CN101166831B - 高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法 - Google Patents

高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种简便的，并且可以正确测定的HDL胆固醇的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。试样中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于使i)胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶，在含有具有胺或铵盐结构的特定的含氮表面活性剂和聚阴离子的水性介质中与试样反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。

Description

高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法
技术领域
本发明涉及试样中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。
背景技术
生物体中的脂蛋白可根据其比重分为高密度脂蛋白(以下简称为HDL)、低密度脂蛋白(以下简称为LDL)、超低密度脂蛋白(以下，简称为VLDL)、乳糜微粒(以下简称为CM)，主要由于脱辅基蛋白的种类的不同，它们在生物体中的作用差异很大，脂质组成各式各样。已知，其中，HDL由于接受来自于包括动脉壁的各组织的胆固醇，因此与积累于细胞内的胆固醇的除去作用相关，其为冠动脉硬化症等各种动脉硬化症的危险预防因子，其血中水平是动脉硬化性疾病的预知发病的有用指标。
以往的HDL中的胆固醇(以下简称为HDL胆固醇)的测定方法由通过超离心法、免疫化学的方法、电泳法、沉淀法等的分馏操作和胆固醇定量操作的两个阶段构成。但是，分馏操作的操作很烦杂，需要很长时间，而且在安全性方面也存在问题。因此，需要这些分离操作的测定法效率极低，是一种不适于实用化的方法。
近年来，为了解决上述问题，已经报道了各种各样的测定方法。例如，在含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆汁酸盐或胆汁酸衍生物或琥珀酸二辛酯磺酸盐的缓冲液中使血清或血浆与这些酶反应，以HDL胆固醇为先驱，使VLDL和LDL中的胆固醇反应，测定生成的过氧化氢后，在反应液中添加含有聚环氧乙烷氧化物基的非离子表面活性剂，使HDL胆固醇与该酶反应，对HDL胆固醇分别进行特异性定量的方法(参照专利文献1)，通过在特定的pH和特定温度下，在含有胰脏 来源的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆汁酸族的表面活性剂和非离子系表面活性剂的缓冲液中使血清与该酶反应，测定HDL胆固醇的方法(参照专利文献2)。在专利文献2中记载的测定方法中，首先，进行LDL胆固醇与该酶的反应，然后，进行HDL胆固醇与该酶的反应，可以测定HDL胆固醇。但是，这些测定方法，测定需要长时间，而且，不一定是非特异性测定HDL胆固醇的方法。
作为通过使HDL以外的脂蛋白凝集，测定HDL胆固醇的方法，已知有：例如，使用硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝集的试剂、二价金属盐以及化学修饰的酶的测定方法(参照专利文献3)；以及聚阴离子等与HDL之外的脂蛋白形成复合体的试剂，和聚环氧乙烷-聚氧化丙烯缩聚物等不溶解脂蛋白的表面活性剂的测定方法(参照专利文献4)；使用硫酸葡聚糖等聚阴离子、二价金属盐，特定的非离子性表面活性剂和与试剂来源的白蛋白不同的白蛋白的测定方法(参照专利文献5)；特征在于用含有脂蛋白分馏剂(硫酸葡聚糖等阴离子和镁离子等二价阳离子的组合)的溶液处理血清或血浆，不用对获得的混合液进行固体和液体的分离处理，在阴离子性表面活性剂(烷基磺酸或胆汁酸或其衍生物)的存在下，使之与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，测定生成的过氧化氢来测定血清或血浆中的HDL胆固醇的方法(参照专利文献6)。
但是，在这些使HDL之外的脂蛋白凝集的HDL胆固醇测定法中，虽然与以往的标准方法存在良好的相关性，但是由反应中生成的凝集物引起的浑浊而导致的不正确、在反应器中的碱清洗时，存在着在与反应液中的金属盐的反应中生成的金属氢氧化物的析出而导致的对自动分析装置的过度负荷等问题。
作为不使HDL以外的脂蛋白凝集来测定HDL胆固醇的方法，已知的有；例如，通过使胰腺来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶与生物体试样，在胆汁酸或其盐以及白蛋白的存在下发生反应，测定由该酶反应消耗或生成的化合物，从而测定生物体试样中的HDL胆固醇的测定方法(参照专利文献7)；对于HDL馏分具有反应选择性的HLB值为16 以上的非离子性表面活性剂的存在下，使优先作用于HDL馏分的脂蛋白脂酶和/或胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶与试样反应，测定试样中的HDL胆固醇的方法(参照专利文献8)等。而且，通过酰基聚环氧乙烷山梨聚糖酯将HDL之外的脂蛋白中的胆固醇优先转换为过氧化氢，除去生成的过氧化氢后，通过添加聚环氧乙烷烷基醚，用酶测定HDL胆固醇的方法(参照专利文献9)。
但是，在这些不使HDL以外的脂蛋白凝集的HDL胆固醇的测定方法中，存在着由于HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的不完全消除，对于HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的非特异性反应所引起的测定值不正确的问题。
而且，作为不使HDL以外的脂蛋白凝集的HDL胆固醇的测定方法，已知有：试样中的HDL胆固醇的测定方法(参照专利文献10)，其特征在于，使i)胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶，在含有非离子性表面活性剂、聚阴离子和白蛋白的水性介质中与试样反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；以及HDL胆固醇的测定方法(参照专利文献11)，其特征在于，使胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有胆汁酸衍生物的水性介质中与试样反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。
专利文献1：特开昭62-69999号公报
专利文献2：特开昭63-126498号公报
专利文献3：特开平8-131197号公报
专利文献4：特开平8-201393号公报
专利文献5：特开平9-285298号公报
专利文献6：特开平8-116996号公报
专利文献7：国际公开WO97/40376A小册子
专利文献8：WO00/52480A小册子
专利文献9：特开平9-299号公报
专利文献10：国际公开WO2004/035816A小册子
专利文献11：WO2004/035817A小册子
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种简便的，并且可以正确测定的HDL胆固醇的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。
用于解决问题的手段
本发明的发明人为了解决上述问题进行了积极的研究，结果发现，在具有胺或铵盐结构的特定的含氮表面活性剂和聚阴离子的共存下，胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶特异性作用于HDL，从而完成本发明。
也就是说，本发明涉及以下(1)-(13)。
(1)试样中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使i)胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶，在含有选自于通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质中的至少一种物质、以及聚阴离子的水性介质中与试样反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；
Figure S2006800142148D00041
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2 表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
Figure S2006800142148D00042
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
(2)根据前述(1)记载的方法，其中，水性介质还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
(3)根据前述(1)或(2)记载的方法，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
(4)高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于含有选自于通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质中的至少一种物质、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂。
Figure S2006800142148D00051
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2 表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
Figure S2006800142148D00052
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
(5)高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于含有选自于通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质中的至少一种物质、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶；
Figure S2006800142148D00061
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2 表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
Figure S2006800142148D00062
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
(6)根据前述(5)记载的试剂，其中还含有还原型辅酶测定用试剂。
(7)前述(4)-(6)任一项记载的试剂，其中还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
(8)前述(4)-(7)任一项记载的试剂，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
(9)高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其含有第一试剂和第二试剂，其特征在于，在第一试剂中含有选自于通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质中的至少一种物质和聚阴离子，第二试剂中含有胆固醇氧化酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中还含有过氧化氢测定用试剂，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中还含有胆甾醇酯水解酶；
Figure S2006800142148D00063
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
(10)高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其含有第一试剂和第二试剂，其特征在于，在第一试剂中含有选自于通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质中的至少一种物质和聚阴离子，第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中还含有氧化型辅酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中还含有胆甾醇酯水解酶；
Figure S2006800142148D00072
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
Figure S2006800142148D00073
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30 的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
(11)前述(10)记载的试剂盒，其中，第一试剂、第二试剂中的任一种或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
(12)前述(9)-(11)任一项中记载的试剂盒，其中，第一试剂、第二试剂中的任一种或两者还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
(13)前述(9)-(12)任一项中记载的试剂盒，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
发明的效果
根据本发明，可以提供简便且正确的HDL胆固醇的测定方法，测定用试剂和测定用试剂盒。
具体实施方式
本发明的HDL胆固醇的测定方法是不消除HDL以外的脂蛋白中的胆固醇，也不使HDL以外的脂蛋白中的胆固醇凝集的测定HDL胆固醇的方法。
作为本发明的测定方法中可以使用的试样，可以列举有例如全血，血浆，血清，髓液，唾液，羊水，尿，汗，胰液等，优选血浆和血清。
作为本发明中的胆甾醇酯水解酶，如果是具有加水分解胆甾醇酯能力的酶，没有特别的限制，还可以使用例如动物，植物或微生物来源的胆甾醇酯酶，脂蛋白脂肪酶，以及通过基因工程方法制备的胆甾醇酯酶，脂蛋白脂肪酶等。
作为胆甾醇酯水解酶，可以使用未修饰的胆甾醇酯水解酶，也可以使用化学修饰的胆甾醇酯水解酶。而且，作为胆甾醇酯水解酶，还可以使用市售品。
作为市售的胆甾醇酯水解酶，可以列举胆甾醇酯酶“Amano”2(CHE2；天野酶公司制)，胆甾醇酯酶“Amano”3(CHE 3；天野酶公司制)， 脂蛋白脂肪酶(LPL311，东洋纺制社制)，脂蛋白脂肪酶“Amano”3(LPL3，天野酶公司制)，43kDa酯酶(天野酶公司制)，EST“Amano”2(天野酶公司制)，胆甾醇酯酶[COE313(化学修饰的胆甾醇酯酶)；东洋纺制社制]等。而且，在本发明中，还可以组合使用两种以上的胆甾醇酯水解酶。
作为胆甾醇酯水解酶的化学修饰中修饰该酶的基团，可以列举有例如以聚乙二醇作为主要成分的基团，以聚丙二醇作为主要成分的基团，具有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基团，含有水溶性多糖类的基团，磺丙基，磺丁基，聚氨基甲酸酯，具有螯合功能的基团等，优选以聚乙二醇作为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，可以列举例如葡聚糖，可溶性淀粉等。
作为用于化学修饰胆甾醇酯水解酶的试剂，可以列举具有上述化学修饰基团，以及与酶的氨基，羧基，巯基等反应获得的官能团或结构的化合物等。作为与酶中的氨基反应获得的官能团或结构，可以列举，例如羧基，活性酯基(N-羟基丁二酰亚胺基等)，酸酐，酰氯化物，醛，环氧化物基，1，3-丙磺酸内酯，1，4-丁烷磺内酯等。作为与酶中的羧基反应获得的官能团或结构，可以列举例如氨基。作为与酶中的巯基具有反应性的基团或结构，可以列举例如马来酰亚胺，二硫化物，α-卤素酯(α-碘酯等)等。
作为化学修饰剂，还可以使用市售品。作为市售的化学修饰剂，可以列举，例如具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和N-羟基丁二酰亚胺基的Sunbright VFM-4101，Sunbright ME-050AS，SunbrightDE-030AS(均由日本油脂公司制)，具有以聚亚烷基二醇作为主要成分的基团和酸酐结构的Sunbright AKM系列(例如，Sunbrbiht AKM-1510等)，Sunbright ADM系列，Sunbright ACM系列(均为日本油脂公司制)，具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和环氧化物基的EPOX-3400，M-EPOX-5000(均由SheawaterPolymers公司制)，具有螯合功能的基团和酸酐结构的二乙烯三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酰乙酸酐(DTPAanhydride；同仁化学公司制)等。
胆甾醇酯水解酶的化学修饰可以用例如以下方法进行，但是不限于本方法。首先，将胆甾醇酯水解酶溶解于pH8.0以上的缓冲液(例如，HEPES缓冲液)中，在0-55℃添加0.01-500倍摩尔量的化学修饰剂，搅拌5分钟-5小时。在实际的酶反应中，作为化学修饰的胆甾醇酯水解酶，不但可以照原样使用该反应液，而且还可以使用根据需要通过超滤膜等除去未反应的化学修饰剂的反应液。
作为可以在本反应的方法中使用的胆甾醇酯水解酶的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选反应液中的浓度为0.01-400U/mL，更优选0.02-200U/mL。
作为本发明中的胆固醇氧化酶，如果是具有通过氧化胆固醇生成过氧化氢的能力的酶，就没有特别的限制，例如，可以使用动物、植物或微生物来源的胆固醇氧化酶，也可以使用由基因工程方法制备的胆固醇氧化酶等，还可以使用胆固醇氧化酶“Amano”1(CHOD1；天野酶公司制)，胆固醇氧化酶(CHOPE；Kikkoman公司制)，胆固醇氧化酶(COO321；东洋纺制社制)，胆固醇氧化酶协和(协和发酵社制)等市售品。而且，在本发明中，还可以组合使用两种以上的胆固醇氧化酶。
胆固醇氧化酶可以是未修饰的酶，也可以是化学修饰的酶。化学修饰的胆固醇氧化酶可以通过例如使用前述的化学修饰剂通过前述化学修饰方法进行制备。
作为可以在本反应的方法中使用的胆固醇氧化酶的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.01-400U/mL，更优选0.02-200U/mL。
作为本发明中的胆固醇脱氢酶，如果是具有通过在氧化型辅酶存在下氧化胆固醇生成还原型辅酶的能力的酶，就没有特别的限制，还可以使用例如动物，植物或微生物来源的胆固醇脱氢酶等。还可以使用胆固醇脱氢酶“Amano”5(CHDH5；天野酶公司制)等市售品。而且。在本发明中，还可以组合使用两种以上的胆固醇脱氢酶。胆固醇脱氢酶可以是未修饰的酶，也可以是化学修饰的酶。化学修饰的胆固醇脱氢酶可以通过例如使用前述的化学修饰剂通过前述化学修饰方法进行 制备。
作为可以在本反应的方法中使用的胆固醇脱氢酶的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.01-400U/mL，更优选0.02-200U/mL。
在使用本发明的胆固醇脱氢酶的测定方法中，可以使用氧化型辅酶。作为氧化型辅酶，可以列举有例如NAD，NADP，thio-NAD，thio-NADP等。
在本发明中，可以与聚阴离子一起使用通式(I)表示的物质[以下称为化合物(I)]，
Figure S2006800142148D00111
(式中，R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2 表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分别表示直链或分链的碳原子数为1-6的烷基或碳原子数为2-6的烯基，X表示阴离子)，
或者通式(II)表示的物质[以下称为化合物(II)]，
Figure S2006800142148D00112
(式中，R5表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R6 和R7相同或不同，分别表示氢原子、直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基)。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分链的碳原子数为6-30的烷基，可以列举例如己基、庚基、辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三 烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等基团，并优选碳原子数为8-24的烷基，且更优选碳原子数为10-18的烷基。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分链的碳原子数为6-30的烯基，可以列举例如己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等，并优选碳原子数为8-24的烯基，且更优选碳原子数为10-18的烯基。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分链的碳原子数为1-30的烷基，可以列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等基团，并优选碳原子数为1-24的烷基，且更优选碳原子数为1-18的烷基。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分支枝状的碳原子数为1-6的烷基，可以列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等基团，并优选甲基、乙基、丙基中任一种，且更优选甲基。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分链的碳原子数为2-30的烯基，可以列举例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基 等，并优选碳原子数为2-24的烯基，且更优选碳原子数为2-18的烯基。
作为化合物(I)和化合物(II)中直链或分链的碳原子数为2-6的烯基，可以列举例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基等，并优选乙烯基、丙烯基中的任一种，且更优选乙烯基。
作为化合物(I)中的阴离子，可以列举例如，氢氧根离子、卤素离子、来自于无机酸的阴离子、来自于有机酸的阴离子等。作为卤素离子，可以列举氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等。作为来自于无机酸的阴离子，可以列举例如硝酸离子、硫酸离子、磷酸离子、碳酸离子等。作为来自于有机酸的阴离子，可以列举例如甲酸离子、乙酸离子、乳酸离子、柠檬酸离子、谷氨酸离子等羧酸离子等。
另外，在通式(I)中，优选R1表示直链或分链的碳原子数为6-30的烷基或烯基，R2表示直链或分链的碳原子数为1-30的烷基或碳原子数为2-30的烯基，R3和R4都表示甲基，X表示阴离子的化合物。
作为化合物(I)的实例(制品)，可以列举例如阳离子AB，阳离子BB，阳离子2ABT，阳离子2DB-500E，阳离子2-OLR(均由日本油脂公司制)等。作为化合物(II)的具体实例(制品)，可以列举例如胺BB，胺AB，胺2-OLR，叔胺BB，叔胺FB(均由日本油脂公司制)等。
作为化合物(I)或化合物(II)的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.0001-1％，更优选0.001-0.1％。
作为可以在本发明中使用的聚阴离子，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的聚阴离子，则没有特别的限定，可以列举例如硫酸葡聚糖或其盐，肝素或其盐，钨磷酸或其盐，硫酸化环糊精或其盐，硫酸寡糖或其盐等，但优选硫酸葡聚糖。作为硫酸葡聚糖，可以列举例如分子量为4万，8万，20万，50万，100万，200万等的硫酸葡聚糖。作为硫酸寡糖，可以列举例如硫酸琼脂糖，硫酸海藻糖，硫酸软骨素等。作为盐，可以列举例如钠盐，钾盐，锂盐，铵盐，镁盐等。而且，在本发明中，可以使用两种以上的聚阴离子。作为在本发明的HDL胆 固醇测定中的聚阴离子的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.001-10％，更优选0.01-1％。
作为可以在本发明中使用的白蛋白，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的，则没有特别的限定，可以列举例如来源于牛，马，羊，人的白蛋白等，但是优选牛血清白蛋白(BSA)。而且，还可以使用通过基因工程方法制备的白蛋白。在本发明中，还可以组合使用两种以上的白蛋白。作为在本发明的HDL胆固醇的测定中的白蛋白的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.001-10％，更优选0.01-1％。
作为可以在本发明中使用的聚环氧乙烷烷基胺或聚环氧乙烷烯基胺，可以列举例如通式(III)表示的化合物[以下称为化合物(III)]，
Figure S2006800142148D00141
[式中，R8表示支链或分链的烷基或烯基，R9表示氢原子或(CH2CH2O)nH，m和n相同或不同，表示1-100的整数，m+n表示2-200的整数]。作为在化合物(III)中的烷基和烯基，可以列举例如前述的支链或分链的碳原子数为6-30的烷基，前述的支链或分链的碳原子数为6-30的烯基，优选碳原子数为8-24的烷基或烯基，更优选碳原子数为10-18的烷基或烯基。
作为聚环氧乙烷烷基胺或聚环氧乙烷烯基胺的具体实例(制品)，可以列举，例如Nymeen L201(氧乙烯月桂胺；日本油脂公司制)，NymeenL207(聚氧乙烯月桂胺；日本油脂公司制)，Nymeen S204，NymeenS210(聚氧乙烯十八烷胺；日本油脂公司制)，Pionin OD420(聚氧乙烯十八烷胺；日本乳化剂公司制)，Pionin D3104(聚氧乙烯月桂胺；竹本油脂公司制)，Pionin D3110(聚氧乙烯月桂胺；竹本油脂公司制)，Pionin D3605(聚氧乙烯烷基(大豆)胺；竹本油脂公司制)，Pionin D3615T(聚氧乙烯烷基(牛脂)胺；竹本油脂公司制)，BLAVNON O209(聚氧乙烯油烯氨基醚；青木油脂公司制)，BLAVNON L205(聚氧乙烯月桂胺酯；青木油脂公司制)等。
聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的氧化乙烯链的聚合度优选为1-100，更优选1-60。在本发明中，还可以使用两种以上的聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺。作为聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺的浓度，如果是可以测定本发明的HDL胆固醇的浓度，就没有特别的限制，但是优选反应液中的浓度为0.0001-1％，更优选0.001-0.1％。
作为可以在本发明的HDL胆固醇的检测方法中使用的水性介质，可以列举，例如脱离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举，例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。
作为Good’s缓冲剂，可以列举，例如2-吗啉乙磺酸(MES)、二(2-羟基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基甲磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N，N-二(2-羟甲基)-2-氨基甲磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基甲磺酸(TES)、2-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N，N-二(2-羟甲基)氨]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-二(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N’-二(2-羟甲基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基甲磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度如果是适于测定的浓度，则没有特别的限制，优选0.001-2.0mol/L，更优选0.005-1.0mol/L。
以下，对本发明的HDL胆固醇的测定方法，测定用试剂和测定用 试剂盒进行具体说明。
(HDL胆固醇的测定方法)
作为本发明的HDL胆固醇的测定方法，可以列举例如如下方式的方法。
测定方法
(1)在含有化合物(I)或化合物(II)和聚阴离子，根据需要含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少-种物质的水性介质中使试样与胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶反应，使之生成过氧化氢或还原型辅酶，
(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶，
(3)通过根据由(2)测定的值和预先制作的标准曲线，计算试样中的HDL胆固醇浓度，可以测定试样中的HDL胆固醇。
在本测定方法中，(1)的反应在例如10-50℃，优选20-40℃，进行1-60分钟，优选进行2-30分钟。
生成的过氧化氢的量，也可以用例如直接过氧化氢电极，但是也可以通过过氧化氢测定用试剂进行测定。过氧化氢测度用试剂是用于将生成的过氧化氢的物质转换成可以检测的物质的试剂。作为可以检测的物质，可以列举，例如色素，发光等，优选色素。在可以检测的物质为色素时，过氧化氢测定用试剂含有氧化发色型发色体和过氧化酶等过氧化活性物质。作为氧化发色型发色体，可以列举例如后述的氧化发色型发色体。在可以检测的物质为发光时，过氧化氢测定用试剂含有化学发光物质。作为化学发光物质，可以列举，例如鲁米诺，异鲁米诺，光泽精(Lucigenin)，吖啶酯等。
作为过氧化氢测定用试剂，在使用含有氧化发色型发色体和过氧化酶等过氧化活性物质的试剂时，通过在过氧化活性物质的存在下与氧化发色型发色体反应生成过氧化氢，定量生成的色素，可以定量过氧化氢。而且，在使用含有化学发光物质的过氧化氢测度用试剂时，过氧化氢通过与化学发光物质反应生成光子(photon)，通过定量生 成的光子，可以定量过氧化氢。
作为氧化发色型发色体，可以列举，例如白色型发色体，氧化偶合发色型发色体等。
白色型发色体，是在过氧化氢和过氧化酶等过氧化活性物质的存在下，单独转换成色素的物质。具体可以列举10-N-羧甲基氨基甲酰-3，7-二(二甲胺)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基代氨基甲酰基-3，7-二(二甲胺)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基碳酰)-4，4’-二(二甲胺)二苯胺钠盐(DA-64)、4，4’-二(二甲胺)二苯胺、二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合发色型发色体是在过氧化氢和过氧化酶等过氧化活性物质的存在下，通过氧化偶合两种化合物而生成色素的物质。
作为两种化合物的组合，可以列举偶合剂和苯胺类的组合，偶合剂和酚类的组合等。作为偶合剂，可以列举例如4-氨酰安替比林(4-AA)，3-甲基-2-噻唑啉酮肼等。作为苯胺类，可以列举N-(3-磺丙基)苯胺、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-甲基苯胺(MAOS)、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-甲基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-甲基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧苯胺、N-甲基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-甲基-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-甲基-N-(3-磺丙基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-甲基-N-(3-磺丙基)-N’-乙酰乙二胺、N-甲基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟代-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。作为酚类，可以例举有苯酚，4-氯酚、3-甲基苯酚-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
在过氧化氢的测定中，过氧化活性物质的浓度如果是适于测定的浓度，则没有特别的限定，但是使用过氧化酶作为过氧化活性物质时，优选1-100kU/L。而且，氧化发色型发色体的浓度如果是适于测定的 浓度，则没有特别的限定，优选0.01-10g/L。
作为还原型辅酶的测定方法，可以列举，例如测定生成的还原型辅酶的吸光度的方法，使用还原型辅酶测定用试剂的方法等。作为测定还原型辅酶的吸光度的方法中的吸光度，优选300-500nm，更优选330-400nm，尤为优选340nm附近。还原型辅酶测定用试剂是用于将生成的还原型辅酶转换成可以检测的物质的试剂。作为可以检测的物质，可以列举，例如色素等。作为可以检测的物质为色素时的还原型辅酶测定用试剂，可以列举，例如含有黄递酶，电子载体(electroncarrier)和还原型发色型发色体的试剂。作为电子载体，可以列举，例如1-甲氧基-5-吩嗪
Figure 2006800142148_0
(methylphenazium)硫酸甲酯(methylsulfate)等。作为还原型辅酶测定用试剂，在使用含有黄递酶，电子载体和还原型发色型发色体的试剂时，通过定量通过还原发色型发色体转化所生成的色素，可以定量还原型辅酶。
作为还原发色型发色体，可以列举，例如3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝化苯基)-5-(2，4-二碘苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二碘苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-3)等。
(HDL胆固醇测定用试剂)
本发明的HDL胆固醇测定用试剂含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚阴离子，胆甾醇酯水解酶，胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂，根据需要，还含有选自于白蛋白，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
作为测定用试剂，优选含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，选自聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质，聚阴离子，胆甾醇酯水解酶，胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂，和含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚阴离子，白蛋白，胆甾醇酯水解酶，胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
而且，作为这种测定用试剂，特别优选含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，选自聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质，聚阴离子，白蛋白，胆甾醇酯水解酶，胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
本发明的HDL胆固醇测定用试剂含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚阴离子，胆甾醇酯水解酶，胆固醇氧化酶，根据需要，还含有选自于还原型辅酶测定用试剂，白蛋白，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
作为这种测定用试剂，优选含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质，聚阴离子，胆甾醇酯水解酶，胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂，和含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚阴离子，白蛋白，胆甾醇酯水解酶，胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
而且，作为这种测定用试剂，特别优选含有选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质，聚阴离子，白蛋白，胆甾醇酯水解酶，胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂，可以例举例如以下方式的试剂，但其并不对本发明的范围有任何限定。而且，方便起见，以下将选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质称为“化合物A”，将选自于白蛋白，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺的至少一种物质称为“化合物B”。在本发明的测定用试剂中，可以使用1种或多种化合物A，可以使用1种或多种化合物B。
试剂1
含有化合物A、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
试剂2
含有化合物A、聚阴离子、化合物B、胆甾醇酯水解酶、胆固醇 氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
试剂3
含有化合物A、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂4
含有化合物A、聚阴离子、化合物B、胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂5
含有化合物A、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
试剂6
含有化合物A、聚阴离子、化合物B、胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
(HDL胆固醇测定用试剂盒)
本发明的HDL胆固醇测定用试剂可以以试剂盒形式保存，流通和使用。作为试剂盒的形式，没有特别的限制，可以是双试剂系列，三试剂系列等中的任意一种，但是优选双试剂系列。
在由第一试剂和第二试剂构成的双试剂系列的HDL胆固醇测定用试剂盒中，第一试剂和第二试剂中可分别含有，也可以在第二试剂一者中含有胆甾醇酯水解酶以及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。在第一试剂和第二试剂中分别含有时，优选在第一试剂中含有胆甾醇酯水解酶，在第二试剂中含有胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶。可以在使用胆固醇脱氢酶的测定方法中使用的氧化型辅酶可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中。
选自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一种物质可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中，但优选包含于第一试剂中。聚阴离子可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中，但优选包含于第一试剂中。
选自于白蛋白，聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺的至少一 种物质(化合物B)可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中。
过氧化氢测定用试剂可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中，但当该试剂含有氧化偶合型发色体时，优选各个试剂中含有氧化偶合型发色体的各种化合物的形态，即，优选过氧化氢测定用试剂包含于第一试剂和第二试剂两者中。还原型辅酶测定用试剂可以包含于第一试剂、第二试剂中的任一者中或包含于两者中，但优选包含于第一试剂、第二试剂两者中。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂盒，可以列举例如以下方式的试剂盒，但其并不对本发明有任何限定。
试剂盒1
第一试剂
化合物A、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
试剂盒2
第一试剂
化合物A、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
试剂盒3
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
试剂盒4
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
试剂盒5
第一试剂
化合物A、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
化合物B、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
试剂盒6
第一试剂
化合物A、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
化合物B、过氧化氢测定用试剂、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
试剂盒7
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
胆固醇脱氢酶
试剂盒8
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
试剂盒9
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
胆固醇脱氢酶
试剂盒10
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
试剂盒11
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
化合物B、胆固醇脱氢酶
试剂盒12
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
化合物B、胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
试剂盒13
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
胆固醇脱氢酶
试剂盒14
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
试剂盒15
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
试剂盒16
第一试剂
化合物A、化合物B、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
还原型辅酶测定用试剂、胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
试剂盒17
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆甾醇酯水解酶
第二试剂
化合物B、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
试剂盒18
第一试剂
化合物A、聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
化合物B、还原型辅酶测定用试剂、胆甾醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
在本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中，可以使用在前述的本发明的HDL胆固醇测定方法中列举的化合物(I)、化合物(II)、聚阴离子、白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺、聚环氧乙烷烯基胺、胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶、过氧化氢测定用试剂、还原型辅酶测定用试剂。
在本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中，根据需要还可以含有水性介质、稳定剂、防腐剂、影响物质消除剂、反应促进剂等。作为水性介质，可以列举，例如前述的水性介质等。作为稳定剂，可以列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)，蔗糖，氯化钙等。作为防腐剂，可以列举， 例如叠氮钠、抗生素等。作为影响物质消除剂，可以列举，例如用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸盐氧化酶等。作为反应促进剂，可以列举，例如共脂肪酶，磷脂酶等酶，硫酸钠，氯化钙等盐类等。
本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒可以以冷冻干燥的状态存在，也可以以溶解于水性介质中的状态存在。在使用冷冻干燥状态的试剂测定试样中的HDL胆固醇时，将该试剂溶解于水性介质中再使用。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中的胆甾醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶的含量，溶解于水性介质中的状态的浓度优选达到0.01-1200U/mL的含量，更优选达到0.02-600U/mL的含量。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中的化合物(I)或化合物(II)的含量，优选为溶解于水性介质中的状态的浓度达到0.0001-3％的含量，更有效达到0.001-0.3％的含量。作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中的聚阴离子的含量，优选为溶解于水性介质中的状态的浓度达到0.001-30％的含量，更优选达到0.01-3％的含量。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中的白蛋白的含量，优选为溶解于水性介质中的状态的浓度达到0.001-3％的含量，更优选达到0.01-0.3％的含量。
作为本发明的HDL胆固醇测定用试剂和试剂盒中的聚环氧乙烷烷基胺或聚环氧乙烷烯基胺的含量，优选为溶解于水性介质中的状态的浓度达到0.0001-3％的含量，更优选达到0.0001-0.3％的含量。
以下，通过实施例对本发明进行详细的说明，但其对本发明的范围不作任何限定。而且，在本实施例中，使用了下述标记的试剂和酶。
HEPES(BDH实验室公司制)，EMSE(DAITO CHEMIX公司制)，硫酸钠(关东化学公司制)，胺BB(十二碳胺，日本油脂公司制)，叔胺BB(十二烷基二甲胺，日本油脂公司制)，阳离子BB(十二烷基三甲基氯化铵)，葡聚糖硫酸钠(分子量50万)(Pharmacia公司制)，牛血清白蛋白(BSA；ProLiant公司制)，4-氨酰安替比林(埼京化成社制)，过氧 化物酶(东洋纺织社制)，43kDa酯酶(胆甾醇酯水解酶；天野酶公司制)，CHOPE(胆固醇氧化酶，Kikkoman公司制)，BLAUNON L205(聚氧乙烯月桂胺酯；青木油脂公司制)。
实施例1
制备了由以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)
HEPES(pH7.5)     10mmol/L
EMSE             0.3g/L
硫酸钠           5.0g/L
胺BB             0.1g/L
葡聚糖硫酸钠     1.0g/L
第二试剂(试剂a)
HEPES(pH 7.0)    10mmol/L
4-氨酰安替比林   0.3g/L
过氧化酶         20kU/L
43kDa酯酶        100kU/L
CHOPE            1.2kU/L
实施例2
制备了由以下的第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)
HEPES(pH7.5)    10mmol/L
EMSE            0.3g/L
硫酸钠          5.0g/L
叔胺BB          0.03g/L
葡聚糖硫酸钠    1.0g/L
第二试剂(试剂a)
HEPES(pH7.0)      10mmol/L
4-氨酰安替比林    0.3g/L
过氧化酶          20kU/L
43kDa酯酶         100kU/L
CHOPE             1.2kU/L
实施例3
制备了由以下的第一试剂(试剂C)和第二试剂(试剂a)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂C)
HEPES(pH7.5)      10mmol/L
EMSE              0.3g/L
硫酸钠            5.0g/L
阳离子BB          0.14g/L
葡聚糖硫酸钠      1.0g/L
第二试剂(试剂a)
HEPES(pH7.0)      10mmol/L
4-氨酰安替比林    0.3g/L
过氧化酶          20kU/L
43kDa酯酶         100kU/L
CHOPE             1.2kU/L
实施例4
制备了由以下的第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂a)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)
HEPES(pH7.5)      10mmol/L
EMSE              0.3g/L
硫酸钠            5.0g/L
阳离子BB          0.14g/L
葡聚糖硫酸钠      1.0g/L
BSA               2.0g/L
第二试剂(试剂a)
HEPES(pH7.0)      10mmol/L
4-氨酰安替比林    0.3g/L
过氧化酶          20kU/L
4 3kDa酯酶        100kU/L
CHOPE             1.2kU/L
实施例5
制备了由以下的第一试剂(试剂C)和第二试剂(试剂b)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂C)
HEPES(pH7.5)      10mmol/L
EMSE              0.3g/L
硫酸钠            5.0g/L
阳离子BB          0.14g/L
葡聚糖硫酸钠      1.0g/L
第二试剂(试剂b)
HEPES(pH7.0)      10mmol/L
4-氨酰安替比林    0.3g/L
过氧化酶          20kU/L
43kDa酯酶         100kU/L
CHOPE             1.2kU/L
BLAUNON L205      0.16g/L
实施例6
制备了由以下的第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂b)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)
HEPES(pH7.5)     10mmol/L
EMSE             0.3g/L
硫酸钠             5.0g/L
阳离子BB           0.14g/L
葡聚糖硫酸钠       1.0g/L
BSA                2.0g/L
第二试剂(试剂b)
HEPES(pH7.0)       10mmol/L
4-氨酰安替比林     0.3g/L
过氧化酶           20kU/L
43kDa酯酶          100kU/L
CHOPE              1.2kU/L
BLAUNON L205       0.16g/L
比较例1
制备了由以下的第一试剂(试剂E)和第二试剂(试剂a)构成的HDL胆固醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂E)
HEPES(pH7.5)       10mmol/L
EMSE               0.3g/L
硫酸钠             5.0g/L
葡聚糖硫酸钠       1.0g/L
第二试剂(试剂a)
HEPES(pH7.0)       10mmol/L
4-氨酰安替比林     0.3g/L
过氧化酶           20kU/L
43kDa酯酶          100kU/L
CHOPE              1.2kU/L
实施例7
使用实施例1的试剂盒，测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
(1)标准曲线的制作
使用生理盐水(HDL胆固醇浓度：0.0mg/dL)和血清(HDL胆固醇浓 度：80.0mg/dL)作为标准液，使用实施例1的试剂盒，通过日立7170S型自动分析装置，制成表示HDL胆固醇浓度与“吸光度”的关系的标准曲线。
这里所谓“吸光度”表示基于通过以下反应测定的两个吸光度(E1和E2)，由E2减去E1获得的值。
向反应器中添加标准液(2μL)和第一试剂(0.15mL)，于37℃加热5分钟，在主波长600nm，副波长700nm测定反应液的吸光度(E1)，接着，在该反应液中添加第二试剂(0.05mL)，再于37℃加热5分钟，于主波长600nm，副波长700nm测定反应液的吸光度(E2)。
(2)通过人血清试样与实施例1的试剂盒的反应计算该试样中的“吸光度”
除了使用人血清试样代替(1)的标准曲线的制备中使用的标准液之外，其余均与(1)的吸光度的计算方法相同的方法，计算该试样中的“吸光度”。
(3)人血清试样中的HDL胆固醇浓度的测定
根据由(2)计算出的“吸光度”和由(1)制备的标准曲线，测定各试样中的HDL胆固醇浓度。
实施例8
除了使用实施例2的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
实施例9
除了使用实施例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
实施例10
除了使用实施例4的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
实施例11
除了使用实施例5的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
实施例12
除了使用实施例6的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
比较例2
除了使用比较例1的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例7的测定法相同，用日立7170型自动分析装置测定人血清30试样中的HDL胆固醇。
接着，使用在实施例7-12和比较例2的测定中使用的人血清30试样，通过记载于Clinical Chemistry第45卷，No.10(1999)的DCM法(Designated Comparison Method)测定该试样中的HDL胆固醇，比较各实施例和比较例中的测定值。各实施例和比较例的各个测定与通过DCM法进行的测定的相关系数示于表1。
表1
    测定法             测定试剂盒     相关系数
    第一试剂     第二试剂
    比较例2             比较例1     0.191
    试剂E     试剂a
    实施例7             实施例1     0.792
    试剂A     试剂a
    实施例8             实施例2     0.892
    试剂B     试剂a
    实施例9             实施例3     0.826
    试剂C     试剂a
    实施例10             实施例4     0.973
    试剂D     试剂a
    实施例11             实施例5     0.900
    试剂C     试剂b
    实施例12             实施例6     0.991
    试剂D     试剂b
根据表1的比较例2与实施例7-12的比较，在使用含有化合物(I)或化合物(II)和聚阴离子的试剂盒的测定中，清楚了与DCM之间良好的相关关系。而且，根据实施例9与实施例10-12之间的比较，清楚了由于使化合物(I)或化合物(II)和聚阴离子之外与白蛋白或聚环氧乙烷烷基胺共存，与DCM之间的相关系数进一步提高。
产业上利用的可能性
根据本发明，可以提供对于动脉硬化等疾病的诊断有用的HDL胆固醇的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。

Claims (13)

1.试样中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使i)胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶，在含有选自于十二烷基三甲基氯化铵、十二碳胺和十二烷基二甲胺中的至少一种物质、以及聚阴离子的水性介质中与试样反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。
2.根据权利要求1记载的方法，其中，水性介质还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
3.根据权利要求1或2记载的方法，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
4.高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于其含有选自于十二烷基三甲基氯化铵、十二碳胺和十二烷基二甲胺中的至少一种物质、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶和胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂。
5.高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于含有选自于十二烷基三甲基氯化铵、十二碳胺和十二烷基二甲胺中的至少一种物质、聚阴离子、胆甾醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶。
6.根据权利要求5记载的试剂，其中还含有还原型辅酶测定用试剂。
7.根据权利要求4-6任一项记载的试剂，其中还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
8.根据权利要求4-7任一项记载的试剂，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
9.高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，其特征在于在第一试剂中含有选自于十二烷基三甲基氯化铵、十二碳胺和十二烷基二甲胺中的至少一种物质和聚阴离子，第二试剂中含有胆固醇氧化酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中含有过氧化氢测定用试剂，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中含有胆甾醇酯水解酶。
10.高密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，其特征在于在第一试剂中含有选自于十二烷基三甲基氯化铵、十二碳胺和十二烷基二甲胺中的至少一种物质和聚阴离子，第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中含有氧化型辅酶，第一试剂、第二试剂中的任一种或二者中含有胆甾醇酯水解酶。
11.根据权利要求10记载的试剂盒，其中，第一试剂、第二试剂中的任一种或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
12.根据权利要求9-11任一项中记载的试剂盒，其中，第一试剂、第二试剂中的任一种或两者中还含有选自于白蛋白、聚环氧乙烷烷基胺和聚环氧乙烷烯基胺中的至少一种物质。
13.根据权利要求9-12任一项中记载的试剂盒，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。
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