JPH09285298A - Ｈｄｌ−コレステロールの測定方法及び測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清または血漿試料中の高密度リポ蛋白（Ｈ
ＤＬ）−コレステロールを、遠心操作を行うことなく、
簡便な操作で測定が可能な方法を提供する。 【解決手段】 少なくともコレステロールエステラーゼ
とコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデ
ヒドロゲナーゼを作用させて試料中の高密度リポ蛋白
（ＨＤＬ）−コレステロールを測定する方法において、
試料由来のアルブミンとは別異にアルブミンを添加・存
在させて前記酵素反応を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は高密度リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）−コレステロールの測定方法およびＨＤＬ−コレス
テロールの測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血漿又は血清中の各リピドフラクション
中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動
脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要
視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂
質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用
した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、
超低密度リポプロテイン（Very low density lipoprote
in；以下ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン
（Low density lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、
及び高密度リポプロテイン（High density lipoprotei
n；以下ＨＤＬともいう）の４種類に分別されている。
各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質に
大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル
型コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質から構
成されている。このため、コレステロールの測定は遊離
型とエステル型の両者について行われている。

【０００３】日常的な臨床検査では、自動分析装置を使
用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行わ
れているが、ＨＤＬ−コレステロールの測定について
は、試料の前処理（分画・分離操作）を行うことが必要
なため、酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が
遅れていた。この試料の前処理としては、種々の沈殿法
が行われており、例えばリンタングステン酸とマグネシ
ウムイオン、デキストラン硫酸とマグネシウムイオン、
ヘパリンとカルシウムイオンあるいはマンガンイオン
（M. Burstein and H. R. Scholnick; Adv. Lipid Re
s., 11, 67, 1973, G.R. Warnick et al.; Clin. Che
m., 25, 596, 1979）、又はポリエチレングリコールを
添加してＬＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み
液を被検試料とする方法が繁用されている。詳細には、
沈殿剤としてリンタングステン酸とマグネシウムイオン
を使った場合、これらを含有する溶液に試料（血清や血
漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性
の複合体とする。これを遠心分離することによって沈殿
を除き、ＨＤＬを含む上清を回収する。分画されたＨＤ
Ｌは総コレステロール測定用の酵素試薬で自動分析シス
テムによる測定が可能となる。また、免疫法（C-C. Heu
ck, et al. Clin. Chem.31, 252, 1985）においても沈
殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ（ＨＤＬには含まれな
い）に対する抗体を試料（血清や血漿）に加え、ＨＤＬ
以外のリピドフラクショを沈殿させる。以下同様に分画
した後、はじめて上清中のＨＤＬ−コレステロールの測
定を行うことができる。このように、従来の方法ではい
ずれも多くの工程と時間を要するという欠点があった。

【０００４】最近、これら分画操作を必要としない測定
法について報告が出されている（例えば、特公平６−１
６７２０号、特公平７−３４７６０号、特開昭５８−１
６５８００号各公報、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９５／
００３７８）。すなわち、従来より主に用いられている
総コレステロール測定のための酵素法としては、コレス
テロールエステラーゼによりコレステロールエステルを
加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロール
をコレステロールオキシダーゼにより、溶存酸素を使っ
て酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適当な
被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応により
発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレステ
ロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費される溶
存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られていた。

【０００５】例えば、前記の各特許公報の記載によれ
ば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系の
ポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在はコレス
テロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界
面活性剤なしには活性を発現しないとされている。そし
て、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩に
は、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリ
ポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのみ
を溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反
応に関与させる効果があるため、ＨＤＬ−コレステロー
ルの測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の
界面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に有される
コレステロールと酵素とを反応させることによってＨＤ
Ｌ−コレステロールを特異的に分別測定する方法が記載
されている。また、特公平７−３４７６０号公報には、
前記と同様の系において、更に、使用する酵素を膵臓由
来のコレステロールエステラーゼとし、抗ＬＤＬ抗体を
反応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの
主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記
抗体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当
該酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラク
ションに対する特異性を上げる工夫を行っている。

【０００６】また、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９５／０
０３７８は高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）以外のリポ蛋白を
凝集させる試薬の存在下、ＨＤＬを含有する試料に化学
修飾されたコレステロールエステラーゼ、化学修飾され
たコレステロールオキシダーゼまたは化学修飾されたコ
レステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する過
酸化水素または還元型補酵素を定量するすることを特徴
とするＨＤＬ中のコレステロールの定量法が記載されて
いる。

【０００７】また、Ｈ．Ｓｕｇｉｕｃｈｉらは国際出願
番号ＰＣＴ／ＪＰ９５／００３７８を応用し自動分析機
へ適応した新しい方法について報告している（Clin. Ch
em.,41, 717, 1995）。すなわち、使用する当該酵素
（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオ
キシダーゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化
学修飾して高分子化した酵素を用いるものである。更
に、前記の高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラシ
ョンと親和性があるとされるシクロデキストリン誘導体
（具体的には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存
させることでＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して
複合体を形成させることができることが記載されてい
る。この複合体は、前記高分子化酵素による反応を受け
にくいためＨＤＬフラクションを特異的に測定すること
ができる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述の従来方
法では、試薬へ新たに抗体を添加したり、反応時間が２
０分以上かかるなど、製造コストや測定操作上、日常使
われている自動分析機への対応が不十分であったり、化
学修飾した酵素を利用するには、酵素の修飾という新た
な工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の
程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵
素の安定性の維持等、新たな問題点を付随することにな
る。また、界面活性剤のみの使用による分別では不完全
さが否めない。本発明者等は、現在の臨床検査試験で
は、迅速で簡便な手段である自動分析装置による測定が
主流である点を鑑み、従来のＨＤＬ−コレステロールの
測定方法及び測定用試薬において、試料（血清又は血
漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、且つ高精
度の測定結果が得られる方法の開発を目的として、鋭意
研究を重ねた結果本発明を完成させた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、少な
くともコレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを作
用させて試料中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）−コレステ
ロールを測定する方法において、試料由来のアルブミン
とは別異にアルブミンを添加・存在させて前記酵素反応
を行うことを特徴とするＨＤＬ−コレステロールの測定
方法、に関する。更に、本発明は、少なくともコレステ
ロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまた
はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させて試料中
の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）−コレステロールを測定す
るための試薬において、更にアルブミンを共存させるこ
とを特徴とするＨＤＬ−コレステロールの測定用試薬、
にも関する。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明の特徴は、従来のＨＤＬ−コレステ
ロールの測定方法において、血清や血漿等の生体液試料
に由来するアルブミンとは別に、人為的にアルブミンを
反応系に存在させると、ＨＤＬ−コレステロールの測定
方法において使用する酵素（コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロール
デヒドロゲナーゼ）とリピドフラクション含有コレステ
ロールとの反応に関して、アルブミンがＨＤＬ−コレス
テロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬＤ
Ｌフラクションのコレステロールとの反応を阻害すると
いう新知見を基本とする。

【００１１】本発明において、試料としては、特に哺乳
動物（特にヒト）の生体液であり、具体的には血清又は
血漿をそのまま用いることができる。本発明において
は、前記の生体試料をコレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼと接触させる際に、試料由来のアルブミン
とは別に人為的にアルブミンを存在させることで、前記
酵素とＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロー
ルとの反応を阻害させた後、係るＨＤＬ−コレステロー
ル測定の反応を実施すれば良い。

【００１２】以下の記述において、「ＨＤＬ以外のリポ
蛋白を凝集させる」とは、ＨＤＬ以外のリポ蛋白と凝集
試薬が会合状態を呈し、該リポ蛋白と酵素との反応が阻
害される状態をいう。ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させ
てＨＤＬ−コレステロールを測定する反応系、具体的に
は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白であるＬＤＬ、ＶＬＤＬおよ
びカイロミクロンを凝集させる凝集試薬、すなわちポリ
アニオンと２価の金属塩からなる凝集試薬、具体的に
は、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリ
コール、へパリンまたはその塩、リンタングステン酸ま
たはその塩もしくはこれらの組み合わせ及び２価の金属
塩からなる公知の凝集試薬を用いるＨＤＬ−コレステロ
ールの測定に本発明方法を適用する場合、試料とコレス
テロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ
またはコレステロールデヒドロゲナーゼと接触させる際
に、アルブミンを共存させておく。あるいは、試料とコ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと接触させ
る際、予めアルブミンを共存させておき、ＬＤＬ及びＶ
ＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害
し、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションの反応を完全に停
止することが可能となり、精度良くＨＤＬフラクション
のコレステロールだけを選択的に測定することができ
る。

【００１３】アルブミンは、本来血清（血漿）にも含ま
れているため、本反応系には試料由来のアルブミンが微
量存在する。しかし、ＨＤＬ以外のリポ蛋白とコレステ
ロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼま
たはコレステロールデヒドロゲナーゼの反応を阻害する
ためには、試料由来のアルブミンでは不充分であること
は以下の実施例で確認されている。反応系におけるアル
ブミン量は、０．０１〜２０．０重量％、好ましくは
０．１〜２０．０重量％、より好ましくは０．５〜１
０．０重量％のアルブミンを存在させておくことが必須
であり、この範囲内にコントロールするために試料由来
のアルブミンとは別異にアルブミンを添加することが必
要となる。

【００１４】ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬ
−コレステロールを測定する反応系の場合、遠心分離等
の操作を行わずに、アルブミン、ポリアニオン、２価の
金属塩、非イオン性界面活性剤と試料を接触させること
により、被検試料中のＬＤＬ−コレステロール及びＶＬ
ＤＬ−コレステロールと酵素とは反応しないが、ＨＤＬ
−コレステロールと酵素と反応するようになる。次いで
コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを作用さ
せ、ＨＤＬ−コレステロールのみと前記各酵素との酵素
反応により消費される物質（例えば、補酵素）又は生成
される物質（例えば、過酸化水素）を、公知の手段によ
り検出し、ＨＤＬ−コレステロールを定量することがで
きる。例えば、過酸化水素を検出する場合には、適当な
被酸化性発色剤とペルオキシダーゼの存在下に生成する
過酸化水素を発色させて、分光学的に比色測定すれば良
い。また、コレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場
合、ＮＡＤ（Ｐ）から生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを例えば
波長３４０ｎｍで分光学的にモニターすることで検出す
ることができる。

【００１５】過酸化水素は、公知の方法で、例えば、適
当な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応
により発色させることができる。被酸化性発色剤として
は、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾ
イックアシド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、自動分析装置に
よる測定では、波長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する
場合）付近、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場
合）付近における吸光度を測定すればよい。

【００１６】次に、従来のＨＤＬ−コレステロール測定
用試薬にアルブミンを共存させた試薬について説明す
る。原則としてコレステロールエステラーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼを作用させてＨＤＬ−コレステロールを測定する試
薬であれば本発明は適用可能である。具体的には、例え
ばＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬ−コレステ
ロールを測定する試薬においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋
白を凝集させる凝集試薬、すなわちポリアニオンと２価
の金属塩からなる凝集試薬、具体的には、デキストラン
硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、へパリン
またはその塩、リンタングステン酸またはその塩もしく
はこれらの組み合わせ及び２価の金属塩からなる凝集試
薬、更に非イオン性界面活性剤、コレステロールエステ
ラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ、酵素反応によって消費される物
質（例えば、補酵素）又は生成される物質（例えば、過
酸化水素）を検出するための組成物に、アルブミンを存
在させたものであれば良い。

【００１７】アルブミンとしては、反応系に０．０１〜
２０．０重量％、好ましくは０．１〜２０．０重量％、
より好ましくは０．５〜１０．０重量％となるように試
薬中に含有させる。アルブミン濃度が０．０１重量％よ
り少ないと阻害効果が不十分であり、１０．０重量％を
越えると試薬の粘度が高くなり、測定の再現性の悪化を
招くという問題点が生じる。また、アルブミンの由来は
特に限定されず、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ等の哺乳動
物由来のほか遺伝子工学的に産生されたものでも使用で
きる。上記試薬の場合、アルブミンと併用するポリアニ
オンとしては、硫酸化多糖類が好ましく、特にデキスト
ラン硫酸がＨＤＬ以外のリポ蛋白と酵素との反応を効果
的に阻害するため、デキストラン硫酸を使用することが
好ましい。デキストラン硫酸としては、反応系に１μＭ
〜５００μＭ、好ましくは５．０μＭ〜１００μＭの分
子量１００００〜５０００００のデキストラン硫酸また
はその塩、あるいは１０μＭ〜５ｍＭ、好ましくは５０
μＭ〜１ｍＭの分子量１０００〜１００００のデキスト
ラン硫酸またはその塩となるように試薬中に含有させ
る。デキストラン硫酸濃度が下限より少ないと阻害効果
が不十分であり、上限を越えると酵素の阻害による反応
性低下という問題点が生じる。２価の金属塩としてはマ
グネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩であり、塩と
しては、水溶性無機塩、例えば、ハロゲン化物（例え
ば、塩化物、臭化物、又はヨウ化物）又は硫酸化物、あ
るいは、水溶性有機塩、例えば、酢酸塩又はクエン酸塩
として用いることができる。２価の金属としては、反応
系に１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの濃度と
なるように試薬中に含有させる。２価の金属塩の濃度が
下限より少ないと阻害効果が不十分であり、上限を越え
ると保存による金属の塩析や酵素の阻害による反応性低
下という問題点が生じる。

【００１８】非イオン性界面活性剤としては、公知の非
イオン性界面活性剤全般を使用することができるが、上
記試薬の場合、アルブミンと併用する非イオン性界面活
性剤としては特にｎ−オクチル−β−グルコシド、ｎ−
オクチル−β−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β−チ
オグルコシドがＨＤＬ以外のリポ蛋白と酵素との反応を
好適に阻害するため、これらから選択される１種以上の
ものを使用することが好ましい。その反応系における濃
度がｎ−オクチル−β−グルコシドの場合、０．０１〜
２．０％、好ましくは０．１〜１．０％となるように試
薬中に含ませる。ｎ−オクチル−β−チオグルコシドの
場合、０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．
５％で用いる。ｎ−ヘプチル−β−チオグルコシドの場
合、０．０１〜２．０％、好ましくは０．１〜１．０％
で用いる。あるいは、これらを前記濃度範囲内で混合し
て使用しても良い。前記非イオン性界面活性剤の濃度が
下限より少ないと酵素との反応が不十分となり、上限を
越えるとＨＤＬ−コレステロールに対する阻害効果が低
下するという問題点が生じる。

【００１９】コレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼ等の酵素としては、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、
又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることがで
きる。酵素の由来も限定されず、コレステロールエステ
ラーゼとしては、例えば、シュードモナス属の微生物
や、牛又は豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼ
を用いることができる。また、コレステロールオキシダ
ーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカ
ルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼ
を用いることができる。コレステロールデヒドロゲナー
ゼについても同様であり、例えば、微生物由来のものを
使用することができる。それらの酵素の添加量も特に限
定されないが、例えば、０．１ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍ
ｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍｌ〜１０ｕ／ｍｌであ
る。

【００２０】コレステロールエステラーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナー
ゼを作用させ、ＨＤＬ−コレステロールのみと前記各酵
素との酵素反応により消費される物質（例えば、補酵
素）又は生成される物質（例えば、過酸化水素）を検出
するには、公知の組成物を用いれば良い。例えば、過酸
化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペ
ルオキシダーゼの存在下に生成する過酸化水素を発色さ
せて、分光学的に比色測定ができ、例えば、適当な被酸
化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発
色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−
ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックア
シド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリ
ン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは
０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは
０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させること
ができる。

【００２１】本発明のＨＤＬ−コレステロール測定用試
薬は、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２
試薬系にすることができる。この場合、第一試薬にアル
ブミン、ポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸）、
２価金属塩、非イオン性界面活性剤を含有させ、第二試
薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオ
キシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを含
有させる。第一試薬及び第二試薬の緩衝剤としては、リ
ン酸緩衝液、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳなどのグ
ッド緩衝液、トリス緩衝液、イミダゾール緩衝液等を使
用することができる。緩衝液の濃度としては、１０〜１
０００ｍＭ、好ましくは２０〜５００ｍＭである。ま
た、それらの緩衝液のｐＨは、５．０〜９．０、好まし
くはＬＤＬのコレステロール及びＶＬＤＬのコレステロ
ールと酵素との阻害が良好なｐＨ６．０〜８．０の範囲
内で適宜選択することができる。

【００２２】２試薬系の本発明試薬を用いて、ＨＤＬ−
コレステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せ
ば以下のとおりである。 第一試薬（アルブミン、ポリアニオン、２価金属塩、非イオン性界面活性剤） ＋被検試料（血清／血漿） ↓ＬＤＬ，ＶＬＤＬと酵素の反応阻害化 第二試薬（酵素及び発色系構成成分含有） （コレステロールエステラーゼ反応） コレステロールエステル＋Ｈ₂ Ｏ→コレステロール＋脂肪酸 （１） （コレステロールオキシダーゼ反応） コレステロール＋Ｏ₂ →Δ４−コレステン−３−オン＋Ｈ₂Ｏ₂ （２） （ペルオキシダーゼ反応） Ｈ₂Ｏ₂＋被酸化性発色剤→酸化縮合物 （３） ↓ 吸光度測定

【００２３】自動分析装置による測定では、主に前記反
応式（２）で生成する過酸化水素を比色法によって測定
するが、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾
紙試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）
でも同様に用いることができる。また、過酸化水素は、
フェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターと
ペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、生
成する酸化電位差を電気化学的に測定することもでき
る。他方、酵素反応により消費される物質、例えば、前
記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従来
公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもでき
る。また、酵素反応により生成される化合物としては、
前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（１）
の生成物である脂肪酸、あるいは前記反応式（２）の生
成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で
測定してもよい。

【００２４】

【作用】以下の説明に限定されるものではないが、本発
明においては、ＨＤＬ−コレステロールの測定方法にお
いて利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコ
レステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒド
ロゲナーゼ）とリピドフラクション含有コレステロール
との反応に際して、前記従来の凝集試薬として用いる化
合物が、直接にリピドフラクションのアポリポタンパク
質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピドフラクシ
ョンのコレステロールと酵素との反応時に酵素と相互作
用するものと考えられる。すなわち、各リピドフラクシ
ョンは、脂質とアポリポタンパク質とからなる脂質複合
体となっているが、その脂質構成比の違いとアポリポタ
ンパク質のタイプ（Ａ−１，Ａ−１，Ｂ−１００，Ｂ−
４８，Ｃ，Ｅなど）の差による物理化学的性質及び量的
（被検試料中に含まれる量）な違いによって識別され
る。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクシ
ョンとの間で最も大きく異なるアポリポタンパク質のタ
イプ（前者がＡ−１，Ａ−２、後者がＢ−１００，Ｃ，
Ｅ）の違いが明らかなため、従来、アポリポタンパク質
に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。この従来
法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体を試料に
混和し、免疫複合体を形成させることが特徴である。こ
の免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、次に酵素
を加えるとＨＤＬ−コレステロールのみが酵素と反応す
るので、ＨＤＬ−コレステロールのみを測定することが
できる。しかし、免疫複合体を形成することができる抗
体の反応性を一定に維持することは難しく、また免疫複
合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定のた
めの比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点があ
った。

【００２５】これに対し、本発明では、アルブミンの添
加によって前記従来の凝集試薬がアポリポタンパク質を
中心とする脂質複合体と相互に作用し、酵素の化学修飾
等も必要とせず、コレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼによる、各リピドフラクション
のコレステロールに対する反応性を特異的に変化させる
ことができ、しかも、本発明方法は、抗体とは異なり、
安定な化合物であり、さらに酵素の修飾に伴う新たな工
程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の程度
差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵素の
安定性の維持等、新たな問題点について考慮する必要が
ない。

【００２４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。 実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画 超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等
（動脈硬化、6, 39, 1978）の方法に準じて行った。具
体的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム
塩１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び
塩化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に
３種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の
比重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩
化ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製し
た。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比
重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。ま
た比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水
９７．５ｍｌに溶解して調製した。１０ｍｌ容量の遠心
管に上記の血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．
２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心
管を１０℃で５００００ｒｐｍ２０時間遠心した。遠心
処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリ
ピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に
比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の
比重液２ｍｌとを重層した。この遠心管を５００００ｒ
ｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収
した。各画分は生理的食塩水に一夜透析後（冷蔵下）、
冷蔵保存した。

【００２５】実施例２：反応阻害剤の検索例 表１に示す各ポリアニオンを含む水溶液０．６ｍｌと、
１００ｍＭの塩化マグネシウム、１．０％のｎ−ＯＴＧ
及び５ｍＭのＥＳＰＴを含む２５０ｍＭのビス−トリス
緩衝液（ｐＨ７．０）０．１５ｍｌ、試料として実施例
１で得られたリピドフラクションのうち、ＨＤＬの２０
μｌ、ＬＤＬの１０μｌ、ＶＬＤＬの１０μｌを各々混
合し、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭの４
−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのＰＯＤ、各５ｕ／ｍｌのＣＨ
Ｅ（シュードモナス由来）及びＣＨＯ（ノカルディヤ由
来）を含む５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．
０）０．２５ｍｌを混合攪拌し、３７℃で５分間反応さ
せた後、波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。ま
た、各ポリアニオン含有水溶液にアルブミンを表２に示
した濃度で添加したものを用い同様の操作を行った。別
に、ポリアニオン及びアルブミンを含まない精製水を用
いて、前記と同様の操作を行い吸光度を測定した。ポリ
アニオン及びアルブミンを含まない時の吸光度を１００
として、各ポリアニオン、各ポリアニオンにアルブミン
を添加したものを用いたときの吸光度の低下率を各脂質
フラクションに対する反応阻害率として求めた。結果を
表１、表２に示す。なお、各物質の略号は以下の意味で
ある。 ＤＳ：デキストラン硫酸 ＡＬＢ：血清アルブミン。 Ｐ：リンタングステン酸ナトリウム ＨＰ：へパリンナトリウム ＰＥＧ：ポリエチレングリコール ｎ−ＯＴＧ：ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド ＣＨＥ：コレステロールエステラーゼ ＣＨＯ：コレステロールオキシダーゼ ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ ＥＳＰＴ：Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トル
イジン

【００２６】

【表１】ポリアニオン 濃度 HDL阻害率 LDL阻害率 VLDL阻害率 ＤＳ 0.5mM 2% 64% 31% Ｐ 0.5mM 1% 28% 18% ＨＰ 50U/ml 1% 35% 24% ＰＥＧ 0.5mM 0% 5% 3%

【００２７】

【表２】ポリアニオン 濃度 アルブミン（％） HDL阻害率 LDL阻害率 VLDL阻害率 ＤＳ 0.5mM 2% 4% 97% 98% Ｐ 0.5mM 2% 2% 44% 64% ＨＰ 50U/ml 2% 3% 56% 34% ＰＥＧ 0.5mM 2% 1% 9% 7% ＤＳ 0.5mM 0.02% 2% 67% 45% ＤＳ 0.5mM 0.1% 2% 78% 57% ＤＳ 0.5mM 0.2% 2% 81% 68% ＤＳ 0.5mM 1% 2% 92% 90% ＤＳ 0.5mM 10% 5% 94% 95% ＨＰ 0.5mM 5% 4% 65% 57%

【００２８】表１、表２の結果より、ＨＤＬ以外のリポ
蛋白を凝集させてＨＤＬ−コレステロールを測定する反
応系において、一定量以上のＡＬＢの添加によってＬＤ
Ｌ及びＶＬＤＬを十分阻害していることがわかる。特に
ＡＬＢとＤＳとの組み合わせが効果的であった。これに
より、ＨＤＬフラクションのコレステロールを精度良く
正確に測定することができる。

【００２９】実施例３：反応経時変化 ０．５ｍＭのＤＳ、２．０％のＡＬＢ、２０ｍＭの塩化
マグネシウム、０．２％のｎ−ＯＴＧ及び１ｍＭのＥＳ
ＰＴを含む５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．
０）０．７５ｍｌに、試料として、血清１０μｌを加
え、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭの４−
ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのＰＯＤ、各５ｕ／ｍｌのＣＨＥ
及びＣＨＯを含む５０ｍＭのビス−トリス緩衝液（ｐＨ
７．０）０．２５ｍｌを添加し、３７℃で５分間加温し
た後の波長５４６ｎｍでの吸光度変化を測定した。血清
に換えてＨＤＬ−コレステロール標準品について同様の
操作を行い、血清中のＨＤＬ−コレステロール値を求め
た。また、ＡＬＢを除いたものを用いて同様の操作を行
い対照とした。他方、同じ検体についてゲルロ過カラム
による反応液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法、
Ｗ，Ｍａｒｚ等，Clin. Chem., 39, 2276, 1993）での
測定を実施し、その測定値と比較した。また、各測定法
での標準物質としては、予め超遠心法で分画したＨＤＬ
フラクションの総コレステロール値を酵素法で測定した
ものを用いた。血清１０例の測定値を表３に示す。

【００３０】

【表３】 検体 本法 対照法 ＨＰＬＣ法 血清１ ３８．２ ６０．５ ３７．８ 血清２ ４１．３ ５８．６ ４０．３ 血清３ ３６．２ ７５．６ ３６．２ 血清４ １６．５ ３０．１ １７．４ 血清５ ２９．２ ４２．３ ２８．５ 血清６ ２１．４ ５８．４ ２３．７ 血清７ ３２．６ ７５．１ ３２．４ 血清８ ２７．９ ３１．２ ２６．５ 血清９ ７０．１ １０９．９ ６８．９ 血清１０ ４３．７ ４６．２ ４１．６ 単位：ｍｇ／ｄｌ

【００３１】表３の通り、本発明方法は対照法と比較し
て、ＨＰＬＣ法との相関が良く、血清中のＨＤＬ−コレ
ステロールを正確に測定することができる。

【００３２】

【発明の効果】試料（血清又は血漿）の遠心操作を行う
ことなく、簡便な操作で、ＨＤＬ−コレステロールの高
精度な測定を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 風早 健司 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 土屋 ほずみ 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくともコレステロールエステラーゼ
   とコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデ
   ヒドロゲナーゼを作用させて試料中の高密度リポ蛋白
   （ＨＤＬ）−コレステロールを測定する方法において、
   試料由来のアルブミンとは別異にアルブミンを添加・存
   在させて前記酵素反応を行うことを特徴とするＨＤＬ−
   コレステロールの測定方法。
2. 【請求項２】 ＨＤＬを含有する試料に、ポリアニオ
   ン、２価の金属塩、非イオン性界面活性剤、コレステロ
   ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたは
   コレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ消費される
   物質または生成する物質を検出し試料中のＨＤＬ−コレ
   ステロールを測定する方法において、前記反応系に試料
   由来のアルブミンとは別異にアルブミンを添加・存在さ
   せて前記酵素反応を行うことを特徴とする請求項１に記
   載のＨＤＬ−コレステロールの測定方法。
3. 【請求項３】 ポリアニオンが硫酸化多糖類であり、非
   イオン性界面活性剤がｎ−オクチル−β−グルコシド、
   ｎ−オクチル−β−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β
   −チオグルコシドから選択される１種以上である請求項
   ２に記載のＨＤＬ−コレステロールの測定方法。
4. 【請求項４】 少なくともコレステロールエステラーゼ
   とコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデ
   ヒドロゲナーゼを作用させて試料中の高密度リポ蛋白
   （ＨＤＬ）−コレステロールを測定するための試薬にお
   いて、更にアルブミンを共存させることを特徴とするＨ
   ＤＬ−コレステロールの測定用試薬。
5. 【請求項５】 ポリアニオン、２価の金属塩、非イオン
   性界面活性剤、コレステロールエステラーゼ、コレステ
   ロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナ
   ーゼ、消費される物質又は生成する物質を検出するため
   の組成物からなるＨＤＬ−コレステロールの測定用試薬
   において、更にアルブミンを共存させることを特徴とす
   る請求項４に記載のＨＤＬ−コレステロールの測定用試
   薬。
6. 【請求項６】 ポリアニオン、２価の金属塩、非イオン
   性界面活性剤を含有する第一試薬と、少なくともコレス
   テロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼま
   たはコレステロールデヒドロゲナーゼを含有する第二試
   薬とからなり、アルブミンを第一試薬に共存させること
   を特徴とする請求項５に記載のＨＤＬ−コレステロール
   の測定用試薬。
7. 【請求項７】 ポリアニオンが硫酸化多糖類であり、非
   イオン性界面活性剤がｎ−オクチル−β−グルコシド、
   ｎ−オクチル−β−チオグルコシド、ｎ−ヘプチル−β
   −チオグルコシドから選択される１種以上である請求項
   ５、６に記載のＨＤＬ−コレステロールの測定用試薬。