JP4101309B2 - 治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト血漿の画分から工業規模で精製する、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法に関する。
【0002】
トロンビンは、その不活性な前駆体であるプロトロンビンの活性化により血流中で生成したセリンプロテアーゼである。これは、凝固過程で基本的な役割を果す:これはフィブリノーゲンを切断してフィブリンモノマーとし、タンパク質分解的切断により第XIII因子を活性化し、これがフィブリンネットワークを安定化する。
【0003】
トロンビンは、他の生理学的過程でも役割を果している:これは分泌及び血小板凝集反応を開始し、白栓の形成を容易にする。これは又、補体系のタンパク質を活性化する。それは繊維芽細胞に対してマイトジェン効果を持ち、損傷を受けた血管の治癒を促進する。
【0004】
これらの種々の性質の結果としてトロンビンは、局所的止血剤としての治療的用途を持つ。現在、馬又は牛の動物トロンビンが、そのような臨床的用途で用いられている。これらの調剤は必ずしも完全に精製されておらず、その適用が異種タンパク質の与え過ぎによる免疫応答の原因となり得る。さらに牛トロンビンの使用は、最近診断されまだ抑制の困難な伝染病、例えば海綿状牛脳炎などを伝染させる危険を持っている。
【0005】
多くの酵素と同様にトロンビンの精製は、その全酵素活性の維持に関して問題がある。実際本来のα−トロンビンは一般に不安定で、自己分解又は限定加水分解によりβ−及びγ−トロンビンなどの誘導体を与え、これらはフィブリノーゲンに対する凝固活性の実質的部分を失っている。
【0006】
周知の精製法は、特に牛トロンビンに適用される:DEAE−セルロースなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィーが含まれ(Yin等,J.Biol.Chem.,1968,243,112)、Sephadex−G 100(R)上での濾過を伴うことができる(Baughman等,J.Biol.Chem.1967,242,5252−5259);ある方法を用いて、ホスホセルロース上で(Rosenberg等,J.Biol.Chem.1970,245,5049)及び数種類のイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることにより(Batt等,J.Biol.Chem.1970,245,4857)β及びγ型を分離することができる。
【0007】
スルホエチル又はスルホプロピルセファデックス(Lundblad,Biochemstry,1971,10,2501)などの新しい樹脂、ならびにヘパリン−セファロース(Nordeman等,Thromb.Res.,1977,11,799−888)及びp−アミノベンズアミジン−アガロース(Hixson等,Arch.Bilchem.Biophys.,1973,154,501)などの担体上におけるアフィニティークロマトグラフィーも使用されてきた。
【0008】
2つの文献がヒトトロンビンの精製につき記載しており、ひとつはベンズアミジン−セファデックス上(Lorne等,Rev.Fr.Transf.Hemobiol.,1989,32,391−403)の精製であるが生成物の活性は低く(11−20NIH U/ml)、他は新規ポリスチレン上の精製であるが、この生成物は牛第V因子(下記参照)を含む。
【0009】
トロンビンを得るためには、その前駆体であるプロトロンビンの供給源のみでなく、選ぶ活性化の様式に依存して、活性化過程に含まれる十分な濃度の他の凝固因子が自由にならなければならない。プロトロンビンを活性化してトロンビンを製造することができる種々の方法が記載されてきた。Fenton等(Biochem.Biolphys.Acta.1971,229,26−32及びJ.Biol.Chem.,1977,252,3587−3598)は、樹脂上に抽出したCohnの第3画分から、塩化カルシウム及びヒト脳から抽出した組織トロンボプラスチンを加えることによりトロンビンを製造する方法につき記載している。反応は、牛起源による第V因子の添加により促進される(Bernamon−Djiane−Coagulation,1968,1,259)。
【0010】
へび毒から抽出した特殊な活性剤も使用することができる(Gosh等,Thromb.Res.,1980,20,281)。
【0011】
しかしこれらの種々の方法には、それが治療的用途のための大量のヒトトロンビンの製造を含む場合に大きな欠点がある。例えばヒト脳からのトロンボプラスチンは、入手が困難であり、数百リットルの血漿を処理するようになるとそれが制限因子となる。その後それを除去する高性能のシステムが得られなければ、まむしの毒を用いた活性化は、人における使用に適合させることは困難である。牛第V因子の利用は、患者に注射される残留量が重症の免疫反応の基となるので、特に危険であることがわかった。
【0012】
それが、異種材料の添加を含まず、さらにウィルス不活性化処理を行って精製濃厚ヒトトロンビンを製造できる方法を出願人が開発した理由である。方法は簡単であり、大量の工業規模への適用と両立する。
【0013】
原料は、ヒト血漿のPPSB画分である(PPSB:プロコンベルチン又はFVII、プロトロンビン、スチュアート因子又は第X因子、及び抗血友病因子B又は第IX因子)(PPSBはPCCとも呼ばれる:プロトロンビン複合濃厚液);従ってプロトロンビンの活性化に必要なすべての分子は、最初の混合物中に存在する:第VII、IX、X因子、リン脂質及び補因子V及びVIII。
【0014】
出願人が行った方法は、以下の連続6段階を含む:
a)凍結沈澱血漿上澄み液をDEAE−Sephadex(R)上に吸着させ、フィブリノーゲン及び、続くトロンビン活性化反応を遅くする微量の阻害剤の除去を可能にする0.20M−0.23M、好ましくは0.23Mの塩化ナトリウムを含むpH7のクエン酸塩緩衝液中で洗浄する。その後塩化ナトリウム濃度を0.50Mに増加させることにより、PPSBを溶離する。
【0015】
b)最終濃度5−10mM、好ましくは7mMの塩化カルシウムを加えることによりトロンビン生産のためのプロトロンビンの活性化を開始する。(過剰のCaCl2は、活性化反応を阻害することが観察された)。この段階には、滞留時間の短いインキュベーション期間、及びそれに続く、より低温における比較的長い第2のインキュベーションが含まれる。
【0016】
従って混合物は、最初に37℃で2時間インキュベートする。この処理だけでPPSB1ml当たり300−350NIH Uのトロンビンの生成を可能にする(NIH U:国立健康研究所−USAにより定義された単位)。この温度でもっと長くインキュベートしても結果は向上しない。
【0017】
その後24℃で少なくとも16時間インキュベートを続け、これにより700−1000NIH Uのトロンビン/1mlのPPSBを得ることができる。
【0018】
c)このようにして石灰化した混合物をそのまま、溶剤−界面活性剤を用いて、特に0.3% TnBp/1% Tweenを加えることによりウィルス不活性化処理を行い;24℃で少なくとも6時間、一般に終夜インキュベートを続ける。この処理をカルシウムの添加前にPPSBに対して行うと、活性化反応に必要なリン脂質などの因子が除去されるので、トロンビンを活性化した後にこの処理を行うことが重要であることに注意するべきである。
【0019】
d)その後1段階のイオンクロマトグラフィー、特に強力な陽イオン交換剤上のクロマトグラフィーを用いてトロンビンを精製する。CH2−SO3基をグラフトしたアガロースマトリックス、例えばS−Sepharose FF(R)(Pharmacia)により形成した硬質ゲルを用いるのが好ましい。クロマトグラフィーは、40mMのナトリウムグルコネート及び0.01Mの塩化ナトリウムを含む培地中、pH6.5で行った。ナトリウムグルコネートは、トロンビンの生物活性に対して非常に有益な保護効果を持つ。
【0020】
トロンビンをカラムに吸着させた後、150mMのナトリウムグルコネート及び0.04MのNaClを含み、pHが6.5の培地中でカラムを洗浄する
トロンビンの溶離条件を調節し、特に塩化ナトリウム濃度を0.2Mに、及びナトリウムグルコネート濃度を150mMに増加させることにより、狭いクロマトグラフィーピークを得る。
【0021】
ナトリウムグルコネート塩基媒体を用いると、さらに透析段階を避けることができるという利点があり、透析段階は従来のリン酸塩緩衝液を用いた場合には必須である。
【0022】
e)クロマトグラフィーカラムから溶離させた後、グルコネート緩衝液中のトロンビンの溶液に、2g/lのアルブミン、5g/lのサッカロース及び60mMのCaCl2を含む安定剤の混合物を加える。これらの安定剤の役割は、以下の段階で特に重要である。
【0023】
f)その後トロンビン調剤を、好ましくは超遠心により濃縮し、後の治療的用途の目的に合わせた体積のアリコートとし、凍結乾燥する。
【0024】
安定剤としてアルブミンの存在は、濃縮段階で必須であることがわかった。
【0025】
サッカロースは、調べた他のすべての糖及びアミノ酸より好ましく、溶液を1−5mlの体積のアリコートとする場合に非常に長時間かかる分配の間に、液体の状態の濃厚液に対して非常に重要な安定化効果を有する。
【0026】
CaCl2及びサッカロースの存在は、凍結乾燥の間の安定化のために非常に重要である。
【0027】
本発明の方法は、記載のある他の方法(特に上記のLorne等及びFischer等)と明確に区別されるいくつかの特徴を呈し、最終生成物に純度及び非常に高い比活性という顕著な利点を与える。
【0028】
これらの特徴をまとめると以下である:
−フィブリノーゲン及び阻害剤を除去した予備洗浄PPSB画分の使用;
−再石灰化条件の選択:塩化カルシウム濃度及び2段階の連続インキュベーションの温度;
−操作の安全のためには望ましく思えるが、この段階で行うとトロンビン活性化反応に必要なリン脂質を変性させてしまうPPSBに対して行うのではなく、トロンビン活性化段階と精製段階の間に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理;
−強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィー及びこの段階におけるナトリウムグルコネートを含む特殊な保護媒体の利用;
−最後の3操作:濃縮、分配及び凍結乾燥の間その活性を保護する、最終生成物のための安定剤の混合物の選択。
【0029】
結局、本発明の目的は、CaCl2の添加によりあらかじめ再石灰化した血漿のPPSB画分のクロマトグラフィーによる精製を含み、特に塩化ナトリウムを用いた洗浄及びその後ナトリウムグルコネートの存在下における強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィーによる精製により最初のPPSB画分を処理してフィブリノーゲン及びトロンビン活性化阻害剤を除去する段階を含む、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法の提供である。
【0030】
本発明の他の特徴により本方法は、洗浄PPSB画分の再石灰化の後、クロマトグラフィーによる活性化トロンビンの精製の前に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理を含む。
【0031】
本発明の他の特徴により本方法は、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物の、クロマトグラフィーカラムから溶離したトロンビンの溶液への添加を含む。
【0032】
本方法の顕著な特徴は、1バッチで最高1600万NIH Uのトロンビン(EPA 0 378 798に記載のような他の周知の方法を用いた場合の150倍以上)の生産を可能にする非常に大量の出発材料を用い、経済的に重要な他の血液−誘導生成物(血液凝固因子、アルブミン、免疫グロブリンなど)の精製と抵触しないその効率である。
【0033】
本発明の目的は、記載の方法を用いて得られ、凝固剤活性が少なくとも500NIH U/mlと同等であり、比活性が少なくとも1000NIH U/mgタンパク質と同等であることを特徴とする、トロンビン濃厚液にも拡張される。
【0034】
本発明の濃厚液の高い濃度及び比活性は、他の方法(前記のLorne等)により製造した活性がわずか11−20NIH U/mlの生成物から、本発明の濃厚液を区別するものである。
【0035】
さらにこの凍結乾燥濃厚液は、非常に安定であり、その凝固剤活性は少なくとも1年間一定である。
【0036】
従って本発明のトロンビン濃厚液は、人における治療的用途に完全に適応している。
【0037】
これは、局所止血剤としてそのまま使用することができる。
【0038】
これは又、特許出願EP−O 305 243にて出願人により記載の、少量の第XIII因子及びフィブロネクチンを含むフィブリノーゲン濃厚液に加えることにより、生物学的膠を形成するのにも使用することができる。生物学的膠の形成法は、凝固の最終段階、すなわちフィブリンネットワークの形成を再現するものである。トロンビンはフィブリノーゲンを切断してフイブリンモノマーとする。それがカルシウムイオンの存在下で第XIII因子を活性化し、その因子は活性化形態で、堅くて脆さのない不溶性血餅中で溶解性のフィブリンを安定化する。従って生成物の止血力により、手術中及び後の出血を制限し、体質性又は後天性凝固不全の患者(特に凝固阻止剤を投与されている患者)の局所止血を強化することができる。
【0039】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、制限するものではない。
【0040】
実施例1
a)−PPSB画分の調製
原料は、0−3℃で解凍し、遠心することにより得た血漿凍結沈澱上澄み液であった。
【0041】
1000−1500リットルの上澄み液を、生理的血清の存在下で、1リットルの上澄み液当たり1.5gの樹脂の割合のDEAE−Sephadex A50(R)に吸着させた。0.01Mのクエン酸塩緩衝液中0.23Mの塩化ナトリウムを用いてpH7にて洗浄した後、同緩衝液中0.50Mの塩化ナトリウムを用いてPPSBを溶離し、40g/lのタンパク質まで濃縮し、そこに2.5g/lのリシンを加えた。その後それをpH7.0にて約290ミリOsm/lの浸透圧に調節した。
【0042】
そのようにして調製したPPSBは、約50U/mlの濃度のプロトロンビンの他に血液凝固因子X,IX及びVIIをそれぞれ約45U/ml、45U/ml及び5U/mlの濃度で含む。それは又、5−6U/mlの因子Vc及びVIIIc、ならびにリン脂質を含み、リン脂質の存在はトロンビン生成時間(又はTGT50)により明らかになった。
【0043】
塩化ナトリウムを用いた洗浄により、フィブリノーゲンならびに、PPSB中に存在すると再石灰化反応を遅くするある種の阻害剤を除去することができた。
【0044】
b)−再石灰化条件
新しく調製した、又は解凍後の9−11リットルのPPSBを、無菌条件下で濾過し、ビーカー又は無菌30リットルステンレススチールタンク中でPPSB1リットル当たり7mlのCaCl2をそこに加え、37℃の水浴中に2時間置いた。この第1段階の後、約300NIH U/lのトロンビンが得られた。
【0045】
その後温度を24℃に下げ、混合物をさらに16時間この温度に保った。処理の最後に得られたトロンビンの収量は、PPSB1ml当たり700−1000NIH Uであった。
【0046】
この段階でトロンビンの比活性は、20−40NIH U/mgタンパク質であった。
【0047】
c)−ウィルス不活性化
ウィルス汚染物の不活性化は、24℃の温度で少なくとも6時間、0.3%のTnBp及び1%のTween80(最終濃度)を加えることにより行った。実際は混合物をTnBP/Tween80媒体中に終夜放置した。
【0048】
この段階でトロンビン活性の損失は観察されなかった。TnBP/Tween80処理の最後にトロンビンの比活性は、20−40NIH U/mgタンパク質であった。
【0049】
その後混合物を、1−30リットルの試料としてプラスチックバッグ中で−30℃にて深冷凍結した。
【0050】
d)−トロンビン精製
この段階の目的は、TnBP/Tween80、活性化血液凝固因子、及びセリンプロテアーゼにより部分的に分解されたPPSBの他のタンパク質を含む反応混合物からトロンビンを分離することである。
【0051】
CH2−SO3基をグラフトしたアガロースマトリックスにより形成した硬質ゲルである強力な陽イオン交換ゲル、S−Sepharose FF(R)(Pharmacia)上でクロマトグラフィーを行った。
【0052】
不安定なトロンビンを、以下の条件下、pH6.5にてナトリウムグルコネートを用いることによりクロマトグラフィーの間保護した:解凍後、10−12リットルのPPSB/トロンビン/溶剤−界面活性剤残留物をpH6.5に調節し、pH6.5にて40mMのナトリウムグルコネート及び0.01MのNaClを含む媒体で平衡化した約16リットルのS−Sephar/se FF(R)のカラム上に注入した。PPSBのタンパク質の大部分、ならびにTnBP及びTween80はカラムに保持されなかった。その後ゲルを、pH6.5にて150mMのナトリウムグルコネート及び0.04MのNaCl媒体で洗浄した。その後、同媒体に0.20Mの塩化ナトリウムを加えることによりトロンビンを溶離させた。
【0053】
カラムから溶離させた後、トロンビンを以下の安定剤の存在下で回収した:2g/lのアルブミン、5g/lのサッカロース及び60mMの塩化カルシウム。その後生成物を遠心により濃縮し、5g/lのアルブミン濃度及びpH6.3−6.5に調節した。
【0054】
クロマトグラフィー及び濃縮の2段階の全収率は、90%程度であった。
【0055】
無菌濾過の後、生物学的膠の形態でのその後の使用目的に拠り、生成物を5ml、2ml、1ml又は0.5mlの体積に分配し、凍結乾燥した。表I及びIIに示す通り、これらの処理の間のトロンビンの酵素活性の保持のために安定剤の存在が必要であった。
【0056】
【表1】
【0057】
【表2】
実施例2:−生成物の性質
トロンビン濃厚液は、凍結乾燥状態であった。蒸留水中で再構成後、以下の方法でそれを評価した:
a)凝固剤活性
本来のアルファ−トロンビンの活性をそのフィブリノーゲン凝固剤活性により測定した。それを参照標準に対するNIH(国立健康研究所)単位で表した:NIHトロンビン、バッチJ。
【0058】
蒸留水中で再構成した後、0.5%のポリエチレングリコール6000を含むOwren Koller緩衝液(L’Hemostase:methode d’exploration et diagnostic pratique.Ed.L’Expansion scientifique K.J.CAEN−H.J.LARRIEU.M.SAMAMA.)中で、1/300から1/900の5段階の希釈液を調製した。KC 10 ANelung装置(BAXTER)を用いて凝固時間を測定した。200μlの希釈液(標準又は試験試料)を1系列のカップ中に入れた。37℃で1分後、1g/lのフィブリノーゲン200μlを加え、ストップウォッチをスタートさせた。両対数紙に標準曲線をプロットした。試験試料の場合に得た時間を記録し、グラフ上でそのNIH U/ml比を推定した。
【0059】
b)−アミド分解活性
SYAGO クロモトロンビン基質上で、供給者の指示に従ってトロンビンのアミド分解活性を決定した。それをnkat/mlで表した。ナノケタールとNIH単位の関係は、1NIH U=2nkatであった。
【0060】
発色基質上で見いだされた活性は、本来のアルファ−トロンビンの活性、ならびにそのタンパク質分解誘導体であるβ及びγトロンビンの活性に相当した。
【0061】
c)−タンパク質濃度
ビウレット法を用いてタンパク質濃度を決定した。
【0062】
d)−ポリアクリルアミド上の電気泳動
SDS媒体中でPhastゲル10/15を用い、Pharmacia PHAST SYSTEM(R)上で電気泳動を行った。
【0063】
e)−トロンビンの存在下でフィブリノーゲン濃厚液、第XIII因子及びフィブロネクチンの凝固により形成した生物学的膠の性質(ヨーロッパ特許0 305 243)
トロンビンの存在下で形成した生物学的膠の性質を以下のパラメーターを用いて評価した:ゲル化速度(秒)、マウス上への接着強度(g/cm2)。半置換時間(秒)及び全置換(ラジアン)をレオメーターを用いて測定した。
【0064】
トロンビン濃厚液の特性
上記の方法により測定した特性を以下の表に示す。
【0065】
【表3】
濃厚液の凝固剤活性は、550NIH Uの程度であった。
【0066】
アミド分解活性は同程度、600−700NIH U/mlであり、分解形態、β及びγ−トロンビンが高い割合で存在しないことを示す。
【0067】
ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により、生成物の純度を評価した。SDS媒体中で、分子量67000のアルブミンに対応するバンドの他に分子量36000のα−トロンビンに対応する唯一の主要バンドが観察された。β−メルカプトエタノールによる還元の後、より低分子量のα−トロンビンのH鎖に対応するバンドが現れた。約4000ダルトンのL鎖は、プレートから移動して消えた。
【0068】
再構成の後の生成物の安定性を調べた(表IV)。トロンビンは、液体状態で少なくとも24時間安定であった。又、深冷凍結状態(表V)及び凍結乾燥状態(表VI)でも安定であった。この安定性は、pHが6.5のグルコネート−サッカロース−塩化カルシウム−アルブミン媒体により保証された。
【0069】
【表4】
【0070】
【表5】
【0071】
【表6】
【0072】
【表7】
ヒトトロンビン又は牛トロンビンの存在下で得た生物学的膠のレオロジー特性を、従来の試験法を用いて比較した。
【0073】
試験は、同一のフィブリノーゲン濃度で行い、それを牛又はヒトトロンビン(06510010)と混合した。各試験に使用した方法は、厳密に同一であった。装置は、CARROMED CSL 100 応力制御レオメーターであった。
【0074】
a)−クリープ様式における使用
ゲル化時間の測定
半置換時間t1及びt2(全置換の50%を得るのに必要に時間)は:
t2(牛トロンビン):1.8秒
t1(ヒトトロンビン):0.77秒
有意な差はなかった。
【0075】
弾性研究
2生成物は、同一の瞬間弾性を有することが見いだされた。
【0076】
b)振動様式における使用
2生成物の場合に約2500N/m2の破断点が見いだされた。
【0077】
2つの膠の貯蔵弾性率G’は、同様に時間と共に向上した。
【0078】
周波数の関数としての貯蔵弾性率G’は、2生成物に関して同等であった。
【0079】
すべての結果は、生成物を使用する場合の血餅の様子、滲出及びゲル化時間に関する観察を支持していた。
【0080】
すべての結果により、ヒトトロンビンの存在下で得た膠のレオロジー特性及び機械的性質は、現在普通に使用されている生物学的膠の成分である牛トロンビンの存在下で得たものと同一であると結論することができた。
【0081】
実施例3 方法のスケールアップ
実施例1に記載の方法を用いて、10−15リットルのPPSBの数バッチを行い、表VIIIに示す通り同一の効率を得た。
【0082】
続くクロマトグラフィー−濃縮段階の収率は、89−100%であった。
【0083】
従って全体として方法は、1000万NIH単位以上のトロンビンを含む、良く標準化されたバッチの生産を可能にする。
【0084】
【表8】
本発明の主たる特徴及び態様は、以下の通りである。
【0085】
1.治療的用途のための高活性ヒトトロンビン濃厚液の製造法において、前もってCaCl2を加えて再石灰化した血漿のPPSB画分のクロマトグラフィー精製を含み、最初のPPSB画分を塩化ナトリウムで洗浄する前処理を行ってフィブリノーゲン及びプロトロンビン活性化阻害剤を除去し、強力な陽イオン交換ゲル中、ナトリウムグルコネートの存在下でクロマトグラフィー精製を行うことを特徴とする方法。
【0086】
2.第1項に記載の方法において、ウィルス不活性化処理を含み、該処理が再石灰化の後、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行われ、溶剤−界面活性剤処理を含むことを特徴とする方法。
【0087】
3.第1又は2項に記載の方法において、クロマトグラフィーゲルから溶離したトロンビンを、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物により安定化することを特徴とする方法。
【0088】
4.第1項に記載の方法において、クエン酸塩緩衝液中0.20M−0.23Mの塩化ナトリウムを用いてDEAE−Sephadexのカラム上で洗浄段階を行った後、塩化ナトリウム濃度を0.5Mに増加されることによりPPSBを溶離させることを特徴とする方法。
【0089】
5.第1−4項のいずれかに記載の方法において、CaCl2を最終濃度5−10mMで加えることによりPPSBを再石灰化し、最初に短期間のインキュベーションを行い、その後より低温で実質的に長期間の第2のインキュベーションを行うことを特徴とする方法。
【0090】
6.第1−5項のいずれかに記載の方法において、CaCl2中の第1期インキュベーションを37℃で2時間行い、第2期インキュベーションを24℃で16時間行うことを特徴とする方法。
【0091】
7.第1−6項のいずれかに記載の方法において、CH2−SO3基をグラフトしたアガロースのゲル上、40mMのナトリウムグルコネート及び0.01Mの塩化ナトリウムを含むpH6.5の媒体中でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする方法。
【0092】
8.第1−7項のいずれかに記載の方法において、塩化ナトリウム濃度を0.2Mに、及びナトリウムグルコネートの濃度を150mMに増加させることによりクロマトグラフィーからトロンビンを溶離させることを特徴とする方法。
【0093】
9.第1−8項のいずれかに記載の方法において、溶離トロンビンを、2g/lのアルブミン、5g/lのサッカロース及び60mMのCaCl2を含む混合物の添加により安定化することを特徴とする方法。
【0094】
10.第1−9項のいずれかに記載の方法において、トロンビンの安定化溶液を濃縮し、その後の治療的用途に合わせた体積のアリコートに分配し、凍結乾燥することを特徴とする方法。
【0095】
11.第1−10項のいずれかに記載の方法を用いて得たヒトトロンビン濃厚液において、凝固剤活性が少なくとも500NIH U/mlと同等であり、比活性が少なくとも1000NIH U/mgタンパク質であることを特徴とする濃厚液。
【0096】
12.第11項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、局所的止血薬として調製ずみの治療用組成物の製造における利用。
【0097】
13.フィブリノーゲン濃厚液と組み合わせて生物学的膠を形成した、第11項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、治療的用途における利用。
Claims (1)
- (i)第VII、IX、X因子、プロトロンビン、リン脂質及び補因子V及びVIIIを含んでなる、凍結沈殿血漿上澄み液の最初のPPSB画分を、クエン酸緩衝液中0.2Mから0.23M塩化ナトリウムで洗浄する前処理を行って、フィブリノーゲン及びプロトロンビン活性化阻害剤をそれらがPPSB中に存在するときには除去し、(ii)該前処理を行ったPPSB画分を、最終濃度5−10mMのCaCl2を加えて最初に37℃で2時間インキュベーションし続いて24℃で少なくとも16時間インキュベーションすることにより再石灰化し、そして、(iii)該再石灰化したPPSB画分を、強力な陽イオン交換ゲルに通して、ナトリウムグルコネート濃度を150mMに増加させ及びNaCl濃度を0.2Mに増加させることによってトロンビンが溶出される、1回のクロマトグラフィー精製にかけること、の工程を含むことを特徴とする、治療的用途のための高活性ヒトトロンビン濃厚液の製造法。
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