JP5969978B2 - Ｈｄｌ亜分画中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、検体中のＨＤＬ亜分画中のコレステロールの測定方法、測定用試薬、及び測定用キットに関する。

高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）はリポ蛋白の１つであり、１．０６３〜１．２１０の比重を有する。ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、冠動脈疾患（ＣＨＤ）の負の危険因子として知られている。近年、ＨＤＬの亜分画であるＨＤＬ２とＨＤＬ３に対して、その臨床的意義に関心が高まっている。ＨＤＬ２は比重１．０６３〜１．１２５、ＨＤＬ３は比重１．１２５〜１．２１０のリポ蛋白である。

肝臓又は腸管から分泌された原始型ＨＤＬは、末梢の細胞膜に接着し、そこから遊離型コレステロールを取り込み、取り込まれた遊離型コレステロールは、ＨＤＬ表面上に存在するＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）の作用によりエステル型コレステロールに変換され、このエステル型コレステロールを芯とした球状のＨＤＬ３となる。ＨＤＬ３は、さらにＬＣＡＴの作用によりエステル型コレステロールが増加し、ＨＤＬ２になる。

ＨＤＬ２中のコレステロールは、２つの経路により代謝される。１つは、ＨＤＬ２ごと肝臓に直接取り込まれ、胆汁酸として排出される経路であり、もう１つは、ＨＤＬ２中のエステル型コレステロールがＣＥＴＰ（コレステロールエステル転送蛋白）の作用により、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間密度リポ蛋白（ＩＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）等の中性脂肪豊富なリポ蛋白内の中性脂肪と交換され、当該中性脂肪豊富なリポ蛋白に転送される経路（コレステロール逆転送系）である。

ＨＤＬ亜分画中のコレステロールの測定方法について、これまでに、ＨＤＬ３とＨＤＬ２との分離工程を伴う沈殿法、ＨＤＬ３とＨＤＬ２との分離工程を伴わないホモジニアス法が知られている。

沈殿法としては、ヘパリン、２価金属イオン及びデキストラン硫酸を用いる、１段階の分離操作による、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法（例えば、特許文献１、非特許文献１）、２段階の分離操作による、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法（例えば、非特許文献２〜４）等が知られている。１段階の分離操作による、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法は、検体中のＨＤＬ３以外のリポ蛋白を凝集させて分離除去し、得られたＨＤＬ３中のコレステロールを測定する方法である。２段階の分離操作による、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法は、先ず、検体中のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させ、遠心分離により、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を除き、次いで、得られたＨＤＬを含む上清中のＨＤＬ２を凝集させ、遠心分離によりＨＤＬ２を除去し、上清に含まれるＨＤＬ３を回収し、得られたＨＤＬ３中のコレステロールを測定する方法である。

ホモジニアス法としては、ＨＤＬに対して高い特異性を示す酵素、及び、ＨＬＢ値が１７以上である非イオン性界面活性剤を用いる方法が知られている（例えば、特許文献２）。

遠心分離等の煩雑な操作を伴わない、簡便、かつ、正確な、検体中のＨＤＬ亜分画中のコレステロールの測定方法が求められている。

特開２００９−２０７４６３号公報 特開２００１−３４６５９８号公報

ジャーナル オブ リピッド リサーチ(Journal of Lipid Research)、４９巻、５号、１１３０−１１３６頁（２００８年） クリニカル ケミストリ(Clinical Chemistry)、３４巻、１１号、２３２２−２３２７頁（１９９８年） クリニカル ケミストリ(Clinical Chemistry)、３６巻、２号、２６５−２７０頁（１９９９年） ジャーナル オブ リピッド リサーチ(Journal of Lipid Research)、２３巻、８号、１２０６−１２２３頁（１９８２年）

本発明の目的は、簡便、かつ、正確に、検体中のＨＤＬ亜分画中のコレステロールを測定する方法、試薬、及び、キットを提供することにある。

本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、コレステロール測定用酵素、２価の金属塩、特定のアルカリ金属塩、及び、デキストラン硫酸又はその塩を用いることにより、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、ＨＤＬ３中のコレステロールを測定することができる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１９］に関する。

［１］検体と、（１）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、（２）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する水性媒体中で反応させ、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法、
［２］２価の金属塩がマグネシウム塩又はカルシウム塩である前記［１］記載の方法、
［３］デキストラン硫酸又はその塩の反応液中の濃度が、０．７５〜２．６ｇ／Ｌである前記［１］または［２］記載の方法、
［４］反応液中の２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が、１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、反応液中のアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が、５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］以下の工程を含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定方法
（１）検体中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロールを測定する工程；
（２）前記［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法により、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定する工程；
（３）上記（１）工程での測定の測定値から、（２）工程での測定の測定値を差し引く工程、
［６］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するための試薬であって、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩、及び、過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定用試薬、
［７］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するための試薬であって、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有することを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定用試薬、
［８］さらに、還元型補酵素測定用試薬を含む、前記［７］記載の試薬、
［９］２価の金属塩がマグネシウム塩又はカルシウム塩である前記［６］〜［８］のいずれかに記載の試薬、
［１０］デキストラン硫酸又はその塩が、反応液中での濃度が０．７５〜２．６ｇ／Ｌとなる含量で含まれる前記［６］〜［９］のいずれかに記載の試薬、
［１１］２価の金属塩が、反応液中での２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれ、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれる前記［６］〜［１０］のいずれかに記載の試薬、
［１２］第一試薬および第二試薬を含有する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するためのキットであって、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を第一試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット、
［１３］第一試薬および第二試薬を含有する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するためのキットであって、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を第一試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット、
［１４］さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する前記［１３］記載のキット、
［１５］２価の金属塩が、マグネシウム塩又はカルシウム塩である前記［１２］〜［１４］のいずれかに記載のキット、
［１６］デキストラン硫酸又はその塩が、反応液中での濃度が０．７５〜２．６ｇ／Ｌとなる含量で含まれる前記［１２］〜［１５］のいずれかに記載のキット、
［１７］２価の金属塩が、反応液中での２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が、１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれ、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が、５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれる前記［１２］〜［１６］のいずれかに記載のキット、
［１８］前記［６］〜［１１］のいずれかに記載のＨＤＬ３中のコレステロール測定用試薬と、ＨＤＬコレステロール測定用試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定用キット、
［１９］前記［１２］〜［１７］のいずれかに記載のＨＤＬ３中のコレステロール測定用キットの第一試薬及び第二試薬と、ＨＤＬコレステロール測定用試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定用キット。

本発明により、簡便、かつ、正確に、検体中のＨＤＬ亜分画中のコレステロールを測定する方法、試薬、及び、キットが提供される。

＜ＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法＞
本発明の、検体中のＨＤＬ３中のコレステロール（以下、ＨＤＬ３−Ｃと記す）の測定方法は、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分離除去を必要としない方法であり、また、ＨＤＬ３−Ｃの測定に先立って、検体中のＨＤＬ３以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のＨＤＬ３−Ｃを測定する方法である。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定方法は、検体とコレステロール測定用酵素とを、（ａ）マグネシウム塩又はカルシウム塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する水性媒体中で反応させ、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法である。コレステロール測定用酵素としては、例えばコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせ等が挙げられる。

本発明の測定方法は、
（１）検体と、コレステロール測定用酵素との反応を、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する水性媒体中で反応させる工程；
（２）ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、工程（１）の反応により生成する物質又は消費される物質を測定する工程；
（３）予め、既知濃度のＨＤＬ３−Ｃを用いて作成された、ＨＤＬ３−Ｃ濃度と、該生成する物質又は該消費される物質由来の情報量との関係を表す検量線と、上記（２）での測定値とを相関付ける工程；及び、
（４）検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を決定する工程
を含む。ここで、工程（１）におけるコレステロール測定用酵素としては、前述のコレステロール測定用酵素等が挙げられる。

工程（２）における、工程（１）の反応により生成する物質としては、コレステロール測定用酵素として、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせを用いる場合には、過酸化水素等が挙げられ、コレステロール測定用酵素として、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせを用いる場合には、還元型補酵素等が挙げられる。

工程（２）における、工程（１）の反応により消費される物質としては、コレステロール測定用酵素として、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせを用いる場合には、酸素分子等が挙げられる。

本発明の測定方法において、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応で生成する過酸化水素は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。

本発明の測定方法において、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素との反応で生成する還元型補酵素は、例えば吸光度法や後述の還元型補酵素測定用試薬を用いて測定することができる。吸光度法としては、吸光度を用いて還元型補酵素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば還元型補酵素の吸光度を、還元型補酵素の最大吸収波長（λ_ｍａｘ＝３４０ｎｍ）付近の波長で測定する方法等が挙げられる。

消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いて測定することができる。

本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられ、血漿及び血清が好ましい。

本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。

コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素の他、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。

市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ“Ａｍａｎｏ”３；天野エンザイム株式会社製）、コレステロールエステラーゼ（ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２；天野エンザイム株式会社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。

化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日油社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日油社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもSheawater Polymers社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（DTPA anhydride；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。

コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも使用することもできる。

本発明の測定方法におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１〜３００ｋＵ／Ｌが好ましい。

本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；協和発酵工業社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２２；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。

コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。

本発明の測定方法におけるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１〜３００ｋＵ／Ｌが好ましい。

本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣＨＤＨ“Ａｍａｎｏ”５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。

本発明の測定方法におけるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１〜３００ｋＵ／Ｌが好ましい。

本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ（thio）−ＮＡＤ、チオ（thio）−ＮＡＤＰ等が挙げられる。

本発明の測定方法における酸化型補酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌであり、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。

本発明における還元型補酵素としては、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ（thio）−ＮＡＤＨ、チオ（thio）−ＮＡＤＰＨ等が挙げられる。

本発明において用いられる２価の金属塩としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする２価の金属塩であれば特に制限はなく、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等が挙げられるが、マグネシウム塩又はカルシウム塩が好ましい。また、本発明においては、２価の金属塩の水和物等も用いることができる。マグネシウム塩としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とするマグネシウム塩であれば特に制限はなく、例えば塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。カルシウム塩としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とするカルシウム塩であれば特に制限はなく、例えば塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。

本発明の測定方法における２価の金属塩の反応液中の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、１３〜１９ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。

本発明の測定方法におけるアルカリ金属塩は、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩及びハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩であり、例えば硫酸リチウム、硝酸リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、フッ化リチウム、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、炭酸カリウム、酢酸カリウム、フッ化カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム等が挙げられる。

本発明の測定方法における硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩及びハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩の反応液中の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌであり、６〜１８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。

本発明の測定方法におけるデキストラン硫酸又はその塩は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とするデキストラン硫酸又はその塩であれば特に制限はないが、分子量が４万〜５０万のデキストラン硫酸又はその塩が好ましい。塩としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする塩であれば特に制限はなく、例えばナトリウム塩等が挙げられる。本発明の測定方法におけるデキストラン硫酸又はその塩の反応液中の濃度としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常０．７５〜２．６ｇ／Ｌであり、１．０〜２．３ｇ／Ｌが好ましい。

本発明において用いられる水性媒体は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。

本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法におけるｐＨは、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法を可能とするｐＨであればいずれでもよいが、例えばｐＨ４〜１０が挙げられる。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。

グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。

本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法における反応温度は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、１０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。汎用の自動分析装置で設定される反応温度は通常３７℃である。
本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法における反応時間は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、１〜６０分間が好ましく、２〜３０分間がより好ましい。

本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法において、コレステロール測定用酵素として、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせを用いる場合には、ＨＤＬ３−Ｃの測定は、反応により生成した過酸化水素の量を測定することにより行うことができる。

生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。

過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、測定することができる。

酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。

カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。

アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＤＯＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等が挙げられる。

フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。

過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、過酸化水素の測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。

本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法において、コレステロール測定用酵素として、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせを用いる場合には、ＨＤＬ３−Ｃの測定は、反応により生成した還元型補酵素の量を測定することにより行うことができる。

生成した還元型補酵素の量は、例えば吸光度法や還元型補酵素測定用試薬を用いて測定することができる。吸光度法としては、例えば前述の吸光度法等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。

還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬、還元型補酵素酸化酵素を含有する試薬、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬等が挙げられる。

還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。

還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。

還元型補酵素測定用試薬として、還元型補酵素酸化酵素を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体と還元型補酵素酸化酵素との反応で生成する過酸化水素を測定することにより、還元型補酵素を測定することができる。生成した過酸化水素は、例えば前述の過酸化水素電極を用いる方法や、前述の過酸化水素測定用試薬を用いる方法等により測定することができる。過酸化水素測定用試薬を用いる方法を用いて還元型補酵素を測定する場合には、還元型補酵素測定用試薬は、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する。

＜ＨＤＬ２中のコレステロールの測定方法＞
ＨＤＬは、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の２つの亜分画からなるリポ蛋白であるので、検体中のＨＤＬコレステロール（総ＨＤＬコレステロール）を測定し、当該総ＨＤＬコレステロール濃度から、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法により測定される検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を差し引くことにより、当該検体中のＨＤＬ２コレステロール（以下、ＨＤＬ２−Ｃと記す）濃度を測定することができる。

すなわち、本発明の、検体中のＨＤＬ２−Ｃの測定方法は、以下の工程を含む方法である。
（１）検体中のＨＤＬ中のコレステロールを測定する工程；
（２）本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定方法により、検体中のＨＤＬ３−Ｃを測定する工程；
（３）上記（１）工程での測定の測定値から、（２）工程での測定の測定値を差し引く工程。

工程（１）におけるＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと記す）の測定は、検体中の総ＨＤＬ中のコレステロールの測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば特開平８−１３１１９７号公報、ＷＯ２００４／０３５８１６号パンフレット、ＷＯ２００６／１１８１９９号パンフレット等に記載の方法により行うことができる。また、ＨＤＬ−Ｃの測定は、市販のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定用キットを用いて行うこともできる。市販のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定キットとしては、例えば「メタボリードＨＤＬ−Ｃ」（協和メデックス社製）、「デタミナーＬ ＨＤＬ−Ｃ」（協和メデックス社製）等が挙げられる。
工程（２）におけるＨＤＬ３−Ｃの測定は、前述のＨＤＬ３−Ｃ測定方法により行うことができる。

＜ＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬＞
本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬は、本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定方法に用いられる試薬である。
本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬の態様を以下に記す。

・測定用試薬１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する試薬
・測定用試薬２
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬
・測定用試薬３
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する試薬
・測定用試薬４
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩、及び、還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＨＤＬ３−Ｃを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬が水性媒体に溶解された状態である場合、試薬中の各要素の濃度は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、反応液中の濃度が以下に示す濃度となる濃度である。
・コレステロールエステル加水分解酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール酸化酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール脱水素酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・酸化型補酵素：通常０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ。
・２価の金属塩：通常１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１３〜１９ｍｍｏｌ／Ｌ。
・硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩：通常５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは６〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ。
・デキストラン硫酸又はその塩：通常０．７５〜２．６ｇ／Ｌ、好ましくは１．０〜２．３ｇ／Ｌ。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬が凍結乾燥状態である場合、試薬中の各要素の含量は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする含量であれば特に制限はなく、例えば反応液中での濃度が上記の濃度となる含量である。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬中の各要素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での各要素の濃度が、例えば以下の濃度となる含量である。
・コレステロールエステル加水分解酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール酸化酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール脱水素酵素：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・酸化型補酵素：通常０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ。
・２価の金属塩：通常１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１３〜１９ｍｍｏｌ／Ｌ。
・硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩：通常５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは６〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ。
・デキストラン硫酸又はその塩：通常０．７５〜２．６ｇ／Ｌ、好ましくは１．０〜２．３ｇ／Ｌ。

＜ＨＤＬ３−Ｃ測定用キット＞
本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬は、本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定方法に用いられ、保存、流通及び使用に適したキットの形態を取ることができる。本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のキットが好ましい。

第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれる。コレステロール酸化酵素は、第二試薬に含まれることが好ましい。酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含まれる。コレステロール脱水素酵素は、第二試薬に含まれることが好ましい。２価の金属塩は、第一試薬に含まれることが好ましい。硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩は、第一試薬に含まれることが好ましい。デキストラン硫酸又はその塩は、第一試薬に含まれることが好ましい。

過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含む場合には、酸化カップリング型色原体の２つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含まれる態様が好ましい。

還元型補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットの態様を以下に記す。
・測定用キット１
第一試薬
(ａ)２価の金属塩、(ｂ)硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、(ｃ)デキストラン硫酸又はその塩を含有する試薬
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬
・測定用キット２
第一試薬
(ａ)２価の金属塩、(ｂ)硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、(ｃ)デキストラン硫酸又はその塩、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素を含有する試薬、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬
・測定用キット３
第一試薬
(ａ)２価の金属塩、(ｂ)硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、(ｃ)デキストラン硫酸又はその塩を含有する試薬
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、及び、コレステロール脱水素酵素を含有する試薬
・測定用キット４
第一試薬
(ａ)２価の金属塩、(ｂ)硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、(ｃ)デキストラン硫酸又はその塩、及び、還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、及び、還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いて検体中のＨＤＬ３−Ｃを測定する場合には、当該キットは水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットが水性媒体に溶解された状態である場合、キットの第一試薬又は第二試薬中の各要素の濃度は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば反応液中の濃度が以下に示す濃度となる濃度である。
・コレステロールエステル加水分解酵素（第一試薬又は第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール酸化酵素（第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール脱水素酵素（第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・酸化型補酵素（第一試薬又は第二試薬）：通常０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ。
・２価の金属塩（第一試薬）：通常１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１３〜１９ｍｍｏｌ／Ｌ。
・硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩（第一試薬）：通常５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは６〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ。
・デキストラン硫酸又はその塩（第一試薬）：通常０．７５〜２．６ｇ／Ｌ、好ましくは１．０〜２．３ｇ／Ｌ。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットが凍結乾燥状態である場合、キットの第一試薬又は第二試薬中の各要素の含量は、本発明のＨＤＬ３−Ｃの測定を可能とする含量であれば特に制限はなく、例えば反応液中の濃度が上記の濃度となる含量である。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットの第一試薬又は第二試薬中の各要素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での各要素の濃度が、例えば以下の濃度となる含量である。
・コレステロールエステル加水分解酵素（第一試薬又は第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール酸化酵素（第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・コレステロール脱水素酵素（第二試薬）：通常０．００１〜８００ｋＵ／Ｌ、好ましくは０．０１〜３００ｋＵ／Ｌ。
・酸化型補酵素（第一試薬又は第二試薬）：通常０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ。
・２価の金属塩（第一試薬）：通常１６〜２７ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１７〜２５ｍｍｏｌ／Ｌ。
・硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩（第一試薬）：通常７〜２８ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは８〜２５ｍｍｏｌ／Ｌ。
・デキストラン硫酸又はその塩（第一試薬）：通常１．０〜３．５ｇ／Ｌ、好ましくは１．３〜３．１ｇ／Ｌ。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、コール酸又はその塩等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等が挙げられる。

本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬及び測定用キットにおいては、前述のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、２価の金属塩、アルカリ金属塩（硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩）、デキストラン硫酸又はその塩、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。

＜ＨＤＬ２−Ｃ測定用キット＞
本発明のＨＤＬ２−Ｃ測定用キットは、本発明のＨＤＬ２−Ｃの測定方法に用いられるキットである。本発明のＨＤＬ２−Ｃ測定用キットとしては、例えば本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬と、ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬とを含むキット、本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットの第一試薬及び第二試薬と、ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬とを含むキット等が挙げられる。本発明のＨＤＬ２−Ｃ測定用キットにおける本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用試薬としては、本発明のＨＤＬ３−Ｃ測定用キットでもよい。

本発明のＨＤＬ２−Ｃ測定用キットにおけるＨＤＬ−Ｃ測定用試薬は、ＨＤＬ−Ｃ測定用キットでもよい。ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定用キットは、ＨＤＬ−Ｃの測定を可能とする試薬、及び、キットであれば特に制限はなく、例えば特開平８−１３１１９７号公報、ＷＯ２００４／０３５８１６号パンフレット、ＷＯ２００６／１１８１９９号パンフレット等に記載のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定用キット等が挙げられる。また、ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定用キットとして、市販のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、測定用キットを用いることもできる。市販のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、測定用キットとしては、例えば前述の市販のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬、及び、ＨＤＬ−Ｃ測定用キット等が挙げられる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例及び比較例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＨＥＰＥＳ（ＶＷＲ社製）、ＨＳＤＡ（同仁化学研究所社製）、ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、コール酸ナトリウム（アクロス社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；セルライアンス社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、デキストラン硫酸ナトリウム分子量５０万（名糖産業社製）、デキストラン硫酸ナトリウム分子量４万（ＩＣＮ社製）、硝酸マグネシウム６水和物（関東化学社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、塩化ナトリウム（和光純薬社製）、塩化カリウム（和光純薬社製）、塩化リチウム（和光純薬社製）、硝酸ナトリウム（ナカライテスク社製）、炭酸ナトリウム（関東化学社製）、臭化ナトリウム（和光純薬社製）、酢酸ナトリウム３水和物（関東化学社製）、フッ化ナトリウム（和光純薬社製）
ＣＯＯ３２２（コレステロール酸化酵素；東洋紡績社製）、ＬＰＬ３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）

また、化学修飾ＬＰＬ３１１は、以下のように調製したものを用いた。
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５，０．１５ｍｏｌ／Ｌ）に、ＬＰＬ３１１を３３ｇ／Ｌとなるように加え、５℃に冷却した後、サンブライトＶＦＭ−４１０１（日油社製）を３３０ｇ／Ｌとなるよう加え、さらに３時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾ＬＰＬ３１１として使用した。

化学修飾ＣＯＯ３２２は、以下のように調製したものを用いた。
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０，０．１ｍｏｌ／Ｌ）にＣＯＯ３２２を５０ｇ／Ｌとなるように加え、１５℃に冷却した後、サンブライトＶＦＭ−４１０１（日油社製）を６．２５ｇ／Ｌとなるように加え、さらに２時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾ＣＯＯ３２２として使用した。

・２価の金属塩と硫酸ナトリウムとの組み合わせによるＨＤＬ３−Ｃの測定
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨＤＬ３−Ｃ測定用キットを調製した。第１表に示す濃度の２価の金属塩（硝酸マグネシウム６水和物又は塩化カルシウム２水和物）、及び、硫酸ナトリウムを含むキットを実施例１（１）〜１（１１）のキットとした。
第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＳＤＡ ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．７５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ｋＵ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム ｘ ｇ／Ｌ（第１表参照）
２価の金属塩 ｙ ｍｍｏｌ／Ｌ（第１表参照）
硫酸ナトリウム ｚ ｍｍｏｌ／Ｌ（第１表参照）
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ６ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１ ０．２ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＣＯＯ３２２ ７．６ｋＵ／Ｌ

［比較例１］
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨＤＬ３−Ｃ測定用キットを調製した。第１表に示す濃度の硝酸マグネシウム６水和物を含むキットを比較例１（１）〜１（３）のキットとした。
第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＳＤＡ ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．７５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ｋＵ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム ｘ ｇ／Ｌ（第１表参照）
硝酸マグネシウム６水和物 ｙ ｍｍｏｌ／Ｌ（第１表参照）
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ６ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１ ０．２ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＣＨＯＤ３２２ ７．６ｋＵ／Ｌ

実施例１（ａ）のキットを用いて、以下のようにして、トリグリセリドが２００ｍｇ／ｄＬ以下のヒト血清４２検体について、それぞれの検体中のＨＤＬ３−Ｃを測定し、分画法との相関係数を算出した。

（１）ヒト血清検体と実施例１（ａ）のキットとの反応による当該検体における「反応吸光度」の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。

ヒト血清を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いでそれぞれ実施例１（ａ）のキットの第一試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応（第一反応）を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、この反応液にそれぞれ実施例１（ａ）のキットの第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温して反応（第二反応）を行い、第二反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いて、吸光度変化（ΔＥ_血清検体）を算出した。また、ヒト血清の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥ_ブランク）を算出した。最後に、下記（式１）により、各ヒト血清検体における「反応吸光度」を算出した。

（２）分画法によるヒト血清検体中のＨＤＬ３−Ｃの測定
上記（１）と同じヒト血清検体を用いて、Journal of Lipid Research vol.49, p.1130-1136 (2008)に記載の方法（分画法）にて各検体中のＨＤＬ３を分離し、得られたＨＤＬ３分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。

また、参考として、同じヒト血清検体を用いて、Clinical Chemistry, Vol.45, No.10, pp.1803-1812 (1999)に記載されたＤＣＭ（Designated Comparison Method）により、各検体中のＨＤＬを分離し、得られたＨＤＬ分画中のコレステロールをデタミナーＬ ＴＣII（協和メデックス社製）を用いて測定した。

（３）本発明の測定方法と分画法との相関
実施例１（１）のキットを用いた測定における「反応吸光度」と、（２）の分画法による測定値との間の相関係数を第１表に記す。
同様に、実施例１（１）のキットの代わりに、実施例１（２）〜１（１１）のキットを用いて、分画法による測定値との間の相関係数を決定した。相関関係を第１表に記す。

［比較例２］
実施例１（１）の代わりに、比較例１（１）〜１（３）の各キットを用いる以外は実施例２の方法と同様の方法により、比較例１（１）〜１（３）の各キットを用いた測定における「反応吸光度」と、分画法による測定値との間の相関係数を決定した。相関係数を第１表に記す。

第１表から、第一試薬中にアルカリ金属塩である硫酸ナトリウムを含有しない比較例１（１）〜１（３）のキットを用いた測定においては、分画法でのＨＤＬ３−Ｃ測定との間に、良好な相関関係は認められず、むしろＨＤＬ−Ｃ測定との間に、良好な相関関係が認められることが判明した。

一方、第一試薬に硫酸ナトリウム及び２価の金属塩を含有する実施例１（１）〜１（１１）のキットを用いた測定においては、分画法でのＨＤＬ３−Ｃ測定との間に、良好な相関関係が認められることが判明した。

・マグネシウム塩濃度と硫酸ナトリウム濃度の検討
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨＤＬ３−Ｃ測定用キットを調製した。第２表に示す濃度の硝酸マグネシウム６水和物、及び、硫酸ナトリウムを含むキットを実施例３（１）〜３（１２）のキットとした。
第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＳＤＡ ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．７５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ｋＵ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万） ２ｇ／Ｌ
硝酸マグネシウム６水和物 ｘ ｍｍｏｌ／Ｌ
（第２表参照）
硫酸ナトリウム ｙ ｍｍｏｌ／Ｌ
（第２表参照）
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ６ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１ ０．２ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＣＯＯ３２２ ７．６ｋＵ／Ｌ

実施例１（１）の代わりに、実施例３（１）〜３（１２）の各キットを用いる以外は実施例２の方法と同様の方法により、実施例３（１）〜３（１２）の各キットを用いた測定における反応吸光度と、分画法による測定値との間の相関係数を決定した。相関係数を第２表に記す。

第２表から、第一試薬中にマグネシウム塩、及び、硫酸ナトリウムを含有する実施例３（１）〜３（１２）のキットを用いた測定においては、分画法でのＨＤＬ３−Ｃ測定との間に、良好な相関関係が認められることが判明した。

・アルカリ金属塩の検討
以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨＤＬ３−Ｃ測定用キットを調製した。第３表に示すアルカリ金属塩及びその濃度を用いたキットを実施例５（１ａ）〜５（９ｃ）のキットとした。
第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＳＤＡ ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ０．７５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ｋＵ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万） ２ｇ／Ｌ
硝酸マグネシウム６水和物 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
アルカリ金属塩（第３表参照）
第二試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム ６ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１ ０．２ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＣＯＯ３２２ ７．６ｋＵ／Ｌ

実施例１（１）の代わりに、実施例５（１ａ）〜５（９ｃ）の各キットを用いる以外は実施例２の方法と同様の方法により、実施例５（１ａ）〜５（９ｃ）の各キットを用いた測定における反応吸光度と、分画法による測定値との間の相関係数を決定した。相関係数を第３表に記す。

第３表から、第一試薬中に、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩を含有するキットを用いた測定においては、分画法でのＨＤＬ３−Ｃ測定との間に、良好な相関関係が認められることが判明した。

・検体中のＨＤＬ３−Ｃの定量
ヒト新鮮血清５検体について、各検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を、分画法、及び、本発明の実施例３（６）及び実施例３（１１）のキットを用いる方法により、以下の手順に従い決定した。

（１）分画法を用いたＨＤＬ３−Ｃの定量
Journal of Lipid Research vol.49, p.1130-1136(2008)に記載の方法（分画法）にて各検体中のＨＤＬ３を分離し、得られたＨＤＬ３分画中のコレステロールをデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定し、各検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を決定した。

（２）実施例３（６）及び実施例３（１１）のキットを用いたＨＤＬ３−Ｃの定量
分画法による測定より、ＨＤＬ３−Ｃ濃度が１６．１ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を検量線作成用サンプルとした。実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、実施例３（６）のキットを用いて、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、ＨＤＬ３−Ｃ濃度と反応吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。

上記の検量線作成用サンプルの代わりにヒト血清５検体を用いて、実施例２の（１）記載の方法と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と先に作成された検量線とから、各検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を決定した。

実施例３（６）のキットの代わりに実施例３（１１）のキットを用いて、同様の方法により、同じヒト血清５検体中のＨＤＬ３−Ｃ濃度を決定した。
分画法を用いて決定されたＨＤＬ３−Ｃ濃度、実施例３（６）及び実施例３（１１）のキットを用いて決定されたＨＤＬ３−Ｃ濃度を第４表に示す。

第４表から、本発明のキットを用いる測定方法により決定されたＨＤＬ３−Ｃ濃度が、分画法により決定されたＨＤＬ３−Ｃ濃度とほぼ一致することが判明した。従って、本発明のキットを用いる測定方法により、ヒト血清中のＨＤＬ３−Ｃを正確に測定できることが判明した。

本発明により、冠動脈疾患等の診断に有効なＨＤＬ亜分画中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

Claims (19)

1. 検体と、（１）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、（２）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有する水性媒体中で、反応液中のアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が、５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌである濃度で反応させ、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定方法。
2. ２価の金属塩がマグネシウム塩又はカルシウム塩である請求項１記載の方法。
3. デキストラン硫酸又はその塩の反応液中の濃度が、０．７５〜２．６ｇ／Ｌである請求項１または２記載の方法。
4. 反応液中の２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が、１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 以下の工程を含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定方法。
   （１）検体中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロールを測定する工程；
   （２）請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法により、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定する工程；
   （３）上記（１）工程での測定の測定値から、（２）工程での測定の測定値を差し引く工程。
6. 請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するための試薬であって、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩、及び、過酸化水素測定用試薬を含有し、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれることを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定用試薬。
7. 請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するための試薬であって、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を含有し、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれることを特徴とする、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールの測定用試薬。
8. さらに、還元型補酵素測定用試薬を含む、請求項７記載の試薬。
9. ２価の金属塩がマグネシウム塩又はカルシウム塩である請求項６〜８のいずれかに記載の試薬。
10. デキストラン硫酸又はその塩が、反応液中での濃度が０．７５〜２．６ｇ／Ｌとなる含量で含まれる請求項６〜９のいずれかに記載の試薬。
11. ２価の金属塩が、反応液中での２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれる請求項６〜１０のいずれかに記載の試薬。
12. 第一試薬および第二試薬を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するためのキットであって、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を第一試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が、５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で第一試薬に含まれ、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。
13. 第一試薬および第二試薬を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法により、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を分離除去することなく、検体中のＨＤＬ３中のコレステロールを測定するためのキットであって、（ａ）２価の金属塩、（ｂ）硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、酢酸塩、及び、ハロゲン化物からなる群より選ばれるアルカリ金属塩、及び、（ｃ）デキストラン硫酸又はその塩を第一試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、アルカリ金属塩が、反応液中でのアルカリ金属塩由来のアルカリ金属イオンの濃度が、５〜２１ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で第一試薬に含まれ、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とするキット。
14. さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する請求項１３記載のキット。
15. ２価の金属塩が、マグネシウム塩又はカルシウム塩である請求項１２〜１４のいずれかに記載のキット。
16. デキストラン硫酸又はその塩が、反応液中での濃度が０．７５〜２．６ｇ／Ｌとなる含量で含まれる請求項１２〜１５のいずれかに記載のキット。
17. ２価の金属塩が、反応液中での２価の金属塩由来の２価の金属イオンの濃度が、１２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量で含まれる請求項１２〜１６のいずれかに記載のキット。
18. 請求項６〜１１のいずれかに記載のＨＤＬ３中のコレステロール測定用試薬と、ＨＤＬコレステロール測定用試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定用キット。
19. 請求項１２〜１７のいずれかに記載のＨＤＬ３中のコレステロール測定用キットの第一試薬及び第二試薬と、ＨＤＬコレステロール測定用試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＨＤＬ２中のコレステロールの測定用キット。