JPS6147511B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はカリクレインの精製方法に関する。さ
らに詳しくは、本発明は哺乳動物臓器から得られ
るカリクレイン、特にすい臓性カリクレインを特
殊な試剤を用いて簡単に、かつ効率よく精製する
方法に関する。 カリクレインは哺乳動物の各種組織で産生され
る蛋白分解酵素の１種であつて、血漿中のキニノ
ーゲンよりキニンを遊離させる作用を有する。遊
離キニンには末梢血管拡張作用があり、従つてカ
リクレインは循環器系疾患の治療に古くから使用
されている。 カリクレインは通常、哺乳動物のすい臓、尿、
顎下線、血液などから抽出されるので、その粗抽
出物には多くの異種蛋白質が含まれている。従つ
て、この抽出物を医薬として使用するには、夾雑
する異種蛋白質による副作用を避けるため、充分
な精製を行うことが必要である。 従来から行われている精製法としては、イオン
交換クロマトグラフイー、ゲル過、塩析および
阻害剤を利用したアフイニテイークロマトグラフ
イーなどが挙げられるが、いずれも操作が繁雑で
あり、精製効率も満足し得るものではない為、必
ずしも工業的に適したものとはいい難い。 上記の精製法の中で最も興味深い方法は阻害剤
を用いたアフイニテイークロマトグラフイーであ
るが、この方法ですら、阻害剤として天然の高分
子物質を使用することに起因する種々の欠点（即
ち阻害剤が高価であること、不安定であること、
再利用が困難であることおよび特異性が少ないこ
となど）を有する。 本発明者らは、上記の事情に鑑み、鋭意研究を
重ねた結果、カリクレインがｐ−アミノ−ベンズ
アミジン残基に対して特異な親和性を有するこ
と、およびこの親和性を利用すれば粗カリクレイ
ンを効率よく精製し得ることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。 本発明方法を実施するには、まず、ｐ−アミノ
−ベンズアミジンを結合させた不溶性担体（以下
ｐ−アミノ−ベンズアミジン結合担体という）を
調製する。これにはスペーサーを適当な不溶性担
体に結合させ、次いでこの生成物に、ペプチド結
合試薬の存在下、ｐ−アミノ−ベンズアミジンを
結合させるのが好ましい。 次いで、得られたｐ−アミノ−ベンズアミジン
結合担体をカラムに充填し、粗カリクレイン溶液
を注ぎ込んだ後、塩化ナトリウム含有燐酸緩衝液
で溶出する。この場合、まず、塩化ナトリウムの
濃度が低い緩衝液（通常0.1M）を用いて夾雑す
る異種蛋白質を溶出させ、次いで塩化ナトリウム
濃度の高い緩衝液（0.5ないし2.0M、好ましくは
0.5M）を用いてカリクレインを溶出させる。 驚くべきことに、上記の方法によつて、例えば
すい臓性カリクレインを精製する場合、キニナー
ゼ（これはキニンを分解する作用を有し、カリク
レインの医薬としての価値を著しく低下させ
る）、トリプシンおよびキモトリプシンの如き酵
素あるいはその他の異種蛋白質は塩化ナトリウム
濃度の低い緩衝液で溶出され、カリクレインのみ
がカラムに残存する。一方、カラムに残存したカ
リクレインは溶出液の塩化ナトリウム濃度をあげ
ることによつて完全に溶出させることができ、か
くして極めて高純度のカリクレインを得ることが
できる。 上記の如きカラムを使用せず、粗カリクレイン
溶液にｐ−アミノ−ベンズアミジン結合担体を加
えて撹拌した後、遠心分離し、得られた沈澱物を
塩化ナトリウム濃度の高い緩衝液で溶出すること
によつても、ほぼ同様の結果が得られる。 本発明方法で使用されるスペーサーは、原則と
して、不溶性担体と結合し得る官能性基を有し、
結合した後に遊離のカルボキシル基を有する化合
物であればよい。例えば不溶性担体をブロムシア
ンで活性化する場合には、それはアミノカルボン
酸類であればよく、特にε−アミノカプロン酸で
あることが好ましい。 不溶性担体としては、水に不溶であつて、しか
も親水基を有するもの、例えばアガロース、デキ
ストランなどを挙げることができる。 スペーサのカルボキシル基とｐ−アミノ−ベン
ズアミジンのアミノ基を結合させるためのペプチ
ド結合試薬としては、従来から使用されている試
薬のいずれを用いてもよいが、特に、１−エチル
−３−（3′−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミドが好ましい。 本発明に係るｐ−アミノ−ベンズアミジン残基
を有する不溶性担体は、使用後緩衝液で洗浄する
ことにより反復使用することができる。 以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、これは本発明を限定するものではない。 実施例 １ ｐ−アミノ−ベンズアミジン結合アガロースの
調製 (1) アガロースのブロムシアンによる活性化アガ
ロース（商品名：セフアロース−4B、フアル
マシア・フアインケミカル社製）400mlをガラ
スフイルターで吸引過し、蒸留水５で水洗
した後ビーカーに入れ、等量の蒸留水を加えて
懸濁する。この懸濁液をマグネチツクスタラー
で撹拌し、これにブロムシアン40ｇを蒸留水
400mlに溶かした溶液を一度に加える。3.5N−
NaOHを加えてPHを10.5ないし11.0に調節し、
20℃で約15分間撹拌する。反応混合物を過
し、蒸留水法５次いで0.1N−NaHCO₃溶液約
５で洗浄した後吸引過する。 (2) ε−アミノカプロン酸結合アガロースの調製 ε−アミノカプロン酸52.4ｇを0.1M−
NaHCO₃溶液400mlに溶かし、1N−NaOHを加
えてPHを9.5に調節する。この溶液に(1)で得た
活性化アガロースを加え、４℃で約24時間撹拌
する。反応混合物を吸引過し、0.1M−
NaHCO₃溶液５、1M−NaCl溶液５および
蒸留水５で順次洗浄する。 (3) ｐ−アミノ−ベンズアミジン結合アガロース
の調製 (2)で得たε−アミノカプロン酸結合アガロー
ス400mlに蒸留水400mlを加えて懸濁し、これに
ｐ−アミノ−ベンズアミジン塩酸塩2.1ｇを蒸
留水100mlに溶かした溶液を加えて撹拌し、1N
−塩酸を加えてPHを4.5に保つ。これに、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド23.8ｇを蒸留水40mlに溶かした
溶液を加え、PHを５に保ちながら室温で約24時
間撹拌する。反応混合物を吸引過し、0.1M
−酢酸緩衝液（PH４）−1M−NaCl ５および
0.1M−トリス塩酸緩衝液（PH８）−1M−NaCl
５で交互に洗浄した後吸引過すると、ｐ−
アミノ−ベンズアミジン結合アガロース390ml
が得られる。 実施例 ２ カリクレインの精製（カラム法） ブタすい臓原末５ｇを10ｍＭの燐酸緩衝液（PH
7.4）500mlに懸濁し、４℃で約２時間撹拌する。
この懸濁液を遠心分離て得た上澄に、80％飽和と
なるまで固形硫安を加え、４℃で約２時間撹拌す
る。次いでこの混合物を０℃で約２時間放置した
後遠心分離し、沈澱部分をとり、これを最少量の
50ｍＭ−燐酸緩衝液（PH7.4）に溶解し、４℃で
同一濃度の緩衝液を用いて透析する。この透析液
に、0.1M−NaClとなる様に食塩を加え、カラム
適用試料とする。 カラムにｐ−アミノベンズアミジン結合アガロ
ース100mlを充填し、50ｍＭ−燐酸衝液（PH7.4）
−0.1M−NaClでよく洗浄し、緩衝化する。これ
に上記試料を入れ、50ｍＭ−燐酸緩衝液（PH
7.4）−0.1M−NaCl約500mlで溶出する。ｐ−アミ
ノ−ベンズアミジンに対する親和性の低いトリプ
シン、キモトリプシン、キニナーゼおよび不純蛋
白質が溶出される。次いで、50ｍＭ−燐酸緩衝液
（PH7.4）−0.5M−NaCl 500mlでカリクレインを溶
出する。 カリクレイン溶出画分を蒸留水で透析した後、
凍結乾燥する。この様にして得たカリクレイン粉
末（20mg）の品質を出発物質のすい臓原末と比較
した結果を表１に示す。表から明らかな様に、カ
リクレイン粉末の血圧降下における生物学的比活
性は、原末の約80倍に上昇している。

【表】 精製品について、BAEE活性、ATEE活性およ
びカゼイン活性と血圧降下活性との相互関係を表
１から求めた。結果を表２に示す。

【表】 実施例 ３ カリクレインの精製（バツチ法） ブタすい臓原末５ｇを10ｍＭ−燐酸緩衝液（PH
7.4）500mlに懸濁し、４℃で約16時間撹拌する。
この懸濁液を遠心分離して得た上澄に、80％飽和
となるまで固形硫安を加え、４℃で約１時間撹拌
する。次いでこの混合物を０℃で約８時間放置し
た後遠心分離し、沈澱部をとり、これを50ｍＭ−
燐酸緩衝液（PH7.4）300mlに溶かし、同一濃度の
緩衝液を用いて透析する。この透析液に0.1M−
NaClとなる様に食塩を加えた後、ｐ−アミノ−
ベンズアミジン結合アガロース100mlを加えて１
時間撹拌する。次いで、この混合物を遠心分離し
て得た沈澱に、50ｍＭ−燐酸緩衝液（PH7.4）−
0.5MNaCl 500mlを加え、１時間撹拌した後遠心
分離する。上澄を蒸留水を用いて透析した後、凍
結乾燥する。この様にして得たカリクレイン粉末
（30mg）の品質を出発物質のすい臓原末と比較し
た結果を表３に示す。

【表】 精製品について、BAEE活性、ATEE活性およ
びカゼイン活性と血圧降下活性との相関関係を表
３から求めた。結果を表４に示す。

【表】 尚、上記実施例２および３に示した特性値は、
以下に記載する方法で測定したものである。 １ 血圧降下活性（生物学的単位）………Frey
単位 体重17Kg前後の雌成犬をペントバルビタール
ナトリウムで麻酔し、ヘパリン含有（1000μ/
ml）生理食塩水を満たしたカニユーレを大腿動
脈に挿入する。このカニユーレを通して試料を
投与し、その血流増加活性を矩形波電磁血流計
を用いて測定する。なお、血流増加活性はバイ
エル社製カリクレインを標準として算出した。 ２ BAEEおよびATEE活性（エステル水解活性
−Hesterinの方法） 蛋白質研究奨励会製ベンゾイル−Ｌ−アルギ
ニンエチルエステル・HCl（BAEE）またはア
セチル−Ｌ−チロシンエチルエステル・H₂O
（ATEE）を、0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）
に25ｍＭ濃度となる様に溶解する。このBAEE
溶液またはATEE溶液0.4mlに、試料溶液0.1ml
ないし0.5mlを添加し、0.2Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）を加えて１mlとし、37℃で30分間反応
させる。次いでこの反応液１mlに、2M−ヒド
ロキシルアミンと3.5NNaOH溶液の等量混液
1.5mlを加えて反応を停止させる。20分後、18
％トリクロル酢酸１mlおよび4N−塩酸１mlを
加え、30分後に遠心分離し、上澄を過する。
この液に10％塩化第二鉄溶液１mlを加え、波
長530ｍμに於ける吸光度を測定する。 試料溶液１ml当たりの力価は次の式で表わさ
れる。 力価＝10（μモル）×標準盲検値のＯ．Ｄ．５３０ｍμ−測定試料のＯ．Ｄ．５３０ｍμ／標準盲検値のＯ．Ｄ．
５３０ｍμ ３ カゼインの分解活性 ハマーステインカゼイン４ｇに2N−NaOH溶
液２mlを加え、乳鉢でよく混合し、これを50ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（PH7.4）に懸濁し、2N−HClを
加えてPH7.4に調節し、３時間撹拌する。次い
で3000回転で10分間遠心分離する。得られた上
澄を４％溶液として用い、村松らの方法（ザ・
ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、57
巻、402頁（1965年））に従つて測定する。 ４ 蛋白質の定量 ローリイ（Lowry）らの方法（ザ・ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
193巻、265頁（1951年））に従つて測定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ｐ−アミノ−ベンズアミジン結合不溶性担体
   を利用してカリクレインをその他の酵素および異
   種蛋白から分離精製する方法であつて、カリクレ
   インおよびその他の酵素並びに異種蛋白を含んで
   いる低塩化ナトリウム濃度の緩衝液をｐ−アミノ
   −ベンズアミジン結合不溶性担体と接触させた
   後、低塩化ナトリウム濃度の緩衝液で溶出、洗浄
   してその他の酵素および異種蛋白を該担体から遊
   離、除去し、次いで高塩化ナトリウム濃度の緩衝
   液で溶出、洗浄して該担体に結合しているカリク
   レインを遊離せしめて回収することを特徴とする
   方法。 ２ ｐ−アミノ−ベンズアミジン結合不溶性担体
   が、（不溶性担体）−（スペーサー）−（ｐ−アミノ
   −ベンズアミジン）の結合体からなる第１項記載
   の方法。 ３ スペーサーがε−アミノカプロン酸である第
   ２項記載の方法。 ４ 不溶性担体がブロムシアンで活性化されたア
   ガロースである第２項または第３項のいずれかに
   記載の方法。 ５ 該緩衝液が燐酸緩衝液である第１項記載の方
   法。 ６ 低塩化ナトリウム濃度が0.1Mである第１項
   に記載の方法。 ７ 高塩化ナトリウム濃度が0.5Mないし2.0Mで
   ある第１項に記載の方法。