SK281266B6 - Spôsob získavania enzýmov z proenzýmov - Google Patents

Abstract

Opisuje sa aktivácia faktorov zrážania krvi vybraných zo skupiny zahrnujúcej protrombín, faktor IX alebo faktor X trypsínom, pri ktorom sa faktor zrážania krvi spracuje s trypsínom imobilizovaným na nosiči nerozpustnom vo vode a imobilizovaný trypsín sa po aktivácii faktora zrážania krvi oddelí.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu aktivácie faktorov zrážania krvi trypsínom ako aj použitia spôsobu na výrobu trombínom.

Doterajší stav techniky

Zrážanie krvi prebieha sériou po sebe idúcich reakcií, v ktorých sa aktivujú faktory zrážania krvi, ktoré opäť katalyzujú nasledujúce reakcie. Nakoniec sa tvorí fibrín z fibrinogénu pôsobením aktivovaného protrombínu (trombínu). Aktivácia faktorov zrážania krvných doštičiek prebieha hlavne proteolýzou zymogénu na proteolytický účinný enzým. Mechanizmus tejto aktivačnej reakcie je z časti ešte neznámy, čím je in vitro aktivácia faktorov zrážania krvi ťažko kontrolovateľná. Premena protrombínu na trombín prebieha napríklad samotným faktorom Xa a vápnikom veľmi pomaly. Prebieha optimálne až potom, keď je prítomný komplex viacerých faktorov (komplex protrombinázy). Vedľa faktoru Xa k tomuto komplexu patrí faktor V, fosfolipidy a vápnik. Faktor Xa štiepi proteolyticky molekulu protrombínu (mol. hmotnosť 68000 D) a generuje tým aktívny enzým trombín (mol. hmotnosť 30000 D).

Plazmová proteáza trombín je multifiinkčný enzým, ktorý spôsobí nielen štiepenie fibrinogénu na fibrín, ale tiež medzi iným aktivuje zrážacie faktory V, VIII a XIII a štiepi svoj vlastný proenzým (protrombín). V terapii sa používa trombín samotný alebo spolu s fibrinogénom na ukľudnenie krvácania alebo v chirurgii na spojovanie tkanív.

Aktivácia protrombínu protrombinázovým komplexom je ex situ ťažko napodobiteľná, preto nechýbajú pokusy, generovať trombín pôsobením proteáz ľudského alebo zvieracieho pôvodu.

Výskum aktivácie ľudského protrombínu hovädzím faktorom Xa alebo hovädzím trypsínom ukazujú, že aktivácia tiypsínom prebieha cez tie isté fyziologické medziprodukty ako pri faktore Xa.

Výťažok však je maximálne 50 %, pretože v prípade trypsínu prebieha ďalej, čo vedie k odbúraniu trombínu, prípadne k vzniku produktov s nízkou molekulovou hmotnosťou. (Kisiel a Hanahan (1973), Biochim. Biophys -Acta 329, 221 -232).

Výťažok trombínu môže byť zlepšený prídavkom sérového albumínu alebo vysokými koncentráciami glycerínu (50 %). (Landaburu a spol., (1961), Am. J. Physiol. 2011, 298 - 302). Na záver aktivačnej reakcie sa produkt musí zbaviť trypsínu a škodlivých prímesí pred tým, než je možné ho spracovať na biologicky prijateľný preparát.

Oddelenie trypsínu z reakčného média by mohlo byť podstatne zjednodušené použitím imobilizovaného enzýmu. Použitie imobilizovaného trypsínu na aktiváciu protrombínu bolo dosiaľ pokladané za nemožné. Pokusy ukazujú, že na rozdiel od rozpustného trypsínu nie je imobilizovaný trypsín na aktiváciu protrombínu na trombín vhodný (Zubairov a Zinkevich (1976), Voprosy medicinskoj chimii 22(2), 187-191).

Úlohou predloženého vynálezu je nájsť jednoduchý spôsob aktivácie faktorov zrážania krvi, ktorý vykazuje vysoký výťažok, vztiahnuté na aktivovaný enzým, bez toho, aby bolo nutné vykonávať stupeň čistenia po aktivačnej reakcii.

Podstata vynálezu

Táto úloha je podľa vynálezu riešená spôsobom aktivácie faktorov zrážania krvi trypsínom, ktorý spočíva v tom, že sa faktor zrážania krvi získa z frakcie obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje sa s trypsínom imobilizovaným na nosiči nerozpustnom vo vode a imobilizovaný trypsín sa po aktivácii faktora zrážania krvi oddelí. Ako vo vode nerozpustný nosič sa používajú niektoré celulózy, dextrany, agarózy, akryláty alebo silikáty.

Sôsob je vhodný najmä na aktiváciu faktorov zražania krvi protrombínu, faktora IX alebo faktora X.

Výhodné uskutočnenie vynálezu spočíva vo vykonaní aktivácie protrombínu, faktora IX alebo faktora X pri hodnote pH 5,8 až 7,9, vodivosti 5 až 25 mS a teplote od 2 do 45 °C.

Spôsob podľa vynálezu je zvlášť dobrý na získanie trombínu z protrombínu. Riadené spracovanie frakcie, obsahujúcej čistený protrombín, imobilizovaným trypsínom zahrnuje rýchle a úplne oddelenie trypsínu po vopred stanovenom čase ošetrenia. Produkt neobsahuje v podstate žiadne produkty. Prídavok bežných stabilizátorov, ako 50 % glycerínu, je tiež možné použiť. Frakcie obsahujúce trombín, môžu byť bežným spôsobom spracované na farmaceutické prípravky.

Na výrobu aktivovaného enzýmu z faktora zrážania krvi sa môže aktivovať buď prečistený faktor zrážania krvi alebo komplex faktorov zrážania krvi, pričom sa aktivovaný enzým v poslednom uvedenom prípade výhodne ďalej čistí. Trombín môže byť tiež získaný aktiváciou prečisteného protrombínu alebo komplexu protrombínu.

Ďalšia výhoda spočíva v tom, že súčasne s aktiváciou faktora zrážania krvi výrazne klesá aktivita vírusu v prípade, že bol použitý východiskový materiál, ktorý pochádzal z krvi darcov kontaminovanej vírusom.

To, že imobilizovaný trypsín spôsobí inaktiváciu vírusu vo frakciách, obsahujúcich krvný faktor, je prekvapujúce. Spracovanie imobilizovanými neutrálnymi hydrolázami na inaktiváciu rozmnožovania schopných filtrovateľných pôvodcov chorôb bolo známe jedine pre frakcie, obsahujúce imunoglobulín G (EP-A 0247998).

Samozrejme môžu byť v rámci spôsobu podľa vynálezu použité tiež ďalšie prídavné postupy pre inaktiváciu prípadne prítomných infekčných agensov. Napríklad je možné zvlhčený lyofilizovaný východiskový materiál spracovať pomocou ohrevu parou.

Nasledujúcimi postupmi je vynález bližšie vysvetlený.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Imobilizácia trypsínu

1,2 g trypsínu typ III (Sigma, Artikel Nr. T 8263) sa naviaže na 350 ml (100 g prášku) CNBr-aktivovanej Sepharosy 4B podľa pokynov výrobcu (fa Pharmacia). Imobilizuje sa viac než 90 % trypsínu.

2. Aktivácia protrombínu vo frakcii obsahujúcej protrombínový komplex

Z 50 1 ľudskej na kryoprecipitát chudej krvnej plazmy sa izoluje protrombínový komplex známym spôsobom podľa Brummelhuisa, „Methods of Plasma Fractionation“ (J. M. Curling vyd., Acad. Press 1980) adsorbciou na aniónovýmennú živicu. Koncentrácia soli frakcie obsahujúcej protrombín sa zníži diafiltráciou na 150 mM NaCl a produkt sa suší vymrazením.

SK 281266 Β6

Na prípadnú inaktiváciu obsiahnutých pôvodcov chorôb sa tieto frakcie podľa AT-B 385657 zahrievajú v prítomnosti vodnej pary 10 h na 60 °C a 1 h na 80 °C .

Získaný prášok sa rozpustí na 25 j. protrombínu/ml (koncentrácia proteínu 12 mg/ml) a spracováva s 1 ml trypsínu, imobilizovanom na Sepharose, 150 min. pri 25 °C za pomalého miešania. Aktivita trombínu je 1980 j. na ml, špecifická aktivita 165 j./mg proteínu.

3. Ďalšie čistenie trombínu zo stupňa 2

Vyrobí sa trombín podľa stupňa 2 a čistí sa prechodom cez stĺpec 45 ml S-Sepharosy (Pharmacia). Stĺpec sa ekvilibruje 25 mM Na₃citrátu s pH 6,2. Trombín (105000j. v 25 mM Na₃citrátu) sa naviaže na S-Sepharose, premyje sa rovnakým pufrom a eluuje 150 ml 450 mM NaCl roztoku.

Výťažok, vztiahnuté na trombín, bol nad 94 %, špecifická aktivita činí 1735 j./mg proteínu. Tento trombín sa za prítomnosti 9 g/1 NaCl a 5 g/1 glycerínu suší vymrazením na stabilný preparát.

4. Aktivácia prečisteného protrombínu

Získanie parou spracovaného protrombínového komplexu z plazmy sa vykoná podľa 2.

Vedľa protrombínu obsahuje vírusinaktívny produkt ešte faktor IX a faktor X. Chromatografickým delením, na sulfátovanom Sephadexe G50 (Pharmacia) (Miletich a spol., (1980), Analyt. Biochim. 105, 304-310) sa oddelia faktory IX a X od protrambínu. Po aktivácii prečisteného protrombínu na trombín podľa 2 bola špecifická aktivita 745 j./mg.

5. Ďalšie čistenie trombínu zo stupňa 4.

110000 j. trombínu sa vyrobí podľa 4 a ďalej sa čistí cez stĺpec 45 ml S-Sepharosy. Po prečistení má trombín špecifickú aktivitu 3240j./mg proteínu.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob aktivácie faktorov zrážania krvi, vybraných zo skupiny zahrnujúcej protrombín, faktor IX alebo faktor X trypsínom, najmä na získanie trombínu z protrombínu, vyznačujúci sa tým, že sa faktor zrážania krvi spracuje trypsínom, imobilizovaným na nosiči nerozpustnom vo vode a imobilizovaný trypsín sa po aktivácii faktoru zrážania krvi oddelí.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa aktivácia protrombínu, faktora IX alebo faktora X vykonáva pri hodnote pH 5,8 až 7,9, vodivosti 5 až 25 mS a teplote 2 až 45°C.