JP5832995B2 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット - Google Patents

低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット Download PDF

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Description

本発明は、検体中に含まれる低密度リポ蛋白(以下、LDLという)中のコレステロール(以下、LDL−Cという)の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。
LDLは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子である。LDL−Cの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の1つであり、LDL−Cを分別定量することは臨床上有用である。
従来のLDL−Cの定量方法としては、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド(Friedewald)式による演算方法などが挙げられる。超遠心法は、リポ蛋白の比重の差を利用し、超遠心分離機を用いてLDLを分離した後、そのコレステロール量を測定する方法である(非特許文献1)が、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。電気泳動法としては、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがあるが、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。フリードワルド式による演算方法では、総コレステロール(以下、TCという)、高密度リポ蛋白(以下、HDLという)中のコレステロール(以下、HDL−Cという)及び総トリグリセライド(以下、T−TGという)の測定値から、次の計算式に従いLDL−C量を算出する(非特許文献2)が、この方法は、血清中のT−TGの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。
Figure 0005832995
また近年、超遠心法などの分離操作を必要とせず、汎用の自動分析機装置に搭載可能なLDL−Cの定量方法も報告されており、この様なLDL−Cの定量方法として、例えば以下の方法が知られている。
LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素(以下、コレステロール測定酵素という)を作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、試料中のHDL、超低密度リポ蛋白(以下、VLDLという)及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第1工程と、次いで、試料中の残存コレステロールを定量する第2工程とからなる試料中のLDL−Cの定量方法(特許文献1)。
血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、並びにコレステロール測定酵素を添加し、リポ蛋白質のうちHDL中及びVLDL中のコレステロールを優先的に反応させた後に、残りのコレステロールの反応量を測定するLDL−Cの定量方法(特許文献2)。
試料に対し、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、並びにコレステロール測定酵素を添加し、リポ蛋白質のうちLDL−Cを選択的に測定する方法(特許文献3)。
試料に対し、ジメチル−α−シクロデキストリン又は/及びポリ−β−シクロデキストリンの存在下で測定する、LDL−Cの測定法(特許文献4)。
カイロミクロン、HDL、LDL、VLDLのいずれか1種以上を含む試料中のコレステロールを直接、選択的に測定する方法において、リン脂質、リン脂質類似基を含有する化合物の存在下、試料中のLDL−Cを定量する方法(特許文献5)。
LpXは、胆汁うっ滞時に出現するLDLと同じ比重をもつ、健常人では全く存在しない異常リポ蛋白であり、化学組成も、構成成分の1つであるコレステロールがほとんど遊離型コレステロールであり、また、アポBを含まず、正常LDLとは大きく異なる。従って、異常リポ蛋白であるLpX中のコレステロールを測定すべきではない、と考えられている(非特許文献3)。
特開平10−38888号公報 特開平9−313200号公報 WO00/17388パンフレット 特開平11−30617号公報 特開2002−202314号公報
アドバンスド・リピッド・リサーチ(Adv. Lipid Res.)、第6巻、1頁、1968年 クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.)、第18巻、499頁、1972年 医学検査、第59巻、第1号、38-43頁、2010年
本発明の目的は、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットを提供することにある。
本発明者らはLDL−Cの測定方法について鋭意検討を重ねた結果、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、および、必要に応じて、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下で、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを反応させることで、LDL以外のリポ蛋白質中のコレステロールを消去することなく、また、リポ蛋白質の物理的な分画操作を行うことなく、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記(1)〜(22)に関する。
(1) 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
(2) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(1)記載の測定方法。
(3) 反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである(2)記載の方法。
(4) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(1)記載の測定方法。
(5) 反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lのコレステロール酸化酵素であり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである(4)記載の方法。
(6) 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行われる、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる(1)〜(6)のいずれかに記載の測定方法。
(8) ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(9) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(8)記載の試薬。
(10) 試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである(9)記載の試薬。
(11) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(8)記載の試薬。
(12) 試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである(11)記載の試薬。
(13) さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含有する、(8)〜(12)のいずれかに記載の試薬。
(14) さらに、過酸化水素測定用試薬を含む(8)〜(13)のいずれかに記載の試薬。
(15) ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンアルキルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(16) ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる(15)記載のキット。
(17) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(15)又は(16)記載のキット。
(18) 第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が1.0〜4.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.25〜1.25mmol/Lである(17)記載のキット。
(19) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(15)又は(16)記載のキット。
(20) 第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が2.0〜8.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.075〜0.3mmol/Lである(19)記載のキット。
(21) さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、(15)〜(20)のいずれかに記載のキット。
(22) さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する(15)〜(21)のいずれかに記載のキット。
本発明により、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
LpX検体のゲルろ過クロマトグラムを示す。横軸は、フラクション番号を、縦軸は、コレステロール濃度の測定値を表す。○は、総コレステロール(TC)濃度を、▲は、遊離型コレステロール(FC)濃度を、*は、実施例5のキットを用いた測定でのコレステロール濃度を、◇は、実施例6のキットを用いた測定でのコレステロール濃度を表す。
本発明による検体中のLDL−Cの測定法は、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分画操作を必要としない方法である。また、LDL−Cの測定に先立って検体中のLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のLDL−Cを測定する方法である。またLDL−Cの測定に先立って、検体中のLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することなく、検体中のLDL−Cを測定する方法である。
本発明の測定方法は、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
さらに、本発明の測定方法は、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、及び、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
本発明の測定方法によれば、異常リポ蛋白であるLpX中のコレステロールを測定せず、正確なLDL−Cの測定が可能となる。
本発明の測定方法は、
[1]検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応を、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に行う工程;
[2]上記[1]の工程で生成する過酸化水素を測定する工程;
[3]予め、既知濃度のLDL−Cを用いて作成された、LDL−C濃度と、該過酸化水素由来の情報量との関係を表す検量線と、上記[2]での測定値とを相関付ける工程;及び、
[4]検体中のLDL−C濃度を決定する工程
を含む。ここで、上記[1]の反応は、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行うこともできる。すなわち、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応は、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、及び、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行うこともできる。
上記[1]工程及び[2]工程は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては、例えば後述の水性媒体等が挙げられる。
本発明の測定方法において、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応で生成する過酸化水素は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられ、血漿及び血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素の他、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ(COE−311;東洋紡績社製)、リポプロテインリパーゼ(LPL−311;東洋紡績社製)、コレステロールエステラーゼIII(CHEIII;天野製薬社製)等が挙げられる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基(化学修飾基)としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬(化学修飾剤)としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基(N−ヒドロキシサクシンイミド基等)、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、1,3−プロパンスルトン、1,4−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル(α−ヨードエステル等)等が挙げられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とN−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトVFM−4101、サンブライトME−050AS、サンブライトDE−030AS(いずれも日油社製)、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKMシリーズ(例えば、サンブライトAKM−1510等)、サンブライトADMシリーズ、サンブライトACMシリーズ(いずれも日油社製)、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するEPOX−3400、M−EPOX−5000(いずれもSheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−N,N,N’,N’’,N’’−ペンタ無水二酢酸(DTPA anhydride;同仁化学研究所社製)等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液(例えばHEPES緩衝液)に溶解し、0〜55℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、5分間〜5時間攪拌する。酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
本発明の測定方法におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度は通常0.001〜800kU/Lであり、0.01〜300kU/Lが好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;協和発酵工業社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHO−CE;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(COO−321;東洋紡績社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の測定方法における反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、ポリオキシエチレンアルキルアミンとしてポリオキシエチレンドデシルアミンを用いる場合は、反応液中のポリオキシエチレンドデシルアミン0.06〜0.3mmol/Lに対して、コレステロール酸化酵素0.25〜1.0kU/Lが好ましく、ポリオキシエチレンアルキルアミンとしてポリオキシエチレンオクタデシルアミンを用いる場合は、反応液中のポリオキシエチレンオクタデシルアミン0.02〜0.075mmol/Lに対して、コレステロール酸化酵素0.5〜2.0kU/Lが好ましい。
本発明において、コレステロールエステル加水分解酵素の酵素活性(U)は、例えば酵素メーカーで値付けされた活性値を用いることができる。
本発明において、コレステロール酸化酵素の酵素活性(U)は、以下の酵素活性測定用試薬とコレステロール酸化酵素との37℃での反応により、1分あたりコレステロール1μmolが反応する酵素量と定義される。
<酵素活性測定用試薬>
リン酸緩衝液(pH7.15) 0.15 mol/L
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル 10 g/L
2−プロパノール 2.5%
4−アミノアンチピリン 0.2 g/L
フェノール 1 g/L
ペルオキシダーゼ 26 kU/L
コレステロール 0.16 g/L
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル(以下、POE・POAアルキルアリールエーテルと略記する)におけるアルキルとしては例えばオクチル、ノニル、デシル、ドデシルなどが挙げられ、POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるアリールとしてはフェニル等が挙げられる。POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。POE・POAアルキルアリールエーテルの具体例としては、エマルゲンL40等(花王社製)、アクロネセスKP189R、アクロネセスKP189R−40、アクロネセスNP−189R(以上、日油社製)等が挙げられる。
本発明の測定方法における反応液中のPOE・POAアルキルアリールエーテルの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常、反応液中の濃度は0.001〜200g/Lであり、好ましくは0.01〜50g/Lである。
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物(以下、POE・POA縮合物と略記する)におけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。POE・POA縮合物におけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ポリオキシアルキレン(POA)の分子量としては、500〜6000であり、好ましくは1500〜4000である。POE・POA縮合物の分子量としては、500〜12000であり、好ましくは1500〜8000である。
POE・POA縮合物の具体例としては、プルロニックL−121、プルロニックP−103、プルロニックF−108(以上、ADEKA社製)、プロノンB−204、アクロネセスB−208(以上、日油社製)等が挙げられる。
本発明の測定方法における反応液中のPOE・POA縮合物の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常、反応液中の濃度は0.001〜200g/Lであり、好ましくは0.01〜50g/Lである。
ポリオキシエチレンアルキルアミン(以下、POEアルキルアミンと略記する)におけるアルキルとしては、例えば炭素数6〜30の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数10以上のアルキルが好ましい。炭素10以上のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。中でも、炭素数12のアルキル[ドデシル(ラウリル)]と炭素数18のアルキル[オクタデシル(ステアリル)]が特に好ましい。POEアルキルアミンのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、1〜40であり、好ましくは、2〜20である。
POEアルキルアミンの具体例(製品)としては、例えばナイミーンL−201(オキシエチレンドデシルアミン;日油社製)、ナイミーンL−202、ナイミーンL−207、ナイミーンL−215(以上、ポリオキシエチレンドデシルアミン;日油社製)、ナイミーンS−202、ナイミーンS−204、ナイミーンS−210、ナイミーンS−215、ナイミーンS−220(以上、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;日油社製)、ナイミーンT2−202、ナイミーンT2−210、ナイミーンT2−230[以上、ポリオキシエチレンアルキル(牛脂)アミン;日油社製]、ナイミーンF−202、ナイミーンF−203、ナイミーンF−205、ナイミーンF−210、ナイミーンF−215[以上、ポリオキシエチレンアルキル(ヤシ油)アミン;日油社製]、ブラウノンL−202、ブラウノンL−205、ブラウノンL−207、ブラウノンL−210、ブラウノンL−230(以上、ポリオキシエチレンドデシルアミン;青木油脂社製)、ブラウノンS−207、ブラウノンS−210、ブラウノンS−215、ブラウノンS−220、ブラウノンS−230(以上、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;青木油脂社製)、ブラウノンS−205T、ブラウノンS−208T、ブラウノンS−210T、ブラウノンS−215T、ブラウノンS−230T[以上、ポリオキシエチレンアルキル(牛脂)アミン;青木油脂社製]、ニューコールOD420(ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;日本乳化剤社製)、パイオニンD3104(ポリオキシエチレンドデシルアミン;竹本油脂社製)、パイオニンD3110(ポリオキシエチレンドデシルアミン;竹本油脂社製)、パイオニンD3605[ポリオキシエチレンアルキル(大豆)アミン;竹本油脂社製]、パイオニンD3615T[ポリオキシエチレンアルキル(牛脂)アミン;竹本油脂社製]等が挙げられる。
本発明の測定方法における反応液中のPOEアルキルアミンの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、POEドデシルアミンの場合は通常0.06〜0.3mmol/Lであり、POEオクタデシルアミンの場合は通常0.02〜0.075mmol/Lである。
ポリアニオンとしては、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸又はその塩、硫酸化シクロデキストリン又はその塩、硫酸化オリゴ糖又はその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が4万、8万、20万、50万、100万、200万等のデキストラン硫酸等が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを2種以上用いてもよい。
本発明のLDL−Cの測定方法における反応液中のポリアニオンの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.005〜100g/Lであり、好ましくは0.05〜10g/Lである。
本発明の測定方法において、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩(以下、POE多環エーテル硫酸エステル塩と略記する)およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を用いることにより、低LDL血症患者由来の血清等の、LDLが極僅かしか含まれない検体(以下、低LDL検体という)中のLDL−Cの測定に好適に使用することができる。低LDL検体を用いるLDL−Cの測定は、検体中のカイロミクロンや干渉物質等の影響を受け易く、従来の方法では、測定により決定されたLDL−C濃度が負の値となる場合があった。低LDL検体には、LDLが僅かに含まれ、LDL中にはコレステロールが含まれることから、低LDL検体は僅かではあるがLDL−Cを含む。従って、測定により決定されるLDL−C濃度は、本来、正の値であり、負の値とはなることはない。本発明の測定方法において、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を用いることにより、このような低LDL検体においても、LDL−Cを正確に測定することができる。
POE多環エーテル硫酸エステル塩としては、例えばポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンナフチルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。POE多環エーテル硫酸エステル塩の具体例(市販品)としては、例えばニューコール707SF、ニューコールB4−SN(以上、日本乳化剤社製)等が挙げられる。
アリールスルホン酸誘導体としては、例えばナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物等が挙げられる。アリールスルホン酸誘導体の具体例(市販品)としては、例えばディスロールSH(日本乳化剤社製)、デモールRN、デモールMS、デモールSN−B(以上、花王社製)等が挙げられる。
本発明のLDL−C測定方法における反応液中のPOE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.005〜7.5g/Lであり、好ましくは、0.01〜6g/Lである。
本発明において用いられる水性媒体は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法におけるpHは、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とするpHであればいずれでもよいが、例えばpH4〜10が挙げられる。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(POPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0mol/Lが好ましく、0.005〜1.0mol/Lがより好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法における反応温度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、10〜50℃が好ましく、30〜40℃がより好ましい。汎用の自動分析装置で設定される反応温度は通常37℃である。
本発明のLDL−Cの測定方法における反応時間は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、1〜60分間が好ましく、2〜30分間がより好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法において、LDL−Cの測定は、反応により生成した過酸化水素の量を測定することにより行うことができる。
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、測定することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、o−フェニレンジアミン、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA−64)、10−N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン ナトリウム塩(DA−67)、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、2つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば4−アミノアンチピリン(4−AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
アニリン類としては、N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N−ジメチル−3−メチルアニリン、N,N−ジ(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−(3,5−ジメトキシフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(DOSE)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4−フルオロ−3,5−ジメトキシアニリン(F−DAOS)、N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(MASE)、N−エチル−N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(Et−MASE)等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、1〜100kU/Lが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、過酸化水素の測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10g/Lが好ましい。
(LDL−C測定用試薬・測定用キット)
本発明のLDL−C測定用試薬は、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬である。本発明のLDL−C測定用試薬は、さらに、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含むことができる。
本発明のLDL−C測定用試薬は、本発明のLDL−C測定方法に用いることができる。本発明のLDL−C測定用試薬は、保存、流通及び使用に適したキットの形態を取ることができる。本発明のLDL−C測定用キットとしては、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系のキットが好ましい。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬又はキットを用いて検体中のLDL−Cを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットにおいては、前述のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体、及び、過酸化水素測定用試薬を用いることができる。
第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれる。コレステロール酸化酵素は第一試薬に含まれず、第二試薬に含まれる。POE・POAアリールエーテルは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第二試薬に含まれる態様が好ましい。POE・POA縮合物は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第二試薬に含まれる態様が好ましい。POEアルキルアミンは、第二試薬に含まれる。ポリアニオンは第一試薬に含まれる。
POE多環エーテル硫酸エステル塩は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第一試薬に含まれる態様が好ましい。
アリールスルホン酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれてよいが、第一試薬に含まれる態様が好ましい。
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含む場合には、酸化カップリング型色原体の2つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含まれる態様が好ましい。
本発明のLDL−C測定用試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度は、通常0.001〜800kU/Lであり、好ましくは0.01〜300kU/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、コレステロールエステル加水分解酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜800kU/L、好ましくは0.01〜300kU/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度は、通常0.004〜3200kU/Lであり、好ましくは0.04〜1200kU/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.004〜3200kU/L、好ましくは0.04〜1200kU/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬におけるPOE・POAアルキルアリールエーテルの濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜200g/Lであり、好ましくは0.01〜50g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、POE・POAアルキルアリールエーテルの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜200g/L、好ましくは0.01〜50g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおけるPOE・POAアルキルアリールエーテルの濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.004〜800g/Lであり、好ましくは0.04〜200g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、POE・POAアルキルアリールエーテルの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.004〜800g/L、好ましくは0.04〜200g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬におけるPOE・POA縮合物の濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜200g/Lであり、好ましくは0.01〜50g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、POE・POA縮合物の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜200g/L、好ましくは0.01〜50g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおけるPOE・POA縮合物の濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.004〜800g/Lであり、好ましくは0.04〜200g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、POE・POA縮合物の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.004〜800g/L、好ましくは0.04〜200g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬におけるポリアニオンの濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.005〜100g/Lであり、好ましくは0.05〜10g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、ポリアニオンの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.005〜100g/L、好ましくは0.05〜10g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおけるポリアニオンの第一試薬中の濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.005〜150g/Lであり、好ましくは0.05〜15g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、ポリアニオンの第一試薬中の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.005〜150g/L、好ましくは0.05〜15g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬における、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.005〜7.5g/Lであり、好ましくは0.01〜6g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.005〜7.5g/L、好ましくは0.01〜6g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおける、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの濃度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.007〜10g/Lであり、好ましくは0.015〜8g/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体それぞれの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.007〜10g/L、好ましくは0.015〜8g/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬におけるコレステロール酸化酵素濃度は、通常LDL−C測定用試薬中のPOEドデシルアミン0.06〜0.3mmol/Lに対して、0.25〜1.0kU/Lであり、LDL−C測定用試薬中のPOEオクタデシルアミン0.02〜0.075mmol/Lに対して、0.5〜2.0kU/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用試薬においては、コレステロール酸化酵素濃度の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態でのコレステロール酸化酵素濃度が、POEドデシルアミン0.06〜0.3mmol/Lに対して、0.25〜1.0kU/Lとなる含量であり、POEオクタデシルアミン0.02〜0.075mmol/Lに対して、0.5〜2.0kU/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用キットにおけるコレステロール酸化酵素の第二試薬中の濃度は、通常第二試薬中のPOEドデシルアミン0.25〜1.25mmol/Lに対して、1.0〜4.0kU/Lであり、第二試薬中のPOEオクタデシルアミン0.075〜0.3mmol/Lに対して、2.0〜8.0kU/Lである。凍結乾燥された状態のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロール酸化酵素の第二試薬中の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態でのコレステロール酸化酵素の濃度が、POEドデシルアミン0.25〜1.25mmol/Lに対して、1.0〜4.0kU/Lとなる含量であり、POEオクタデシルアミン0.075〜0.3mmol/Lに対して、2.0〜8.0kU/Lとなる含量である。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
以下に、本発明のLDL−C測定用試薬の具体的態様を記すが、本発明のLDL−C測定用試薬はこれらに限定されない。
・試薬1
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬2
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬3
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬4
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
以下に、本発明のLDL−C測定用キットの具体的態様を記すが、本発明のLDL−C測定用キットはこれらに限定されない。
・キット1
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット2
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット3
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット4
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット5
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット6
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット7
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット8
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット9
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット10
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット11
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット12
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例及び比較例においては、下記メーカーの試薬、酵素及び界面活性剤を使用した。
試薬
MOPS(同仁化学研究所社製)
DOSE(ダイトーケミックス社製)
硫酸ナトリウム(関東化学社製)
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万)(アマシャム社製)
4−アミノアンチピリン(埼京化成社製)
酵素
ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)
CHODI(コレステロール酸化酵素;キッコーマン社製)
LPL−311(コレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)
界面活性剤
ブラウノンL−205(ポリオキシエチレンドデシルアミン;青木油脂社製)
ナイミーンS−204(ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;日油社製)
アクロネセスKP189R(POE・POAアルキルアリールエーテル;日油社製)
プルロニックL−121(POE・POA縮合物;ADEKA社製)
ニューコール707SF(POE多環エーテル硫酸エステル塩);日本乳化剤社製)
ニューコールB4−SN(POE多環エーテル硫酸エステル塩;日本乳化剤社製)
ディスロールSH(アリールスルホン酸誘導体;日本乳化剤社製)
デモールRN(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
デモールMS(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
デモールSN−B(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.25〜1.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
[比較例] 以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
実施例1及び比較例の各キットを用いて、ヒト血清50検体中のLDL−Cを以下の手順により測定した。
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(LDL−C濃度:0.0mg/dL)及び血清(LDL−C濃度:140mg/dL)を、キットとして、実施例1及び比較例の各キットを用いて、それぞれ日立7170S形自動分析装置により、LDL−C濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度(E1及びE2)を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(3μL)と第一試薬(0.15mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、次いで、この反応液に第二試薬(0.05mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
(2)ヒト血清検体と実施例1及び比較例の各キットとの反応による当該検体における「吸光度」の測定
(1)の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は(1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。
(3)ヒト血清検体中のLDL−C濃度の決定
(2)で測定出した「吸光度」と、(1)で作成した検量線とから、各検体中のLDL−C濃度を決定した。
次いで、キットとして、市販のLDL−C測定用キットであるデタミナーL LDL−C(協和メデックス社製)を用いて、検体として同じヒト血清50検体を用いて、上記と同様の手順により、それぞれの検体中のLDL−Cを測定した。
実施例1及び比較例の各キットを用いた測定と、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間の相関係数を第1表に示す。
Figure 0005832995
第1表から明らかな様に、第二試薬中のCHODIが1.0〜4.0kU/L、第二試薬中のブラウノンL−205が0.25〜1.25mmol/Lの実施例1のキットを用いる測定において、市販キットを用いる測定との間に良好な相関が得られることが判明した。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ナイミーンS−204 0.075〜0.375 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
実施例1のキットの代わりに実施例3のキットを用い、検体として実施例1の検体とは異なる検体(50検体)を用いる以外は、実施例2に記載の方法と同様に、実施例3のキットを用いる測定と、デタミナーL LDL−Cを用いる測定との間の相関係数を算出した。その結果を第2表に示す。
Figure 0005832995
第2表から明らかな様に、第二試薬中のCHODIが2.0〜8.0kU/L、第二試薬中のナイミーンS−204が0.075〜0.3mmol/Lの実施例3のキットを用いる測定において、市販キットを用いる測定との間に良好な相関が得られることが判明した。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 3 kU/L
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ナイミーンS−204 0.15 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 4 kU/L
[試験例]
異常リポ蛋白の1つであるLpXを多量に含む肝疾患患者由来の血清[以下、LpX検体と記す]を用いて、本発明のLDL−C測定方法において、LpX中のコレステロールに対する反応性が抑制されることを以下の方法により示した。
LpXは、その構成成分であるコレステロールが、ほとんど遊離型コレステロールのみであることを特徴とする。LpX検体そのものを下記に示す方法でゲルろ過クロマトグラフィーに付すと、LpX画分のピークがVLDL画分のピークと同じ位置に出現する。そこで、先ず、LpX検体を超遠心分離により、比重が1.006よりも小さい上清画分を分離した。すなわち、超遠心分離用チューブに生理食塩水で希釈した試料を添加し、このチューブを日立ローター50.4TIローターにセットし、29,000rpmで18.5時間、超遠心分離を行い、遠心分離終了後、チューブスライサーを用いて分離した上清(カイロミクロン及びVLDLを含む)を除き、LpXを含む画分を得た。
上記で得られたLpXを含む画分を、以下の条件により、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して、得られた各フラクションについて、総コレステロール測定用キット及び遊離型コレステロール測定用キットを用いて、各フラクション中の総コレステロール濃度及び遊離型コレステロール濃度を測定した。同様に、各フラクションについて、各フラクション中のコレステロール濃度を、実施例5及び6それぞれのキットを用いて測定した。その結果(クロマトグラム)を図1に示す。
<ゲルろ過カラムクロマトグラフィー>
システム:BIOCAD700E(PreSeptive Biosystems社製)
カラム:SuperoseHR6カラム(ファルマシア社製)
溶出溶媒:EDTA(1mmol/L)を含有する0.15mol/L塩化ナトリウム水溶液(pH7.4)
流速:0.3mL/分
<濃度測定>
発色試薬:
(1)総コレステロール(TC)測定用キット:デタミナーL TC II(協和メデックス社製)
発色反応温度:37℃
検出波長:主波長600nm;副波長800nm
サンプル量:4μL
(2)遊離型コレステロール(FC)測定用キット:デタミナーL FC(協和メデックス社製)
発色反応温度:37℃
検出波長:主波長600nm;副波長700nm
サンプル量:4μL
本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン(クロマトグラム)を図1に示す。図1に示されているように、最初に溶出されるフラクションにおいては、総コレステロールが遊離型コレステロールとほぼ同濃度であり、また、アポB測定用キットを用いた同様の測定により、当該フラクションにはアポBが含まれないことが確認されていることから、当該フラクションがLpXに該当することを確認した。すなわち、当該肝疾患患者由来の血清が異常リポ蛋白の1つであるLpXを多量に含むことを確認した。尚、図1のクロマトグラムにおいてLpXに次いで溶出されるフラクションは、LpY(異常リポ蛋白の1つ)と微量のLDLを含むフラクションであることが確認された。
一方、実施例5及び6のキットを用いて、本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの各フラクション中のコレステロール濃度を測定した結果、図1に示す通り、LpX中のコレステロールとは反応しないことが分かった。従って、本発明のLDL−C測定用キットは、LpX中のコレステロールと反応せず、本発明のLDL−C測定方法は、LpX中のコレステロールに対する反応性が抑制された方法であることが判明した。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キットを調製した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
POE多環エーテル硫酸エステル塩またはアリールスルホン酸誘導体(その種類と濃度は第3表参照)
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 4 kU/L
[試験例]
検体として、低LDL血症患者由来の血清を用い、キットとして、実施例7のキットを用いる以外は、実施例2に記載の方法と同様の方法により、当該検体中のLDL−C濃度を決定した。その結果を第3表に示す。
Figure 0005832995
第3表から明らかなように、POE多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体のいずれをも含まない実施例1のキットを用いた測定においては、LDL−C濃度が負の値となったが、POE多環エーテル硫酸エステル塩、アリールスルホン酸誘導体のいずれかを含む実施例7のキットを用いた測定においては、LDL−C濃度が正の値となり、正確なLDL−Cの測定が可能となることが示された。
本発明により、メタボリックシンドロームや動脈硬化等の診断に有用なLDL−Cの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

Claims (13)

  1. 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンドデシルアミン及びポリアニオンの存在下に、反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、反応液中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである濃度で反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  2. 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンオクタドデシルアミン及びポリアニオンの存在下に、反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、反応液中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである濃度で反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  3. 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行われる、請求項1又は2記載の方法。
  4. 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる請求項1〜のいずれかに記載の測定方法。
  5. ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンドデシルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有し、試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  6. ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有し、試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  7. さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含有する、請求項5又は6記載の試薬。
  8. さらに、過酸化水素測定用試薬を含む請求項5〜7のいずれかに記載の試薬。
  9. ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンドデシルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が1.0〜4.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.25〜1.25mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  10. ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンオクタデシルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が2.0〜8.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.075〜0.3mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  11. ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる請求項9又は10記載のキット。
  12. さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、請求項9〜11のいずれかに記載のキット。
  13. さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する請求項9〜12のいずれかに記載のキット。
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