JP3251304B2 - 生体試料成分中の物質の分析方法及びこれに用いられる試薬 - Google Patents
生体試料成分中の物質の分析方法及びこれに用いられる試薬Info
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- JP3251304B2 JP3251304B2 JP50417099A JP50417099A JP3251304B2 JP 3251304 B2 JP3251304 B2 JP 3251304B2 JP 50417099 A JP50417099 A JP 50417099A JP 50417099 A JP50417099 A JP 50417099A JP 3251304 B2 JP3251304 B2 JP 3251304B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、臨床診断の分野における生体試料成分中の
物質を分析する方法及びこれに用いられる試薬に関す
る。具体的には、例えば高比重リポ蛋白質（HDL）中の
コレステロールを分析する方法及びこれに用いられる試
薬に関する。
物質を分析する方法及びこれに用いられる試薬に関す
る。具体的には、例えば高比重リポ蛋白質（HDL）中の
コレステロールを分析する方法及びこれに用いられる試
薬に関する。
背景技術 リポ蛋白質は、古くから超遠心操作によって、高比重
リポ蛋白質（HDL、比重1.063〜1.21）、低比重リポ蛋白
質（LDL、比重1.019〜1.063）、超低比重リポ蛋白質（V
LDL、比重1.006〜1.019）、カイロミクロン（CM、比重
＜1.006）に分画されている。この分画操作は、超遠心
機を必要とする上に、遠心を数日に亘って行わなければ
ならず、多検体を処理することはできなかった。
リポ蛋白質（HDL、比重1.063〜1.21）、低比重リポ蛋白
質（LDL、比重1.019〜1.063）、超低比重リポ蛋白質（V
LDL、比重1.006〜1.019）、カイロミクロン（CM、比重
＜1.006）に分画されている。この分画操作は、超遠心
機を必要とする上に、遠心を数日に亘って行わなければ
ならず、多検体を処理することはできなかった。
これに代わり、ポリエチレングリコールまたはデキス
トラン硫酸等のポリアニオンにマグネシウムやカルシウ
ム等の二価カチオンを共存させたり、あるいはリンタン
グステン酸に二価カチオンを共存させた分画剤なる溶液
と血清とを混和させることによって、LDL、VLDL、CMを
沈澱させ、遠心後の上清に残るHDLのみを分画する方法
が主流となっていた。この方法では、臨床検査の分野で
広く普及している自動分析装置を用いることができた。
すなわち、酵素法による総コレステロールの測定が自動
分析装置によって確立しているので、この確立した測定
法を応用して、分画したHDL中のコレステロール濃度を
求めることができた。
トラン硫酸等のポリアニオンにマグネシウムやカルシウ
ム等の二価カチオンを共存させたり、あるいはリンタン
グステン酸に二価カチオンを共存させた分画剤なる溶液
と血清とを混和させることによって、LDL、VLDL、CMを
沈澱させ、遠心後の上清に残るHDLのみを分画する方法
が主流となっていた。この方法では、臨床検査の分野で
広く普及している自動分析装置を用いることができた。
すなわち、酵素法による総コレステロールの測定が自動
分析装置によって確立しているので、この確立した測定
法を応用して、分画したHDL中のコレステロール濃度を
求めることができた。
しかしながら、この方法も低速とは言え遠心操作が必
要であり、分画剤と血清とを混和させるときの人為的な
定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。そ
の上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目を同時に
は測定できなかった。臨床検査は迅速対応が求められて
おり、このことからも検査時間の短縮が課題となってい
た。
要であり、分画剤と血清とを混和させるときの人為的な
定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。そ
の上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目を同時に
は測定できなかった。臨床検査は迅速対応が求められて
おり、このことからも検査時間の短縮が課題となってい
た。
一方、臨床的には動脈硬化のリスクファクターである
LDL中のコレステロール値を重視する報告〔総コレステ
ロールの基準値と設定根拠、動脈硬化、24（６）,260
（1996）〕もある。現在LDL中のコレステロール値は総
コレステロール（Ｔ−CHO）、中性脂肪（TG）及びHDL中
のコレステロールの測定結果から経験的なファクターを
代入して求められる。その式〔Friedewald WT,et al,Cl
in.Chem.,18,499−502（1972）〕を以下に示す。
LDL中のコレステロール値を重視する報告〔総コレステ
ロールの基準値と設定根拠、動脈硬化、24（６）,260
（1996）〕もある。現在LDL中のコレステロール値は総
コレステロール（Ｔ−CHO）、中性脂肪（TG）及びHDL中
のコレステロールの測定結果から経験的なファクターを
代入して求められる。その式〔Friedewald WT,et al,Cl
in.Chem.,18,499−502（1972）〕を以下に示す。
LDL中のコレステロール値＝（Ｔ−CHO値） −（HDL中のコレステロール値）−（TG値）/5 この方法では、測定する三項目が全て正確に測定され
なければ成立しない。また、TG値が400mg/dを越えた
り、LDL中のコレステロール濃度が100mg/d以下になる
と計算値がLDL中のコレステロール濃度を反映しなくな
ると言われている〔Warnick GR,et al,Clin.Chem.,36
（１）,15−19（1990）、McNamara JR,et al,Clin.Che
m.,36（１）,36−42（1990）〕。したがって、この方法
では、肝心な異常値が求められない。他に、電気泳動で
リポ蛋白を分離し蛋白量を測定する方法やHPLCによるリ
ポ蛋白別コレステロールの測定方法もあるが、いずれも
検体処理能力に欠ける方法であり、高価な装置も必要と
なる。
なければ成立しない。また、TG値が400mg/dを越えた
り、LDL中のコレステロール濃度が100mg/d以下になる
と計算値がLDL中のコレステロール濃度を反映しなくな
ると言われている〔Warnick GR,et al,Clin.Chem.,36
（１）,15−19（1990）、McNamara JR,et al,Clin.Che
m.,36（１）,36−42（1990）〕。したがって、この方法
では、肝心な異常値が求められない。他に、電気泳動で
リポ蛋白を分離し蛋白量を測定する方法やHPLCによるリ
ポ蛋白別コレステロールの測定方法もあるが、いずれも
検体処理能力に欠ける方法であり、高価な装置も必要と
なる。
近年、HDL中のコレステロール測定に関して前述した
問題を解決するため、全自動のHDL中のコレステロール
を測定するキットが開発され普及しつつある。特許第26
00065号公報、特開平８−201393号公報及び特開平８−1
31195号公報に記載の技術は分画剤を併用するが、分画
剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が自動
分析装置で一般的に使用される洗剤により不溶性の沈澱
物を形成し、それが廃液機構で蓄積することによって、
自動分析装置の故障の原因となっている。更に反応液中
に不溶性の凝集物を形成し、測定結果に影響を与える濁
りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか、凝集
物により反応セルが汚染されて、同時に測定している他
の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えてい
る。
問題を解決するため、全自動のHDL中のコレステロール
を測定するキットが開発され普及しつつある。特許第26
00065号公報、特開平８−201393号公報及び特開平８−1
31195号公報に記載の技術は分画剤を併用するが、分画
剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が自動
分析装置で一般的に使用される洗剤により不溶性の沈澱
物を形成し、それが廃液機構で蓄積することによって、
自動分析装置の故障の原因となっている。更に反応液中
に不溶性の凝集物を形成し、測定結果に影響を与える濁
りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか、凝集
物により反応セルが汚染されて、同時に測定している他
の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えてい
る。
普及しているほとんどの自動分析装置では、10分で反
応を完了する場合が多い。このとき反応中に濁度変化が
あっては測定値の正確性に問題がある。その他、反応液
が濁ると再現性が低下するという問題も加わる。それ
故、測定する検体に制限が加わり、幅広い測定波長そ多
種多様な患者検体に対応することができない。例えば、
340nm付近（UV領域）では凝集物による濁りの現象によ
り、吸光度が２以上、あるいは３以上となって分析機の
許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。
応を完了する場合が多い。このとき反応中に濁度変化が
あっては測定値の正確性に問題がある。その他、反応液
が濁ると再現性が低下するという問題も加わる。それ
故、測定する検体に制限が加わり、幅広い測定波長そ多
種多様な患者検体に対応することができない。例えば、
340nm付近（UV領域）では凝集物による濁りの現象によ
り、吸光度が２以上、あるいは３以上となって分析機の
許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。
二価カチオンを用いることのない特開平９−96637号
公報の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清を含ませる方
法であるが、これも難溶性の抗原抗体凝集物を形成する
ので、反応セルが汚染される。したがって、同時に測定
している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を
与える。また、反応液中の濁りが強度となるので、特に
UV領域によるHDL中のコレステロール測定に対しても前
述と同じ原因で正確な測定が不可能である。高波長域で
も濁りの影響で測定値の正確性に欠ける。
公報の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清を含ませる方
法であるが、これも難溶性の抗原抗体凝集物を形成する
ので、反応セルが汚染される。したがって、同時に測定
している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を
与える。また、反応液中の濁りが強度となるので、特に
UV領域によるHDL中のコレステロール測定に対しても前
述と同じ原因で正確な測定が不可能である。高波長域で
も濁りの影響で測定値の正確性に欠ける。
一方、LDL中のコレステロールの測定に至っては、現
在も計算による方法を採らざるを得ない状況である。
在も計算による方法を採らざるを得ない状況である。
本発明の目的は、汎用の自動分析機を用いて遠心操作
による分離をせずに、HDLやLDL中のコレステロール等の
生体試料成分中の物質を分析する方法及びこれに用いら
れる試薬を提供することにある。
による分離をせずに、HDLやLDL中のコレステロール等の
生体試料成分中の物質を分析する方法及びこれに用いら
れる試薬を提供することにある。
発明の開示 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行っ
た結果、金属などの包接〔Rogers,R.D.et al.,J.Radioa
nal.Nucl.Chem.,208,153−161（1991）〕のために開発
されたカリクスアレン類が、例えばリポ蛋白質中のコレ
ステロールなどの特定の生体試料成分中の物質と選択的
に複合体を形成し得ることから、分離操作を必要とせず
に該成分中の物質を分別定量するのに有効であることを
見い出した。
た結果、金属などの包接〔Rogers,R.D.et al.,J.Radioa
nal.Nucl.Chem.,208,153−161（1991）〕のために開発
されたカリクスアレン類が、例えばリポ蛋白質中のコレ
ステロールなどの特定の生体試料成分中の物質と選択的
に複合体を形成し得ることから、分離操作を必要とせず
に該成分中の物質を分別定量するのに有効であることを
見い出した。
すなわち、本発明は、一種または二種以上のカリクス
アレン類が生体試料成分と複合体を形成することを特徴
とするカリクスアレン類を含有する試薬、カリクスアレ
ン類を含有する生体試料成分中の物質の分析用試薬、お
よび、カリクスアレン類を用いて生体試料成分中の物質
を分析する方法に関する。
アレン類が生体試料成分と複合体を形成することを特徴
とするカリクスアレン類を含有する試薬、カリクスアレ
ン類を含有する生体試料成分中の物質の分析用試薬、お
よび、カリクスアレン類を用いて生体試料成分中の物質
を分析する方法に関する。
生体試料成分とは、血清中や血漿中などに含まれる特
定の成分であり、例えばHDL、LDL、VLDL、CM及びレムナ
ント様リポ蛋白質などのリポ蛋白質が挙げられる。また
生体試料成分中の物質とは、生体試料成分中に含まれる
分析の目的となる物質であり、例えば、生体試料成分が
リポ蛋白質のときは、コレステロール、中性脂質やリン
脂質などが挙げられる。
定の成分であり、例えばHDL、LDL、VLDL、CM及びレムナ
ント様リポ蛋白質などのリポ蛋白質が挙げられる。また
生体試料成分中の物質とは、生体試料成分中に含まれる
分析の目的となる物質であり、例えば、生体試料成分が
リポ蛋白質のときは、コレステロール、中性脂質やリン
脂質などが挙げられる。
カリクスアレン類は、フェノールを基本骨格とし、フ
ェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた
環状オリゴマーである。カリクスアレン類としては、カ
リクス（４）アレン〔Calix（４）arene〕、カリクス
（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス
（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリク
ス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリ
クス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボ
キシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）
アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス
（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カ
リクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。本発明に
おいては、これらカリクスアレン類から選ばれる一種ま
たは二種以上を用いることができるが、使用に際しては
特に制限されない。製品化に成功している硫酸カリクス
アレンが水溶性に優れ取扱いが容易である。このカリク
スアレン類をコレステロール測定に応用する場合、コレ
ステロールを酵素的に測定する条件下に、反応液中に0.
05〜20mmol/、好ましくは0.1〜5mmol/となるように
添加すればよい。
ェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた
環状オリゴマーである。カリクスアレン類としては、カ
リクス（４）アレン〔Calix（４）arene〕、カリクス
（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス
（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリク
ス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリ
クス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボ
キシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）
アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス
（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カ
リクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。本発明に
おいては、これらカリクスアレン類から選ばれる一種ま
たは二種以上を用いることができるが、使用に際しては
特に制限されない。製品化に成功している硫酸カリクス
アレンが水溶性に優れ取扱いが容易である。このカリク
スアレン類をコレステロール測定に応用する場合、コレ
ステロールを酵素的に測定する条件下に、反応液中に0.
05〜20mmol/、好ましくは0.1〜5mmol/となるように
添加すればよい。
本発明における分析とは、生体試料成分中の物質を測
定することであり、定性または定量することである。
定することであり、定性または定量することである。
カリクスアレン類が生体試料成分複合体を形成すると
は、カリクスアレン類と生体試料成分が結合していれ
ば、特に結合方法は制限されないが、例えば、イオン結
合や配位結合などがあげられる。
は、カリクスアレン類と生体試料成分が結合していれ
ば、特に結合方法は制限されないが、例えば、イオン結
合や配位結合などがあげられる。
リポ蛋白質は、コレステロールを含む脂質成分とアポ
蛋白質とが結合することにより内部に脂質、外部に蛋白
質が存在するものであり、生体中で可溶化している。カ
リクスアレン類は、リポ蛋白質表面とのイオン結合によ
り、主にLDLやVLDLと複合体を形成し、該リポ蛋白質成
分を構成する物質（例えばコレステロール）が遊離する
ことを抑制する。したがって、複合体を形成すること
は、複合体が形成された生体試料成分に含まれる物質の
酵素反応を阻害することになり、目的とする生体試料成
分中の物質を酵素反応により測定することができる。例
えば、LDLやVLDL中のコレステロールや中性脂質の酵素
反応を阻害させ、HDL中のコレステロールや中性脂質を
定量することができる。
蛋白質とが結合することにより内部に脂質、外部に蛋白
質が存在するものであり、生体中で可溶化している。カ
リクスアレン類は、リポ蛋白質表面とのイオン結合によ
り、主にLDLやVLDLと複合体を形成し、該リポ蛋白質成
分を構成する物質（例えばコレステロール）が遊離する
ことを抑制する。したがって、複合体を形成すること
は、複合体が形成された生体試料成分に含まれる物質の
酵素反応を阻害することになり、目的とする生体試料成
分中の物質を酵素反応により測定することができる。例
えば、LDLやVLDL中のコレステロールや中性脂質の酵素
反応を阻害させ、HDL中のコレステロールや中性脂質を
定量することができる。
反応液中のpH条件については、分析する物質に依存
し、例えばHDL中のコレステロールを測定する場合に
は、総コレステロール測定の完成する条件であればよい
が、通常pH6.0〜9.0である。
し、例えばHDL中のコレステロールを測定する場合に
は、総コレステロール測定の完成する条件であればよい
が、通常pH6.0〜9.0である。
本発明においては、カリクスアレン類の濃度、pH、界
面活性剤、酵素の由来、酵素を反応させる順序を変化さ
せることにより、分析の対象とする生体試料成分を選択
でき、各々の条件は実験的に定められるものである。当
業者はそのような条件の至適化を容易に実施することが
できる。
面活性剤、酵素の由来、酵素を反応させる順序を変化さ
せることにより、分析の対象とする生体試料成分を選択
でき、各々の条件は実験的に定められるものである。当
業者はそのような条件の至適化を容易に実施することが
できる。
このように、カリクスアレン類の濃度を変化させるこ
とにより、測定対象とする物質が含まれる生体試料成分
を選択できることは、体外診断薬の分野に応用するのに
有用である。例えば、従来の方法では、HDL中のコレス
テロール測定には、測定対象物質（コレステロール）の
みの測定に限定した方法が用いられており、その方法は
同じHDL中のコレステロールとは異なる物質、例えばHDL
中の中性脂質の測定には適用できなかった。また同じコ
レステロールの測定においても、HDL中のコレステロー
ルのみに有効であり、他のリポ蛋白質、例えばLDL中の
コレステロールには適用できなかった。本発明は同じ生
体試料成分中の異なる物質の分析に適用できる特徴があ
る。例えばHDL中のコレステロールのみならず、HDL中の
中性脂質やリン脂質の分析にも適用できる。したがっ
て、HDL、LDL、VLDL、CM及びレムナント様リポ蛋白質の
リポ蛋白質画分に含まれるコレステロール、中性脂質及
びリン脂質を測定対象とすることができる。
とにより、測定対象とする物質が含まれる生体試料成分
を選択できることは、体外診断薬の分野に応用するのに
有用である。例えば、従来の方法では、HDL中のコレス
テロール測定には、測定対象物質（コレステロール）の
みの測定に限定した方法が用いられており、その方法は
同じHDL中のコレステロールとは異なる物質、例えばHDL
中の中性脂質の測定には適用できなかった。また同じコ
レステロールの測定においても、HDL中のコレステロー
ルのみに有効であり、他のリポ蛋白質、例えばLDL中の
コレステロールには適用できなかった。本発明は同じ生
体試料成分中の異なる物質の分析に適用できる特徴があ
る。例えばHDL中のコレステロールのみならず、HDL中の
中性脂質やリン脂質の分析にも適用できる。したがっ
て、HDL、LDL、VLDL、CM及びレムナント様リポ蛋白質の
リポ蛋白質画分に含まれるコレステロール、中性脂質及
びリン脂質を測定対象とすることができる。
本発明の試薬は、生体試料成分中の物質の測定に適し
た公知の測定用試薬に、カリクスアレン類を最終濃度が
所望の濃度となるように配合させた試薬キットとして、
または、所望の濃度となるべく調整されたカリクスアレ
ン類含有試薬と公知の測定用試薬を組み合わせた試薬キ
ットとして通常提供される。提供される際の試薬の形態
は、乾燥状、液状など特に限定されるものではない。試
薬キット中には、酵素の活性化剤などが配合されていて
もよい。また試薬キットが、例えば第一反応用試薬と第
二反応用試薬との組合せのように、反応液中に添加する
時期が異なる複数の種類の試薬を組み合わせたものであ
ってもよい。
た公知の測定用試薬に、カリクスアレン類を最終濃度が
所望の濃度となるように配合させた試薬キットとして、
または、所望の濃度となるべく調整されたカリクスアレ
ン類含有試薬と公知の測定用試薬を組み合わせた試薬キ
ットとして通常提供される。提供される際の試薬の形態
は、乾燥状、液状など特に限定されるものではない。試
薬キット中には、酵素の活性化剤などが配合されていて
もよい。また試薬キットが、例えば第一反応用試薬と第
二反応用試薬との組合せのように、反応液中に添加する
時期が異なる複数の種類の試薬を組み合わせたものであ
ってもよい。
本発明の分析方法においては、市販の各種測定用試薬
に緩衝液を加えて調製するに際して、カリクスアレン類
を最終濃度が所望の濃度となるように添加する態様も包
含される。
に緩衝液を加えて調製するに際して、カリクスアレン類
を最終濃度が所望の濃度となるように添加する態様も包
含される。
本発明の試薬は、カリクスアレン類を含有し、その他
の成分として、目的とする生体試料成分中の物質と反応
する酵素等の試薬を含有するように適宜調製される。例
えば、HDLやLDL中のコレステロール値は、総コレステロ
ールを測定する方法により測定される。このときに、リ
ポプロテインリパーゼ（LIP）、コレステロールエステ
ラーゼ（CE）、コレステロール脱水素酵素（CDH、例え
ばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性コレス
テロール脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドフォスフェート依存性コレステロール脱水素酵素
等）及びコレステロールオキシダーゼ（CO）からなる群
から選ばれる一種または二種以上の酵素が用いられる。
さらに、コレステロールを測定する反応を完成させるた
めの条件下で添加する活性化剤、安定化剤、補酵素、過
酸化水素定量用のペルオキシダーゼ（PO）及び発色剤が
適宜選択される。
の成分として、目的とする生体試料成分中の物質と反応
する酵素等の試薬を含有するように適宜調製される。例
えば、HDLやLDL中のコレステロール値は、総コレステロ
ールを測定する方法により測定される。このときに、リ
ポプロテインリパーゼ（LIP）、コレステロールエステ
ラーゼ（CE）、コレステロール脱水素酵素（CDH、例え
ばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性コレス
テロール脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドフォスフェート依存性コレステロール脱水素酵素
等）及びコレステロールオキシダーゼ（CO）からなる群
から選ばれる一種または二種以上の酵素が用いられる。
さらに、コレステロールを測定する反応を完成させるた
めの条件下で添加する活性化剤、安定化剤、補酵素、過
酸化水素定量用のペルオキシダーゼ（PO）及び発色剤が
適宜選択される。
また、CDHを用いる場合、この酵素の可逆反応を阻止
する目的で、ヒドラジン類を添加する技術〔特開平５−
176797号公報〕が先に報告されているが、本発明におい
てもヒドラジン類を添加した状況下で分析することがで
きる。また、酵素を化学修飾して酵素に選択性を持たせ
る技術〔特許第2600065号公報〕があり、本発明におい
てもかかる酵素を用いることができるが、本発明におい
てはそのような酵素を使用しなくても十分な選択性を得
ることができる。
する目的で、ヒドラジン類を添加する技術〔特開平５−
176797号公報〕が先に報告されているが、本発明におい
てもヒドラジン類を添加した状況下で分析することがで
きる。また、酵素を化学修飾して酵素に選択性を持たせ
る技術〔特許第2600065号公報〕があり、本発明におい
てもかかる酵素を用いることができるが、本発明におい
てはそのような酵素を使用しなくても十分な選択性を得
ることができる。
CDHを用いる際の補酵素としては、β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド酸化型（NAD）、Thio−ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−NA
D）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸酸化型（NADP）、Thio−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸酸化型（ｔ−NADP）等が挙げられ、こ
れらからなる群から選ばれる一種または二種以上の補酵
素が用いられる。コレステロールの存在によって、これ
ら補酵素は、それぞれの還元型、すなわちNADH、ｔ−NA
DH、NADPH、ｔ−NADPHに変換される。
ドアデニンジヌクレオチド酸化型（NAD）、Thio−ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−NA
D）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸酸化型（NADP）、Thio−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸酸化型（ｔ−NADP）等が挙げられ、こ
れらからなる群から選ばれる一種または二種以上の補酵
素が用いられる。コレステロールの存在によって、これ
ら補酵素は、それぞれの還元型、すなわちNADH、ｔ−NA
DH、NADPH、ｔ−NADPHに変換される。
総コレステロールの測定において酵素の活性化剤とし
て用いられるコール酸類や界面活性剤は、コレステロー
ルを酵素で測定する条件下において適宜選択し、実験的
に濃度を調整して用いることができる。例えば、HDL中
のコレステロールを測定する場合、第一反応でHDL以外
のリポ蛋白質にカリクスアレン類を添加して、複合体を
形成させて安定化させ、第二反応で酵素等を添加して、
HDL中のコレステロール濃度を測定すればよい。
て用いられるコール酸類や界面活性剤は、コレステロー
ルを酵素で測定する条件下において適宜選択し、実験的
に濃度を調整して用いることができる。例えば、HDL中
のコレステロールを測定する場合、第一反応でHDL以外
のリポ蛋白質にカリクスアレン類を添加して、複合体を
形成させて安定化させ、第二反応で酵素等を添加して、
HDL中のコレステロール濃度を測定すればよい。
LDL中のコレステロールを測定する場合は、先に述べ
た条件を組み合わせて、第一反応でLDLと複合体を形成
させ安定化させる一方で、HDL及びVLDL中のコレステロ
ールを予め反応させて消去し、残ったLDL中のコレステ
ロールを第二反応にて測定する。
た条件を組み合わせて、第一反応でLDLと複合体を形成
させ安定化させる一方で、HDL及びVLDL中のコレステロ
ールを予め反応させて消去し、残ったLDL中のコレステ
ロールを第二反応にて測定する。
第一反応時においてリポ蛋白質と複合体を形成するカ
リクスアレン類は、その種類の組み合わせや濃度を調整
すればよい。また、コレステロールの測定には、CD
H、CODとLIP及びCEの三種を組み合わせた酵素反応
を用いればよい。第二反応にてLDLの複合体を分解させ
る界面活性剤、コール酸類、酵素等を添加し、第一反応
で未反応のLDL中のコレステロールを測定すれば、第一
反応におけるコレステロール濃度との差引でLDL中のコ
レステロール濃度が求められる。このときLDLを分解さ
せるために添加する化合物は、酵素的にコレステロール
を測定することを妨害しなければ何等制限されない。
リクスアレン類は、その種類の組み合わせや濃度を調整
すればよい。また、コレステロールの測定には、CD
H、CODとLIP及びCEの三種を組み合わせた酵素反応
を用いればよい。第二反応にてLDLの複合体を分解させ
る界面活性剤、コール酸類、酵素等を添加し、第一反応
で未反応のLDL中のコレステロールを測定すれば、第一
反応におけるコレステロール濃度との差引でLDL中のコ
レステロール濃度が求められる。このときLDLを分解さ
せるために添加する化合物は、酵素的にコレステロール
を測定することを妨害しなければ何等制限されない。
VLDL中のコレステロールを測定する場合は、先に述べ
た条件を組み合わせて、第一反応でVLDLと複合体を形成
させ安定化させる一方で、HDL及びLDL中のコレステロー
ルを予め測定する。第一反応時においてリポ蛋白質と複
合体を形成するカリクスアレン類は、その種類の組合せ
と濃度を適宜調整すればよい。第二反応にてVLDLの複合
体を分解させる界面活性剤、コール酸類、酵素等を添加
し、第一反応で未反応のVLDL中のコレステロールを測定
すれば、第一反応におけるコレステロール濃度との差引
でVLDL中のコレステロール濃度が求められる。このとき
VLDLを分解させるために添加する化合物は、酵素的にコ
レステロールを測定することを妨害しなければ何等制限
されない。
た条件を組み合わせて、第一反応でVLDLと複合体を形成
させ安定化させる一方で、HDL及びLDL中のコレステロー
ルを予め測定する。第一反応時においてリポ蛋白質と複
合体を形成するカリクスアレン類は、その種類の組合せ
と濃度を適宜調整すればよい。第二反応にてVLDLの複合
体を分解させる界面活性剤、コール酸類、酵素等を添加
し、第一反応で未反応のVLDL中のコレステロールを測定
すれば、第一反応におけるコレステロール濃度との差引
でVLDL中のコレステロール濃度が求められる。このとき
VLDLを分解させるために添加する化合物は、酵素的にコ
レステロールを測定することを妨害しなければ何等制限
されない。
この複合体を形成し、酵素反応にて目的物質を測定す
る方法は、選択的にリポ蛋白質中のコレステロールを測
定するのみでなく、目的とする物質に対する酵素を適宜
変更することにより、リポ蛋白別に中性脂肪またはリン
脂質などの測定にも応用ができる。
る方法は、選択的にリポ蛋白質中のコレステロールを測
定するのみでなく、目的とする物質に対する酵素を適宜
変更することにより、リポ蛋白別に中性脂肪またはリン
脂質などの測定にも応用ができる。
以下、本発明をより詳細に説明するために、HDL及びL
DL中のコレステロールの測定例について記すが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
DL中のコレステロールの測定例について記すが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 以下の試薬1,2を調製し、HDL−コレステロールを測定
した。
した。
試薬１の調製 緩衝液 pH6.5 硫酸カリクス（６）アレン 1.0 mmol/ 二塩化ヒドラジニウム 100 mmol/ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型
［NAD］ 5.0 mmol/ 試薬２の調製 緩衝液 pH8.5 コレステロール脱水素酵素 20.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 6.0 U/ml 検体は、一般人の血清25例を用いた。測定は、自動分
析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作法
は、先ず検体５μに試薬１を180μ加え37℃で５分
間恒温し、この時点で主波長340nm及び副波長570nmにて
吸光度１を測定した。
［NAD］ 5.0 mmol/ 試薬２の調製 緩衝液 pH8.5 コレステロール脱水素酵素 20.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 6.0 U/ml 検体は、一般人の血清25例を用いた。測定は、自動分
析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作法
は、先ず検体５μに試薬１を180μ加え37℃で５分
間恒温し、この時点で主波長340nm及び副波長570nmにて
吸光度１を測定した。
更に、試薬２を60μ加え37℃で５分間恒温し、この
時点で主波長340nm及び副波長570nmにて吸光度２を測定
した。吸光度１と吸光度２との差を求めて、既知HDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体
の値を換算した。対照法としてポリエチレングリコール
（PG）法を用いた。PG法は国際試薬社製PGポールを使用
した。また、遠心後の上清のコレステロール濃度は、国
際試薬社製Ｔ−CHO試薬・Ａを用いて求めた。その結果
を表１に示した。
時点で主波長340nm及び副波長570nmにて吸光度２を測定
した。吸光度１と吸光度２との差を求めて、既知HDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体
の値を換算した。対照法としてポリエチレングリコール
（PG）法を用いた。PG法は国際試薬社製PGポールを使用
した。また、遠心後の上清のコレステロール濃度は、国
際試薬社製Ｔ−CHO試薬・Ａを用いて求めた。その結果
を表１に示した。
対照法との相関性は、相関係数0.993、回帰式Ｙ＝0.9
89X＋1.18であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例１による値（単位:mg/d）であり、ＸはP
G法による値（単位:mg/d）である。
89X＋1.18であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例１による値（単位:mg/d）であり、ＸはP
G法による値（単位:mg/d）である。
〔実施例２〕 以下の試薬1,2を調製し、HDL−コレステロールを測定
した。
した。
試薬１の調製 緩衝液 pH6.5 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5
−ジメトキシアニリンナトリウム 1.0 mmol/l 硫酸カリクス（６）アレン 1.0 mmol/l ペルオキシダーゼ 5.0 U/l 試薬２の調製 緩衝液 pH7.0 コレステロール酸化酵素 10.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 6.0 U/ml ４−アミノアンチピリン 10.0 U/ml 検体は、一般人の血清20例を用いた。測定は、自動分
析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作法
は、先ず検体３μに試薬１を180μ加え37℃で５分
間恒温し、この時点で主波長600nm及び副波長700nmにて
吸光度１を測定した。
−ジメトキシアニリンナトリウム 1.0 mmol/l 硫酸カリクス（６）アレン 1.0 mmol/l ペルオキシダーゼ 5.0 U/l 試薬２の調製 緩衝液 pH7.0 コレステロール酸化酵素 10.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 6.0 U/ml ４−アミノアンチピリン 10.0 U/ml 検体は、一般人の血清20例を用いた。測定は、自動分
析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作法
は、先ず検体３μに試薬１を180μ加え37℃で５分
間恒温し、この時点で主波長600nm及び副波長700nmにて
吸光度１を測定した。
更に、試薬２を60μ加え37℃で５分間恒温し、この
時点で主波長600nm及び副波長700nmにて吸光度２を測定
した。吸光度１と吸光度２との差を求めて、既知HDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準波として検体
の値を算出した。対照法としてポリエチレングリコール
（PG）法を用いた。対照法の操作は、実施例１に従っ
た。測定結果を表２に示した。
時点で主波長600nm及び副波長700nmにて吸光度２を測定
した。吸光度１と吸光度２との差を求めて、既知HDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準波として検体
の値を算出した。対照法としてポリエチレングリコール
（PG）法を用いた。対照法の操作は、実施例１に従っ
た。測定結果を表２に示した。
対照法との相関性は、相関係数0.986、回帰式Ｙ＝0.8
79X＋6.03であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例２による値（単位:mg/d）であり、ＸはP
G法による値（単位:mg/d）である。
79X＋6.03であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例２による値（単位:mg/d）であり、ＸはP
G法による値（単位:mg/d）である。
〔実施例３〕 以下の試薬1,2を調製し、LDL−コレステロールを測定
した。
した。
試薬１の調製 緩衝液 pH7.5 硫酸カリクス（６）アレン 0.8 mmol/ 二塩化ヒドラジニウム 100 mmol/ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型
［NAD］ 5.0 mmol/ コレステロール脱水素酵素 10.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 4.0 U/ml 試薬２の調製 緩衝液 pH7.5 コレステロールエステラーゼ 3.0 U/ml 検体は、一般人の血清24例を用い、フリーデワルド式
による換算既知のLDL−コレステロール濃度のコントロ
ールを標準液として検体の値を算出した。測定は、自動
分析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作
法は、先ず検体３μに試薬１を210μ加え、37℃で
５分間恒温し、この時点で主波長340nm及び副波長570nm
にて吸光度１を測定した。
［NAD］ 5.0 mmol/ コレステロール脱水素酵素 10.0 U/ml コレステロールエステラーゼ 4.0 U/ml 試薬２の調製 緩衝液 pH7.5 コレステロールエステラーゼ 3.0 U/ml 検体は、一般人の血清24例を用い、フリーデワルド式
による換算既知のLDL−コレステロール濃度のコントロ
ールを標準液として検体の値を算出した。測定は、自動
分析装置（日立7170型自動分析装置）で実施した。操作
法は、先ず検体３μに試薬１を210μ加え、37℃で
５分間恒温し、この時点で主波長340nm及び副波長570nm
にて吸光度１を測定した。
更に、試薬２を70μ加え、37℃で５分間恒温し、こ
の時点で主波長340nm及び副波長570nmにて吸光度２を測
定した。吸光度１と吸光度２との差を求め、既知LDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体
の値（単位:mg/d）を算出した。
の時点で主波長340nm及び副波長570nmにて吸光度２を測
定した。吸光度１と吸光度２との差を求め、既知LDL−
コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体
の値（単位:mg/d）を算出した。
対照法として国際試薬社製Ｔ−CHO試薬・KL「コクサ
イ」、TG試薬・Ａ及びPGポール法を用い、フリーデワル
ドの式によりLDL−コレステロール濃度を求めた。その
結果を表３に示した。
イ」、TG試薬・Ａ及びPGポール法を用い、フリーデワル
ドの式によりLDL−コレステロール濃度を求めた。その
結果を表３に示した。
対照法との相関性は、相関係数0.982、回帰式Ｙ＝1.0
08X＋5.98であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例３による値（単位:mg/d）であり、Ｘは
対照法による値（単位:mg/d）である。
08X＋5.98であり良好な相関性を得た。なお、回帰式中
のＹは実施例３による値（単位:mg/d）であり、Ｘは
対照法による値（単位:mg/d）である。
産業上の利用の可能性 本発明によれば、生体試料成分中の物質、例えば血清
中の特定画分（リポ蛋白質など）中の物質（コレステロ
ールなど）を他の画分より分離することなく分析するこ
とができる。したがって、遠心分画などの分離分画が不
要であるから、操作が簡便であり、測定誤差や人為的要
因での問題を低減させることができる。
中の特定画分（リポ蛋白質など）中の物質（コレステロ
ールなど）を他の画分より分離することなく分析するこ
とができる。したがって、遠心分画などの分離分画が不
要であるから、操作が簡便であり、測定誤差や人為的要
因での問題を低減させることができる。
また、二種類の試薬を用いる方法に応用できるので、
汎用型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能とな
り、他の検査項目とマルチチャンネル化して測定するこ
とができる。
汎用型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能とな
り、他の検査項目とマルチチャンネル化して測定するこ
とができる。
本出願は日本で出願された平成９年特許願第169281号
を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含
されるものである。
を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含
されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡津 吉史 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１番２号 国際試薬株式会社研究開発センター内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/60 G01N 33/536 G01N 33/92 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質の分
別的な測定において、カリクスアレン類と該生体試料成
分に含まれる特定リポ蛋白質との複合体を形成させるこ
とを特徴とする、該特定リポ蛋白質中構成物質の酵素反
応性の分別的阻害方法。 - 【請求項２】生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質の分
別的な測定において、カリクスアレン類と特定リポ蛋白
質との複合体を形成させ、該特定リポ蛋白質中構成物質
の酵素反応性を分別的に阻害させる工程を導入すること
を特徴とする生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質の分
別的測定方法。 - 【請求項３】生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質の分
別的な測定において、生体試料成分のリポ蛋白質中構成
物質のうち、特定リポ蛋白質に対してカリクスアレン類
と複合体を形成させることによって、該特定リポ蛋白質
中構成物質の酵素反応性を阻害させ、一方で、該特定リ
ポ蛋白質中構成物質を除く他のリポ蛋白質中構成物質を
消去処理し、次いで、酵素反応性が阻害されていた該特
定リポ蛋白質中構成物質の酵素反応性を回復させて、酵
素反応を履行することを特徴とするリポ蛋白質中構成物
質の分別的測定方法。 - 【請求項４】特定リポ蛋白質が低比重リポ蛋白質である
ことを特徴とする請求項３に記載のリポ蛋白質中構成物
質の分別的測定方法。 - 【請求項５】特定リポ蛋白質が超低比重リポ蛋白質であ
ることを特徴とする請求項３に記載のリポ蛋白質中構成
物質の分別的測定方法。 - 【請求項６】生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質の分
別的な測定において、高比重リポ蛋白質を除く他のリポ
蛋白質とカリクスアレン類の複合体を形成させ、該他の
リポ蛋白質の酵素反応性を分別的に阻害させることを特
徴とする高比重リポ蛋白質中構成物質の分別的測定方
法。 - 【請求項７】生体試料成分のリポ蛋白質中構成物質がコ
レステロールであることを特徴とする請求項１〜６のい
ずれか１に記載の分別的測定方法。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１に記載のリポ蛋
白質中構成物質の分別的測定方法に使用する測定用試
薬。 - 【請求項９】請求項８に記載の測定用試薬を少なくとも
１以上含むことを特徴とする測定用試薬キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-169281 | 1997-06-25 | ||
| JP16928197 | 1997-06-25 | ||
| PCT/JP1998/002795 WO1998059068A1 (fr) | 1997-06-25 | 1998-06-22 | Procede servant a analyser des specimens biologiques afin de rechercher des substances contenues dans leurs constituants et reactif utilise dans ce procede |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3251304B2 true JP3251304B2 (ja) | 2002-01-28 |
Family
ID=15883615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50417099A Expired - Lifetime JP3251304B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-22 | 生体試料成分中の物質の分析方法及びこれに用いられる試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1020532B1 (ja) |
| JP (1) | JP3251304B2 (ja) |
| DE (1) | DE69840725D1 (ja) |
| WO (1) | WO1998059068A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006057377A1 (ja) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | Jimro Co., Ltd. | レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100682082B1 (ko) | 1999-03-01 | 2007-02-12 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 생체시료성분의 측정방법 |
| US6818414B1 (en) | 1999-06-21 | 2004-11-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of pretreatment of sample for quantitating cholesterol and method for quantitating cholesterol in specific lipoproteins by using the same |
| JP4456715B2 (ja) * | 2000-02-28 | 2010-04-28 | 協和メデックス株式会社 | レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬 |
| ATE446378T1 (de) * | 2000-06-07 | 2009-11-15 | Sysmex Corp | Verfahren zur analyse von komponenten biologischer proben |
| MXPA03004206A (es) | 2000-11-14 | 2003-09-22 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Metodo de ensayo de lipido y reactivo para su uso en el mismo. |
| AU2003284453A1 (en) | 2002-11-27 | 2004-06-18 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd | Method of measuring lipid in specific lipoprotein |
| WO2007007392A1 (ja) | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| JP4884012B2 (ja) * | 2006-01-25 | 2012-02-22 | シスメックス株式会社 | 高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬キット及び測定方法 |
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|---|---|---|---|---|
| HUT51677A (en) * | 1987-04-10 | 1990-05-28 | Univ Southern Australia | Process for quantitative determination of ion solutions |
| US5409959A (en) * | 1991-01-29 | 1995-04-25 | Genelabs Incorporated | Antithrombotic treatment with calix(n)arene compounds |
| AU4581893A (en) * | 1992-08-12 | 1994-03-15 | Dermot Diamond | Chromogenic ligands and use thereof in optical sensors |
| FR2698362B1 (fr) * | 1992-11-26 | 1994-12-23 | Commissariat Energie Atomique | Calix [4] arènes-bis-couronnes, leur procédé de préparation et leur utilisation pour l'extraction sélective du césium et des actinides. |
| JP3107474B2 (ja) * | 1993-02-17 | 2000-11-06 | 国際試薬株式会社 | リポ蛋白分画中の成分の定量方法 |
| JP2600065B2 (ja) * | 1994-03-08 | 1997-04-16 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
-
1998
- 1998-06-22 WO PCT/JP1998/002795 patent/WO1998059068A1/ja active Application Filing
- 1998-06-22 DE DE69840725T patent/DE69840725D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-22 JP JP50417099A patent/JP3251304B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-22 EP EP98928635A patent/EP1020532B1/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
| WO2006057377A1 (ja) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | Jimro Co., Ltd. | レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法 |
| US7799537B2 (en) | 2004-11-29 | 2010-09-21 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Cholesterol measuring reagent containing a cholesterol esterase |
| CN101065495B (zh) * | 2004-11-29 | 2011-05-04 | 大塚制药株式会社 | 残粒样脂蛋白中胆固醇的测定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1020532A4 (en) | 2000-10-04 |
| DE69840725D1 (de) | 2009-05-20 |
| WO1998059068A1 (fr) | 1998-12-30 |
| EP1020532B1 (en) | 2009-04-08 |
| EP1020532A1 (en) | 2000-07-19 |
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