JPH01153088A - 修飾酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素の有効利用を図るために、酵素蛋白質の
欠点を補うのみならず、新しい機能を付与した修飾酵素
に関する。

［従来の技術］ アスパラギナーゼ、トリプトファナーゼ、ウリカーゼ等
の酵素が医薬として利用されているが、その蛋白質はヒ
ト以外の動物や微生物由来のものが多く、ヒトにとって
は異種蛋白質であるため、これをヒトに投与したときに
は抗体が生じ、さらにはアナヒイラシーショックの危険
があり、そのため臨床での利用は大きく制限されている
。そこで抗原性を低下又は消失させ、医薬としての安全
性を高めることが望まれている。

また、酵素はバイオリアクターとしても多く利用されて
いるが、有機溶媒にも溶解して酵素活性を発現できれば
、酵素の工業的利用範囲を拡大させることができる。

本発明者等は、先にポリオキシエチレンのトリアジン誘
導体で酵素を修飾して、抗原性を低下させまた有機溶媒
に可溶化することを可能にした。

更に、これら修飾酵素を回収、再利用を図るため、また
は酵素を局所にのみ作用させるため、磁性体と複合体を
形成させることを可能にした。

［発明の構成コ 本発明は、さらに改良を試み、容易に製造される修飾酵
素を提供することを目的とする。

本発明は、ポリオキシエチレンアリルエーテル誘導体と
無水マレイン酸との共重合体（Ｑ）で修飾された修飾酵
素（Ｑ−Ｅ）である。

式中、又は水素原子又はメチル基を示し、Ｙはアルキル
基、アルキルフェニル基、アラルキル基又はアシル基を
示す。ｍは１〜１０００を示し、ｎは２〜２００を示す
。

更に本発明は、共重合体（Ｑ）と磁性体（Ｍ）で修飾さ
れた修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）である。

Ｙのアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシアリブチル
、アミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デ
シル、ラウリル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタ
デシルのような炭素数１〜２０のアルキル基、好ましく
は炭素数１〜６、特にメチルである。Ｙのアルキルフェ
ニル基としては、ブチルフェニル、オクチルフェニル、
ノニルフェニル、ジブチルフェニルのような炭素数１〜
２０のアルキルが置換したフェニル基である。Ｙのアラ
ルキル基としては、ベンジルである。Ｙのアシル基とし
ては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、カプリロイ
ル、ラウロイルのような炭素数２〜１８のアルカノイル
基、好ましくはアセチル、並びにベンゾイル、トルオイ
ルである。ｍとしては１〜１０００、好ましくは７〜２
００である。ｎは２〜２００、好ましくは２〜４０であ
る。分子量は５００ないし８０．０００．好ましくは２
．０００ないし２０．０００であり、酵素（Ｅ）が高分
子量のものである場合には修飾剤（Ｑ）も高分子が好ま
しい。

ポリオキシエチレンアリルエーテル誘導体としては、次
の化合物があげられる。

平均分子量 ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２０（Ｃ２Ｈ４０）　３２ＣＨ３１３
０００ＣＨ７＝ＣＨＣＨ７Ｏ（Ｃ，Ｈ，Ｏ）　、ＣＨ３
７０００ＣＨ，＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２０（Ｃ２Ｈ，Ｏ）
、、ＣＩ＠Ｈｆｆ？　　　１５０００Ｃｆ（ｔ＝ｃＨｃ
）ＩｚＯ（ＣＪ４０）　＋。Ｃ０ＣＨ，１４０００本発
明により修飾される酵素（Ｅ）としては、リパーゼ、エ
ステラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、サブチリシ
ンのような加水分解酵素、ペルオキシダーゼ、カタラー
ゼのような酸化還元酵素、ウリカーゼ、アスパラギナー
ゼ、トリプトファナーゼなどがあげられる。

本発明の修飾酵素（Ｑ−Ｅ）は、次のようにして製造さ
れる。ポリオキシエチレンアリルエーテル誘導体と無水
マレイン酸とを有機溶媒に溶解し。

ベンゾイルパーオキサイドの存在下窒素気流中８０℃で
７時間還流した後、溶媒を留去して共重合体（Ｑ）　を
得る。

次に酵素（Ｅ）の緩衝液に共重合体（Ｑ）の過剰量を加
えて室温で反応させることにより、酵素分子中のアミノ
基の一部が共重合体（Ｑ）で修飾された本発明の修飾酵
素（Ｑ−Ｅ）が容易に得られる。

また、共重合体（Ｑ）と磁性体（Ｍ）とで修飾された修
飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）を製造するには。

共重合体（Ｑ）の水溶液に磁性体（Ｍ）を反応させ、未
反応の共重合体を限外ろ過により除き、凍結乾燥して粉
末を得る。この粉末は水にも有機溶媒にも分散し磁性流
体（Ｍ−Ｑ）となる。磁性流体に酵素を混合することに
より修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）が得られる。このような修
飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）は有機溶媒中で作用し、磁石によ
り反応系から容易に分離することができる。

磁性体（Ｍ）としては、遷移金属又はそのイオン、その
酸化物、例えば鉄、コバルト、ニッケルなどの金属、こ
れらの酸化物が用いられ、マグネタイト、フェライト、
ガーネット型酸化物、コランダム型酸化物、ペロブスカ
イト型酸化物があげられる。反応系中で磁性体を生成さ
せることもでき、例えば第一鉄イオンと第二鉄イオンと
を中性〜アルカリ性で反応、第一鉄イオンの酸化による
反応などを用いることができる。

［発明の効果コ 本発明の修飾酵素（Ｑ−Ｅ、）は酵素（Ｅ）と共重合体
（Ｑ）とを混合するだけで製造され、酵素蛋白を医薬と
して体内に投与した際に問題となる抗原性を減少、消失
させ、かつ血中での作用時間を延長して薬効を増強する
ものである。また、有機溶媒に溶解し、酵素活性を発現
する新しいバイオリアクターとして利用することができ
る。更に磁性を有する修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）は、酵素
を患部に磁気的に誘導して作用させることができ、水及
び有機溶媒から迅速簡便な磁気分離により回収が可能で
あり、また分離した修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）は再使用が
可能である。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼ１０ｍｇを含む０、
２Ｍはう酸緩衝液（ｐＨ８，５）　２ｍｌに、ポリオキ
シエチレンアリルメチルエーテルと無水マレイン酸との
共重合体（平均分子量１３０００）を所定量加え、室温
で１時間反応させた後、常法により精製して修飾酵素を
得た。この修飾酵素の抗体との反応性を抗し−アスパラ
ギナーゼ抗体を用いて定量沈降反応で調べた。その結果
を第１表に示す。修飾率が増加すると、酵素活性が低下
するが抗原性が減少した。

第１表 添加共重合　修飾率　酵素活性　抗体との反応性実施例
２ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕＬｇａｒｉｓ由来のトリプトファ
ナーゼ１０ｍｇと０．１ｍＭピリドキサールりん酸、６
０ｍＭ塩化カリウムを含むほう酸緩衝液（ｐＨ９，０）
　２ｍｌに、ポリオキシエチレンアリルメチルエーテル
と無水マレイン酸との共重合体（平均分子量１３０００
）　２００ｍを加え、４℃で３時間反応物させた後、常
法により精製して修飾酵素を得た。このものは酵素分子
中のアミノ基の４７％が修飾されており、未修飾酵素の
１５％のトリプトファン合成活性を保持していた。

実施例３ ポリオキシエチレンアリルメチルエーテルと無水マレイ
ン酸との共重合体（平均分子量１３０００）の１０％水
溶液に１２ｍ１のＦｅＣ１１４Ｈｚ０１０％溶液と０．
１２ｍ１の過酸化水素の０．３％溶液を加え、５０〜６
０℃でＰＨＩＯ付近で１時間窒素を吹込みながら攪拌し
た。限外ろ過により未反応の共重合体を除き、凍結乾燥
して磁性流体の粉末を得た。この磁性体の性質は第２表
に示す。

第２表 組　成：マグネタイト−ポリオキシエチレンアリルメチ
ルエーテルと無水マレイン酸との共重合体＝１：５ 粒　径：約１０ｎｍ 分散性：水、ベンゼン、トルエン、クロロホルム保持カ
ニ０エルステツド（磁化曲線より）飽和磁化：　３１０
ｅｍｕ／ｇ　（磁化曲線より）この磁性流体とリパーゼ
を混合後凍結乾燥した。

この修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）は、ベンゼンに分散し、ア
ミルラウレートとラウリルアルコールからラウリルラウ
レートとアミルアルコールを生成するエステル交換を効
率よく触媒した。そしてこの修飾酵素は磁石により反応
系から容易に完全に分離され、磁石を離すと再び同様な
酵素活性を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ポリオキシエチレンアリルエーテル誘導体と無水マ
   レイン酸との共重合体（Ｑ）で修飾された修飾酵素（Ｑ
   −Ｅ）。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘは水素原子又はメチル基を示し、Ｙはアルキル
   基、アルキルフェニル基、アラルキル基又はアシル基を
   示す、ｍは１〜１０００を示し、ｎは２〜２００を示す
   。 ２　Ｙがメチル基である特許請求の範囲第１項の修飾酵
   素（Ｑ−Ｅ）。 ３　ポリオキシエチレンアリルエーテル誘導体と無水マ
   レイン酸との共重合体（Ｑ）と磁性体（Ｍ）とで修飾さ
   れた修飾酵素（Ｍ−Ｑ−Ｅ）。