법 자체는 주지이고, 여기에서 설명할 필요는 없지만 만약을 위해 이하에 간단히 기재한다.
중성지방(트리글리세리드)은 예를 들면 체액 중에 함유되는 글리세린에 글리세롤키나제, 글리세롤-3-인산 옥시다아제 및 카탈라아제를 작용시켜 글리세린으로부터 생성된 과산화수소를 소거한 후, 이어서 체액 중의 트리글리세리드에 리포프로테인 리파아제, 글리세롤키나제, 글리세롤-3-인산 옥시다아제, 퍼옥시다아제 및 색원체를 작용시켜 트리글리세리드로부터 글리세린을 생성시키고, 글리세린으로부터 글리세롤-3-인산을 생성시키며, 글리세롤-3-인산으로부터 과산화수소를 생성시키고, 상기 과산화수소를 발색시킨 후 그 발색 강도를 측정함으로써 정량할 수 있다(특허문헌 1).
HDL콜레스테롤은 예를 들면 pH5~8을 유지하는 완충액 중, 및 2가의 금속 이온의 존재 하에서 피검 시료에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 생성된 과산화수소를 카탈라아제에 의해 제거함으로써 피검 시료 중의 고밀도 리포단백 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 소거하고, 이어서 상기 제 1 공정의 산물에 고밀도 리포단백에 특이적으로 작용하는 HLB가 13~14인 계면활성제를 첨가하여 고밀도 리포단백 중의 콜레스테롤을 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 정량함으로써 정량할 수 있다(특허문헌 2).
LDL콜레스테롤은 예를 들면 아민을 함유하는 완충액의 존재 하에서 저밀도 리포단백 이외의 리포단백에 작용하는 계면활성제의 존재 하에 있어서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 생성된 과산화수소를 카탈라아제에 의해 소거함으로써 피검 시료 중의 고밀도 리포단백, 초저밀도 리포단백 및 카일로마이크론 중의 콜레스테롤을 소거하고, 이어서 피검 시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량함으로써 정량할 수 있다(특허문헌 3).
크레아티닌은 예를 들면 체액 중에 함유되는 크레아틴에 크레아틴아미디노히드롤라아제, 사르코신옥시다아제 및 카탈라아제를 작용시켜 크레아틴으로부터 생성된 과산화수소를 소거한 후, 이어서 체액 중의 크레아티닌에 크레아티닌아미도히드롤라아제, 크레아틴아미디노히드롤라아제, 사르코신옥시다아제, 퍼옥시다아제 및 색원체를 작용시켜 크레아티닌으로부터 크레아틴을 생성시키고, 크레아틴으로부터 사르코신을 생성시키며, 사르코신으로부터 과산화수소를 생성시키고, 상기 과산화수소를 발색시킨 후 그 발색 강도를 측정함으로써 정량할 수 있다(특허문헌 1).
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
(비교예 1, 실시예 1)
내인성 유리 글리세롤 제거 중성지방 측정용 시약으로서 하기 조성을 갖는 제 1 시약 및 제 2 시약을 조제했다.(비교예 1)
제 1 시약 PIPES 완충액, pH6.5 50mmol/L
글리세롤키나제 1000U/L
글리세롤-3-인산 옥시다아제 5000U/L
카탈라아제(소 간장 유래) 300000U/L
N-(2-히드록시술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 0.3mmol/L
아데노신5'-3인산 1.6mmol/L
염화마그네슘 7.5mmol/L
폴리에틸렌글리콜모노-p-이소옥틸페닐에테르 0.3%
제 2 시약 PIPES 완충액, pH6.5 50mmol/L
리포프로테인 리파아제 3000U/L
퍼옥시다아제 3000U/L
4-아미노안티피린 4.2mmol/L
아지화나트륨 0.1%
염화마그네슘 7.5mmol/L
폴리에틸렌글리콜모노-p-이소옥틸페닐에테르 0.3%
한편, 상기 비교예 1의 제 1 시약의 카탈라아제를 Aspergillus niger 유래(Aspergillus niger CatR, Roche Diagnostics GmbH사제)로 변경한 제 1 시약(실시예 1)을 조제했다.
아지화나트륨을 0~0.1% 첨가한 시료(사람 혈청) 4㎕에 미리 37℃에서 가온한 제 1 시약 300㎕를 혼화하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 제 2 시약 100㎕를 첨가하여 5분간 반응시키고, 600nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 측정된 흡광도로부터 중성지방량을 산출하여 시료 중의 중성지방량을 구했다. 비교예 1 및 실시예 1의 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
비교예 1에서는 시료 중의 아지화나트륨의 첨가량이 증가함에 따라 내인성 유리 글리세롤의 소거가 방해되고, 측정값이 상승한다. 한편, 실시예 1에서는 아지화나트륨의 첨가량이 증가해도 측정값은 거의 상승하지 않고, 소거계가 거의 방해받고 있지 않다는 것을 알 수 있다. 이로 인해, 본 발명에 의해 아지화물이 혼입되어도 카탈라아제에 의한 소거계가 거의 방해받지 않아 정확한 측정을 행할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 측정 대상 성분 이외의 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 카탈라아제로 분해시키고, 이어서 측정 대상 성분으로부터 유래되는 과산화수소를 정량함으로써 상기 측정 대상 성분을 정량할 때에 상기 카탈라아제로서 75kDa 이상의 서브유닛을 갖는 미생물 유래의 카탈라아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 아지화물에 의한 카탈라아제의 저해에 기인하는 측정 오차의 저감 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 카탈라아제는 헴 d를 갖는 카탈라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 미생물은 포도스포라(Podospora)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 클라도스포륨(Cladosporium)속, 에메리켈라(Emericella)속, 플레우로투스(Pleurotus)속, 데이노코커스(Deinococcus)속, 에쉐리히아(Escherichia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 바실루스(Bacillus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 보트리오티니아(Botryotinia)속, 클라비셉스(Claviceps)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 아젤로미세스(Ajellomyces)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 시노리조비움(Sinorhizobium)속, 메조리조비움(Mesorhizobium)속, 노제마(Nosema)속 및 크산토모나스(Xanthomonas)속의 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 미생물은 아스페르길루스속 균인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 대상 성분은 중성지방, HDL콜레스테롤, LDL콜레스테롤 또는 크레아티닌인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
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