JPH08131197A - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法Info
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Abstract
ポ蛋白(HDL)中のコレステロールの定量法を提供す
る。 【構成】 HDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬の存
在下、HDLを含有する試料にコレステロールエステル
加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素またはコレ
ステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素
または還元型補酵素を定量することを特徴とするHDL
中のコレステロールの定量法。
Description
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白(HDL)中の
コレステロール(以下、HDLコレステロールという)
の定量法に関する。
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のHDLコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
2段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってHD
Lを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法(SRID法)、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白(LDL)、超低密度リポ蛋白(V
LDL)およびカイロミクロン(CM)の表面に存在す
るアポ蛋白Bにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと2価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のHD
Lコレステロールを定量する(臨床検査法提要、第29
版、金井泉著、金原出版、471頁、1983年)。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したHDL画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人為的誤差も
生じ易い。以上のように、HDLコレステロール測定の
煩雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純に
HDLを分画せずに血清検体を直接コレステロールエス
テラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試
薬に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わ
りがなく、HDLコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭63−126498には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、HDLのみならずLDL、VLDLなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
な分画分離操作の不要な簡便なHDLコレステロールの
定量法を提供することにある。
外のリポ蛋白すなわちLDL、VLDLおよびCMを凝
集させる試薬の存在下、コレステロール反応試薬を用い
てコレステロール定量の酵素反応をさせることにより、
特に生成した凝集物を分離することなくHDLを含有す
る試料中のHDLコレステロールを特異的に定量できる
ことを見い出し、本発明に至った。
せる試薬の存在下、HDLを含有する試料にコレステロ
ール加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または
コレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化
水素または還元型補酵素を定量することを特徴とするH
DL中のコレステロールの定量法に関する。
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法の一例
について説明する。第一試薬として、HDL以外のリポ
蛋白を凝集させる試薬を含む中性付近の緩衝液を調製す
る。また、第二試薬として、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ(またはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ)、パーオキシダーゼ、4−アミノ
アンチピリンおよびトリンダー試薬〔またはNAD
(P)〕を含む緩衝液を調製する(トリンダー試薬は第
一試薬中に入れてもよい)。体液検体を一定量第一試薬
に添加し、例えば37℃で数分間加温してLDL、VL
DLおよびCMを凝集させる。これに第二試薬を添加、
攪拌して酵素反応させた後、コレステロールオキシダー
ゼにより過酸化水素が発生する場合には4−アミノアン
チピリンおよびトリンダー試薬から過酸化水素とパーオ
キシダーゼによって生成する色素の極大波長における吸
光度を測定し、コレステロールデヒドロゲナーゼを用い
る場合にはNAD(P)Hの増加を300〜500n
m、好ましくは330〜400nm、例えば340nm
での吸光度で測定する(ジアホラーゼ、テトラゾリウム
塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、ホルマザン
色素を比色定量することも可能である)。HDLコレス
テロール量は、別途一定量のコレステロールを含む標準
液で同じ操作を行い、比較計算する。なお、第一試薬と
第二試薬とを最初からまとめ、これに体液検体を添加し
て例えば37℃で数分間加温し、LDL、VLDLおよ
びCMを凝集させてさらに酵素反応させることもでき
る。
び2価の金属塩が含まれる。凝集剤としては、ヘパリン
またはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキ
ストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、
硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはこれらの混合物などがあげら
れ、シクロデキストリンとしては、α−シクロデキスト
リン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリ
ンなどがあげられ、オリゴ糖としては、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースなどがあげられ、塩
としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、ア
ンモニウム塩、マグネシウム塩などがあげられる。2価
の金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩、マ
ンガン塩、ニッケル塩などがあげられる。
子量5000〜20000のヘパリンまたはその塩、
0.1〜10mMの分子量4000〜8000のリンタ
ングステン酸またはその塩、0.01〜5mMの分子量
10000〜500000のデキストラン硫酸またはそ
の塩、0.1〜20mMの分子量1000〜10000
のデキストラン硫酸またはその塩、0.3〜100mM
の分子量4000〜25000のポリエチレングリコー
ル(PEG)、0.1〜50mMの分子量1000〜3
000の硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、0.
1〜50mMの分子量400〜3000の硫酸化オリゴ
糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが好まし
く用いられる。さらに好ましくは、0.03〜1mMの
分子量14000〜16000のヘパリンまたはその
塩、0.1〜3mMの分子量5000〜7000のリン
タングステン酸またはその塩、0.01〜5mMの分子
量150000〜250000のデキストラン硫酸また
はその塩、0.1〜10mMの分子量1000〜500
0のデキストラン硫酸またはその塩、1.0〜50mM
の分子量5000〜22000のPEG、0.1〜10
mMの分子量1000〜2000の硫酸化シクロデキス
トリンまたはその塩、0.1〜10mMの分子量400
〜2000の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそ
れらの混合物などが用いられる。
のマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケ
ル塩などがあげられ、好ましくは、0.1〜50mMの
マグネシウム塩が用いられる。
−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレン
ジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(3−メチル
フェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N,N
−ジメチル−m−トルイジン、N,N−ジスルホプロピ
ル−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−ス
ルホプロピル−m−アニシジン、N−エチル−N−スル
ホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル
−3,5−ジメトキシアニリン、N−スルホプロピル−
3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホ
プロピル−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N
−スルホプロピル−m−トルイジン、N−エチル−N−
(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−アニシ
ジン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホ
プロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキ
シ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリ
ン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−
3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(2−
ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチル
アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−ス
ルホプロピル)−m−トルイジン、N−スルホプロピル
アニリン、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安
息香酸、フェノールなどがあげられる。
ステロールエステルを加水分解する能力を有する微生物
または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプ
ロテインリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水
素を生成する微生物由来のコレステロールオキシダー
ゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲ
ナーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、安定
性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを主成
分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基
などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いられ
る。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
定する系を含んでいるため、コレステロールオキシダー
ゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるい
はコール酸類も使用可能であり、また、グロブリンなど
を可溶化するための種々の塩類を使用することもでき
る。界面活性剤としては、ノニオン系、アニオン系、カ
チオン系の界面活性剤が0〜1%の範囲で使用され、コ
ール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウ
ロコール酸、ケノデオキシコール酸などが0〜5%の範
囲で使用され、塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチ
ウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが0〜1
00mMの範囲で使用される。
ス、グッドの緩衝剤などが好適に使用される。pHは5
〜9の範囲がよい。次に、実施例によって本発明の態様
を説明する。
〔デタミナーHDL(協和メデックス社製)で沈澱〕
(臨床化学、初版、荻三男著、医典社、110頁、19
87年)、直接HDLコレステロールを測定する本法お
よび特開昭63−126498に記載のコール酸を用い
る方法(以下、A法という)を比較した。
し、37℃で5分間インキュベーションし、この時点で
一旦555nmの吸光度を測定した(E1)。次いで、
第二試薬を0.75ml添加して攪拌し、5分後の同波
長における吸光度を測定した(E2)。HDLコレステ
ロールの濃度は、コレステロール濃度200mg/dl
の標準液を用いて同様の操作を行い、(E2−E1)の
値を比較することにより算出した。
析機を用いてデタミナーLTC(協和メデックス社製)
で測定した。結果を第1表に示す。
法として常用されているリンタングステン酸−デキスト
ラン硫酸−Mg沈殿法とよい相関を示した。 実施例2 第一試薬に用いる凝集剤および2価の金属塩を種々組み
換える以外は実施例1の本法と同様の操作を行い、血清
検体30検体を日立7250自動分析機(検体4μl、
第一試薬300μl、第二試薬100μlの条件)でそ
れぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数(R)でみ
た。
を30mMとして実施例1の本法と同様の操作を行い、
血清検体30検体を日立7250自動分析機(検体4μ
l、第一試薬300μl、第二試薬100μlの条件)
でそれぞれ測定した。沈澱法との相関を相関係数(R)
でみた。
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼをポ
リエチレングリコール(分子量6000)で化学修飾
し、これを用いて下記に示す組成で実施例1の本法と同
様の操作を行った。結果を第4表に示す。
た。20mMリン酸緩衝液(pH8)に酵素(10mg
/ml)を溶解させて5℃に冷却後、これに20倍モル
のサンブライト4001を添加して溶解させ、5℃で4
時間反応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せ
ずそのまま酵素溶液として用いた。
Mg沈殿法でHDLコレステロール濃度が38.9mg
/dlと測定された検体50μlを上記試薬3mlに添
加し、20秒後に一旦555nmの吸光度を測定した
(E1)。次いで、37℃で5分間インキュベーション
し、直ちに同波長における吸光度を測定した(E2)。
HDLコレステロールの濃度は、コレステロール濃度2
00mg/dlの標準液を用いて同様の操作を行い、
(E2−E1)の値を比較することにより算出した。そ
の結果、HDLコレステロール濃度は39.1mg/d
lと算出され、沈澱法で得られた結果とほぼ一致した。
T−activated(ベーリンガー社製)でコレス
テロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダー
ゼを化学修飾したもの、(2)ポリウレタンを修飾する
試薬であるポリウレタンP4000−activate
d(ベーリンガー社製)でコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼを化学修飾したも
の、および(3)1,3−プロパンサルトンでコレステ
ロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ
を化学修飾したものを用い、また、検体としてリンタン
グステン酸−デキストラン硫酸−Mg沈殿法でHDLコ
レステロール濃度が38.9mg/dlと測定された検
体50μlを用いて、実施例4と同様の操作を行った。
その結果、HDLコレステロール濃度はそれぞれ(1)
39.7mg/dl、(2)38.2mg/dlおよび
(3)39.0mg/dlと算出され、沈澱法で得られ
た結果とほぼ一致した。
た。 (1),(2) 20mMリン酸緩衝液(pH8)に酵
素(10mg/ml)を溶解させて5℃に冷却後、これ
に20倍モルのT40,TCT−activatedま
たはポリウレタンP4000−activatedを添
加して溶解させ、5℃で4時間反応させた。得られた化
学修飾酵素は、精製分離せずそのまま酵素溶液として用
いた。
に酵素(10mg/ml)を溶解させ、これに20倍モ
ルの1,3−プロパンサルトンのジメチルホルムアミド
溶液(10mg/ml)を添加し、37℃で24時間反
応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せずその
まま酵素溶液として用いた。
要な簡便なHDLコレステロールの定量法が提供され
る。
Claims (3)
- 【請求項1】 高密度リポ蛋白(HDL)以外のリポ蛋
白を凝集させる試薬の存在下、HDLを含有する試料に
コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ
ール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用さ
せ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定量する
ことを特徴とするHDL中のコレステロールの定量法。 - 【請求項2】 HDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬
がヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはそ
の塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレング
リコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫
酸化オリゴ糖またはその塩もしくはこれらの混合物、お
よび2価の金属塩からなる請求項1記載のHDL中のコ
レステロールの定量法。 - 【請求項3】 コレステロールエステル加水分解酵素、
コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵
素が化学修飾されたコレステロールエステラーゼ、化学
修飾されたコレステロールオキシダーゼまたは化学修飾
されたコレステロールデヒドロゲナーゼである請求項1
記載のHDL中のコレステロールの定量法。
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