JPH09299A - 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キット - Google Patents
高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キットInfo
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- JPH09299A JPH09299A JP15495995A JP15495995A JPH09299A JP H09299 A JPH09299 A JP H09299A JP 15495995 A JP15495995 A JP 15495995A JP 15495995 A JP15495995 A JP 15495995A JP H09299 A JPH09299 A JP H09299A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビ
タンエステルにより、試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）以外のリポ蛋白分画中のコレステロールにコレステ
ロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼな
どの酵素を優先的に作用させて、過酸化水素を生成させ
る。ペルオキシダーゼの存在下で無色の複合体を形成さ
せて、過酸化水素を反応系外に導く。次に、界面活性剤
アルキルポリオキシエチレンエーテルにより、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する
これら酵素の作用を抑制させるとともに、ＨＤＬコレス
テロールに酵素を作用させて、過酸化水素を生成させ
る。過酸化水素により生成されたキノン色素を比色測定
して、ＨＤＬコレステロールを定量する。 【効果】 操作が簡略化され、多数の試料を短時間で処
理できる。微量の試料でも自動分析装置にて連続的に測
定できる。臨床検査の日常業務における作業効率の向上
に貢献できる。
タンエステルにより、試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）以外のリポ蛋白分画中のコレステロールにコレステ
ロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼな
どの酵素を優先的に作用させて、過酸化水素を生成させ
る。ペルオキシダーゼの存在下で無色の複合体を形成さ
せて、過酸化水素を反応系外に導く。次に、界面活性剤
アルキルポリオキシエチレンエーテルにより、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する
これら酵素の作用を抑制させるとともに、ＨＤＬコレス
テロールに酵素を作用させて、過酸化水素を生成させ
る。過酸化水素により生成されたキノン色素を比色測定
して、ＨＤＬコレステロールを定量する。 【効果】 操作が簡略化され、多数の試料を短時間で処
理できる。微量の試料でも自動分析装置にて連続的に測
定できる。臨床検査の日常業務における作業効率の向上
に貢献できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高比重リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）分画中のコレステロール（以下「ＨＤＬコレステロ
ール」ともいう。）の定量方法及び定量用試薬キットに
関し、とりわけ臨床検査の分野において、血清などの生
体試料中のＨＤＬコレステロールの定量方法、及びＨＤ
Ｌコレステロール定量用試薬キットに関する。
Ｌ）分画中のコレステロール（以下「ＨＤＬコレステロ
ール」ともいう。）の定量方法及び定量用試薬キットに
関し、とりわけ臨床検査の分野において、血清などの生
体試料中のＨＤＬコレステロールの定量方法、及びＨＤ
Ｌコレステロール定量用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】血液中のリポ蛋白はその比重により、カ
イロミクロン（比重＜１．００６）、超低比重リポ蛋白
（ＶＬＤＬ，比重１．００６〜１．０１９）、低比重リ
ポ蛋白（ＬＤＬ，比重１．０１９〜１．０６３）、高比
重リポ蛋白（ＨＤＬ，比重１．０６３〜１．２１）など
に分類され、これらのリポ蛋白の代謝に影響を与える疾
患についての研究が進められてきた。中でもＨＤＬにつ
いては、その分画中の成分であるコレステロールが虚血
性心疾患に密接に関係するとの１９７７年のFramingham
の報告以来、急速に研究が進んでいる。
イロミクロン（比重＜１．００６）、超低比重リポ蛋白
（ＶＬＤＬ，比重１．００６〜１．０１９）、低比重リ
ポ蛋白（ＬＤＬ，比重１．０１９〜１．０６３）、高比
重リポ蛋白（ＨＤＬ，比重１．０６３〜１．２１）など
に分類され、これらのリポ蛋白の代謝に影響を与える疾
患についての研究が進められてきた。中でもＨＤＬにつ
いては、その分画中の成分であるコレステロールが虚血
性心疾患に密接に関係するとの１９７７年のFramingham
の報告以来、急速に研究が進んでいる。
【０００３】従来、ＨＤＬコレステロールの定量は沈殿
分画法、超遠心法、電気泳動法などにより分離されたＨ
ＤＬ分画について、その成分であるコレステロールが公
知の方法にて測定されている。臨床検査での測定では、
沈殿分画法がよく行われている。これは沈殿剤を用いて
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画を沈殿させ、それを遠心分離
してＨＤＬ分画を得る。このときの沈殿剤としては、ポ
リアニオンと２価のカチオンとの組み合わせが良く用い
られる。このようなポリアニオンにはポリエチレングリ
コール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などが
あり、また２価のカチオンとしてはＭｇ、Ｍｎ、Ｃａ、
Ｌｉ、Ｎｉなどが知られている。
分画法、超遠心法、電気泳動法などにより分離されたＨ
ＤＬ分画について、その成分であるコレステロールが公
知の方法にて測定されている。臨床検査での測定では、
沈殿分画法がよく行われている。これは沈殿剤を用いて
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画を沈殿させ、それを遠心分離
してＨＤＬ分画を得る。このときの沈殿剤としては、ポ
リアニオンと２価のカチオンとの組み合わせが良く用い
られる。このようなポリアニオンにはポリエチレングリ
コール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などが
あり、また２価のカチオンとしてはＭｇ、Ｍｎ、Ｃａ、
Ｌｉ、Ｎｉなどが知られている。
【０００４】次に、遠心分離により得られたＨＤＬ分画
中のコレステロールを定量する公知の方法としては、酵
素反応による測定が良く用いられる。なかでも、コレス
テロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステロールオキシ
ダーゼ（ＣＯ）を用い、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）と色原体とを組み合わせて可視部領域で吸光度を測
定する方法が良く知られている。
中のコレステロールを定量する公知の方法としては、酵
素反応による測定が良く用いられる。なかでも、コレス
テロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステロールオキシ
ダーゼ（ＣＯ）を用い、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）と色原体とを組み合わせて可視部領域で吸光度を測
定する方法が良く知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の沈殿剤を用いる方法で、ＨＤＬ分画を分離す
るには、遠心分離の操作が必要となるため、臨床検査の
日常業務で効率化のための自動分析装置を用いる場合に
は、直接利用できないという制約があった。そのためＨ
ＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル
化して測定するには支障があった。
うな従来の沈殿剤を用いる方法で、ＨＤＬ分画を分離す
るには、遠心分離の操作が必要となるため、臨床検査の
日常業務で効率化のための自動分析装置を用いる場合に
は、直接利用できないという制約があった。そのためＨ
ＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル
化して測定するには支障があった。
【０００６】本発明は、上述の課題を解決し、ＨＤＬコ
レステロールを効率良く測定することを目的とし、とり
わけ臨床検査において自動分析装置を用いて測定できる
有用な方法及びそのための試薬キットを提供することを
目的とする。
レステロールを効率良く測定することを目的とし、とり
わけ臨床検査において自動分析装置を用いて測定できる
有用な方法及びそのための試薬キットを提供することを
目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究し
た結果、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロール
に酵素を優先的に作用させる界面活性剤と、ＨＤＬ以外
のリポ蛋白分画中のコレスレロールに対する酵素による
作用を抑制させる界面活性剤とを用いることにより、Ｈ
ＤＬ分画中のコレステロールが測定できることを見い出
した。そして、さらに研究を重ねた結果、上述の目的が
達成されることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
た結果、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロール
に酵素を優先的に作用させる界面活性剤と、ＨＤＬ以外
のリポ蛋白分画中のコレスレロールに対する酵素による
作用を抑制させる界面活性剤とを用いることにより、Ｈ
ＤＬ分画中のコレステロールが測定できることを見い出
した。そして、さらに研究を重ねた結果、上述の目的が
達成されることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００８】すなわち、本発明は、界面活性剤アシルポ
リオキシエチレンソルビタンエステルにより、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に
作用させて得られる反応生成物を反応系外に導き、次に
界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルによ
り、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロ
ールに対する酵素による作用を抑制させるとともに、Ｈ
ＤＬコレステロールに酵素を作用させて反応を進行させ
ることを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量方法に
関するものである。
リオキシエチレンソルビタンエステルにより、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に
作用させて得られる反応生成物を反応系外に導き、次に
界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルによ
り、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロ
ールに対する酵素による作用を抑制させるとともに、Ｈ
ＤＬコレステロールに酵素を作用させて反応を進行させ
ることを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量方法に
関するものである。
【０００９】また、本発明は、界面活性剤アシルポリオ
キシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試
薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテル
を含む第２試薬とからなることを特徴とするＨＤＬコレ
ステロール定量用試薬キットに関するものである。
キシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試
薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテル
を含む第２試薬とからなることを特徴とするＨＤＬコレ
ステロール定量用試薬キットに関するものである。
【００１０】本発明の試薬キットにおける、コレステロ
ールに作用する酵素としては、コレステロールエステラ
ーゼ（ＣＥ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）な
どが例示される。リポ蛋白分画中には、コレステロール
の他にコレステロールエステルも含まれているので、通
常、コレステロールエステルを加水分解させてコレステ
ロールに変換させるために、コレステロールエステラー
ゼ（ＣＥ）をコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）と共
存させる。
ールに作用する酵素としては、コレステロールエステラ
ーゼ（ＣＥ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）な
どが例示される。リポ蛋白分画中には、コレステロール
の他にコレステロールエステルも含まれているので、通
常、コレステロールエステルを加水分解させてコレステ
ロールに変換させるために、コレステロールエステラー
ゼ（ＣＥ）をコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）と共
存させる。
【００１１】本発明の試薬キットにおける第１試薬中の
酵素は、例えばＣＥの場合には、１単位／ｍｌ〜１００
単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍ
ｌ、ＣＯの場合には、０．５単位／ｍｌ〜１００単位／
ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌとなる
ように配合するが、試料の種類などに応じて適宜決定さ
れる。
酵素は、例えばＣＥの場合には、１単位／ｍｌ〜１００
単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍ
ｌ、ＣＯの場合には、０．５単位／ｍｌ〜１００単位／
ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌとなる
ように配合するが、試料の種類などに応じて適宜決定さ
れる。
【００１２】ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画であるＬＤＬ、
ＶＬＤＬ、カイロミクロンなどに含まれるコレステロー
ルに対して、上記酵素を優先的に作用させる界面活性剤
アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常
Ｃn ソルビタンＥx と略記される、親水性部分にポリオ
キシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発
明の目的に適合するものであれば全て用いることができ
る。具体的な商品名としては、Tween ２１（Ｃ12ソルビ
タンＥ4 ）、Tween ８１（Ｃ12ソルビタンＥ5）、Tween
２０（Ｃ12ソルビタンＥ20）、Tween ４０（Ｃ16ソル
ビタンＥ20）、Tween ６０（Ｃ18ソルビタンＥ20）、Tw
een ８０（Ｃ18:1ソルビタンＥ20）、Emasol４１３０
（Ｃ18ソルビタンＥx ）、Tween ８５（Ｃ17:1ソルビタ
ンＥ20）などが例示される。
ＶＬＤＬ、カイロミクロンなどに含まれるコレステロー
ルに対して、上記酵素を優先的に作用させる界面活性剤
アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常
Ｃn ソルビタンＥx と略記される、親水性部分にポリオ
キシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発
明の目的に適合するものであれば全て用いることができ
る。具体的な商品名としては、Tween ２１（Ｃ12ソルビ
タンＥ4 ）、Tween ８１（Ｃ12ソルビタンＥ5）、Tween
２０（Ｃ12ソルビタンＥ20）、Tween ４０（Ｃ16ソル
ビタンＥ20）、Tween ６０（Ｃ18ソルビタンＥ20）、Tw
een ８０（Ｃ18:1ソルビタンＥ20）、Emasol４１３０
（Ｃ18ソルビタンＥx ）、Tween ８５（Ｃ17:1ソルビタ
ンＥ20）などが例示される。
【００１３】本発明の試薬キットにおける第１試薬中の
界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステ
ルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜
０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．
０５ｗ／ｖ％となるように配合されるが、試料の種類な
どに応じて適宜決定される。
界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステ
ルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜
０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．
０５ｗ／ｖ％となるように配合されるが、試料の種類な
どに応じて適宜決定される。
【００１４】ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロ
ールに対する上記酵素の作用を抑制させる界面活性剤ア
ルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常Ｃn Ｅx と
略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非
イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するも
のであれば全て用いることができる。具体的な商品名と
しては、Atlas Ｇ２１２７（Ｃ12Ｅ8 ）、Brij３６Ｔ
（Ｃ12Ｅ10）、Nopalcal６−Ｌ（Ｃ12Ｅ14）、Brij３５
（Ｃ12Ｅ23）、Emulogphene ＢＣ７２０（Ｃ
12Ｅ 9.8 ）、SteroxＡＪ１００（Ｃ13Ｅ9.5 ）、Brij５
６（Ｃ16Ｅ10）、Brij５８（Ｃ16Ｅ20）、Brij７６（Ｃ
18Ｅ10）、Brij９６（Ｃ18:1Ｅ10）、Brij７８（Ｃ18Ｅ
20）、Brij９８（Ｃ18:1Ｅ29）などが例示される。
ールに対する上記酵素の作用を抑制させる界面活性剤ア
ルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常Ｃn Ｅx と
略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非
イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するも
のであれば全て用いることができる。具体的な商品名と
しては、Atlas Ｇ２１２７（Ｃ12Ｅ8 ）、Brij３６Ｔ
（Ｃ12Ｅ10）、Nopalcal６−Ｌ（Ｃ12Ｅ14）、Brij３５
（Ｃ12Ｅ23）、Emulogphene ＢＣ７２０（Ｃ
12Ｅ 9.8 ）、SteroxＡＪ１００（Ｃ13Ｅ9.5 ）、Brij５
６（Ｃ16Ｅ10）、Brij５８（Ｃ16Ｅ20）、Brij７６（Ｃ
18Ｅ10）、Brij９６（Ｃ18:1Ｅ10）、Brij７８（Ｃ18Ｅ
20）、Brij９８（Ｃ18:1Ｅ29）などが例示される。
【００１５】本発明の試薬キットにおける第２試薬中の
界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通
常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ
％、好ましくは０．０５ｗ／ｖ％〜２ｗ／ｖ％となり、
また第１試薬中に配合される界面活性剤アシルポリオキ
シエチレンソルビタンエステルよりも高濃度となるよう
に配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定され
る。
界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通
常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ
％、好ましくは０．０５ｗ／ｖ％〜２ｗ／ｖ％となり、
また第１試薬中に配合される界面活性剤アシルポリオキ
シエチレンソルビタンエステルよりも高濃度となるよう
に配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定され
る。
【００１６】本発明の定量方法では、まずコレステロー
ルに作用する酵素と、上記界面活性剤アシルポリオキシ
エチレンソルビタンエステルと、試料とを混合させる。
すると、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタ
ンエステルの存在により、反応液中に含まれる酵素が、
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに優先的
に作用する。
ルに作用する酵素と、上記界面活性剤アシルポリオキシ
エチレンソルビタンエステルと、試料とを混合させる。
すると、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタ
ンエステルの存在により、反応液中に含まれる酵素が、
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに優先的
に作用する。
【００１７】酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合
には、酵素の作用によりコレステロールの反応生成物と
して過酸化水素が生成する。本発明の定量方法において
は、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレ
ンエーテルを反応系に混在させる前に、生成した反応生
成物を反応系外に導く必要があり、例えば色原体が用い
られる。色原体は、ニトロ基、アゾ基、カルボニル基、
エチレン結合、シアン基などの発色団を含み、水酸基、
アミノ基などの助色団を含まない有機化合物である。本
発明において用いられ得る色原体としては、単独では発
色能力が弱いが、上記助色団を含む有機化合物が共存す
ることにより、発色能力が増強されるものが好ましい。
反応生成物が過酸化水素である場合には、ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）の存在下で、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナト
リウム塩（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ
Ｓ）などの色原体と過酸化水素とを反応させて、無色の
複合体を形成させ、過酸化水素を反応系外に導くことが
できる。
には、酵素の作用によりコレステロールの反応生成物と
して過酸化水素が生成する。本発明の定量方法において
は、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレ
ンエーテルを反応系に混在させる前に、生成した反応生
成物を反応系外に導く必要があり、例えば色原体が用い
られる。色原体は、ニトロ基、アゾ基、カルボニル基、
エチレン結合、シアン基などの発色団を含み、水酸基、
アミノ基などの助色団を含まない有機化合物である。本
発明において用いられ得る色原体としては、単独では発
色能力が弱いが、上記助色団を含む有機化合物が共存す
ることにより、発色能力が増強されるものが好ましい。
反応生成物が過酸化水素である場合には、ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）の存在下で、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナト
リウム塩（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ
Ｓ）などの色原体と過酸化水素とを反応させて、無色の
複合体を形成させ、過酸化水素を反応系外に導くことが
できる。
【００１８】通常、ＰＯＤは、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０
Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌ、色
原体の濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％、好ま
しくは０．０１ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％とするが、試
料の種類などに応じて適宜決定される。
Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌ、色
原体の濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％、好ま
しくは０．０１ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％とするが、試
料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１９】次に、反応液中に、第２試薬中の界面活性
剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを混在させるこ
とによって、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコ
レステロールに対して、酵素の作用が抑制されるととも
に、酵素がＨＤＬコレステロールに対して作用し、酵素
の作用によりコレステロールの反応が進行する。
剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを混在させるこ
とによって、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコ
レステロールに対して、酵素の作用が抑制されるととも
に、酵素がＨＤＬコレステロールに対して作用し、酵素
の作用によりコレステロールの反応が進行する。
【００２０】酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合
には、この反応により過酸化水素が生成される。この過
酸化水素は、ＰＯＤの存在下で、例えば４−アミノアン
チピリンなどの助色団を含む有機化合物（０．００１ｗ
／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ
％〜０．０５ｗ／ｖ％）と、色原体とを縮合反応させ、
キノン色素を生成させる。なお、色原体としては、上述
のＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどを挙げることができる。こ
のキノン色素を比色測定することによって、ＨＤＬコレ
ステロールが測定できる。比色測定は既知の方法により
行うことができ、例えば自動分析装置を用いて行うこと
ができる。
には、この反応により過酸化水素が生成される。この過
酸化水素は、ＰＯＤの存在下で、例えば４−アミノアン
チピリンなどの助色団を含む有機化合物（０．００１ｗ
／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ
％〜０．０５ｗ／ｖ％）と、色原体とを縮合反応させ、
キノン色素を生成させる。なお、色原体としては、上述
のＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどを挙げることができる。こ
のキノン色素を比色測定することによって、ＨＤＬコレ
ステロールが測定できる。比色測定は既知の方法により
行うことができ、例えば自動分析装置を用いて行うこと
ができる。
【００２１】本発明方法における各反応、即ち第２試薬
を反応系に混在させる前または混在させた後の各反応
は、それぞれ通常、室温下で、１分間〜１０分間、好ま
しくは３分間〜７分間行なわれるが、特にこの条件に限
定されるものではない。
を反応系に混在させる前または混在させた後の各反応
は、それぞれ通常、室温下で、１分間〜１０分間、好ま
しくは３分間〜７分間行なわれるが、特にこの条件に限
定されるものではない。
【００２２】本発明のＨＤＬコレステロール定量用試薬
キットは、前述の界面活性剤アシルポリオキシエチレン
ソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活
性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試
薬とからなる。
キットは、前述の界面活性剤アシルポリオキシエチレン
ソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活
性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試
薬とからなる。
【００２３】第１試薬中の酵素には、例えばＣＥ、ＣＯ
などを挙げることができる。また第１試薬中には、酵素
の他に、通常例えば、酵素ＰＯＤ、さらにＨＤＡＯＳ、
ＴＯＯＳなどの色原体が配合され得るが、これらの色原
体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−ア
ミノアンチピリンなどは配合されない。
などを挙げることができる。また第１試薬中には、酵素
の他に、通常例えば、酵素ＰＯＤ、さらにＨＤＡＯＳ、
ＴＯＯＳなどの色原体が配合され得るが、これらの色原
体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−ア
ミノアンチピリンなどは配合されない。
【００２４】これに対して、第２試薬中には、当該界面
活性剤の他に、通常、色原体と反応してキノン色素を生
成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどが配合
される。
活性剤の他に、通常、色原体と反応してキノン色素を生
成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどが配合
される。
【００２５】なお、本発明の試薬キットは、遅くともＨ
ＤＬコレステロールの定量測定時において、このように
第１及び第２の二種類の試薬に分かれていれば良い。従
って、一般に試薬キットとしての形態は、安定性などを
考慮して三種類以上の試薬に分けておき、測定のため使
用時において上記の第１及び第２の二種類の試薬に調製
するようなものでも良い。
ＤＬコレステロールの定量測定時において、このように
第１及び第２の二種類の試薬に分かれていれば良い。従
って、一般に試薬キットとしての形態は、安定性などを
考慮して三種類以上の試薬に分けておき、測定のため使
用時において上記の第１及び第２の二種類の試薬に調製
するようなものでも良い。
【００２６】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するため実施
例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２７】〔実施例１〕界面活性剤アシルポリオキシ
エチレンソルビタンエステルとして商品名がＴｗｅｅｎ
８５、また界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエー
テルとして商品名がＢｒｉｊ９８の界面活性剤をそれぞ
れ使用して、次の第１及び第２試薬を準備した。
エチレンソルビタンエステルとして商品名がＴｗｅｅｎ
８５、また界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエー
テルとして商品名がＢｒｉｊ９８の界面活性剤をそれぞ
れ使用して、次の第１及び第２試薬を準備した。
【００２８】〈第１試薬〉１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、０．１２ｍｇ／ｍｌのＨＤＡＯＳ、０．６
単位／ｍｌのＰＯＤ、１０単位／ｍｌのＣＯ、１０単位
／ｍｌのＣＥ、０．０１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８５
Ｈ７．０）、０．１２ｍｇ／ｍｌのＨＤＡＯＳ、０．６
単位／ｍｌのＰＯＤ、１０単位／ｍｌのＣＯ、１０単位
／ｍｌのＣＥ、０．０１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８５
【００２９】〈第２試薬〉１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピ
リン、１．５ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ９８
Ｈ７．０）、０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピ
リン、１．５ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ９８
【００３０】日立７１７０型自動分析装置を用いて、試
料４μｌに第１試薬２５０μｌを加え、５分後に第２試
薬５０μｌを加え、５分後に波長６００ｎｍ／７００ｎ
ｍで測定した。試料としてＨＤＬコレステロール濃度が
１５０ｍｇ／ｄｌの血清を１０段階に希釈したものを用
いたところ、表１に示すように、良好な直線性が得られ
た。
料４μｌに第１試薬２５０μｌを加え、５分後に第２試
薬５０μｌを加え、５分後に波長６００ｎｍ／７００ｎ
ｍで測定した。試料としてＨＤＬコレステロール濃度が
１５０ｍｇ／ｄｌの血清を１０段階に希釈したものを用
いたところ、表１に示すように、良好な直線性が得られ
た。
【００３１】
【表１】
【００３２】この実施例においては、第１試薬を添加し
た後に、遠心分離などの煩雑な操作を必要とせず、試料
中に第２試薬を添加するだけで、試料中のＨＤＬコレス
テロールの量に対応して生成されたキノン色素の比色測
定が行なわれる。
た後に、遠心分離などの煩雑な操作を必要とせず、試料
中に第２試薬を添加するだけで、試料中のＨＤＬコレス
テロールの量に対応して生成されたキノン色素の比色測
定が行なわれる。
【００３３】〔実施例２〕実施例１と同様の試薬を用い
て、同様に日立７１７０型自動分析装置で２０例のヒト
血清を試料として測定し、標準液の測定からＨＤＬコレ
ステロール値を求めた。そして同じ試料について市販製
品〔商品名：ＨＤＬ−コレス（ＰＧ）、国際試薬社製〕
を用いて測定した値と比較した。その結果、表２に示す
ように、良好な相関性が得られた。
て、同様に日立７１７０型自動分析装置で２０例のヒト
血清を試料として測定し、標準液の測定からＨＤＬコレ
ステロール値を求めた。そして同じ試料について市販製
品〔商品名：ＨＤＬ−コレス（ＰＧ）、国際試薬社製〕
を用いて測定した値と比較した。その結果、表２に示す
ように、良好な相関性が得られた。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【発明の効果】本発明のＨＤＬコレステロールの定量方
法によれば、従来、沈殿分画法において必要とされてい
た遠心分離の操作が不要となるので、操作が簡略化さ
れ、多数の試料を短時間で、かつ容易に処理できる。し
かも２種類の試薬を用いる方法に応用できるので、汎用
型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能となり、
ＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネ
ル化して測定することができる。また、試料を取り扱う
上で、試料に直接手を触れる機会が著しく減少するの
で、ウイルス感染の危険性も減少する。さらに、微量の
試料に対しても測定可能であるので、小児や老人など採
血量に制限がある場合でも測定が可能となる。従って、
本発明方法は、臨床検査の分野において極めて有用であ
り、臨床検査の日常業務における作業効率の向上に貢献
することができる。
法によれば、従来、沈殿分画法において必要とされてい
た遠心分離の操作が不要となるので、操作が簡略化さ
れ、多数の試料を短時間で、かつ容易に処理できる。し
かも２種類の試薬を用いる方法に応用できるので、汎用
型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能となり、
ＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネ
ル化して測定することができる。また、試料を取り扱う
上で、試料に直接手を触れる機会が著しく減少するの
で、ウイルス感染の危険性も減少する。さらに、微量の
試料に対しても測定可能であるので、小児や老人など採
血量に制限がある場合でも測定が可能となる。従って、
本発明方法は、臨床検査の分野において極めて有用であ
り、臨床検査の日常業務における作業効率の向上に貢献
することができる。
【００３６】また、本発明のＨＤＬコレステロール定量
用試薬キットは、本発明方法を実施するための試薬キッ
トとしての効果を奏する。
用試薬キットは、本発明方法を実施するための試薬キッ
トとしての効果を奏する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋口 陽一 神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際試薬株 式会社研究開発センター内
Claims (4)
- 【請求項１】 界面活性剤アシルポリオキシエチレンソ
ルビタンエステルにより、高比重リポ蛋白以外のリポ蛋
白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させて
得られる反応生成物を反応系外に導き、次に界面活性剤
アルキルポリオキシエチレンエーテルにより、高比重リ
ポ蛋白以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロール
に対する酵素による作用を抑制させるとともに、高比重
リポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を作用させて反
応を進行させることを特徴とする高比重リポ蛋白分画中
のコレステロールの定量方法。 - 【請求項２】 酵素がコレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼである請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 界面活性剤アシルポリオキシエチレンソ
ルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活性
剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試薬
とからなることを特徴とする高比重リポ蛋白分画中のコ
レステロール定量用試薬キット。 - 【請求項４】 酵素がコレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼである請求項３記載の試薬
キット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15495995A JP3614514B2 (ja) | 1995-06-21 | 1995-06-21 | 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キット |
| PCT/JP1996/001602 WO1997000971A1 (fr) | 1995-06-21 | 1996-06-12 | Methode de dosage du cholesterol dans un amas de hdl et trousse de dosage associee |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15495995A JP3614514B2 (ja) | 1995-06-21 | 1995-06-21 | 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09299A true JPH09299A (ja) | 1997-01-07 |
| JP3614514B2 JP3614514B2 (ja) | 2005-01-26 |
Family
ID=15595652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15495995A Expired - Fee Related JP3614514B2 (ja) | 1995-06-21 | 1995-06-21 | 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3614514B2 (ja) |
| WO (1) | WO1997000971A1 (ja) |
Cited By (17)
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|---|---|---|---|---|
| WO1998047005A1 (fr) * | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Denka Seiken Co., Ltd. | Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite |
| WO1999010526A1 (fr) * | 1997-08-27 | 1999-03-04 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Methodes de quantification de cholesterol des lipoproteines de haute densite |
| WO2000052480A1 (fr) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | International Reagents Corporation | Dosage de composant d'un echantillon biologique |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| US6479249B2 (en) * | 1996-12-09 | 2002-11-12 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of determining cholesterol content of high-density lipoproteins |
| US6818414B1 (en) | 1999-06-21 | 2004-11-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of pretreatment of sample for quantitating cholesterol and method for quantitating cholesterol in specific lipoproteins by using the same |
| US6849431B2 (en) | 1997-07-25 | 2005-02-01 | Ryoji Tamura | Non-B, non-C, non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virus particle, method for isolating virus particle, and method for detecting virus |
| WO2005100591A1 (ja) * | 2004-04-15 | 2005-10-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
| US6979552B2 (en) | 2000-11-14 | 2005-12-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of lipid assay and reagent for use therein |
| WO2008087895A1 (ja) * | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 高密度リポ蛋白中コレステロール測定方法およびその試薬 |
| US7682831B2 (en) | 2002-11-27 | 2010-03-23 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of measuring lipid in specific lipoprotein |
| US7811780B2 (en) | 2005-04-27 | 2010-10-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for measurement of cholesterol in high-density lipoprotein |
| WO2012011556A1 (ja) * | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法 |
| JP2014030393A (ja) * | 2012-08-03 | 2014-02-20 | Denka Seiken Co Ltd | 高密度リポ蛋白（ｈｄｌ）中のコレステロールの定量方法 |
| WO2014034823A1 (ja) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
| WO2019177093A1 (ja) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポ蛋白質中のコレステロールの定量方法 |
| WO2020032079A1 (ja) * | 2018-08-08 | 2020-02-13 | デンカ生研株式会社 | リポ蛋白コレステロールの定量方法及び定量キット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2502559C (en) | 2002-10-16 | 2014-12-16 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for measuring cholesterol in high density lipoprotein |
-
1995
- 1995-06-21 JP JP15495995A patent/JP3614514B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-06-12 WO PCT/JP1996/001602 patent/WO1997000971A1/ja active Application Filing
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| US6479249B2 (en) * | 1996-12-09 | 2002-11-12 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of determining cholesterol content of high-density lipoproteins |
| US6893832B2 (en) * | 1996-12-09 | 2005-05-17 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high density lipoprotein |
| WO1998047005A1 (fr) * | 1997-04-14 | 1998-10-22 | Denka Seiken Co., Ltd. | Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite |
| US6194164B1 (en) | 1997-04-14 | 2001-02-27 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantitating cholesterol present in low density lipoproteins |
| AU735659B2 (en) * | 1997-04-14 | 2001-07-12 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol present in low density lipoprotein |
| US6849431B2 (en) | 1997-07-25 | 2005-02-01 | Ryoji Tamura | Non-B, non-C, non-G hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virus particle, method for isolating virus particle, and method for detecting virus |
| WO1999010526A1 (fr) * | 1997-08-27 | 1999-03-04 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Methodes de quantification de cholesterol des lipoproteines de haute densite |
| WO2000052480A1 (fr) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | International Reagents Corporation | Dosage de composant d'un echantillon biologique |
| US7208287B2 (en) | 1999-03-01 | 2007-04-24 | Sysmex Corporation | Reagent set and method for detecting cholesterol in a high-density lipoprotein or low density lipoprotein |
| JP4547095B2 (ja) * | 1999-03-01 | 2010-09-22 | シスメックス株式会社 | 生体試料成分の測定方法 |
| US6818414B1 (en) | 1999-06-21 | 2004-11-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of pretreatment of sample for quantitating cholesterol and method for quantitating cholesterol in specific lipoproteins by using the same |
| US7335483B2 (en) | 1999-06-21 | 2008-02-26 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of pretreatment of sample for quantitating cholesterol and method for quantitating cholesterol in specific lipoproteins by using the same |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| US6979552B2 (en) | 2000-11-14 | 2005-12-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of lipid assay and reagent for use therein |
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| EP2194142A1 (en) | 2002-11-27 | 2010-06-09 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of measuring cholesterol in high density lipoproteins |
| WO2005100591A1 (ja) * | 2004-04-15 | 2005-10-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
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| JP5332611B2 (ja) * | 2007-01-15 | 2013-11-06 | 東洋紡株式会社 | 高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法およびその試薬 |
| WO2012011556A1 (ja) * | 2010-07-23 | 2012-01-26 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法 |
| US8932865B2 (en) | 2010-07-23 | 2015-01-13 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3 |
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