FI106562B - Menetelmä yhden veren hyytymistekijän aktivoimiseksi - Google Patents

Description

106562

Menetelmä yhden veren hyytymistekijän aktivoimiseksi

Keksintö koskee menetelmää veren hyytymistekijöiden aktivoimiseksi trypsiinillä sekä menetelmän käyttöä trombiinin val-5 mistamiseksi.

Veren hyytymisessä tapahtuu sarja peräkkäisiä reaktioita, joissa aktivoituu veren hyytymistekijöitä, jotka puolestaan katalysoivat seuraavia reaktioita. Lopuksi muodostuu fib-10 riiniä aktivoidun protrombiinin (trombiinin) vaikutuksella fibrinogeenistä. Veren hyytymistekijöiden aktivointi tapahtuu useimmiten tsymogeenin proteolyysin avulla proteolyyttisesti vaikuttavaksi entsyymiksi. Tämän aktivointireaktion mekanismi on osittain vielä tuntematon, mistä syystä veren hyytymiste-15 kijoiden in vitro-aktivointi on vaivoin valvottavissa. Prot rombiinin muunto trombiiniksi tapahtuu esimerkiksi tekijällä Xa ja kalsiumilla yksinään hyvin hitaasti. Se tapahtuu vasta silloin optimaalisesti, kun esiintyy puolestaa useiden tekijöiden kompleksi (protrombinaasikompleksi). Tekijän Xa lisäk-20 si tähän kompleksiin kuuluvat tekijä V, fosfolipidejä ja kalsium. Tekijä Xa lohkaisee protrombiinimolekyylin (molekyy-lipaino 68.000 D) proteolyyttisesti ja tuottaa siten aktiivisen entsyymin trombiini (molekyylipaino 30.000 D).

25 Plasmaproteaasi trombiini on monitoiminnallinen entsyymi, • ’· joka ei vaikuta ainoastaan fibrinogeenin lohkaisun johdosta c < : fibriiniksi koaguloivasti, vaan aktivoi myös mm. hyytymiste- kijät V, VIII ja XIII ja lohkaisee oman entsyymiinsä (protrom- • · · • *,: biinin) . Terapiassa trombiinia käytetään yksinään tai yhdessä 3O fibrinogeenin kanssa verenvuotojen tyrehdyttämiseksi tai kirurgiassa kudosliimauksessa.

« · · • c • · .···, Protrombiinin aktivointia protrombiinikompleksin kautta on hyvin vaikea jäljitellä ex situ, mistä syystä on tehty useita « « · v :35 yrityksiä trombiinin tuottamiseksi ihmis- tai eläinperäisten proteaasien vaikutuksella.

• · ·

Tutkimukset ihmisen protrombiinin aktivoimiseksi naudan teki- « · jällä Xa tai naudan trypsiinillä ovat osoittaneet, että akti- 2 106562 vointi trypsiinillä tapahtuu samojen fysiologisten välituotteiden kautta kuin tekijällä Xa. Saanto on tällöin kuitenkin maksimaalisesti 50 %, koska trypsiinin kohdalla proteolyysi jatkuu, mikä johtaa trombiinin ha-joamiseen tai vastaavasti 5 low-molecular-weight-tuotteiden muodostumiseen (Kisiel ja

Hanahan (1973), Biochim. Biophys. Acta 329, 221 - 232).

Trombiinin saantoa voidaan parantaa lisäaineilla, kuten see-rumialbumiinilla tai glyserolin korkeilla konsentraatioilla 10 (50 %) (Landaburu et ai. (1961), Am. J. Physiol. 201, 298 - 302). Tosin tuote on puhdistettava aktivointireaktion jälkeen panoksellisesti trypsiinistä ja erilaisista lisäaineista ennen, kuin se voidaan käsitellä biologisesti sopivaksi valmisteeksi .

15

Trypsiinin poistoa reaktioväliaineesta voitaisiin olennaisesti yksinkertaistaa käyttämällä immobilisoitua entsyymiä. Immobilisoidun trypsiinin käyttöä protrombiinin aktivoimiseksi on pidetty tähän asti mahdottomana. Kokeet ovat osoitta-20 neet, että päinvastoin kuin liukeneva trypsiini immobilisoitu trypsiini ei sovellu protrombiinin aktivoimiseksi trombiinik-si sitraattiplasmassa (Zubairov ja Zinkevich (1976), Vosprosy . meditsinskoi khimii 22(2), 187-91).

(Ill « « ;,: :25 Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan yksinkertainen ·': ! menetelmä veren hyytymistekijöiden aktivoimiseksi, joka takaa * *· aktivoidun entsyymin suuren saannon ilman, että on suoritet- • · · • V tava panoksellisia puhdistusvaiheita aktivointireaktion jäi- • · · ·* keen.

30 .***. Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmällä • · • · · .♦·*. yhden veren hyytymistekijän, nimittäin protrombiinin, tekijän ’·* IX tai tekijän X aktivoimiseksi trypsiinillä, jossa '·' * menetelmässä veren hyytymistekijä otetaan talteen protrom- :...:35 biinikompleksipitoisesta fraktiosta, käsitellään veteen liu- ;‘j*: kenemattomaan kantoaineeseen immobilisoidulla trypsiinillä ja erotetaan immobilisoitu trypsiini veren hyytymistekijän aktivoinnin jälkeen. Veteen liukenemattomana kantoaineena voidaan 3 106562 käyttää esimerkiksi selluloosaa, dekstraaneja, agaroosia, akrylaatteja tai silikaatteja.

Menetelmä soveltuu etenkin veren hyytymistekijän protrombiinin 5 aktivoimiseksi.

Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa protrombiinin, tekijän IX tai tekijän X aktivointi suoritetaan pH-arvossa 5,8 - 7,9, 5-25 mS:n johtavuudessa ja 2 - 45 °C:n lämpöti-10 lassa.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erittäin hyvin trombiinin ottamiseksi talteen protrombiinista. Puhdistettua protrombiinia sisältävän fraktion valvotussa käsittelyssä 15 immobilisoidulla trypsiinillä trypsiini erotetaan nopeasti ja täydellisesti ennalta määrätyn käsittelyajan jälkeen. Tuote ei sisällä siten olennaisesti mitään lohkaisutuotteita. Voidaan luopua siis tavan-omaisten stabilisaattoreiden, kuten glyserolin 50 %:n lisäämisestä. Trombiinipitoinenfraktio 20 voidaan käsitellä tavanomaisella tavalla farmaseuttiseksi valmisteeksi.

Aktivoidun entsyymin valmistamiseksi veren hyytymistekijästä i !"! voidaan aktivoida joko puhdistettu veren hyytymistekijä tai

4 I I

25 veren hyytymistekijäkompleksi, jolloin aktivoitu entsyymi

• 4 I

·· [ puhdistetaan edullisesti edelleen viimeksi mainitussa tapauk sessa. Trombiini voidaan ottaa talteen myös aktivoimalla • * · 1 2 3 4 ’.· puhdistettu protrombiini tai protrombiinikompleksi.

• · · 2 • · · 3 » 4 » 30 Keksinnön eräänä lisäetuna on se, että samanaikaisesti veren :***: hyytymistekijän aktivoinnin kanssa virusaktiviteetti vähenee * · · · ·***· olennaisesti, mikäli käytetään lähtöainetta, joka on peräisin ·«» viruksen saastuttamasta lähteestä.

4 « 4 4 « 4 • 4 4 *···* 35 Immobilisoidun trypsiinin virusinaktivoiva vaikutus veren hyytymistekijäpitoisessa fraktiossa oli yllättävä. Käsittely ·;··· immobil iso iduilla neutraaleilla hydrolaaseilla lisääntymisky- 4 106562 kyisten suodatettavien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi on ollut tunnettua ainoastaan immunoglobuliini-G-pitoisissa fraktioissa (EP-hakemusjulkaisu 0 247 998).

5 Tietenkin keksinnön mukaisen menetelmän puitteissa on mahdol lista suorittaa myös ylimääräisiä toimenpiteitä mahdollisesti esiintyvien infektioosisten aineiden inaktivoimiseksi. Siten voidaan suorittaa esimerkiksi kostutetun lyofilisoidun lähtöaineen höyry-lämpö-käsittely.

10

Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien esimerkkien avulla.

1. Trypsiinin immobilisointi 15 1,2 g trypsiiniä Type III (Sigma, tuote n:o T 8253) sidottiin 350 ml:aan (100 g jauhetta) CNBr-aktivoitua Sepharose 4B:tä valmistajan (Pharmacia) ohjeiden mukaisesti. Yli 90 % tryp-siinistä immobilisoitiin.

20 2. Protrombiinin aktivointi protrombiinikompleksipitoisessa fraktiossa

• I « I

• |

* t I

’·'· ; 50 l:sta ihmisen kryosakkaköyhää veriplasmaa eristettiin :.! ; protrombiinikompleksi tunnetun menetelmän mukaisesti, jonka 25 on esittänyt Brummelhuis julkaisussa "Methods of Plasma Frac- : γ tionation" (J. M. Curling ed., Acad. Press 1980) adsorboimal- ·*·*; la anioninvaihtimeen. Protrombiinia sisältävän fraktion suo- lakonsentraatiota vähennettiin diasuodatuksen avulla arvoon 150 mM NaCl:ää ja tuote jäädytyskuivatettiin.

30 .. . Mahdollisesti esiintyvien taudinaiheuttajien inaktivoimiseksi *..* tätä fraktiota kuumennettiin julkaisun AT-patenttijulkaisun • · *·*> 385.657 mukaisesti vesihöyryn läsnäollessa 10 tunnin ajan 60 ·;· °C:ssa ja 1 tunnin ajan 80 °C:ssa.

35 Y Kuumennettu irtojauhe liuotettiin 25 yksiköksi (E) protrom- • * · biinia/ml (proteiinikonsentraatio 12 mg/ml) ja käsiteltiin 5 106562 hitaasti sekoittaen 150 minuutin ajan 25 °C:ssa 1 ml:11a trypsiiniä, joka oli immobilisoitu Sepharoseen. Trombiiniak-tiivisuus oli 1980 E/ml, spesifinen aktiivisuus oli 165 E/mg proteiinia.

5 3. Kohdan 2. trombiinin edelleenpuhdistus

Trombiini valmistettiin kohdan 2. mukaisesti ja puhdistettiin edelleen 45 ml:n S-Sepharose-pylvään (Pharmacia) avulla seulo raavasti. Pylväs tasapainotettiin 25 mM Na3-sitraatilla, pH

6,2. Trombiini (105.000 E 25 mM Na3-sitraatissa) sidottiin S-Sepharoseen, pestiin samalla puskurilla ja eluoitiin 150 ml:11a 450 mM NaCl-liuosta.

15 Trombiinin saanto oli yli 94 %, spesifinen aktiivisuus oli 1735 E/mg proteiinia. Tämä trombiini voitiin jäädytyskuivat-tiin stabiiliksi valmisteeksi käyttämällä läsnä 9 g/1 NaCl:ää ja 5 g/1 glysiiniä.

20 4. Puhdistetun protrombiinin aktivointi 4 • 4 4 4 Höyrykäsitellyn protrombiinikompleksin talteenotto plasmasta • i · *·· : suoritettiin kohdan 2. mukaisesti.

• 4 • 4 25 Protrombiinin lisäksi virusinaktivoitu tuote sisälsi vielä • V tekijää IX ja tekijää X. Tekijät IX ja X erotettiin protrom- : biinista erottamalla kromatografisesti sulfatisoidun Sephadex G50:n (Pharmacia) avulla (Miletich et ai., (1980), Analyt. Biochem. 105, 304 - 310). Puhdistetun trombiinin aktivoinnin 30 jälkeen kohdan 2. mukaisesti spesifinen aktiivisuus oli 745 E/mg.

• « • « · • « 5. Kohdan 4. trombiinin edelleenpuhdistus 35 110.000 yksikköä (E) trombiinia valmistettiin kohdan 4. mu- V kaisesti ja puhdistettiin edelleen 45 ml:n S-Sepharose-pyl- • * · • « « • · · fi 106562 θ vään avulla. Puhdistamisen jälkeen trombiinin spesifinen aktiivisuus oli 3240 E/mg proteiinia.

« i « « · 0 0 • 0 • 0 0 0· 0 «I *

Claims (4)

7 106562

1. Menetelmä yhden veren hyytymistekijän, nimittäin protrombiinin, tekijän IX tai tekijän X, aktivoimiseksi 5 trypsiinillä, tunnettu siitä, että - veren hyytymistekijä otetaan talteen protrombiinikom-pleksipitoisesta fraktiosta, - käsitellään veteen liukenemattomaan kantoaineeseen im-mobilisoidulla trypsiinillä ja 10. immobilisoitu trypsiini erotetaan veren hyytymistekijän aktivoinnin jälkeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veren hyytymistekijänä käytetään protrombiinia. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että protrombiinin, tekijän IX tai tekijän X aktivointi suoritetaan pH-arvossa 5,8 - 7,9, 5 - 25 mS:n johtavuudessa ja 2 - 45 EC:n lämpötilassa. 20

4. Patenttivaatimuksen 3 mukaisen menetelmän käyttö trombii- . nin ottamiseksi talteen protrombiinista. < • It <11 I < ( • • · • · · • · · • · • · • · · • « · • I » • < « · • « · • · · • · « ··· • (Il < I I < € « • m β 106562