JPH1084997A - Ｌｄｌ−コレステロールの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 低比重リポタンパク（ＬＤＬ）中のコレステ
ロールを、従来法に於いて必要であった、ＬＤＬとＬＤ
Ｌ以外の不要のリポタンパクとを分離するための煩雑な
前処理操作なしに直接自動分析装置等を用いて測定し得
る方法及びそれに用いられる試薬を提供。 【解決手段】 両性界面活性剤及び、カルボキシル基又
はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下で行う
ことを特徴とする、ＬＤＬ中のコレステロールの測定
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、血清、血漿などの生体
試料中に存在する低比重リポタンパク（以下、ＬＤＬと
略記する。）中のコレステロールの測定法及びそのため
の試薬に関する。

【０００２】

【発明の背景】血清中の脂質の主な成分はコレステロー
ル、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清
脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血
中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重
リポタンパク（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低比重リポタンパ
ク(ＶＬＤＬ）カイロミクロン（ＣＭ）等に分類され
る。これらリポタンパクのうち、ＨＤＬは組織に沈着し
た過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、
抗動脈硬化作用を有し、一方、ＬＤＬは肝臓から各組織
へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増
加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられてい
る。従って、ＬＤＬ中のコレステロール（以下、ＬＤＬ
−コレステロールと略記する。）は、動脈硬化症、虚血
性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、該ＬＤ
Ｌ−コレステロールの含有量は、これら疾患の診断・治
療および予防の重要な指標となる。

【０００３】従来、ＬＤＬ−コレステロールの測定法と
しては、沈澱法、超遠心法、電気泳動法、算出式による
算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈澱
法、超遠心法及び電気泳動法は、沈澱・遠心分離処理、
超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、ＬＤＬとＬ
ＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程
が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査
の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定
を実施することができないという問題点を有している。
また、フローデワルド（Friedewald）の式で知られてい
る総コレステロール値、ＨＤＬ−コレステロール値及び
トリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセ
ライドが500mg／dl以上含有する試料を用いた場合に
は、正確なＬＤＬ−コレステロール量を測定することが
できないという問題を有している。

【０００４】近年、従来法に於ける上記の如き問題点を
解消するために、種々の方法が開発されており、例えば
特開平7-280812号公報に開示された方法もその一つであ
る。即ち、ＬＤＬを凝集剤又は／及び抗体を使用して凝
集させた後に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含まれるコ
レステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導い
て消去（消費）させた後、界面活性剤又は／及び無機塩
類を使用して、凝集させたＬＤＬを定量反応ができる程
度に溶解させ、ＬＤＬ−コレステロールを定量反応に付
し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれである。

【０００５】しかしながら、この方法は、測定に３又は
４種の試薬が必要であるため、３又は４種の試薬を用い
て測定が可能なごく一部の自動分析装置にしか適用でき
ず、通常の臨床検査に於いて用いられている２種の試薬
までしか使用できない自動分析装置を用いては測定を実
施することができないという問題点がある。また、この
方法には、３又は４種の試薬を用いて測定を行うため、
測定値の再現性が低下するという問題点もあった。

【０００６】更に、煩雑な前処理操作なしでＬＤＬ−コ
レステロールを測定する方法として特開昭５８−１６５
８００号公報に開示されている方法がある。しかしなが
ら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステ
ロールエステラーゼの使用濃度が限定されるため試薬の
調製が煩雑であり、更に測定時のｐＨや、測定時間間隔
等測定条件を厳密に設定しなくてはならず、しかもＨＤ
Ｌ中のコレステロールもある程度反応することから、動
力学的測定、すなわち、レイト・アッセイでしかＬＤＬ
−コレステロールの測定を行うことができないため、実
用的な測定方法とは言い難い方法であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記した如き状況に鑑
み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のＬ
ＤＬ−コレステロールを、従来法に於いて必要であっ
た、ＬＤＬとＬＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離
するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等
を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用い
られる試薬の提供にある。

【０００８】

【発明を解決するための手段】本発明は、両性界面活性
剤及び、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂脂
族アミン類の存在下で測定を行うことを特徴とする、低
比重リポタンパク中のコレステロールの測定法の発明で
ある。

【０００９】また、本発明は、生体試料と、水性媒体を
含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ₁）
を測定し、次いで該混合液と、コレステロールオキシダ
ーゼ及びコレステロールエステラーゼを含んでなる第二
試液とを混合して反応させた後に吸光度（ＯＤ₂）を測
定し、ＯＤ₂から、ＯＤ₁に補正係数を掛けて得られた値
を差し引いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得られたＯＤ
₃を、予め既知濃度のコレステロールを含む標準品を用
いて上記と同様にして求めた、コレステロール量とＯＤ
₃との関係を示す検量線に当てはめることにより生体試
料中の低比重リポタンパク中のコレステロールを求める
ことを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレステロ
ールの測定法であって、両性界面活性剤とカルボキシル
基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類が夫々第一
試液と第二試液の少なくとも一方に含まれ、また、カッ
プラー、デベロッパー、及びペルオキシダーゼが夫々第
一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれていること
を特徴とする、該測定法の発明である。

【００１０】更に、本発明は、両性界面活性剤及び、カ
ルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類
を含んでなる、低比重リポタンパク中のコレステロール
測定用試薬の発明である。

【００１１】また、本発明は、カップラー（又はデベロ
ッパー）を含んでなる第一試薬と、コレステロールオキ
シダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダ
ーゼと、デベロッパー（又はカップラー）を含んでなる
第二試薬とを含んでなるものであって、両性界面活性剤
とカルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミ
ン類が夫々第一試薬と第二試薬の少なくとも一方に含ま
れている、低比重リポタンパク中のコレステロール測定
用キットの発明である。

【００１２】更にまた、本発明は、両性界面活性剤と、
カップラー（又はデベロッパー）を含んでなる第一試薬
と、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエス
テラーゼ、ペルオキシダーゼと、デベロッパー（又はカ
ップラー）を含んでなる第二試薬とを含んでなるもので
あって、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪
族アミン類が第一試薬と第二試薬の少なくとも一方に含
まれている、低比重リポタンパク中のコレステロール測
定用キットの発明である。

【００１３】即ち、本発明者らは、ＬＤＬ−コレステロ
ールを、ＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別す
るための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得
る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中
のＬＤＬ−コレステロールの測定を、両性界面活性剤及
び、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族ア
ミン類の存在下で行えば、ＬＤＬ以外の不要なリポタン
パクを分離分別することなくＬＤＬ中のコレステロール
を特異的に測定することが可能となることを見出し、本
発明を完成するに至った。

【００１４】本発明に於いて用いられる、両性界面活性
剤としては、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含有されてい
るコレステロールがコレステロール測定反応に関与する
のを抑制する作用を有するものであればよく、特に限定
されない。このような両性界面活性剤としてより具体的
には、例えばアルキルベタイン誘導体（例えばラウリル
ベタイン、ステアリルベタイン、ラウリルジメチルアン
モニウムベタイン、ココナットベタイン、ヤシ油脂肪酸
アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベ
タイン等）、イミダゾリニウムベタイン誘導体（例えば
２−ラウリル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシ
エチルイミダゾリニウムベタイン、２−ウンデシル−Ｎ
−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチ
ル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、
例えば２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等）、スルホベ
タイン誘導体（例えばＮ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−デシ
ル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン
スルホン酸、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホン酸、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−
アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等）のベタイン誘
導体、例えばアルキルグリシン、アルキルビス（アミノ
エチル）グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシ
ン、Ｎ−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラ
ニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体、例えばビス
（２−ウンデシル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ン）クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等の
イミダゾリン誘導体、例えばラウリルジメチルアミンオ
キサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。
上記した如き両性界面活性剤のうち、ラウリルベタイ
ン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸
アミドプロピルベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキ
シメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタ
イン及び２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが望ましく用
いられる。また、これら両性界面活性剤の使用濃度とし
ては、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含有されるコレステ
ロールがコレステロール測定反応に関与するのを抑制し
得る濃度であればよく、特に限定されないが、最終の反
応液中の濃度が通常0.0001％〜10％（W／V）、好ましく
は0.001％〜１％（W／V）となるように添加される。
尚、これら両性界面活性剤は単独で用いても、或は適宜
混合して用いても何れにてもよい。尚、本発明の方法に
於いては、非イオン性界面活性剤を共存させると、ＬＤ
Ｌ以外のリポタンパクに含有されているコレステロール
がコレステロール測定反応に関与する可能性が高くなる
ので、非イオン性界面活性剤非共存下で実施することが
望ましい。

【００１５】本発明に於いて用いられる、カルボキシル
基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類としては、
ＬＤＬ以外のリポタンパクに含有されているコレステロ
ールがコレステロール測定反応に関与するのを抑制する
作用を有するものであればよく、特に限定されないが、
例えばアミノ酸類、アミノエタンスルホン酸誘導体、ア
ミノプロパンスルホン酸誘導体、グリシン誘導体のなか
から適宜選択された、前述の如き性質を有するものが挙
げられる。このようなアミノ酸類の具体例としては、例
えばアラニン、グルタミン、グルタミン酸等が挙げられ
る。また、アミノエタンスルホン酸誘導体の具体例とし
ては、例えばＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエ
タンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥ
Ｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン
酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）
−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピ
ペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（Ｐ
ＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）等が挙げられ、
アミノプロパンスルホン酸誘導体の具体例としては、例
えばＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン
酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ
−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−
〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−
〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕
プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３
−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニ
ル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホ
リノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ
−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、
ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロ
パンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
（ＴＡＰＳ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（Ｔ
ＡＰＳＯ）等が挙げられ、また、グリシン誘導体の具体
例としては、例えばＮ−（２−アセトアミド）イミノ二
酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）等が
挙げられる。上記した如きカルボキシル基又はスルホン
酸基を有する脂肪族アミン類のうち、２−〔４−（２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸
（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンス
ルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−モルホリノプロパンス
ルホン酸（ＭＯＰＳ）及びＮ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（ＡＤＡ）が望ましく用いられる。また、カ
ルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類
の使用濃度としては、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含ま
れているコレステロールがコレステロール測定反応に関
与するのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定され
ないが、最終の反応液中の濃度が通常１ｍＭ〜２Ｍ、好
ましくは10ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは100〜700ｍＭ、
更に好ましくは200〜600ｍＭとなるように添加される。
尚、これら化合物は単独で用いても、或は適宜混合して
用いても何れにてもよい。

【００１６】本発明の測定法は、上記した如き両性界面
活性剤と、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂
肪族アミン類とを併用する以外は、自体公知のコレステ
ロール測定法に準じて実施すれば良く、使用される試薬
類もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すればよ
い。即ち、血清、血漿等の生体試料中のＬＤＬ−コレス
テロールを、両性界面活性剤と、カルボキシル基又はス
ルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下、自体公知
のコレステロール測定法に準じて測定することにより、
生体試料中のＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定す
ることができる。

【００１７】これら自体公知のコレステロール測定法と
しては、生体試料中のコレステロールを測定し得る自体
公知のコレステロール測定法は全て挙げられるが、酵素
反応を利用する、例えば試料中のコレステロールエステ
ルをコレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）によって遊
離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する
遊離コレステロールと共に、コレステロールオキシダー
ゼ（ＣＯＤ）によって酸化して、コレステ−４−エン−
３−オンと過酸化水素にし、ペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）存在下、生成した過酸化水素で被酸化性呈色試薬を
酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する酸化呈
色法、例えば試料中のコレステロールエステルをコレス
テロールエステラーゼ（ＣＨＥ）によって遊離コレステ
ロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレス
テロールと共にコレステロール脱水素酵素（ＣＨＤ）の
存在下ＮＡＤと反応させて、生成するＮＡＤＨを340nm
で測定する紫外部測定法等が好ましく挙げられる。

【００１８】本発明の測定法に用いられるコレステロー
ルオキシダーゼは、その由来は特に限定されず、通常こ
の分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア
属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵
臓等動物臓器に由来するもの等は全て使用可能である。
コレステロ−ルオキシダーゼの使用量としては、コレス
テロール測定時の反応液中の濃度として、通常0.02〜10
u／ml、好ましくは0.1〜２u／mlの範囲から適宜選択さ
れる。

【００１９】本発明の測定法に用いられるコレステロ−
ルエステラ−ゼは、その由来は特に限定されず、通常こ
の分野で使用されているもの、例えば、キャンディダ
属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵
臓等動物臓器に由来するもの等は全て使用可能である。
コレステロ−ルエステラーゼの使用量としては、コレス
テロール測定時の反応液中の濃度として、通常0.02〜10
u／ml、好ましくは0.1〜２u／mlの範囲から適宜選択さ
れる。

【００２０】本発明の測定法に用いられるペルオキシダ
ーゼは、その由来は特に限定されず、通常この分野で使
用されているもの、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物
に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するも
の、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等は全て使
用可能である。ペルオキシダーゼの使用量としては、コ
レステロール測定時の反応液中の濃度として、通常0.01
〜50u／ml、好ましくは0.1〜５u／mlの範囲から適宜選
択される。

【００２１】本発明の測定法に用いられる被酸化性呈色
試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して
呈色するものであれば何れにても良いが、４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡ）等のカップラー及び、該カップ
ラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合
せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフ
トール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリ
ン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ト
リフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導
体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導
体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジア
ミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤
等が挙げられる。デベロッパーとしてのフェノール系化
合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロ
フェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げら
れ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば１−
ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナ
フトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリ
ン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチル
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）
−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン
（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオ
ロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（Ｈ
ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニ
ル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられる。カ
ップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カッ
プラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組
み合わせるデベロッパーの種類等により異なるため一概
には言えないが、コレステロール測定時の反応液中の濃
度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mMの範
囲から適宜選択され、カップラーとして４−ＡＡを使用
する場合の使用量としては、コレステロール測定時の反
応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1
〜５mMの範囲から適宜選択される。また、デベロッパー
の使用量としては、用いるデベロッパーの種類や組み合
わせるカップラーの種類等により異なるため一概には言
えないが、コレステロール測定時の反応液中の濃度とし
て、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMの範囲から
適宜選択される。トリフェニルメタン系ロイコ色素の具
体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス
（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニル
メタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４
−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩
等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例として
は、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ
−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジ
エチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トル
エンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレ
ンブルー誘導体の具体例としては、例えば10−（カルボ
キシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチ
ルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、10−〔３−
（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルア
ミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フ
ェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体
の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、
ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、
３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げ
られ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例として
は、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−
メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミ
ノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−
ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイ
ル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフ
ェニル）イミダゾール等が挙げられる。これら発色剤の
使用量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲か
ら適宜選択される。

【００２２】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用試
薬は、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤＬ−
コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、両
性界面活性剤と、カルボキシル基又はスルホン酸基を有
する脂肪族アミン類とを使用する以外は、上記した如き
自体公知のコレステロール測定法に使用されるコレステ
ロール測定用試薬、例えば酸化呈色法に於いて使用され
るＣＯＤ、ＣＨＥ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬、緩衝剤
等の試薬類、例えば紫外部測定法に於いて使用されるＣ
ＨＥ、ＣＨＤ、ＮＡＤ、緩衝剤等の試薬類を、この分野
で使用される濃度範囲で含有するように調製されたもの
であり、構成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で
述べた通りである。

【００２３】本発明のＬＤＬ−コレステロ−ル測定用試
薬は、１液法用として調製されたものでも２液法用とし
て調製されたものでも又それ以上に分けたものでも何れ
にてもよく、特に限定されない。尚、２液以上の試薬に
分けた場合には、両性界面活性剤とカルボキシル基又は
スルホン酸基を有する脂肪族アミン類の夫々が少なくと
も何れかの試薬に含まれていれば良い。また、コレステ
ロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ等の
酵素類も何れかの試薬に含まれていればよい。また、本
発明のＬＤＬ−コレステロ−ル測定用試薬中には、例え
ばアニオン性化合物（例えばデキストラン硫酸、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等のポリアニオ
ン等）等のイオン性化合物が含まれていても良い。これ
らは単独または混合して使用することができる。更に、
Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺等のカチオン（或いはこれらカ
チオンを生じさせ得る金属塩）と組み合わせて使用して
もよい。これらイオン性化合物の使用濃度としては、特
に限定されないが、反応液中の濃度が、通常0.01〜10％
（W／V）の範囲で使用される。また、本発明のＬＤＬ−
コレステロ−ル測定用試薬中にはＬＤＬ以外のリポタン
パク中のコレステロールがコレステロール測定反応に関
与することを防止するために、ポリクロ−ナル抗体また
はモノクロ−ナル抗体の１種または２種以上を共存させ
てもよい。このような目的で使用可能な抗体としては、
例えば抗アポリポタンパクＡ抗体、抗アポリポタンパク
Ｃ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体、抗αリポタンパク
抗体等が挙げられる。これら抗体の使用濃度としては、
ＬＤＬ以外のリポタンパク中に含まれるコレステロール
がコレステロール測定反応に関与するのを防止し得る濃
度以上であればよく、特に限定されないが、最終の反応
液中の濃度が通常0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜
１mgAb/mlとなるように反応液中に添加される。

【００２４】本発明のＬＤＬ−コレステロールの測定法
は、１液法によっても２液法によっても又それ以上の方
法によっても実施することができる。２液法の場合に
は、両性界面活性剤とカルボキシル基又はスルホン酸基
を有する脂肪族アミン類の夫々が少なくとも第１試液と
第２試液の何れかに含まれていれば良く、また、カップ
ラー、デベロッパー及びペルオキシダーゼの夫々が少な
くとも第１試液と第２試液の何れかに含まれていれば良
い。尚、第１試液及び第２試液に於いて、夫々の試液に
含まれる成分は、例えば水、緩衝液等の水性媒体、好ま
しくは緩衝液に溶解される。また、第１試液は、他の成
分を含まず、水性媒体のみからなるものであっても良
い。また、第１試液の水性媒体として水を用いる場合に
は、第２試液の水性媒体としては緩衝液を用いるのが望
ましい。更に、水性媒体として緩衝液を用いる場合に
は、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族ア
ミン類を含まない試液に於ける水性媒体を緩衝液とする
ことが望ましい。

【００２５】本発明の測定法に用いられる緩衝剤として
は、pH５〜11の範囲で緩衝作用を有し、コレステロール
測定反応を阻害しないものであれば特に限定されず、通
常この分野で使用されているものは全て使用可能であ
る。このような緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、グッドの緩衝剤、リン酸、
ホウ酸等が挙げられ、緩衝剤の使用濃度としては特に限
定されないが、通常１mM〜２Ｍ、好ましくは10mM〜１Ｍ
の範囲から適宜選択され、また、pHは、通常５〜11、好
ましくは６〜８、より好ましくは７付近の範囲から適宜
選択される。

【００２６】本発明の測定法の好ましい実施態様として
は、例えば以下の如くである。即ち、例えば血清、血漿
等の生体試料と、例えば水性媒体、カップラー、両性界
面活性剤、及びカルボキシル基又はスルホン酸基を有す
る脂肪族アミン類、要すればイオン性化合物、カチオ
ン、抗体等を含有する第１試液とを混合し、２〜40℃で
１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ₁）を測定す
る。次いで、該反応液と、例えばコレステロ−ルエステ
ラ−ゼ、コレステロ−ルオキシダ−ゼ、ペルオキシダー
ゼ、デベロッパー及び、カルボキシル基又はスルホン酸
基を有する脂肪族アミン類、を含有する第２液とを混合
し、２〜40℃で１〜60分反応させた後に吸光度（Ｏ
Ｄ₂）を測定する。上記のＯＤ₂からＯＤ₁に由来する値
（例えばＯＤ₁に補正係数を掛けて求めた値）を差し引
いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得られたＯＤ₃を、例えば
予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準
品を試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレ
ステロール濃度とＯＤ₃との関係を示す検量線に当ては
めることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロール
の値を求める。

【００２７】また、本発明のＬＤＬ−コレステロ−ルの
測定法は、１液法により実施しても良く、この場合は、
例えば以下の如く行えばよい。即ち、例えば血清、血漿
等の生体試料と、例えばコレステロ−ルエステラ−ゼ、
コレステロ−ルオキシダ−ゼ、ペルオキシダーゼ、被酸
化性呈色試薬（又は、カップラー及びデベロッパー）、
両性界面活性剤、及びカルボキシル基又はスルホン酸基
を有する脂肪族アミン類、要すればイオン性化合物、カ
チオン、抗体等を含有する試液とを混合し、２〜40℃で
１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ_1'）を測定す
る。また、生体試料の代わりに生理食塩水等を使用する
以外は上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って盲検値
（ＯＤ_Bl）を求める。次いで、ＯＤ_1'からＯＤ_Bl差し引
いた吸光度（ＯＤ_2'）を求め、これを、例えば予めＬＤ
Ｌ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料
として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロー
ル濃度とＯＤ_2'との関係を示す検量線に当てはめること
により、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値が求
められる。

【００２８】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用キ
ットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤＬ
−コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、
カップラー（又はデベロッパー）を含んでなる第一試薬
と、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエス
テラーゼ、ペルオキシダーゼと、デベロッパー（又はカ
ップラー）を含んでなる第二試薬とを含んでなるもので
あって、両性界面活性剤とカルボキシル基又はスルホン
酸基を有する脂肪族アミン類が夫々第一試薬と第二試薬
の少なくとも一方に含まれているものであり、夫々の構
成要素の好ましい様態、具体例については上で述べた通
りである。また、当該キットには、必要に応じて、ＬＤ
Ｌ−コレステロール標準品等が組み合わされていても良
いことは言うまでもない。

【００２９】また、両性界面活性剤はコレステロールエ
ステラーゼを失活させる可能性もあるので、これらは別
々の試薬に含まれている方が好ましく、従って、本発明
のＬＤＬ−コレステロール測定用キットは、保存安定性
等の点から、例えば以下の如き組合せからなるものがよ
り好ましい。即ち、両性界面活性剤と、カップラー（又
はデベロッパー）を含んでなる第一試薬と、コレステロ
ールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペル
オキシダーゼと、デベロッパー（又はカップラー）を含
んでなる第二試薬とを含んでなるものであって、カルボ
キシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類が第
一試薬と第二試薬の少なくとも一方に含まれているもの
が好ましい。尚、夫々の構成要素の好ましい様態、具体
例については上で述べた通りであり、また、当該キット
には、必要に応じて、ＬＤＬ−コレステロール標準品等
が組み合わされていても良い。

【００３０】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定法及
び測定用試薬並びに測定用キットは、両性界面活性剤及
び、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族ア
ミン類の存在下で、コレステロールの測定を行わせるた
めに、ＨＤＬのみならずＶＬＤＬ、カイロミクロン等の
ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールとは実質
的に反応せず、ＬＤＬ−コレステロールのみと特異的に
反応するので、従来法では困難であったエンドポイント
・アッセイでのＬＤＬ−コレステロール測定を可能なら
しめるものである。また、標準品についても、必ずしも
コレステロールの純品を用いて調製された標準液を用い
る必要はなく、例えばヒトや動物等の血清を用いて調製
された標準血清を標準品として使用することができる。

【００３１】以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明
を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限
定されるものではない。

【００３２】

【実施例】

実施例１ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、超遠心法で分画した
リポタンパクの反応性を比較した。（試料）自体公知の
超遠心法で血清より分画して得たＨＤＬ画分（64.9mg／
dl）、ＬＤＬ画分（148.2mg／dl）、ＶＬＤＬ画分（76.
3mg／dl）又はＣＭ画分（28.4mg／dl）を試料とした。 （試薬） ・試薬１ Ｒ−１；４−アミノアンチピリン １mMを含有する200m
M ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシ
メチル)メタン（Bis-Tris）緩衝液（pH7.0）をＲ−１と
した。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） ２U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） １U／ml、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホ
プロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Ｎa塩（ＤＡＯ
Ｓ） １mM及びアンヒトール２４Ｂ〔花王（株）商品
名。ココナットベタイン。〕 0.08％（W／V）を含有す
る200mM ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒド
ロキシメチル)メタン（Bis-Tris）緩衝液（pH7.0）をＲ
−２とした。 ・試薬２ Ｒ−１；４−アミノアンチピリン １mMを含有する200m
M ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)（PIPE
S）緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） ２U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） １U／ml、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホ
プロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Ｎa塩（ＤＡＯ
Ｓ） １mM及びアンヒトール２４Ｂ〔花王（株）商品
名。ココナットベタイン。〕 0.08％（W／V）を含有す
る200mM ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)
（PIPES）緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 ・試薬３ Ｒ−１；４−アミノアンチピリン １mMを含有する200m
M N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝液（pH7.
0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） ２U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） １U／ml、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホ
プロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Ｎa塩（ＤＡＯ
Ｓ） １mM及びソフタゾリンＬＰＢ−Ｒ〔川研ファイン
ケミカル(株)商品名。ラウリン酸アミドプロピルベタイ
ン〕 0.1％を含有する200mM N-(2-アセトアミド)イミ
ノ二酢酸(ADA)緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （測定条件） 測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。 測定方法；２ポイント エンド[１６]−[３４] 試料量 ；３μｌ Ｒ−１ ；２７０μｌ Ｒ−２ ； ９０μｌ 測定波長；７００／６００ｎｍ 測定温度；３７℃ （結果）図１に試薬１を使用して得られた測定結果を、
図２に試薬２を使用して得られた測定結果を、図３に試
薬３を使用して得られた測定結果を夫々示す。尚、図１
〜３に於いて、□はＨＤＬを含有する試料について得ら
れた結果を、◆はＬＤＬを含有する試料について得られ
た結果を、◇はＶＬＤＬを含有する試料について得られ
た結果を、×はＣＭを含有する試料について得られた結
果を、また、●はリポタンパクを含有しない試料につい
て得られた結果を夫々示す。図１の測定結果から明らか
な如く、両性界面活性剤であるアンヒトール２４Ｂは含
有しているが、カルボキシル基又はスルホン酸基を有す
る脂肪族アミン類を含有していない試薬１は、リポタン
パク中のコレステロールと殆ど反応しないことが判る。
これに対して、図２の測定結果から、アンヒトール２４
Ｂのみならず、スルホン酸基を有する脂肪族アミン類で
あるピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)（PIPE
S）共存下でリポタンパク中のコレステロールの測定を
行うと、ＬＤＬ中のコレステロールを特異的に測定し得
るようになることが判る。また、同様に図３の測定結果
から、両性界面活性剤であるソフタゾリンＬＰＢ−Ｒ
と、カルボキシル基を有する脂肪族アミン類であるN-(2
-アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)の共存下でリポタン
パク中のコレステロールの測定を行った場合でも、ＬＤ
Ｌ中のコレステロールを特異的に測定し得るようになる
ことが判る。以上のことから、両性界面活性剤と、カル
ボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類と
の存在下でリポタンパク中のコレステロールの測定を行
うと、ＬＤＬ中のコレステロールを特異的に測定し得る
ことが判る。

【００３３】実施例２ （試料）実施例１と同じ。 （試薬） Ｒ−１；４−アミノアンチピリン １mMを含有する200m
M 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH7.
0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） ２U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） １U／ml、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホ
プロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Ｎa塩（ＤＡＯ
Ｓ） １mM及び下記表１に挙げた所定の界面活性剤を所
定濃度含有する200mM 2-モルホリノエタンスルホン酸
（MES）緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。

【００３４】

【表１】

【００３５】（測定条件）実施例１と同じ。 （結果）図４に界面活性剤としてエマルゲン７０９を含
有するＲ−２を使用して得られた測定結果を、図５に界
面活性剤としてエマルゲン１２０を含有するＲ−２を使
用して得られた測定結果を、図６に界面活性剤としてｎ
−オクチル−β−Ｄ−グルコシドを含有するＲ−２を使
用して得られた測定結果を、図７に界面活性剤としてエ
マールＮＣ−３５を含有するＲ−２を使用して得られた
測定結果を、図８に界面活性剤としてコール酸を含有す
るＲ−２を使用して得られた測定結果を、図９に界面活
性剤としてｎ−ドデシルトリメチルアンモニウムクロリ
ドを含有するＲ−２を使用して得られた測定結果を、図
１０に界面活性剤としてヘキサデシルピリジニウムクロ
リドを含有するＲ−２を使用して得られた測定結果を、
図１１に界面活性剤としてソフタゾリンＣＰＢを含有す
るＲ−２を使用して得られた測定結果を、図１２に界面
活性剤としてアミポールＡＤを含有するＲ−２を使用し
て得られた測定結果を、図１３に界面活性剤としてレボ
ン１０１−Ｈを含有するＲ−２を使用して得られた測定
結果を、図１４に界面活性剤としてアンヒトール２０Ｎ
を含有するＲ−２を使用して得られた測定結果を夫々示
す。尚、図４〜１４に於いて、□はＨＤＬを含有する試
料について得られた結果を、◆はＬＤＬを含有する試料
について得られた結果を、◇はＶＬＤＬを含有する試料
について得られた結果を、×はＣＭを含有する試料につ
いて得られた結果を、また、●はリポタンパクを含有し
ない試料について得られた結果を夫々示す。図４〜１０
の測定結果から明らかな如く、非イオン性界面活性剤、
陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤を含有
するＲ−２を用いると、ＬＤＬ以外のリポタンパク中に
含有されているコレステロールとも反応することが判
る。これに対して、図１１〜１４の測定結果から、両性
界面活性剤を含有するＲ−２を用いると、ＬＤＬ中のコ
レステロールを特異的に測定し得るようになることが判
る。

【００３６】実施例３ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、超遠心法で分画した
リポタンパクの反応性を比較した。 （試料）自体公知の超遠心法で血清より分画して得たＨ
ＤＬ画分（63.1mg／dl）、ＬＤＬ画分（138.1mg／d
l）、ＶＬＤＬ画分（77.3mg／dl）又はＣＭ画分（35.0m
g／dl）を試料とした。 （試薬） Ｒ−１；グルタミン酸 400mM及びN-(2-ヒドロキシ-3-
スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯ
Ｓ） 0.6mMを含有する100mM ビス(2-ヒドロキシエチ
ル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン（Bis-Tri
s）緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） 1.6U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） ６U／ml、４−アミノアンチピリン ３mM及び
ソフタゾリンＣＬ 0.1％（W／V）〔川研ファインケミ
カル(株)商品名。2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒ
ドロキシエチルイミダゾリニウムベタインベタイン〕含
有する100mM ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス
(ヒドロキシメチル)メタン（Bis-Tris）緩衝液（pH7.
0）をＲ−２とした。

【００３７】（測定条件）実施例１と同じ。 （結果）図１５に得られた測定結果を示す。尚、図１５
に於いて、□はＨＤＬを含有する試料について得られた
結果を、◆はＬＤＬを含有する試料について得られた結
果を、◇はＶＬＤＬを含有する試料について得られた結
果を、○はＣＭを含有する試料について得られた結果
を、また、●はリポタンパクを含有しない試料について
得られた結果を夫々示す。図１５の測定結果から明らか
な如く、両性界面活性剤としてソフタゾリンＣＬ及びア
ミノ酸としてグルタミン酸の存在下でリポタンパク中の
コレステロールの測定を行えば、ＬＤＬ中のコレステロ
ールを特異的に測定し得ることが判る。

【００３８】実施例４ （試料）実施例３と同じ。 （試薬） Ｒ−１；N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメ
トキシアニリン（ＨＤＡＯＳ） 0.6mMを含有する400mM
ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)（PIPES）
緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；コレステロールオキシダーゼ（CHO"Amano"VW、
天野製薬(株)製。）２U／ml、コレステロールエステラ
ーゼ（製造番号：T-18、旭化成工業(株)製） 1.6U／m
l、パーオキシダーゼ（製造番号：PEO-302、東洋紡(株)
製。） ６U／ml、４−アミノアンチピリン ３mM及び
下記表２に挙げた所定の界面活性剤を0.08％（W／V）含
有する400mM ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン
酸)（PIPES）緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。

【００３９】

【表２】

【００４０】（測定条件）実施例１と同じ。 （結果）図１６に界面活性剤としてソフタゾリンＣＬを
含有するＲ−２を使用して得られた測定結果を、図１７
に界面活性剤としてソフタゾリンＮＳを含有するＲ−２
を使用して得られた測定結果を、図１８に界面活性剤と
してエナジコールＣ−４０Ｈを使用して得られた測定結
果を夫々示す。尚、図１６〜１８に於いて、□はＨＤＬ
を含有する試料について得られた結果を、◆はＬＤＬを
含有する試料について得られた結果を、◇はＶＬＤＬを
含有する試料について得られた結果を、△はＣＭを含有
する試料について得られた結果を、また、●はリポタン
パクを含有しない試料について得られた結果を夫々示
す。図１６〜１８の測定結果から明らかな如く、両性界
面活性剤及びカルボキシル基又はスルホン酸基を有する
脂肪族アミン類の存在下でリポタンパク中のコレステロ
ールの測定を行えば、ＬＤＬ中のコレステロールを特異
的に測定し得ることが判る。

【００４１】実施例５ 血清、血漿等生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの測
定を実施するために使用される、測定用キットの代表的
な例としては、以下のようなものが挙げられる。 （１）第一試薬（pH6.5〜7.5）：カップラー（又はデベ
ロッパー）、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する
脂肪族アミン類。 （２）第二試薬（pH6.5〜7.5）：コレステロールオキシ
ダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、デベロッパー（又はカップラー）、両性界面活性
剤、カルボキシル基又はスルホン酸基を有する脂肪族ア
ミン類。

【００４２】実施例６ 血清、血漿等生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの測
定を実施するために使用される、測定用キットの代表的
な例としては、以下のようなものが挙げられる。 （１）第一試薬（pH6.5〜7.5）：両性界面活性剤、カッ
プラー（又はデベロッパー）、カルボキシル基又はスル
ホン酸基を有する脂肪族アミン類。 （２）第二試薬（pH6.5〜7.5）：コレステロールオキシ
ダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、デベロッパー（又はカップラー）、カルボキシル基
又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類。

【００４３】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は試料中のＬＤ
Ｌ−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測定し得る
方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであ
り、本発明を利用することにより、従来の方法では不可
能であったＬＤＬ−コレステロ−ルを直接、しかも汎用
の自動分析装置を用いて測定し得るという効果を奏する
ものであるので、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図２】実施例１で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図３】実施例１で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図４】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図５】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図６】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図７】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図８】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図９】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含む
各種試料についての反応曲線を示す。

【図１０】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１１】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１２】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１３】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１４】実施例２で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１５】実施例３で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１６】実施例４で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１７】実施例４で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【図１８】実施例４で得られた、各種リポタンパクを含
む各種試料についての反応曲線を示す。

【符号の説明】

図１〜１４に於いて、□は高比重リポタンパク（ＨＤ
Ｌ）を含有する試料について得られた結果を、◆は低比
重リポタンパク（ＬＤＬ）を含有する試料について得ら
れた結果を、◇は超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）を
含有する試料について得られた結果を、×はカイロミク
ロン（ＣＭ）を含有する試料について得られた結果を、
また、●はリポタンパクを含有しない試料について得ら
れた結果を夫々示す。図１５に於いて、□は高比重リポ
タンパク（ＨＤＬ）を含有する試料について得られた結
果を、◆は低比重リポタンパク（ＬＤＬ）を含有する試
料について得られた結果を、◇は超低比重リポタンパク
（ＶＬＤＬ）を含有する試料について得られた結果を、
○はカイロミクロン（ＣＭ）を含有する試料について得
られた結果を、また、●はリポタンパクを含有しない試
料について得られた結果を夫々示す。図１６〜１８に於
いて、□は高比重リポタンパク（ＨＤＬ）を含有する試
料について得られた結果を、◆は低比重リポタンパク
（ＬＤＬ）を含有する試料について得られた結果を、◇
は超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）を含有する試料に
ついて得られた結果を、△はカイロミクロン（ＣＭ）を
含有する試料について得られた結果を、また、●はリポ
タンパクを含有しない試料について得られた結果を夫々
示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 両性界面活性剤及び、カルボキシル基又
   はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下で測定
   を行うことを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレ
   ステロールの測定法。
2. 【請求項２】 生体試料と、水性媒体を含んでなる第一
   試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ₁）を測定し、次い
   で該混合液と、コレステロールオキシダーゼ及びコレス
   テロールエステラーゼを含んでなる第二試液とを混合し
   て反応させた後に吸光度（ＯＤ₂）を測定し、ＯＤ₂か
   ら、ＯＤ₁に補正係数を掛けて得られた値を差し引いた
   吸光度（ＯＤ₃）を求め、得られたＯＤ₃を、予め既知濃
   度のコレステロールを含む標準品を用いて上記と同様に
   して求めた、コレステロール量とＯＤ₃との関係を示す
   検量線に当てはめることにより生体試料中の低比重リポ
   タンパク中のコレステロールを求めることを特徴とす
   る、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定法で
   あって、両性界面活性剤とカルボキシル基又はスルホン
   酸基を有する脂肪族アミン類が夫々第一試液と第二試液
   の少なくとも一方に含まれ、また、カップラー、デベロ
   ッパー、及びペルオキシダーゼが夫々第一試液と第二試
   液の少なくとも一方に含まれていることを特徴とする、
   該測定法。
3. 【請求項３】 カップラーとデベロッパーの一方が第一
   試液に含まれ、他方が第二試液に含まれている、請求項
   ２に記載の測定法。
4. 【請求項４】 両性界面活性剤が第一試液に含まれてい
   る、請求項２に記載の測定法。
5. 【請求項５】 両性界面活性剤が、ベタイン誘導体、ア
   ミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体及びアミン
   オキサイド誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１
   種の化合物である、請求項１又は２に記載の測定法。
6. 【請求項６】 カルボキシル基又はスルホン酸基を有す
   る脂肪族アミン類が、アミノ酸類、アミノエタンスルホ
   ン酸誘導体、アミノプロパンスルホン酸誘導体及びグリ
   シン誘導体からなる群より選ばれた少なくとも１種の化
   合物である、請求項１又は２に記載の測定法。
7. 【請求項７】 非イオン性界面活性剤非共存下で実施す
   る、請求項１又は２に記載の測定法。
8. 【請求項８】 両性界面活性剤及び、カルボキシル基又
   はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類を含んでなる、
   低比重リポタンパク中のコレステロール測定用試薬。
9. 【請求項９】 更に、コレステロールオキシダーゼ、コ
   レステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ及び被酸
   化性呈色試薬を含む、請求項８に記載の試薬。
10. 【請求項１０】 被酸化性呈色試薬が、カップラー及び
    デベロッパーからなる、請求項９に記載の試薬。
11. 【請求項１１】 カップラー（又はデベロッパー）を含
    んでなる第一試薬と、コレステロールオキシダーゼ、コ
    レステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼと、デベ
    ロッパー（又はカップラー）を含んでなる第二試薬とを
    含んでなるものであって、両性界面活性剤とカルボキシ
    ル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類が夫々第
    一試薬と第二試薬の少なくとも一方に含まれている、低
    比重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。
12. 【請求項１２】 両性界面活性剤と、カップラー（又は
    デベロッパー）を含んでなる第一試薬と、コレステロー
    ルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオ
    キシダーゼと、デベロッパー（又はカップラー）を含ん
    でなる第二試薬とを含んでなるものであって、カルボキ
    シル基又はスルホン酸基を有する脂肪族アミン類が第一
    試薬と第二試薬の少なくとも一方に含まれている、低比
    重リポタンパク中のコレステロール測定用キット。 【０００１】