JP4547095B2 - 生体試料成分の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する手段および方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
古くからリポ蛋白は、超遠心操作により高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）に分画されていた。この操作は熟練が必要であり、超遠心機を備え付け、遠心を数日にわたって行う。そのため、多検体を処理することは出来なかった。
【０００３】
これに代わりポリエチレングリコール、またはデキストラン硫酸等のポリアニオンに、マグネシムやカルシウム等の二価カチオンを共存させたり、リンタングステン酸に二価カチオンを共存させた溶液と血清とを混和させてＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを沈澱させ、遠心後の上清に残るＨＤＬのみを分画する方法が主流となっていた。
【０００４】
この方法は、臨床検査の分野で広く普及している自動分析装置を用いることができる。すなわち分画したＨＤＬ中のコレステロールは、既に確立されている自動分析装置を用いた総コレステロールの酵素法による測定を応用して、その濃度を求めることができる。しかしながらこの方法も低速ではあるが遠心操作が必要であり、分画剤と血清を混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目と同時には測定出来なかった。臨床検査は迅速な対応が求められており、他の検査項目と同時に測定して検査時間を短縮することが課題となっていた。
【０００５】
一方、臨床的に動脈硬化のリスクファクターであるＬＤＬ中のコレステロール値を重視する報告［総コレステロールの基準値と設定根拠：動脈硬化，２４（６），２８０（１９９６）］もある。現在ＬＤＬ中のコレステロール値は総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、中性脂肪（ＴＧ）およびＨＤＬ中コレステロールの測定結果から、経験的なファクターを挿入して求める。その式［Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ Ｗ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１８，４９９〜５０２（１９７２）］は以下である。
ＬＤＬ中コレステロール値＝
総コレステロール値−ＨＤＬコレステロール値−ＴＧ値／５
この方法は、測定する３項目が全て正確に測定されなければ成立しない。また、ＴＧ値が４００ｍｇ／ｄＬを越えたり、ＬＤＬ中のコレステロール濃度が１００ｍｇ／ｄＬ以下になると、計算値がＬＤＬ中のコレステロール濃度を反映しなくなると言われている［Ｗａｒｎｉｃｋ Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６（１），１５〜１９（１９９０）］，［ＭｃＮａｍａｒａ Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６（１），３６〜４２（１９９０）］。従って、この方法では測定の目的であるＬＤＬ中のコレステロールの異常値を検出することが難しかった。
【０００６】
また他に、電気泳動でリポ蛋白を分離し蛋白量を測定する方法や、ＨＰＬＣによるリポ蛋白別コレステロールの測定法もあるが、いずれも検体処理能力に欠ける方法であり、高価な専用装置も必要となる。
【０００７】
近年、ＨＤＬ中のコレステロール測定に関して前述した問題を解決するため、ＨＤＬ中のコレステロールを全自動で測定するキットが開発され普及しつつある。特許第２６０００６５号公報、特開平８−２０１３９３号公報および特開平８−１３１１９５号公報にみられる技術は、分画剤を併用しており、分画剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が、自動分析装置で一般的に使用される洗剤により不溶性の沈殿物を形成し、それが該装置の廃液機構内で蓄積することにより、故障の原因となっている。
【０００８】
更に、測定反応中に不溶性の凝集物を形成し、測定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか、その凝集物により反応セルが汚染され、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えている。
【０００９】
このＨＤＬ中のコレステロールの自動測定法では、２ポイントエンド法、レート法、ダブルレート法、フィックスタイム法などの公知の測光法が選択できるようになっているので、濁ったままの状態でも測定は可能である。しかし、これらの測光法によってもこの濁りの中における測定は、反応中に濁度変化があったときは、測定値の正確性に問題が生ずる。また、反応液が濁ると再現性が低下する。それ故、測定する検体に制限が加わり、幅広い測定波長を用いることができず、多種多様な患者検体に対応することができない。例えば、３４０ｎｍ付近（短波長域）では凝集物による濁りの現象で吸光度が２〜３以上となり分析機の許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。
【００１０】
二価カチオンを用いることのない特開平９−９６６３７号公報記載の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清とを含ませる方法であるが、これも濁りの原因となる抗原抗体凝集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与える。また、反応液中の濁りが強くなるので、特に短波長域によるＨＤＬ中のコレステロール測定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能である。
【００１１】
これらの技術は、複合体や凝集体を形成することで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持つ測定への悪影響は、解消されない。このような濁りを最終的に消去する技術が濁り対策の一つである。特開平６−２４２１１０号公報に見られるように、濁りを最終的に消去する操作を加えれば、正確な測定値が得られるようになる。しかし、この方法では最低でも３〜４段階の試薬分注操作が必要となる。市販されている自動分析装置の中には３〜４段階の試薬分注操作に対応できるものもあるが、一般的に普及している生化学項目用の自動分析装置は最大２段階の試薬分注操作に対応しているものが多いので、この方法が応用できないことがあった。
【００１２】
一方、ＬＤＬ中のコレステロールの測定は、現在も前述したような計算による方法を取らざるを得ない状況である。近年、特開平０７−２８０８１２号公報、ＷＯ９６／２９５９９号公報、特開平０９−３１３２００号公報記載の技術に見られる、完全自動化を目指したＬＤＬ中のコレステロール測定法の報告がある。これらは、凝集体や複合体を形成する技術の延長線上にあるので、測定時の濁りの調整が今後の課題である。
【００１３】
発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する方法において、汎用の自動分析装置を用いて、処理工程中に遠心分離操作をすることなく、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中のＨＤＬ（高比重リポ蛋白）、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）、ＶＬＤＬ（超低比重リポ蛋白）等のリポ蛋白中の成分を定量する方法を提供することである。
【００１４】
本発明は、血清中の特定リポ蛋白画分中の成分を酵素反応で測定する方法において、特異的に該成分を測定するために、リポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段を導入することを特徴とする、特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法を提供する。特定のリポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段としては、酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加すること、非イオン界面活性剤を選択すること、および／または特定リポ蛋白に対する反応特異性を有する酵素を選択し用いること、が挙げられる。
【００１５】
本発明は、上記３つの手段を適宜選択し、単独であるいは組合せて利用することにより、ＨＤＬ中の成分の測定法、ＬＤＬ中の成分の測定法、および／またはＶＬＤＬ中の成分の測定方法を提供する。
【００１６】
本発明の測定方法は、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）中の成分を測定する場合、反応液のイオン強度を十分に高くすること、および／またはＨＤＬに優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼを作用させること、および／またはＨＤＬに反応選択性をもちＨＬＢ値が１６以上である非イオン界面活性剤を使用すること、を導入することを特徴とする。
【００１７】
さらに本発明の測定方法は、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）中のコレステロールを測定する場合、第一酵素反応系においてまずＨＤＬ画分中のコレスレロール成分を選択的に酵素反応させて測定または消化し、ついで第二酵素反応系においてＨＬＢ値が１１〜１３である非イオン界面活性剤を利用してＬＤＬ画分中のコレステロール成分を酵素反応により測定する方法を提供する。
【００１８】
さらにまた本発明の測定方法は、第一酵素反応系および第二酵素反応系を同時にまたは別々に行うことにより超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のコレステロール成分を残留させ、ついでＶＬＤＬ画分を分解する手段を導入してＶＬＤＬ画分中のコレステロール成分を酵素反応により測定する方法を提供する。また、ＨＤＬ、ＬＤＬの消去を伴わず、ＶＬＤＬ画分中のコレステロールを測定してもよい。
【００１９】
また本発明の測定方法は、上記本発明の測定方法にコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を添加して遊離のコレステロールを消化する工程を加えた測定方法をも含む。
【００２０】
上記本発明の測定方法は、その酵素反応液のｐＨが、リポ蛋白が凝集、または白濁を起こさない範囲であって、リポ蛋白中の成分を酵素反応させる酵素の至適ｐＨにより選択されることを特徴とする。
【００２１】
発明の実施の最良の形態
本発明の酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加することによる特定リポ蛋白成分に対する酵素の反応性を調整することとは、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの各リポ蛋白画分が水溶解性において差異をもつことから、この性質を利用して特定画分のみを溶解させ、選択的に特定画分中の成分に対して酵素反応を起こすことを意味する。この目的を達成する一手段として、試料中のイオン強度を上昇させる。ＨＤＬを選択的に溶解させるためのイオン強度は、例えばヒドラジン濃度において約３０ｍＭ、より好ましくは６０ｍＭ以上を添加することによって得られる。ヒドラジンとしては、ヒドラジン類、その塩、その水和物、その溶媒和物から、ＨＤＬの選択溶解性を指標にして選ばれたものが、使用できる。同様に、ＮａＣｌ、尿素、グアニジン類、セミカルバジド類も、使用できる。イオン強度を上昇させるこれらの化合物は、単独でまたは複数を組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度は、ＨＤＬの選択溶解性を指標にして、用時実験的繰返しによって、決定できる。
【００２２】
本発明の、酵素の特定リポ蛋白に対する反応特異性を利用して特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）および／またはコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を選択して行う。この酵素としては、市販のＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来のＬＰＬ、ＣＥが例示される。なお、ＬＤＬ画分を対象にする場合には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の酵素などを適宜選択することができる。酵素について、各種修飾化は、酵素活性と特定リポ蛋白画分への選択性が維持されていれば、為されても為されなくてもよい。酵素の添加量は、自体公知の基質量に応じて増減され調整される。
【００２３】
本発明の、選択された非イオン界面活性剤の特定リポ蛋白に対する反応選択性を利用して、特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、非イオン界面活性剤のＨＬＢ値によって特定される。
【００２４】
ＨＤＬ画分を対象にする場合、ＨＬＢ値が１６以上のものが選択され、好適には１７以上が選択される。より好ましくは、ＨＬＢ値が１７以上のポリオキシエチレンエーテル類が選択される。この選択された界面活性剤は、ＬＤＬ画分及びＶＬＤＬ画分に対するＬＰＬ、ＣＥ、コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）等の酵素作用を阻害する。具体例を以下に列記するが、本発明に用いる非イオン界面活性剤は、ＨＬＢ値を指標にして随時選択可能であり、下記の例に限定されない；セチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂株式会社：ノニオンＫ−２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂株式会社：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）等。
【００２５】
ＬＤＬ画分またはＶＬＤＬ画分を対象にする場合、とくに積極的にＬＤＬ画分の成分への酵素反応を対象とする場合には、ＨＬＢ値が１１〜１３の非イオン界面活性剤が選択される。例示をすれば、トリトンＸ−１００、ノニオンＨＳ２１０、ノニオンＡ−１０Ｒ（日本油脂株式会社）があげられる。しかし、ＬＤＬ画分の成分を測定するため使用する界面活性剤も、ＨＬＢ値を指標にして随時選択することができ、これらの例に限定されない。
【００２６】
上記界面活性剤の添加量は、測定するリポ蛋白量により変化するが、ＨＤＬおよびＬＤＬを対象とした事例において示したのは、検体約５μＬに対して、界面活性剤濃度０．０１〜１０％の試薬約１８０μＬである。これにより、ＨＤＬまたはＬＤＬが選択的に分解され、これらに含まれる成分の酵素反応が可能となる。ＶＬＤＬを対象とする場合には、界面活性剤濃度を０．０５〜２０％に調整して使用される。これにより、ＶＬＤＬが選択的に分解され、これに含まれる成分の酵素反応が可能となる。
【００２７】
酵素反応がなされる反応液のｐＨは、リポ蛋白が凝集または白濁をおこさない範囲であって、リポ蛋白中の成分に作用する酵素の至適ｐＨを考慮して選択される。好適には、ｐＨ約６〜約９である。ｐＨが約６以下であると、リポ蛋白が白濁をおこす。リポ蛋白が比較的安定なｐＨ７付近を選択して測定条件を調整すればよいが、ＣＯＤ（コレステロール酸化酵素）、ＣＤＨ（コレステロール脱水素酵素）、ＬＰＬ、およびＣＥ等の酵素の至適ｐＨも考慮する。好適には、ＣＤＨ、ＬＰＬ、およびＣＥの反応は、ｐＨ約７〜約９が望ましく、ＣＯＤの反応は、ｐＨ約６〜約８が望ましい。反応液は、緩衝液で調整することが好ましく、通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用できる。例示すれば、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４′−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、リン酸緩衝液、を添加物との適合性により適宜選択して利用する。なお、本発明の実施例および実験例では、ｐＨ条件に合わせて、各々ＰＩＰＥＳ緩衝液およびＴＡＰＳ緩衝液を利用した。
【００２８】
また所望により、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロン中の遊離型コレステロールが、ＨＤＬ中のコレステロール測定時の反応に関与して、しばしば誤差の原因となるので、予めＣＯＤやＣＤＨでこれらの遊離型コレステロールを反応させてヒドラジン存在下で、コレステノンヒドラゾンに変換し、ＨＤＬ中のコレステロール測定時のために、非基質化しておく方法もある。非基質化する技術は公知であり、例えば特開平５−１７６７９７号公報を参考にすればよい。
【００２９】
本発明においては、上記３つの手段、イオン強度の選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独でまたは適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全ての手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入する必要は無い。
【００３０】
ＨＤＬ中のコレステロール成分を測定する場合、第一の要件は、水溶性が高い高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）中の成分を溶液中に溶解しやすくするためにイオン強度を十分な程度に高く調整することであり、第二の要件はＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）および／またはコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を選択して作用させることであり、第三の要件はＨＤＬ画分に対して反応選択性をもちＨＬＢ値が１６以上である非イオン界面活性剤を用いてＨＤＬ画分中の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応をおこすことである。
【００３１】
リポ蛋白中の成分であるコレステロールを酵素測定法で測定する場合、酵素としてＣＤＨを用いるときは補酵素として、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等を使用する。また、ＣＯＤを使用するときは、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）と公知の過酸化水素定量法を組み合わせて測定を行う。総コレステロールの測定に必要となる酵素の活性化剤であるコール酸類や界面活性剤は、その条件を適宜選択し、実験的繰り返しにより濃度を調整すればよい。
【００３２】
ＬＤＬ中のコレステロール成分を測定する場合は、まず上記のＨＤＬ画分中のコレステロール成分を第一酵素反応系において選択的に酵素反応させ、ついで第二酵素反応系においてＬＤＬ画分に対して作用するＬＰＬおよび／またはＣＥとＬＤＬを積極的に分解する界面活性剤とを加え、ＣＤＨによる反応生産物を検出する。
【００３３】
酵素反応生産物の測定は、ＣＥ、ＬＰＬ等の酵素作用によって生成される化合物であるコレステロールを定量する自体公知の方法から適宜に以下に示すような測定系を選択して行う。例えば、ＣＤＨ−ＮＡＤ系を用いる場合は３４０ｎｍの吸光度で測定し、ＣＤＨ−ｔ−ＮＡＤ系を用いる場合は４０５ｎｍの吸光度で測定し、ＣＯＤ系を用いる場合、５００ｎｍ以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定する。測光法は、既知のレート法、２ポイントエンド法等が所望により利用できる。
【００３４】
実施例
実施例１
以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清１０例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体５μＬに、試薬１−ＡまたはＢまたはＣ１８０μＬをそれぞれ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬２を６０μＬ加えて３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて、ＨＤＬ−コレステロール濃度が既知のコントロールを標準液として検体の値を換算した。対照法としてポリエチレングリコール（ＰＧ）法を用いた。ＰＧ法は国際試薬株式会社製ＰＧポールを使用した。また、遠心後の上清のコレテロール濃度は、国際試薬株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ａを用いて求めた。測定結果として対照法との比較を表１に示した。試薬１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃを用いた測定は対照法によく一致した良好な結果となった。
【００３５】
試薬１−Ａ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．６％
【００３６】
試薬１−Ｂ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｂｒｉｊ９７（ＨＬＢ値１９） ０．２４％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００３７】
試薬１−Ｃ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．２％
コレステロール酸化酵素（ＣＯＤ） １．０Ｕ／ｍＬ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００３８】
試薬２
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００３９】
【００４０】
実施例２
以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清１０例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず検体３μＬに試薬Ａ−１を２１０μＬ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ａ−２を７０μＬ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めてＬＤＬ−コレステロール濃度が既知のコントロールを標準液として検体の値を換算した。試薬Ｂ−１と試薬Ｂ−２も前述と同様に操作する。対照法の値は、フリーデワルド式より求めた。ＨＤＬコレステロール値は、国際試薬株式会社製ＰＧポールを使用した。総コレステロール値は、国際試株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ａを用いて求めた。ＴＧ値は、国際試薬株式会社製ＴＧ試薬・Ａを用いて求めた。測定結果を表２に示した。本法は、対照法と比べて良好な結果を得た。
【００４１】
試薬Ａ−１
緩衝液 ｐＨ７．８
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．１５％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４２】
試薬Ａ−２
緩衝液 ｐＨ８．５
ＣＥ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来） ３．０Ｕ／ｍＬ
ノニオンＡ−１０Ｒ ０．５％
デオキシコール酸ナトリウム ８．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４３】
試薬Ｂ−１
緩衝液 ｐＨ７．８
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール酸化酵素（ＣＯＤ） ０．３Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．１５％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４４】
試薬Ｂ−２
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＣＥ ３．０Ｕ／ｍＬ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来）
ノニオンＡ−１０Ｒ ０．５％
デオキシコール酸ナトリウム ８．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４５】
【００４６】
実験例
以下の試薬を調製し、各ファクターの効果を実験１〜４で検討した。検体は、一般人の血清１０例をプールしたのち、超遠心操作をしてえられる、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ画分を使用した。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体５μＬに各々１８０μＬの試薬１−Ｄ〜Ｇを加え、３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬１−Ｄ〜Ｇに各々相応する試薬２−Ｄ〜Ｇを各６０μＬ加え、３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を検定した。
【００４７】
実験１のための試薬１−Ｄと試薬２−Ｄ
試薬１−Ｄ
緩衝液 ｐＨ７．０
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４８】
試薬２−Ｄ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ０〜１５Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００４９】
実験２のための試薬１−Ｅと試薬２−Ｅ
試薬１−Ｅ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム ０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５０】
試薬２−Ｅ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５１】
実験３のための試薬１−Ｆと試薬２−Ｆ
試薬１−Ｆ
緩衝液 ｐＨ７．０
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０〜１．０％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５２】
試薬２−Ｆ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５３】
実験４のための試薬１−Ｇと試薬２−Ｇ
試薬１−Ｇ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０〜１．０％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５４】
試薬２−Ｇ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５５】
実験１についての考察（図１）
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来のＬＰＬのリポ蛋白画分に対する特異性を調べた結果、ＨＤＬおよびＶＬＤＬ画分に対して非常に強く作用し、ＬＤＬ画分に対して弱い反応性を示した。この酵素を使って、以下の実験を進めた。なお、各試薬中に、６Ｕ／ｍＬ添加することにした。
【００５６】
実験２についての考察（図２）
ヒドラジンの添加効果を確認した。ヒドラジンの添加は、ＬＰＬのＨＤＬ画分に対する特異的反応性を更に強めた。ＬＤＬ画分に対する反応性は、殆ど変動が見られなかった。この結果をもとに試薬１−Ｄに、１００ｍｍｏｌ／Ｌのヒドラジンを添加した。
【００５７】
実験３についての考察（図３）
ＨＬＢ値１７．３の非イオン界面活性剤のノニオンＫ−２３０／日本油脂株式会社を使って、ＨＤＬ画分に対する添加効果を確認した。非イオン界面活性剤の添加は、ＬＰＬのＶＬＤＬに対する反応性を極端にさげ、ＨＤＬ画分に対する特異的反応性を更に強めた。ＬＤＬ画分に対するＬＰＬの反応性も低下させる効果を確認した。この結果をもとに試薬１−Ｄに、０．６％のノニオンＫ−２３０を添加した。
【００５８】
実験４についての考察（図４）
各手段、すなわちノニオンＫ−２３０、ヒドラジンおよびＬＰＬを組合せて用いた結果、より完璧なＨＤＬ画分の選択的反応系を確立した。
【００５９】
産業上の利用の可能性
本発明の手段を適宜選択し単独であるいは組合せて導入した特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法では、反応液中に形成される複合体や凝集体による濁りが生じることがなく、目的とする特定のリポ蛋白中コレステロールの測定精度を上昇させることができる。
【００６０】
また本発明の測定方法を用いれば、生化学的検査項目を同時に測定してもその測定結果への影響がないため、リポ蛋白中コレステロールの測定と、生化学的検査項目の測定とを同時に行うことが可能となる。また本発明の測定方法は、遠心分離をする必要がなく、試薬分注操作も２段階であるため、汎用されているほとんどの自動分析装置に適用することができ、測定の簡易化を達成できる。
【００６１】
さらに本発明は、リポ蛋白中のコレステロールのみならず他の脂質成分（中性脂肪、リン脂質等）の測定にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１：リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ；ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）の添加効果を示した図である。（実験１）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図２：ヒドラジンの添加効果を示した図である。（実験２）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図３：ＨＬＢ値が１７．３である非イオン界面活性剤ノニオンＫ−２３０の添加効果を示した図である。（実験３）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図４：酵素反応液のイオン強度調整物質、非イオン界面活性剤ノニオンＫ−２３０、および選択された酵素を添加した効果を示した図である。（実験４）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
技術分野
本発明は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する手段および方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
古くからリポ蛋白は、超遠心操作により高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）に分画されていた。この操作は熟練が必要であり、超遠心機を備え付け、遠心を数日にわたって行う。そのため、多検体を処理することは出来なかった。
【０００３】
これに代わりポリエチレングリコール、またはデキストラン硫酸等のポリアニオンに、マグネシムやカルシウム等の二価カチオンを共存させたり、リンタングステン酸に二価カチオンを共存させた溶液と血清とを混和させてＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを沈澱させ、遠心後の上清に残るＨＤＬのみを分画する方法が主流となっていた。
【０００４】
この方法は、臨床検査の分野で広く普及している自動分析装置を用いることができる。すなわち分画したＨＤＬ中のコレステロールは、既に確立されている自動分析装置を用いた総コレステロールの酵素法による測定を応用して、その濃度を求めることができる。しかしながらこの方法も低速ではあるが遠心操作が必要であり、分画剤と血清を混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目と同時には測定出来なかった。臨床検査は迅速な対応が求められており、他の検査項目と同時に測定して検査時間を短縮することが課題となっていた。
【０００５】
一方、臨床的に動脈硬化のリスクファクターであるＬＤＬ中のコレステロール値を重視する報告［総コレステロールの基準値と設定根拠：動脈硬化，２４（６），２８０（１９９６）］もある。現在ＬＤＬ中のコレステロール値は総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、中性脂肪（ＴＧ）およびＨＤＬ中コレステロールの測定結果から、経験的なファクターを挿入して求める。その式［Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ Ｗ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１８，４９９〜５０２（１９７２）］は以下である。
ＬＤＬ中コレステロール値＝
総コレステロール値−ＨＤＬコレステロール値−ＴＧ値／５
この方法は、測定する３項目が全て正確に測定されなければ成立しない。また、ＴＧ値が４００ｍｇ／ｄＬを越えたり、ＬＤＬ中のコレステロール濃度が１００ｍｇ／ｄＬ以下になると、計算値がＬＤＬ中のコレステロール濃度を反映しなくなると言われている［Ｗａｒｎｉｃｋ Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６（１），１５〜１９（１９９０）］，［ＭｃＮａｍａｒａ Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６（１），３６〜４２（１９９０）］。従って、この方法では測定の目的であるＬＤＬ中のコレステロールの異常値を検出することが難しかった。
【０００６】
また他に、電気泳動でリポ蛋白を分離し蛋白量を測定する方法や、ＨＰＬＣによるリポ蛋白別コレステロールの測定法もあるが、いずれも検体処理能力に欠ける方法であり、高価な専用装置も必要となる。
【０００７】
近年、ＨＤＬ中のコレステロール測定に関して前述した問題を解決するため、ＨＤＬ中のコレステロールを全自動で測定するキットが開発され普及しつつある。特許第２６０００６５号公報、特開平８−２０１３９３号公報および特開平８−１３１１９５号公報にみられる技術は、分画剤を併用しており、分画剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が、自動分析装置で一般的に使用される洗剤により不溶性の沈殿物を形成し、それが該装置の廃液機構内で蓄積することにより、故障の原因となっている。
【０００８】
更に、測定反応中に不溶性の凝集物を形成し、測定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか、その凝集物により反応セルが汚染され、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えている。
【０００９】
このＨＤＬ中のコレステロールの自動測定法では、２ポイントエンド法、レート法、ダブルレート法、フィックスタイム法などの公知の測光法が選択できるようになっているので、濁ったままの状態でも測定は可能である。しかし、これらの測光法によってもこの濁りの中における測定は、反応中に濁度変化があったときは、測定値の正確性に問題が生ずる。また、反応液が濁ると再現性が低下する。それ故、測定する検体に制限が加わり、幅広い測定波長を用いることができず、多種多様な患者検体に対応することができない。例えば、３４０ｎｍ付近（短波長域）では凝集物による濁りの現象で吸光度が２〜３以上となり分析機の許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。
【００１０】
二価カチオンを用いることのない特開平９−９６６３７号公報記載の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清とを含ませる方法であるが、これも濁りの原因となる抗原抗体凝集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与える。また、反応液中の濁りが強くなるので、特に短波長域によるＨＤＬ中のコレステロール測定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能である。
【００１１】
これらの技術は、複合体や凝集体を形成することで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持つ測定への悪影響は、解消されない。このような濁りを最終的に消去する技術が濁り対策の一つである。特開平６−２４２１１０号公報に見られるように、濁りを最終的に消去する操作を加えれば、正確な測定値が得られるようになる。しかし、この方法では最低でも３〜４段階の試薬分注操作が必要となる。市販されている自動分析装置の中には３〜４段階の試薬分注操作に対応できるものもあるが、一般的に普及している生化学項目用の自動分析装置は最大２段階の試薬分注操作に対応しているものが多いので、この方法が応用できないことがあった。
【００１２】
一方、ＬＤＬ中のコレステロールの測定は、現在も前述したような計算による方法を取らざるを得ない状況である。近年、特開平０７−２８０８１２号公報、ＷＯ９６／２９５９９号公報、特開平０９−３１３２００号公報記載の技術に見られる、完全自動化を目指したＬＤＬ中のコレステロール測定法の報告がある。これらは、凝集体や複合体を形成する技術の延長線上にあるので、測定時の濁りの調整が今後の課題である。
【００１３】
発明の開示
本発明が解決しようとする課題は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する方法において、汎用の自動分析装置を用いて、処理工程中に遠心分離操作をすることなく、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中のＨＤＬ（高比重リポ蛋白）、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）、ＶＬＤＬ（超低比重リポ蛋白）等のリポ蛋白中の成分を定量する方法を提供することである。
【００１４】
本発明は、血清中の特定リポ蛋白画分中の成分を酵素反応で測定する方法において、特異的に該成分を測定するために、リポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段を導入することを特徴とする、特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法を提供する。特定のリポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段としては、酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加すること、非イオン界面活性剤を選択すること、および／または特定リポ蛋白に対する反応特異性を有する酵素を選択し用いること、が挙げられる。
【００１５】
本発明は、上記３つの手段を適宜選択し、単独であるいは組合せて利用することにより、ＨＤＬ中の成分の測定法、ＬＤＬ中の成分の測定法、および／またはＶＬＤＬ中の成分の測定方法を提供する。
【００１６】
本発明の測定方法は、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）中の成分を測定する場合、反応液のイオン強度を十分に高くすること、および／またはＨＤＬに優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼを作用させること、および／またはＨＤＬに反応選択性をもちＨＬＢ値が１６以上である非イオン界面活性剤を使用すること、を導入することを特徴とする。
【００１７】
さらに本発明の測定方法は、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）中のコレステロールを測定する場合、第一酵素反応系においてまずＨＤＬ画分中のコレスレロール成分を選択的に酵素反応させて測定または消化し、ついで第二酵素反応系においてＨＬＢ値が１１〜１３である非イオン界面活性剤を利用してＬＤＬ画分中のコレステロール成分を酵素反応により測定する方法を提供する。
【００１８】
さらにまた本発明の測定方法は、第一酵素反応系および第二酵素反応系を同時にまたは別々に行うことにより超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）中のコレステロール成分を残留させ、ついでＶＬＤＬ画分を分解する手段を導入してＶＬＤＬ画分中のコレステロール成分を酵素反応により測定する方法を提供する。また、ＨＤＬ、ＬＤＬの消去を伴わず、ＶＬＤＬ画分中のコレステロールを測定してもよい。
【００１９】
また本発明の測定方法は、上記本発明の測定方法にコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を添加して遊離のコレステロールを消化する工程を加えた測定方法をも含む。
【００２０】
上記本発明の測定方法は、その酵素反応液のｐＨが、リポ蛋白が凝集、または白濁を起こさない範囲であって、リポ蛋白中の成分を酵素反応させる酵素の至適ｐＨにより選択されることを特徴とする。
【００２１】
発明の実施の最良の形態
本発明の酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加することによる特定リポ蛋白成分に対する酵素の反応性を調整することとは、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬの各リポ蛋白画分が水溶解性において差異をもつことから、この性質を利用して特定画分のみを溶解させ、選択的に特定画分中の成分に対して酵素反応を起こすことを意味する。この目的を達成する一手段として、試料中のイオン強度を上昇させる。ＨＤＬを選択的に溶解させるためのイオン強度は、例えばヒドラジン濃度において約３０ｍＭ、より好ましくは６０ｍＭ以上を添加することによって得られる。ヒドラジンとしては、ヒドラジン類、その塩、その水和物、その溶媒和物から、ＨＤＬの選択溶解性を指標にして選ばれたものが、使用できる。同様に、ＮａＣｌ、尿素、グアニジン類、セミカルバジド類も、使用できる。イオン強度を上昇させるこれらの化合物は、単独でまたは複数を組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度は、ＨＤＬの選択溶解性を指標にして、用時実験的繰返しによって、決定できる。
【００２２】
本発明の、酵素の特定リポ蛋白に対する反応特異性を利用して特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）および／またはコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を選択して行う。この酵素としては、市販のＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来のＬＰＬ、ＣＥが例示される。なお、ＬＤＬ画分を対象にする場合には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の酵素などを適宜選択することができる。酵素について、各種修飾化は、酵素活性と特定リポ蛋白画分への選択性が維持されていれば、為されても為されなくてもよい。酵素の添加量は、自体公知の基質量に応じて増減され調整される。
【００２３】
本発明の、選択された非イオン界面活性剤の特定リポ蛋白に対する反応選択性を利用して、特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、非イオン界面活性剤のＨＬＢ値によって特定される。
【００２４】
ＨＤＬ画分を対象にする場合、ＨＬＢ値が１６以上のものが選択され、好適には１７以上が選択される。より好ましくは、ＨＬＢ値が１７以上のポリオキシエチレンエーテル類が選択される。この選択された界面活性剤は、ＬＤＬ画分及びＶＬＤＬ画分に対するＬＰＬ、ＣＥ、コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）等の酵素作用を阻害する。具体例を以下に列記するが、本発明に用いる非イオン界面活性剤は、ＨＬＢ値を指標にして随時選択可能であり、下記の例に限定されない；セチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカル株式会社：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂株式会社：ノニオンＫ−２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂株式会社：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）等。
【００２５】
ＬＤＬ画分またはＶＬＤＬ画分を対象にする場合、とくに積極的にＬＤＬ画分の成分への酵素反応を対象とする場合には、ＨＬＢ値が１１〜１３の非イオン界面活性剤が選択される。例示をすれば、トリトンＸ−１００、ノニオンＨＳ２１０、ノニオンＡ−１０Ｒ（日本油脂株式会社）があげられる。しかし、ＬＤＬ画分の成分を測定するため使用する界面活性剤も、ＨＬＢ値を指標にして随時選択することができ、これらの例に限定されない。
【００２６】
上記界面活性剤の添加量は、測定するリポ蛋白量により変化するが、ＨＤＬおよびＬＤＬを対象とした事例において示したのは、検体約５μＬに対して、界面活性剤濃度０．０１〜１０％の試薬約１８０μＬである。これにより、ＨＤＬまたはＬＤＬが選択的に分解され、これらに含まれる成分の酵素反応が可能となる。ＶＬＤＬを対象とする場合には、界面活性剤濃度を０．０５〜２０％に調整して使用される。これにより、ＶＬＤＬが選択的に分解され、これに含まれる成分の酵素反応が可能となる。
【００２７】
酵素反応がなされる反応液のｐＨは、リポ蛋白が凝集または白濁をおこさない範囲であって、リポ蛋白中の成分に作用する酵素の至適ｐＨを考慮して選択される。好適には、ｐＨ約６〜約９である。ｐＨが約６以下であると、リポ蛋白が白濁をおこす。リポ蛋白が比較的安定なｐＨ７付近を選択して測定条件を調整すればよいが、ＣＯＤ（コレステロール酸化酵素）、ＣＤＨ（コレステロール脱水素酵素）、ＬＰＬ、およびＣＥ等の酵素の至適ｐＨも考慮する。好適には、ＣＤＨ、ＬＰＬ、およびＣＥの反応は、ｐＨ約７〜約９が望ましく、ＣＯＤの反応は、ｐＨ約６〜約８が望ましい。反応液は、緩衝液で調整することが好ましく、通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用できる。例示すれば、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４′−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、リン酸緩衝液、を添加物との適合性により適宜選択して利用する。なお、本発明の実施例および実験例では、ｐＨ条件に合わせて、各々ＰＩＰＥＳ緩衝液およびＴＡＰＳ緩衝液を利用した。
【００２８】
また所望により、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロン中の遊離型コレステロールが、ＨＤＬ中のコレステロール測定時の反応に関与して、しばしば誤差の原因となるので、予めＣＯＤやＣＤＨでこれらの遊離型コレステロールを反応させてヒドラジン存在下で、コレステノンヒドラゾンに変換し、ＨＤＬ中のコレステロール測定時のために、非基質化しておく方法もある。非基質化する技術は公知であり、例えば特開平５−１７６７９７号公報を参考にすればよい。
【００２９】
本発明においては、上記３つの手段、イオン強度の選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独でまたは適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全ての手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入する必要は無い。
【００３０】
ＨＤＬ中のコレステロール成分を測定する場合、第一の要件は、水溶性が高い高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）中の成分を溶液中に溶解しやすくするためにイオン強度を十分な程度に高く調整することであり、第二の要件はＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）および／またはコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を選択して作用させることであり、第三の要件はＨＤＬ画分に対して反応選択性をもちＨＬＢ値が１６以上である非イオン界面活性剤を用いてＨＤＬ画分中の成分に対して直接的および／または優先的に反応液中で酵素反応をおこすことである。
【００３１】
リポ蛋白中の成分であるコレステロールを酵素測定法で測定する場合、酵素としてＣＤＨを用いるときは補酵素として、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等を使用する。また、ＣＯＤを使用するときは、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）と公知の過酸化水素定量法を組み合わせて測定を行う。総コレステロールの測定に必要となる酵素の活性化剤であるコール酸類や界面活性剤は、その条件を適宜選択し、実験的繰り返しにより濃度を調整すればよい。
【００３２】
ＬＤＬ中のコレステロール成分を測定する場合は、まず上記のＨＤＬ画分中のコレステロール成分を第一酵素反応系において選択的に酵素反応させ、ついで第二酵素反応系においてＬＤＬ画分に対して作用するＬＰＬおよび／またはＣＥとＬＤＬを積極的に分解する界面活性剤とを加え、ＣＤＨによる反応生産物を検出する。
【００３３】
酵素反応生産物の測定は、ＣＥ、ＬＰＬ等の酵素作用によって生成される化合物であるコレステロールを定量する自体公知の方法から適宜に以下に示すような測定系を選択して行う。例えば、ＣＤＨ−ＮＡＤ系を用いる場合は３４０ｎｍの吸光度で測定し、ＣＤＨ−ｔ−ＮＡＤ系を用いる場合は４０５ｎｍの吸光度で測定し、ＣＯＤ系を用いる場合、５００ｎｍ以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定する。測光法は、既知のレート法、２ポイントエンド法等が所望により利用できる。
【００３４】
実施例
実施例１
以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清１０例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体５μＬに、試薬１−ＡまたはＢまたはＣ１８０μＬをそれぞれ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬２を６０μＬ加えて３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて、ＨＤＬ−コレステロール濃度が既知のコントロールを標準液として検体の値を換算した。対照法としてポリエチレングリコール（ＰＧ）法を用いた。ＰＧ法は国際試薬株式会社製ＰＧポールを使用した。また、遠心後の上清のコレテロール濃度は、国際試薬株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ａを用いて求めた。測定結果として対照法との比較を表１に示した。試薬１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃを用いた測定は対照法によく一致した良好な結果となった。
【００３５】
試薬１−Ａ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．６％
【００３６】
試薬１−Ｂ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｂｒｉｊ９７（ＨＬＢ値１９） ０．２４％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００３７】
試薬１−Ｃ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．２％
コレステロール酸化酵素（ＣＯＤ） １．０Ｕ／ｍＬ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００３８】
試薬２
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００３９】
実施例２
以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清１０例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず検体３μＬに試薬Ａ−１を２１０μＬ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ａ−２を７０μＬ加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めてＬＤＬ−コレステロール濃度が既知のコントロールを標準液として検体の値を換算した。試薬Ｂ−１と試薬Ｂ−２も前述と同様に操作する。対照法の値は、フリーデワルド式より求めた。ＨＤＬコレステロール値は、国際試薬株式会社製ＰＧポールを使用した。総コレステロール値は、国際試株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ａを用いて求めた。ＴＧ値は、国際試薬株式会社製ＴＧ試薬・Ａを用いて求めた。測定結果を表２に示した。本法は、対照法と比べて良好な結果を得た。
【００４１】
試薬Ａ−１
緩衝液 ｐＨ７．８
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．１５％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４２】
試薬Ａ−２
緩衝液 ｐＨ８．５
ＣＥ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来） ３．０Ｕ／ｍＬ
ノニオンＡ−１０Ｒ ０．５％
デオキシコール酸ナトリウム ８．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４３】
試薬Ｂ−１
緩衝液 ｐＨ７．８
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール酸化酵素（ＣＯＤ） ０．３Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．１５％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４４】
試薬Ｂ−２
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＣＥ ３．０Ｕ／ｍＬ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来）
ノニオンＡ−１０Ｒ ０．５％
デオキシコール酸ナトリウム ８．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４５】
実験例
以下の試薬を調製し、各ファクターの効果を実験１〜４で検討した。検体は、一般人の血清１０例をプールしたのち、超遠心操作をしてえられる、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ画分を使用した。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体５μＬに各々１８０μＬの試薬１−Ｄ〜Ｇを加え、３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬１−Ｄ〜Ｇに各々相応する試薬２−Ｄ〜Ｇを各６０μＬ加え、３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍおよび副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を検定した。
【００４７】
実験１のための試薬１−Ｄと試薬２−Ｄ
試薬１−Ｄ
緩衝液 ｐＨ７．０
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００４８】
試薬２−Ｄ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ０〜１５Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００４９】
実験２のための試薬１−Ｅと試薬２−Ｅ
試薬１−Ｅ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム ０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５０】
試薬２−Ｅ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５１】
実験３のための試薬１−Ｆと試薬２−Ｆ
試薬１−Ｆ
緩衝液 ｐＨ７．０
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０〜１．０％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５２】
試薬２−Ｆ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５３】
実験４のための試薬１−Ｇと試薬２−Ｇ
試薬１−Ｇ
緩衝液 ｐＨ７．０
二塩化ヒドラジニウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ＮＡＤ ６．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０〜１．０％
コール酸ナトリウム ０．１％
【００５４】
試薬２−Ｇ
緩衝液 ｐＨ８．５
コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ） ２０．０Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６．０Ｕ／ｍＬ
（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）
コール酸ナトリウム ０．２％
【００５５】
実験１についての考察（図１）
Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来のＬＰＬのリポ蛋白画分に対する特異性を調べた結果、ＨＤＬおよびＶＬＤＬ画分に対して非常に強く作用し、ＬＤＬ画分に対して弱い反応性を示した。この酵素を使って、以下の実験を進めた。なお、各試薬中に、６Ｕ／ｍＬ添加することにした。
【００５６】
実験２についての考察（図２）
ヒドラジンの添加効果を確認した。ヒドラジンの添加は、ＬＰＬのＨＤＬ画分に対する特異的反応性を更に強めた。ＬＤＬ画分に対する反応性は、殆ど変動が見られなかった。この結果をもとに試薬１−Ｄに、１００ｍｍｏｌ／Ｌのヒドラジンを添加した。
【００５７】
実験３についての考察（図３）
ＨＬＢ値１７．３の非イオン界面活性剤のノニオンＫ−２３０／日本油脂株式会社を使って、ＨＤＬ画分に対する添加効果を確認した。非イオン界面活性剤の添加は、ＬＰＬのＶＬＤＬに対する反応性を極端にさげ、ＨＤＬ画分に対する特異的反応性を更に強めた。ＬＤＬ画分に対するＬＰＬの反応性も低下させる効果を確認した。この結果をもとに試薬１−Ｄに、０．６％のノニオンＫ−２３０を添加した。
【００５８】
実験４についての考察（図４）
各手段、すなわちノニオンＫ−２３０、ヒドラジンおよびＬＰＬを組合せて用いた結果、より完璧なＨＤＬ画分の選択的反応系を確立した。
【００５９】
産業上の利用の可能性
本発明の手段を適宜選択し単独であるいは組合せて導入した特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法では、反応液中に形成される複合体や凝集体による濁りが生じることがなく、目的とする特定のリポ蛋白中コレステロールの測定精度を上昇させることができる。
【００６０】
また本発明の測定方法を用いれば、生化学的検査項目を同時に測定してもその測定結果への影響がないため、リポ蛋白中コレステロールの測定と、生化学的検査項目の測定とを同時に行うことが可能となる。また本発明の測定方法は、遠心分離をする必要がなく、試薬分注操作も２段階であるため、汎用されているほとんどの自動分析装置に適用することができ、測定の簡易化を達成できる。
【００６１】
さらに本発明は、リポ蛋白中のコレステロールのみならず他の脂質成分（中性脂肪、リン脂質等）の測定にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１：リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ；ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ由来）の添加効果を示した図である。（実験１）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図２：ヒドラジンの添加効果を示した図である。（実験２）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図３：ＨＬＢ値が１７．３である非イオン界面活性剤ノニオンＫ−２３０の添加効果を示した図である。（実験３）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
図４：酵素反応液のイオン強度調整物質、非イオン界面活性剤ノニオンＫ−２３０、および選択された酵素を添加した効果を示した図である。（実験４）図中、−●−はＨＤＬ画分、−○−はＬＤＬ画分、−□−はＶＬＤＬ画分の反応相対量（％）を示す。
Claims (4)
- 生体試料中の高比重リポ蛋白中コレステロールを測定する方法であって、
ヒドラジン塩及びＨＬＢが１７〜１９の非イオン界面活性剤とを含む第一試薬と、前記生体試料とを混合する工程、
前記工程で調製された混合液に、さらに前記高比重リポ蛋白に反応する第１酵素と、コレステロール脱水素酵素及びコレステロール酸化酵素からなる群より選択される少なくとも１つの第２酵素とを含む第二試薬を混合する工程、及び
混合物の吸光度を測定して前記高比重リポ蛋白中コレステロールを測定する工程、
を含む高比重リポ蛋白中コレステロール測定方法。 - 前記第１酵素が、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１に記載の方法。
- 生体試料中の高比重リポ蛋白中コレステロールを測定する試薬キットであって、
ヒドラジン塩と、ＨＬＢが１７〜１９の非イオン界面活性剤とを含む第一試薬、及び
前記高比重リポ蛋白に反応する第１酵素と、コレステロール脱水素酵素及びコレステロール酸化酵素からなる群より選択される少なくとも１つの第２酵素とを含む第二試薬、
を備える高比重リポ蛋白中コレステロール測定試薬キット。 - 前記第１酵素が、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる群より選択される少なくとも１つである請求項３に記載の試薬キット。
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