JP4101309B2 - 治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法 - Google Patents
治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、ヒト血漿の画分から工業規模で精製する、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法に関する。
【０００２】
トロンビンは、その不活性な前駆体であるプロトロンビンの活性化により血流中で生成したセリンプロテアーゼである。これは、凝固過程で基本的な役割を果す：これはフィブリノーゲンを切断してフィブリンモノマーとし、タンパク質分解的切断により第ＸＩＩＩ因子を活性化し、これがフィブリンネットワークを安定化する。
【０００３】
トロンビンは、他の生理学的過程でも役割を果している：これは分泌及び血小板凝集反応を開始し、白栓の形成を容易にする。これは又、補体系のタンパク質を活性化する。それは繊維芽細胞に対してマイトジェン効果を持ち、損傷を受けた血管の治癒を促進する。
【０００４】
これらの種々の性質の結果としてトロンビンは、局所的止血剤としての治療的用途を持つ。現在、馬又は牛の動物トロンビンが、そのような臨床的用途で用いられている。これらの調剤は必ずしも完全に精製されておらず、その適用が異種タンパク質の与え過ぎによる免疫応答の原因となり得る。さらに牛トロンビンの使用は、最近診断されまだ抑制の困難な伝染病、例えば海綿状牛脳炎などを伝染させる危険を持っている。
【０００５】
多くの酵素と同様にトロンビンの精製は、その全酵素活性の維持に関して問題がある。実際本来のα−トロンビンは一般に不安定で、自己分解又は限定加水分解によりβ−及びγ−トロンビンなどの誘導体を与え、これらはフィブリノーゲンに対する凝固活性の実質的部分を失っている。
【０００６】
周知の精製法は、特に牛トロンビンに適用される：ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィーが含まれ（Ｙｉｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６８，２４３，１１２）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ １００(R)上での濾過を伴うことができる（Ｂａｕｇｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６７，２４２，５２５２−５２５９）；ある方法を用いて、ホスホセルロース上で（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，５０４９）及び数種類のイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることにより（Ｂａｔｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，４８５７）β及びγ型を分離することができる。
【０００７】
スルホエチル又はスルホプロピルセファデックス（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，１９７１，１０，２５０１）などの新しい樹脂、ならびにヘパリン−セファロース（Ｎｏｒｄｅｍａｎ等，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９７７，１１，７９９−８８８）及びｐ−アミノベンズアミジン−アガロース（Ｈｉｘｓｏｎ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｌｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９７３，１５４，５０１）などの担体上におけるアフィニティークロマトグラフィーも使用されてきた。
【０００８】
２つの文献がヒトトロンビンの精製につき記載しており、ひとつはベンズアミジン−セファデックス上（Ｌｏｒｎｅ等，Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｔｒａｎｓｆ．Ｈｅｍｏｂｉｏｌ．，１９８９，３２，３９１−４０３）の精製であるが生成物の活性は低く（１１−２０ＮＩＨ Ｕ／ｍｌ）、他は新規ポリスチレン上の精製であるが、この生成物は牛第Ｖ因子（下記参照）を含む。
【０００９】
トロンビンを得るためには、その前駆体であるプロトロンビンの供給源のみでなく、選ぶ活性化の様式に依存して、活性化過程に含まれる十分な濃度の他の凝固因子が自由にならなければならない。プロトロンビンを活性化してトロンビンを製造することができる種々の方法が記載されてきた。Ｆｅｎｔｏｎ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９７１，２２９，２６−３２及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，２５２，３５８７−３５９８）は、樹脂上に抽出したＣｏｈｎの第３画分から、塩化カルシウム及びヒト脳から抽出した組織トロンボプラスチンを加えることによりトロンビンを製造する方法につき記載している。反応は、牛起源による第Ｖ因子の添加により促進される（Ｂｅｒｎａｍｏｎ−Ｄｊｉａｎｅ−Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，１９６８，１，２５９）。
【００１０】
へび毒から抽出した特殊な活性剤も使用することができる（Ｇｏｓｈ等，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９８０，２０，２８１）。
【００１１】
しかしこれらの種々の方法には、それが治療的用途のための大量のヒトトロンビンの製造を含む場合に大きな欠点がある。例えばヒト脳からのトロンボプラスチンは、入手が困難であり、数百リットルの血漿を処理するようになるとそれが制限因子となる。その後それを除去する高性能のシステムが得られなければ、まむしの毒を用いた活性化は、人における使用に適合させることは困難である。牛第Ｖ因子の利用は、患者に注射される残留量が重症の免疫反応の基となるので、特に危険であることがわかった。
【００１２】
それが、異種材料の添加を含まず、さらにウィルス不活性化処理を行って精製濃厚ヒトトロンビンを製造できる方法を出願人が開発した理由である。方法は簡単であり、大量の工業規模への適用と両立する。
【００１３】
原料は、ヒト血漿のＰＰＳＢ画分である（ＰＰＳＢ：プロコンベルチン又はＦＶＩＩ、プロトロンビン、スチュアート因子又は第Ｘ因子、及び抗血友病因子Ｂ又は第ＩＸ因子）（ＰＰＳＢはＰＣＣとも呼ばれる：プロトロンビン複合濃厚液）；従ってプロトロンビンの活性化に必要なすべての分子は、最初の混合物中に存在する：第ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、リン脂質及び補因子Ｖ及びＶＩＩＩ。
【００１４】
出願人が行った方法は、以下の連続６段階を含む：
ａ）凍結沈澱血漿上澄み液をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ(R)上に吸着させ、フィブリノーゲン及び、続くトロンビン活性化反応を遅くする微量の阻害剤の除去を可能にする０．２０Ｍ−０．２３Ｍ、好ましくは０．２３Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７のクエン酸塩緩衝液中で洗浄する。その後塩化ナトリウム濃度を０．５０Ｍに増加させることにより、ＰＰＳＢを溶離する。
【００１５】
ｂ）最終濃度５−１０ｍＭ、好ましくは７ｍＭの塩化カルシウムを加えることによりトロンビン生産のためのプロトロンビンの活性化を開始する。（過剰のＣａＣｌ2は、活性化反応を阻害することが観察された）。この段階には、滞留時間の短いインキュベーション期間、及びそれに続く、より低温における比較的長い第２のインキュベーションが含まれる。
【００１６】
従って混合物は、最初に３７℃で２時間インキュベートする。この処理だけでＰＰＳＢ１ｍｌ当たり３００−３５０ＮＩＨ Ｕのトロンビンの生成を可能にする（ＮＩＨ Ｕ：国立健康研究所−ＵＳＡにより定義された単位）。この温度でもっと長くインキュベートしても結果は向上しない。
【００１７】
その後２４℃で少なくとも１６時間インキュベートを続け、これにより７００−１０００ＮＩＨ Ｕのトロンビン／１ｍｌのＰＰＳＢを得ることができる。
【００１８】
ｃ）このようにして石灰化した混合物をそのまま、溶剤−界面活性剤を用いて、特に０．３％ ＴｎＢｐ／１％ Ｔｗｅｅｎを加えることによりウィルス不活性化処理を行い；２４℃で少なくとも６時間、一般に終夜インキュベートを続ける。この処理をカルシウムの添加前にＰＰＳＢに対して行うと、活性化反応に必要なリン脂質などの因子が除去されるので、トロンビンを活性化した後にこの処理を行うことが重要であることに注意するべきである。
【００１９】
ｄ）その後１段階のイオンクロマトグラフィー、特に強力な陽イオン交換剤上のクロマトグラフィーを用いてトロンビンを精製する。ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースマトリックス、例えばＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ(R)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により形成した硬質ゲルを用いるのが好ましい。クロマトグラフィーは、４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１Ｍの塩化ナトリウムを含む培地中、ｐＨ６．５で行った。ナトリウムグルコネートは、トロンビンの生物活性に対して非常に有益な保護効果を持つ。
【００２０】
トロンビンをカラムに吸着させた後、１５０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０４ＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが６．５の培地中でカラムを洗浄する
トロンビンの溶離条件を調節し、特に塩化ナトリウム濃度を０．２Ｍに、及びナトリウムグルコネート濃度を１５０ｍＭに増加させることにより、狭いクロマトグラフィーピークを得る。
【００２１】
ナトリウムグルコネート塩基媒体を用いると、さらに透析段階を避けることができるという利点があり、透析段階は従来のリン酸塩緩衝液を用いた場合には必須である。
【００２２】
ｅ）クロマトグラフィーカラムから溶離させた後、グルコネート緩衝液中のトロンビンの溶液に、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭのＣａＣｌ2を含む安定剤の混合物を加える。これらの安定剤の役割は、以下の段階で特に重要である。
【００２３】
ｆ）その後トロンビン調剤を、好ましくは超遠心により濃縮し、後の治療的用途の目的に合わせた体積のアリコートとし、凍結乾燥する。
【００２４】
安定剤としてアルブミンの存在は、濃縮段階で必須であることがわかった。
【００２５】
サッカロースは、調べた他のすべての糖及びアミノ酸より好ましく、溶液を１−５ｍｌの体積のアリコートとする場合に非常に長時間かかる分配の間に、液体の状態の濃厚液に対して非常に重要な安定化効果を有する。
【００２６】
ＣａＣｌ2及びサッカロースの存在は、凍結乾燥の間の安定化のために非常に重要である。
【００２７】
本発明の方法は、記載のある他の方法（特に上記のＬｏｒｎｅ等及びＦｉｓｃｈｅｒ等）と明確に区別されるいくつかの特徴を呈し、最終生成物に純度及び非常に高い比活性という顕著な利点を与える。
【００２８】
これらの特徴をまとめると以下である：
−フィブリノーゲン及び阻害剤を除去した予備洗浄ＰＰＳＢ画分の使用；
−再石灰化条件の選択：塩化カルシウム濃度及び２段階の連続インキュベーションの温度；
−操作の安全のためには望ましく思えるが、この段階で行うとトロンビン活性化反応に必要なリン脂質を変性させてしまうＰＰＳＢに対して行うのではなく、トロンビン活性化段階と精製段階の間に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理；
−強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィー及びこの段階におけるナトリウムグルコネートを含む特殊な保護媒体の利用；
−最後の３操作：濃縮、分配及び凍結乾燥の間その活性を保護する、最終生成物のための安定剤の混合物の選択。
【００２９】
結局、本発明の目的は、ＣａＣｌ2の添加によりあらかじめ再石灰化した血漿のＰＰＳＢ画分のクロマトグラフィーによる精製を含み、特に塩化ナトリウムを用いた洗浄及びその後ナトリウムグルコネートの存在下における強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィーによる精製により最初のＰＰＳＢ画分を処理してフィブリノーゲン及びトロンビン活性化阻害剤を除去する段階を含む、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法の提供である。
【００３０】
本発明の他の特徴により本方法は、洗浄ＰＰＳＢ画分の再石灰化の後、クロマトグラフィーによる活性化トロンビンの精製の前に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理を含む。
【００３１】
本発明の他の特徴により本方法は、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物の、クロマトグラフィーカラムから溶離したトロンビンの溶液への添加を含む。
【００３２】
本方法の顕著な特徴は、１バッチで最高１６００万ＮＩＨ Ｕのトロンビン（ＥＰＡ ０ ３７８ ７９８に記載のような他の周知の方法を用いた場合の１５０倍以上）の生産を可能にする非常に大量の出発材料を用い、経済的に重要な他の血液−誘導生成物（血液凝固因子、アルブミン、免疫グロブリンなど）の精製と抵触しないその効率である。
【００３３】
本発明の目的は、記載の方法を用いて得られ、凝固剤活性が少なくとも５００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌと同等であり、比活性が少なくとも１０００ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質と同等であることを特徴とする、トロンビン濃厚液にも拡張される。
【００３４】
本発明の濃厚液の高い濃度及び比活性は、他の方法（前記のＬｏｒｎｅ等）により製造した活性がわずか１１−２０ＮＩＨ Ｕ／ｍｌの生成物から、本発明の濃厚液を区別するものである。
【００３５】
さらにこの凍結乾燥濃厚液は、非常に安定であり、その凝固剤活性は少なくとも１年間一定である。
【００３６】
従って本発明のトロンビン濃厚液は、人における治療的用途に完全に適応している。
【００３７】
これは、局所止血剤としてそのまま使用することができる。
【００３８】
これは又、特許出願ＥＰ−Ｏ ３０５ ２４３にて出願人により記載の、少量の第ＸＩＩＩ因子及びフィブロネクチンを含むフィブリノーゲン濃厚液に加えることにより、生物学的膠を形成するのにも使用することができる。生物学的膠の形成法は、凝固の最終段階、すなわちフィブリンネットワークの形成を再現するものである。トロンビンはフィブリノーゲンを切断してフイブリンモノマーとする。それがカルシウムイオンの存在下で第ＸＩＩＩ因子を活性化し、その因子は活性化形態で、堅くて脆さのない不溶性血餅中で溶解性のフィブリンを安定化する。従って生成物の止血力により、手術中及び後の出血を制限し、体質性又は後天性凝固不全の患者（特に凝固阻止剤を投与されている患者）の局所止血を強化することができる。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、制限するものではない。
【００４０】
実施例１
ａ）−ＰＰＳＢ画分の調製
原料は、０−３℃で解凍し、遠心することにより得た血漿凍結沈澱上澄み液であった。
【００４１】
１０００−１５００リットルの上澄み液を、生理的血清の存在下で、１リットルの上澄み液当たり１．５ｇの樹脂の割合のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０(R)に吸着させた。０．０１Ｍのクエン酸塩緩衝液中０．２３Ｍの塩化ナトリウムを用いてｐＨ７にて洗浄した後、同緩衝液中０．５０Ｍの塩化ナトリウムを用いてＰＰＳＢを溶離し、４０ｇ／ｌのタンパク質まで濃縮し、そこに２．５ｇ／ｌのリシンを加えた。その後それをｐＨ７．０にて約２９０ミリＯｓｍ／ｌの浸透圧に調節した。
【００４２】
そのようにして調製したＰＰＳＢは、約５０Ｕ／ｍｌの濃度のプロトロンビンの他に血液凝固因子Ｘ，ＩＸ及びＶＩＩをそれぞれ約４５Ｕ／ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌの濃度で含む。それは又、５−６Ｕ／ｍｌの因子Ｖｃ及びＶＩＩＩｃ、ならびにリン脂質を含み、リン脂質の存在はトロンビン生成時間（又はＴＧＴ５０）により明らかになった。
【００４３】
塩化ナトリウムを用いた洗浄により、フィブリノーゲンならびに、ＰＰＳＢ中に存在すると再石灰化反応を遅くするある種の阻害剤を除去することができた。
【００４４】
ｂ）−再石灰化条件
新しく調製した、又は解凍後の９−１１リットルのＰＰＳＢを、無菌条件下で濾過し、ビーカー又は無菌３０リットルステンレススチールタンク中でＰＰＳＢ１リットル当たり７ｍｌのＣａＣｌ2をそこに加え、３７℃の水浴中に２時間置いた。この第１段階の後、約３００ＮＩＨ Ｕ／ｌのトロンビンが得られた。
【００４５】
その後温度を２４℃に下げ、混合物をさらに１６時間この温度に保った。処理の最後に得られたトロンビンの収量は、ＰＰＳＢ１ｍｌ当たり７００−１０００ＮＩＨ Ｕであった。
【００４６】
この段階でトロンビンの比活性は、２０−４０ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００４７】
ｃ）−ウィルス不活性化
ウィルス汚染物の不活性化は、２４℃の温度で少なくとも６時間、０．３％のＴｎＢｐ及び１％のＴｗｅｅｎ８０（最終濃度）を加えることにより行った。実際は混合物をＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０媒体中に終夜放置した。
【００４８】
この段階でトロンビン活性の損失は観察されなかった。ＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０処理の最後にトロンビンの比活性は、２０−４０ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００４９】
その後混合物を、１−３０リットルの試料としてプラスチックバッグ中で−３０℃にて深冷凍結した。
【００５０】
ｄ）−トロンビン精製
この段階の目的は、ＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０、活性化血液凝固因子、及びセリンプロテアーゼにより部分的に分解されたＰＰＳＢの他のタンパク質を含む反応混合物からトロンビンを分離することである。
【００５１】
ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースマトリックスにより形成した硬質ゲルである強力な陽イオン交換ゲル、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ(R)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でクロマトグラフィーを行った。
【００５２】
不安定なトロンビンを、以下の条件下、ｐＨ６．５にてナトリウムグルコネートを用いることによりクロマトグラフィーの間保護した：解凍後、１０−１２リットルのＰＰＳＢ／トロンビン／溶剤−界面活性剤残留物をｐＨ６．５に調節し、ｐＨ６．５にて４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１ＭのＮａＣｌを含む媒体で平衡化した約１６リットルのＳ−Ｓｅｐｈａｒ／ｓｅ ＦＦ(R)のカラム上に注入した。ＰＰＳＢのタンパク質の大部分、ならびにＴｎＢＰ及びＴｗｅｅｎ８０はカラムに保持されなかった。その後ゲルを、ｐＨ６．５にて１５０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０４ＭのＮａＣｌ媒体で洗浄した。その後、同媒体に０．２０Ｍの塩化ナトリウムを加えることによりトロンビンを溶離させた。
【００５３】
カラムから溶離させた後、トロンビンを以下の安定剤の存在下で回収した：２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭの塩化カルシウム。その後生成物を遠心により濃縮し、５ｇ／ｌのアルブミン濃度及びｐＨ６．３−６．５に調節した。
【００５４】
クロマトグラフィー及び濃縮の２段階の全収率は、９０％程度であった。
【００５５】
無菌濾過の後、生物学的膠の形態でのその後の使用目的に拠り、生成物を５ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ又は０．５ｍｌの体積に分配し、凍結乾燥した。表Ｉ及びＩＩに示す通り、これらの処理の間のトロンビンの酵素活性の保持のために安定剤の存在が必要であった。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
実施例２：−生成物の性質
トロンビン濃厚液は、凍結乾燥状態であった。蒸留水中で再構成後、以下の方法でそれを評価した：
ａ）凝固剤活性
本来のアルファ−トロンビンの活性をそのフィブリノーゲン凝固剤活性により測定した。それを参照標準に対するＮＩＨ（国立健康研究所）単位で表した：ＮＩＨトロンビン、バッチＪ。
【００５８】
蒸留水中で再構成した後、０．５％のポリエチレングリコール６０００を含むＯｗｒｅｎ Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液（Ｌ’Ｈｅｍｏｓｔａｓｅ：ｍｅｔｈｏｄｅ ｄ’ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｅｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒａｔｉｑｕｅ．Ｅｄ．Ｌ’Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ Ｋ．Ｊ．ＣＡＥＮ−Ｈ．Ｊ．ＬＡＲＲＩＥＵ．Ｍ．ＳＡＭＡＭＡ．）中で、１／３００から１／９００の５段階の希釈液を調製した。ＫＣ １０ ＡＮｅｌｕｎｇ装置（ＢＡＸＴＥＲ）を用いて凝固時間を測定した。２００μｌの希釈液（標準又は試験試料）を１系列のカップ中に入れた。３７℃で１分後、１ｇ／ｌのフィブリノーゲン２００μｌを加え、ストップウォッチをスタートさせた。両対数紙に標準曲線をプロットした。試験試料の場合に得た時間を記録し、グラフ上でそのＮＩＨ Ｕ／ｍｌ比を推定した。
【００５９】
ｂ）−アミド分解活性
ＳＹＡＧＯ クロモトロンビン基質上で、供給者の指示に従ってトロンビンのアミド分解活性を決定した。それをｎｋａｔ／ｍｌで表した。ナノケタールとＮＩＨ単位の関係は、１ＮＩＨ Ｕ＝２ｎｋａｔであった。
【００６０】
発色基質上で見いだされた活性は、本来のアルファ−トロンビンの活性、ならびにそのタンパク質分解誘導体であるβ及びγトロンビンの活性に相当した。
【００６１】
ｃ）−タンパク質濃度
ビウレット法を用いてタンパク質濃度を決定した。
【００６２】
ｄ）−ポリアクリルアミド上の電気泳動
ＳＤＳ媒体中でＰｈａｓｔゲル１０／１５を用い、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＨＡＳＴ ＳＹＳＴＥＭ(R)上で電気泳動を行った。
【００６３】
ｅ）−トロンビンの存在下でフィブリノーゲン濃厚液、第ＸＩＩＩ因子及びフィブロネクチンの凝固により形成した生物学的膠の性質（ヨーロッパ特許０ ３０５ ２４３）
トロンビンの存在下で形成した生物学的膠の性質を以下のパラメーターを用いて評価した：ゲル化速度（秒）、マウス上への接着強度（ｇ／ｃｍ2）。半置換時間（秒）及び全置換（ラジアン）をレオメーターを用いて測定した。
【００６４】
トロンビン濃厚液の特性
上記の方法により測定した特性を以下の表に示す。
【００６５】
【表３】
濃厚液の凝固剤活性は、５５０ＮＩＨ Ｕの程度であった。
【００６６】
アミド分解活性は同程度、６００−７００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌであり、分解形態、β及びγ−トロンビンが高い割合で存在しないことを示す。
【００６７】
ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により、生成物の純度を評価した。ＳＤＳ媒体中で、分子量６７０００のアルブミンに対応するバンドの他に分子量３６０００のα−トロンビンに対応する唯一の主要バンドが観察された。β−メルカプトエタノールによる還元の後、より低分子量のα−トロンビンのＨ鎖に対応するバンドが現れた。約４０００ダルトンのＬ鎖は、プレートから移動して消えた。
【００６８】
再構成の後の生成物の安定性を調べた（表ＩＶ）。トロンビンは、液体状態で少なくとも２４時間安定であった。又、深冷凍結状態（表Ｖ）及び凍結乾燥状態（表ＶＩ）でも安定であった。この安定性は、ｐＨが６．５のグルコネート−サッカロース−塩化カルシウム−アルブミン媒体により保証された。
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５】
【００７１】
【表６】
【００７２】
【表７】
ヒトトロンビン又は牛トロンビンの存在下で得た生物学的膠のレオロジー特性を、従来の試験法を用いて比較した。
【００７３】
試験は、同一のフィブリノーゲン濃度で行い、それを牛又はヒトトロンビン（０６５１００１０）と混合した。各試験に使用した方法は、厳密に同一であった。装置は、ＣＡＲＲＯＭＥＤ ＣＳＬ １００ 応力制御レオメーターであった。
【００７４】
ａ）−クリープ様式における使用
ゲル化時間の測定
半置換時間ｔ１及びｔ２（全置換の５０％を得るのに必要に時間）は：
ｔ２（牛トロンビン）：１．８秒
ｔ１（ヒトトロンビン）：０．７７秒
有意な差はなかった。
【００７５】
弾性研究
２生成物は、同一の瞬間弾性を有することが見いだされた。
【００７６】
ｂ）振動様式における使用
２生成物の場合に約２５００Ｎ／ｍ2の破断点が見いだされた。
【００７７】
２つの膠の貯蔵弾性率Ｇ’は、同様に時間と共に向上した。
【００７８】
周波数の関数としての貯蔵弾性率Ｇ’は、２生成物に関して同等であった。
【００７９】
すべての結果は、生成物を使用する場合の血餅の様子、滲出及びゲル化時間に関する観察を支持していた。
【００８０】
すべての結果により、ヒトトロンビンの存在下で得た膠のレオロジー特性及び機械的性質は、現在普通に使用されている生物学的膠の成分である牛トロンビンの存在下で得たものと同一であると結論することができた。
【００８１】
実施例３ 方法のスケールアップ
実施例１に記載の方法を用いて、１０−１５リットルのＰＰＳＢの数バッチを行い、表ＶＩＩＩに示す通り同一の効率を得た。
【００８２】
続くクロマトグラフィー−濃縮段階の収率は、８９−１００％であった。
【００８３】
従って全体として方法は、１０００万ＮＩＨ単位以上のトロンビンを含む、良く標準化されたバッチの生産を可能にする。
【００８４】
【表８】
本発明の主たる特徴及び態様は、以下の通りである。
【００８５】
１．治療的用途のための高活性ヒトトロンビン濃厚液の製造法において、前もってＣａＣｌ2を加えて再石灰化した血漿のＰＰＳＢ画分のクロマトグラフィー精製を含み、最初のＰＰＳＢ画分を塩化ナトリウムで洗浄する前処理を行ってフィブリノーゲン及びプロトロンビン活性化阻害剤を除去し、強力な陽イオン交換ゲル中、ナトリウムグルコネートの存在下でクロマトグラフィー精製を行うことを特徴とする方法。
【００８６】
２．第１項に記載の方法において、ウィルス不活性化処理を含み、該処理が再石灰化の後、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行われ、溶剤−界面活性剤処理を含むことを特徴とする方法。
【００８７】
３．第１又は２項に記載の方法において、クロマトグラフィーゲルから溶離したトロンビンを、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物により安定化することを特徴とする方法。
【００８８】
４．第１項に記載の方法において、クエン酸塩緩衝液中０．２０Ｍ−０．２３Ｍの塩化ナトリウムを用いてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのカラム上で洗浄段階を行った後、塩化ナトリウム濃度を０．５Ｍに増加されることによりＰＰＳＢを溶離させることを特徴とする方法。
【００８９】
５．第１−４項のいずれかに記載の方法において、ＣａＣｌ2を最終濃度５−１０ｍＭで加えることによりＰＰＳＢを再石灰化し、最初に短期間のインキュベーションを行い、その後より低温で実質的に長期間の第２のインキュベーションを行うことを特徴とする方法。
【００９０】
６．第１−５項のいずれかに記載の方法において、ＣａＣｌ2中の第１期インキュベーションを３７℃で２時間行い、第２期インキュベーションを２４℃で１６時間行うことを特徴とする方法。
【００９１】
７．第１−６項のいずれかに記載の方法において、ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースのゲル上、４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５の媒体中でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする方法。
【００９２】
８．第１−７項のいずれかに記載の方法において、塩化ナトリウム濃度を０．２Ｍに、及びナトリウムグルコネートの濃度を１５０ｍＭに増加させることによりクロマトグラフィーからトロンビンを溶離させることを特徴とする方法。
【００９３】
９．第１−８項のいずれかに記載の方法において、溶離トロンビンを、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭのＣａＣｌ2を含む混合物の添加により安定化することを特徴とする方法。
【００９４】
１０．第１−９項のいずれかに記載の方法において、トロンビンの安定化溶液を濃縮し、その後の治療的用途に合わせた体積のアリコートに分配し、凍結乾燥することを特徴とする方法。
【００９５】
１１．第１−１０項のいずれかに記載の方法を用いて得たヒトトロンビン濃厚液において、凝固剤活性が少なくとも５００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌと同等であり、比活性が少なくとも１０００ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であることを特徴とする濃厚液。
【００９６】
１２．第１１項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、局所的止血薬として調製ずみの治療用組成物の製造における利用。
【００９７】
１３．フィブリノーゲン濃厚液と組み合わせて生物学的膠を形成した、第１１項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、治療的用途における利用。
本発明は、ヒト血漿の画分から工業規模で精製する、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法に関する。
【０００２】
トロンビンは、その不活性な前駆体であるプロトロンビンの活性化により血流中で生成したセリンプロテアーゼである。これは、凝固過程で基本的な役割を果す：これはフィブリノーゲンを切断してフィブリンモノマーとし、タンパク質分解的切断により第ＸＩＩＩ因子を活性化し、これがフィブリンネットワークを安定化する。
【０００３】
トロンビンは、他の生理学的過程でも役割を果している：これは分泌及び血小板凝集反応を開始し、白栓の形成を容易にする。これは又、補体系のタンパク質を活性化する。それは繊維芽細胞に対してマイトジェン効果を持ち、損傷を受けた血管の治癒を促進する。
【０００４】
これらの種々の性質の結果としてトロンビンは、局所的止血剤としての治療的用途を持つ。現在、馬又は牛の動物トロンビンが、そのような臨床的用途で用いられている。これらの調剤は必ずしも完全に精製されておらず、その適用が異種タンパク質の与え過ぎによる免疫応答の原因となり得る。さらに牛トロンビンの使用は、最近診断されまだ抑制の困難な伝染病、例えば海綿状牛脳炎などを伝染させる危険を持っている。
【０００５】
多くの酵素と同様にトロンビンの精製は、その全酵素活性の維持に関して問題がある。実際本来のα−トロンビンは一般に不安定で、自己分解又は限定加水分解によりβ−及びγ−トロンビンなどの誘導体を与え、これらはフィブリノーゲンに対する凝固活性の実質的部分を失っている。
【０００６】
周知の精製法は、特に牛トロンビンに適用される：ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィーが含まれ（Ｙｉｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６８，２４３，１１２）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ １００(R)上での濾過を伴うことができる（Ｂａｕｇｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６７，２４２，５２５２−５２５９）；ある方法を用いて、ホスホセルロース上で（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，５０４９）及び数種類のイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることにより（Ｂａｔｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，４８５７）β及びγ型を分離することができる。
【０００７】
スルホエチル又はスルホプロピルセファデックス（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，１９７１，１０，２５０１）などの新しい樹脂、ならびにヘパリン−セファロース（Ｎｏｒｄｅｍａｎ等，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９７７，１１，７９９−８８８）及びｐ−アミノベンズアミジン−アガロース（Ｈｉｘｓｏｎ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｌｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９７３，１５４，５０１）などの担体上におけるアフィニティークロマトグラフィーも使用されてきた。
【０００８】
２つの文献がヒトトロンビンの精製につき記載しており、ひとつはベンズアミジン−セファデックス上（Ｌｏｒｎｅ等，Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｔｒａｎｓｆ．Ｈｅｍｏｂｉｏｌ．，１９８９，３２，３９１−４０３）の精製であるが生成物の活性は低く（１１−２０ＮＩＨ Ｕ／ｍｌ）、他は新規ポリスチレン上の精製であるが、この生成物は牛第Ｖ因子（下記参照）を含む。
【０００９】
トロンビンを得るためには、その前駆体であるプロトロンビンの供給源のみでなく、選ぶ活性化の様式に依存して、活性化過程に含まれる十分な濃度の他の凝固因子が自由にならなければならない。プロトロンビンを活性化してトロンビンを製造することができる種々の方法が記載されてきた。Ｆｅｎｔｏｎ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９７１，２２９，２６−３２及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，２５２，３５８７−３５９８）は、樹脂上に抽出したＣｏｈｎの第３画分から、塩化カルシウム及びヒト脳から抽出した組織トロンボプラスチンを加えることによりトロンビンを製造する方法につき記載している。反応は、牛起源による第Ｖ因子の添加により促進される（Ｂｅｒｎａｍｏｎ−Ｄｊｉａｎｅ−Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，１９６８，１，２５９）。
【００１０】
へび毒から抽出した特殊な活性剤も使用することができる（Ｇｏｓｈ等，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９８０，２０，２８１）。
【００１１】
しかしこれらの種々の方法には、それが治療的用途のための大量のヒトトロンビンの製造を含む場合に大きな欠点がある。例えばヒト脳からのトロンボプラスチンは、入手が困難であり、数百リットルの血漿を処理するようになるとそれが制限因子となる。その後それを除去する高性能のシステムが得られなければ、まむしの毒を用いた活性化は、人における使用に適合させることは困難である。牛第Ｖ因子の利用は、患者に注射される残留量が重症の免疫反応の基となるので、特に危険であることがわかった。
【００１２】
それが、異種材料の添加を含まず、さらにウィルス不活性化処理を行って精製濃厚ヒトトロンビンを製造できる方法を出願人が開発した理由である。方法は簡単であり、大量の工業規模への適用と両立する。
【００１３】
原料は、ヒト血漿のＰＰＳＢ画分である（ＰＰＳＢ：プロコンベルチン又はＦＶＩＩ、プロトロンビン、スチュアート因子又は第Ｘ因子、及び抗血友病因子Ｂ又は第ＩＸ因子）（ＰＰＳＢはＰＣＣとも呼ばれる：プロトロンビン複合濃厚液）；従ってプロトロンビンの活性化に必要なすべての分子は、最初の混合物中に存在する：第ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、リン脂質及び補因子Ｖ及びＶＩＩＩ。
【００１４】
出願人が行った方法は、以下の連続６段階を含む：
ａ）凍結沈澱血漿上澄み液をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ(R)上に吸着させ、フィブリノーゲン及び、続くトロンビン活性化反応を遅くする微量の阻害剤の除去を可能にする０．２０Ｍ−０．２３Ｍ、好ましくは０．２３Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７のクエン酸塩緩衝液中で洗浄する。その後塩化ナトリウム濃度を０．５０Ｍに増加させることにより、ＰＰＳＢを溶離する。
【００１５】
ｂ）最終濃度５−１０ｍＭ、好ましくは７ｍＭの塩化カルシウムを加えることによりトロンビン生産のためのプロトロンビンの活性化を開始する。（過剰のＣａＣｌ2は、活性化反応を阻害することが観察された）。この段階には、滞留時間の短いインキュベーション期間、及びそれに続く、より低温における比較的長い第２のインキュベーションが含まれる。
【００１６】
従って混合物は、最初に３７℃で２時間インキュベートする。この処理だけでＰＰＳＢ１ｍｌ当たり３００−３５０ＮＩＨ Ｕのトロンビンの生成を可能にする（ＮＩＨ Ｕ：国立健康研究所−ＵＳＡにより定義された単位）。この温度でもっと長くインキュベートしても結果は向上しない。
【００１７】
その後２４℃で少なくとも１６時間インキュベートを続け、これにより７００−１０００ＮＩＨ Ｕのトロンビン／１ｍｌのＰＰＳＢを得ることができる。
【００１８】
ｃ）このようにして石灰化した混合物をそのまま、溶剤−界面活性剤を用いて、特に０．３％ ＴｎＢｐ／１％ Ｔｗｅｅｎを加えることによりウィルス不活性化処理を行い；２４℃で少なくとも６時間、一般に終夜インキュベートを続ける。この処理をカルシウムの添加前にＰＰＳＢに対して行うと、活性化反応に必要なリン脂質などの因子が除去されるので、トロンビンを活性化した後にこの処理を行うことが重要であることに注意するべきである。
【００１９】
ｄ）その後１段階のイオンクロマトグラフィー、特に強力な陽イオン交換剤上のクロマトグラフィーを用いてトロンビンを精製する。ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースマトリックス、例えばＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ(R)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により形成した硬質ゲルを用いるのが好ましい。クロマトグラフィーは、４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１Ｍの塩化ナトリウムを含む培地中、ｐＨ６．５で行った。ナトリウムグルコネートは、トロンビンの生物活性に対して非常に有益な保護効果を持つ。
【００２０】
トロンビンをカラムに吸着させた後、１５０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０４ＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが６．５の培地中でカラムを洗浄する
トロンビンの溶離条件を調節し、特に塩化ナトリウム濃度を０．２Ｍに、及びナトリウムグルコネート濃度を１５０ｍＭに増加させることにより、狭いクロマトグラフィーピークを得る。
【００２１】
ナトリウムグルコネート塩基媒体を用いると、さらに透析段階を避けることができるという利点があり、透析段階は従来のリン酸塩緩衝液を用いた場合には必須である。
【００２２】
ｅ）クロマトグラフィーカラムから溶離させた後、グルコネート緩衝液中のトロンビンの溶液に、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭのＣａＣｌ2を含む安定剤の混合物を加える。これらの安定剤の役割は、以下の段階で特に重要である。
【００２３】
ｆ）その後トロンビン調剤を、好ましくは超遠心により濃縮し、後の治療的用途の目的に合わせた体積のアリコートとし、凍結乾燥する。
【００２４】
安定剤としてアルブミンの存在は、濃縮段階で必須であることがわかった。
【００２５】
サッカロースは、調べた他のすべての糖及びアミノ酸より好ましく、溶液を１−５ｍｌの体積のアリコートとする場合に非常に長時間かかる分配の間に、液体の状態の濃厚液に対して非常に重要な安定化効果を有する。
【００２６】
ＣａＣｌ2及びサッカロースの存在は、凍結乾燥の間の安定化のために非常に重要である。
【００２７】
本発明の方法は、記載のある他の方法（特に上記のＬｏｒｎｅ等及びＦｉｓｃｈｅｒ等）と明確に区別されるいくつかの特徴を呈し、最終生成物に純度及び非常に高い比活性という顕著な利点を与える。
【００２８】
これらの特徴をまとめると以下である：
−フィブリノーゲン及び阻害剤を除去した予備洗浄ＰＰＳＢ画分の使用；
−再石灰化条件の選択：塩化カルシウム濃度及び２段階の連続インキュベーションの温度；
−操作の安全のためには望ましく思えるが、この段階で行うとトロンビン活性化反応に必要なリン脂質を変性させてしまうＰＰＳＢに対して行うのではなく、トロンビン活性化段階と精製段階の間に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理；
−強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィー及びこの段階におけるナトリウムグルコネートを含む特殊な保護媒体の利用；
−最後の３操作：濃縮、分配及び凍結乾燥の間その活性を保護する、最終生成物のための安定剤の混合物の選択。
【００２９】
結局、本発明の目的は、ＣａＣｌ2の添加によりあらかじめ再石灰化した血漿のＰＰＳＢ画分のクロマトグラフィーによる精製を含み、特に塩化ナトリウムを用いた洗浄及びその後ナトリウムグルコネートの存在下における強力な陽イオン交換ゲル上のクロマトグラフィーによる精製により最初のＰＰＳＢ画分を処理してフィブリノーゲン及びトロンビン活性化阻害剤を除去する段階を含む、治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法の提供である。
【００３０】
本発明の他の特徴により本方法は、洗浄ＰＰＳＢ画分の再石灰化の後、クロマトグラフィーによる活性化トロンビンの精製の前に行う、溶剤−界面活性剤を用いたウィルス不活性化処理を含む。
【００３１】
本発明の他の特徴により本方法は、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物の、クロマトグラフィーカラムから溶離したトロンビンの溶液への添加を含む。
【００３２】
本方法の顕著な特徴は、１バッチで最高１６００万ＮＩＨ Ｕのトロンビン（ＥＰＡ ０ ３７８ ７９８に記載のような他の周知の方法を用いた場合の１５０倍以上）の生産を可能にする非常に大量の出発材料を用い、経済的に重要な他の血液−誘導生成物（血液凝固因子、アルブミン、免疫グロブリンなど）の精製と抵触しないその効率である。
【００３３】
本発明の目的は、記載の方法を用いて得られ、凝固剤活性が少なくとも５００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌと同等であり、比活性が少なくとも１０００ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質と同等であることを特徴とする、トロンビン濃厚液にも拡張される。
【００３４】
本発明の濃厚液の高い濃度及び比活性は、他の方法（前記のＬｏｒｎｅ等）により製造した活性がわずか１１−２０ＮＩＨ Ｕ／ｍｌの生成物から、本発明の濃厚液を区別するものである。
【００３５】
さらにこの凍結乾燥濃厚液は、非常に安定であり、その凝固剤活性は少なくとも１年間一定である。
【００３６】
従って本発明のトロンビン濃厚液は、人における治療的用途に完全に適応している。
【００３７】
これは、局所止血剤としてそのまま使用することができる。
【００３８】
これは又、特許出願ＥＰ−Ｏ ３０５ ２４３にて出願人により記載の、少量の第ＸＩＩＩ因子及びフィブロネクチンを含むフィブリノーゲン濃厚液に加えることにより、生物学的膠を形成するのにも使用することができる。生物学的膠の形成法は、凝固の最終段階、すなわちフィブリンネットワークの形成を再現するものである。トロンビンはフィブリノーゲンを切断してフイブリンモノマーとする。それがカルシウムイオンの存在下で第ＸＩＩＩ因子を活性化し、その因子は活性化形態で、堅くて脆さのない不溶性血餅中で溶解性のフィブリンを安定化する。従って生成物の止血力により、手術中及び後の出血を制限し、体質性又は後天性凝固不全の患者（特に凝固阻止剤を投与されている患者）の局所止血を強化することができる。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、制限するものではない。
【００４０】
実施例１
ａ）−ＰＰＳＢ画分の調製
原料は、０−３℃で解凍し、遠心することにより得た血漿凍結沈澱上澄み液であった。
【００４１】
１０００−１５００リットルの上澄み液を、生理的血清の存在下で、１リットルの上澄み液当たり１．５ｇの樹脂の割合のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０(R)に吸着させた。０．０１Ｍのクエン酸塩緩衝液中０．２３Ｍの塩化ナトリウムを用いてｐＨ７にて洗浄した後、同緩衝液中０．５０Ｍの塩化ナトリウムを用いてＰＰＳＢを溶離し、４０ｇ／ｌのタンパク質まで濃縮し、そこに２．５ｇ／ｌのリシンを加えた。その後それをｐＨ７．０にて約２９０ミリＯｓｍ／ｌの浸透圧に調節した。
【００４２】
そのようにして調製したＰＰＳＢは、約５０Ｕ／ｍｌの濃度のプロトロンビンの他に血液凝固因子Ｘ，ＩＸ及びＶＩＩをそれぞれ約４５Ｕ／ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌの濃度で含む。それは又、５−６Ｕ／ｍｌの因子Ｖｃ及びＶＩＩＩｃ、ならびにリン脂質を含み、リン脂質の存在はトロンビン生成時間（又はＴＧＴ５０）により明らかになった。
【００４３】
塩化ナトリウムを用いた洗浄により、フィブリノーゲンならびに、ＰＰＳＢ中に存在すると再石灰化反応を遅くするある種の阻害剤を除去することができた。
【００４４】
ｂ）−再石灰化条件
新しく調製した、又は解凍後の９−１１リットルのＰＰＳＢを、無菌条件下で濾過し、ビーカー又は無菌３０リットルステンレススチールタンク中でＰＰＳＢ１リットル当たり７ｍｌのＣａＣｌ2をそこに加え、３７℃の水浴中に２時間置いた。この第１段階の後、約３００ＮＩＨ Ｕ／ｌのトロンビンが得られた。
【００４５】
その後温度を２４℃に下げ、混合物をさらに１６時間この温度に保った。処理の最後に得られたトロンビンの収量は、ＰＰＳＢ１ｍｌ当たり７００−１０００ＮＩＨ Ｕであった。
【００４６】
この段階でトロンビンの比活性は、２０−４０ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００４７】
ｃ）−ウィルス不活性化
ウィルス汚染物の不活性化は、２４℃の温度で少なくとも６時間、０．３％のＴｎＢｐ及び１％のＴｗｅｅｎ８０（最終濃度）を加えることにより行った。実際は混合物をＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０媒体中に終夜放置した。
【００４８】
この段階でトロンビン活性の損失は観察されなかった。ＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０処理の最後にトロンビンの比活性は、２０−４０ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００４９】
その後混合物を、１−３０リットルの試料としてプラスチックバッグ中で−３０℃にて深冷凍結した。
【００５０】
ｄ）−トロンビン精製
この段階の目的は、ＴｎＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０、活性化血液凝固因子、及びセリンプロテアーゼにより部分的に分解されたＰＰＳＢの他のタンパク質を含む反応混合物からトロンビンを分離することである。
【００５１】
ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースマトリックスにより形成した硬質ゲルである強力な陽イオン交換ゲル、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ(R)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でクロマトグラフィーを行った。
【００５２】
不安定なトロンビンを、以下の条件下、ｐＨ６．５にてナトリウムグルコネートを用いることによりクロマトグラフィーの間保護した：解凍後、１０−１２リットルのＰＰＳＢ／トロンビン／溶剤−界面活性剤残留物をｐＨ６．５に調節し、ｐＨ６．５にて４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１ＭのＮａＣｌを含む媒体で平衡化した約１６リットルのＳ−Ｓｅｐｈａｒ／ｓｅ ＦＦ(R)のカラム上に注入した。ＰＰＳＢのタンパク質の大部分、ならびにＴｎＢＰ及びＴｗｅｅｎ８０はカラムに保持されなかった。その後ゲルを、ｐＨ６．５にて１５０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０４ＭのＮａＣｌ媒体で洗浄した。その後、同媒体に０．２０Ｍの塩化ナトリウムを加えることによりトロンビンを溶離させた。
【００５３】
カラムから溶離させた後、トロンビンを以下の安定剤の存在下で回収した：２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭの塩化カルシウム。その後生成物を遠心により濃縮し、５ｇ／ｌのアルブミン濃度及びｐＨ６．３−６．５に調節した。
【００５４】
クロマトグラフィー及び濃縮の２段階の全収率は、９０％程度であった。
【００５５】
無菌濾過の後、生物学的膠の形態でのその後の使用目的に拠り、生成物を５ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ又は０．５ｍｌの体積に分配し、凍結乾燥した。表Ｉ及びＩＩに示す通り、これらの処理の間のトロンビンの酵素活性の保持のために安定剤の存在が必要であった。
【００５６】
【表１】
【表２】
トロンビン濃厚液は、凍結乾燥状態であった。蒸留水中で再構成後、以下の方法でそれを評価した：
ａ）凝固剤活性
本来のアルファ−トロンビンの活性をそのフィブリノーゲン凝固剤活性により測定した。それを参照標準に対するＮＩＨ（国立健康研究所）単位で表した：ＮＩＨトロンビン、バッチＪ。
【００５８】
蒸留水中で再構成した後、０．５％のポリエチレングリコール６０００を含むＯｗｒｅｎ Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液（Ｌ’Ｈｅｍｏｓｔａｓｅ：ｍｅｔｈｏｄｅ ｄ’ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｅｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒａｔｉｑｕｅ．Ｅｄ．Ｌ’Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ Ｋ．Ｊ．ＣＡＥＮ−Ｈ．Ｊ．ＬＡＲＲＩＥＵ．Ｍ．ＳＡＭＡＭＡ．）中で、１／３００から１／９００の５段階の希釈液を調製した。ＫＣ １０ ＡＮｅｌｕｎｇ装置（ＢＡＸＴＥＲ）を用いて凝固時間を測定した。２００μｌの希釈液（標準又は試験試料）を１系列のカップ中に入れた。３７℃で１分後、１ｇ／ｌのフィブリノーゲン２００μｌを加え、ストップウォッチをスタートさせた。両対数紙に標準曲線をプロットした。試験試料の場合に得た時間を記録し、グラフ上でそのＮＩＨ Ｕ／ｍｌ比を推定した。
【００５９】
ｂ）−アミド分解活性
ＳＹＡＧＯ クロモトロンビン基質上で、供給者の指示に従ってトロンビンのアミド分解活性を決定した。それをｎｋａｔ／ｍｌで表した。ナノケタールとＮＩＨ単位の関係は、１ＮＩＨ Ｕ＝２ｎｋａｔであった。
【００６０】
発色基質上で見いだされた活性は、本来のアルファ−トロンビンの活性、ならびにそのタンパク質分解誘導体であるβ及びγトロンビンの活性に相当した。
【００６１】
ｃ）−タンパク質濃度
ビウレット法を用いてタンパク質濃度を決定した。
【００６２】
ｄ）−ポリアクリルアミド上の電気泳動
ＳＤＳ媒体中でＰｈａｓｔゲル１０／１５を用い、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＨＡＳＴ ＳＹＳＴＥＭ(R)上で電気泳動を行った。
【００６３】
ｅ）−トロンビンの存在下でフィブリノーゲン濃厚液、第ＸＩＩＩ因子及びフィブロネクチンの凝固により形成した生物学的膠の性質（ヨーロッパ特許０ ３０５ ２４３）
トロンビンの存在下で形成した生物学的膠の性質を以下のパラメーターを用いて評価した：ゲル化速度（秒）、マウス上への接着強度（ｇ／ｃｍ2）。半置換時間（秒）及び全置換（ラジアン）をレオメーターを用いて測定した。
【００６４】
トロンビン濃厚液の特性
上記の方法により測定した特性を以下の表に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
アミド分解活性は同程度、６００−７００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌであり、分解形態、β及びγ−トロンビンが高い割合で存在しないことを示す。
【００６７】
ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により、生成物の純度を評価した。ＳＤＳ媒体中で、分子量６７０００のアルブミンに対応するバンドの他に分子量３６０００のα−トロンビンに対応する唯一の主要バンドが観察された。β−メルカプトエタノールによる還元の後、より低分子量のα−トロンビンのＨ鎖に対応するバンドが現れた。約４０００ダルトンのＬ鎖は、プレートから移動して消えた。
【００６８】
再構成の後の生成物の安定性を調べた（表ＩＶ）。トロンビンは、液体状態で少なくとも２４時間安定であった。又、深冷凍結状態（表Ｖ）及び凍結乾燥状態（表ＶＩ）でも安定であった。この安定性は、ｐＨが６．５のグルコネート−サッカロース−塩化カルシウム−アルブミン媒体により保証された。
【００６９】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【００７３】
試験は、同一のフィブリノーゲン濃度で行い、それを牛又はヒトトロンビン（０６５１００１０）と混合した。各試験に使用した方法は、厳密に同一であった。装置は、ＣＡＲＲＯＭＥＤ ＣＳＬ １００ 応力制御レオメーターであった。
【００７４】
ａ）−クリープ様式における使用
ゲル化時間の測定
半置換時間ｔ１及びｔ２（全置換の５０％を得るのに必要に時間）は：
ｔ２（牛トロンビン）：１．８秒
ｔ１（ヒトトロンビン）：０．７７秒
有意な差はなかった。
【００７５】
弾性研究
２生成物は、同一の瞬間弾性を有することが見いだされた。
【００７６】
ｂ）振動様式における使用
２生成物の場合に約２５００Ｎ／ｍ2の破断点が見いだされた。
【００７７】
２つの膠の貯蔵弾性率Ｇ’は、同様に時間と共に向上した。
【００７８】
周波数の関数としての貯蔵弾性率Ｇ’は、２生成物に関して同等であった。
【００７９】
すべての結果は、生成物を使用する場合の血餅の様子、滲出及びゲル化時間に関する観察を支持していた。
【００８０】
すべての結果により、ヒトトロンビンの存在下で得た膠のレオロジー特性及び機械的性質は、現在普通に使用されている生物学的膠の成分である牛トロンビンの存在下で得たものと同一であると結論することができた。
【００８１】
実施例３ 方法のスケールアップ
実施例１に記載の方法を用いて、１０−１５リットルのＰＰＳＢの数バッチを行い、表ＶＩＩＩに示す通り同一の効率を得た。
【００８２】
続くクロマトグラフィー−濃縮段階の収率は、８９−１００％であった。
【００８３】
従って全体として方法は、１０００万ＮＩＨ単位以上のトロンビンを含む、良く標準化されたバッチの生産を可能にする。
【００８４】
【表８】
【００８５】
１．治療的用途のための高活性ヒトトロンビン濃厚液の製造法において、前もってＣａＣｌ2を加えて再石灰化した血漿のＰＰＳＢ画分のクロマトグラフィー精製を含み、最初のＰＰＳＢ画分を塩化ナトリウムで洗浄する前処理を行ってフィブリノーゲン及びプロトロンビン活性化阻害剤を除去し、強力な陽イオン交換ゲル中、ナトリウムグルコネートの存在下でクロマトグラフィー精製を行うことを特徴とする方法。
【００８６】
２．第１項に記載の方法において、ウィルス不活性化処理を含み、該処理が再石灰化の後、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行われ、溶剤−界面活性剤処理を含むことを特徴とする方法。
【００８７】
３．第１又は２項に記載の方法において、クロマトグラフィーゲルから溶離したトロンビンを、アルブミン、サッカロース及び塩化カルシウムを含む安定剤の混合物により安定化することを特徴とする方法。
【００８８】
４．第１項に記載の方法において、クエン酸塩緩衝液中０．２０Ｍ−０．２３Ｍの塩化ナトリウムを用いてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのカラム上で洗浄段階を行った後、塩化ナトリウム濃度を０．５Ｍに増加されることによりＰＰＳＢを溶離させることを特徴とする方法。
【００８９】
５．第１−４項のいずれかに記載の方法において、ＣａＣｌ2を最終濃度５−１０ｍＭで加えることによりＰＰＳＢを再石灰化し、最初に短期間のインキュベーションを行い、その後より低温で実質的に長期間の第２のインキュベーションを行うことを特徴とする方法。
【００９０】
６．第１−５項のいずれかに記載の方法において、ＣａＣｌ2中の第１期インキュベーションを３７℃で２時間行い、第２期インキュベーションを２４℃で１６時間行うことを特徴とする方法。
【００９１】
７．第１−６項のいずれかに記載の方法において、ＣＨ2−ＳＯ3基をグラフトしたアガロースのゲル上、４０ｍＭのナトリウムグルコネート及び０．０１Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５の媒体中でクロマトグラフィーを行うことを特徴とする方法。
【００９２】
８．第１−７項のいずれかに記載の方法において、塩化ナトリウム濃度を０．２Ｍに、及びナトリウムグルコネートの濃度を１５０ｍＭに増加させることによりクロマトグラフィーからトロンビンを溶離させることを特徴とする方法。
【００９３】
９．第１−８項のいずれかに記載の方法において、溶離トロンビンを、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロース及び６０ｍＭのＣａＣｌ2を含む混合物の添加により安定化することを特徴とする方法。
【００９４】
１０．第１−９項のいずれかに記載の方法において、トロンビンの安定化溶液を濃縮し、その後の治療的用途に合わせた体積のアリコートに分配し、凍結乾燥することを特徴とする方法。
【００９５】
１１．第１−１０項のいずれかに記載の方法を用いて得たヒトトロンビン濃厚液において、凝固剤活性が少なくとも５００ＮＩＨ Ｕ／ｍｌと同等であり、比活性が少なくとも１０００ＮＩＨ Ｕ／ｍｇタンパク質であることを特徴とする濃厚液。
【００９６】
１２．第１１項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、局所的止血薬として調製ずみの治療用組成物の製造における利用。
【００９７】
１３．フィブリノーゲン濃厚液と組み合わせて生物学的膠を形成した、第１１項に記載のヒトトロンビン濃厚液の、治療的用途における利用。
Claims (1)
- （ｉ）第ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子、プロトロンビン、リン脂質及び補因子Ｖ及びＶＩＩＩを含んでなる、凍結沈殿血漿上澄み液の最初のＰＰＳＢ画分を、クエン酸緩衝液中０．２Ｍから０．２３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄する前処理を行って、フィブリノーゲン及びプロトロンビン活性化阻害剤をそれらがＰＰＳＢ中に存在するときには除去し、（ｉｉ）該前処理を行ったＰＰＳＢ画分を、最終濃度５−１０ｍＭのＣａＣｌ2を加えて最初に３７℃で２時間インキュベーションし続いて２４℃で少なくとも１６時間インキュベーションすることにより再石灰化し、そして、（ｉｉｉ）該再石灰化したＰＰＳＢ画分を、強力な陽イオン交換ゲルに通して、ナトリウムグルコネート濃度を１５０ｍＭに増加させ及びＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに増加させることによってトロンビンが溶出される、１回のクロマトグラフィー精製にかけること、の工程を含むことを特徴とする、治療的用途のための高活性ヒトトロンビン濃厚液の製造法。
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| DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
| US5795780A (en) * | 1993-06-23 | 1998-08-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of use of autologous thrombin blood fraction in a cell culture with keratinocytes |
| JPH07308190A (ja) * | 1994-05-18 | 1995-11-28 | Green Cross Corp:The | トロンビンの製造方法 |
| US5506127A (en) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Proba; Zbigniew | Therapeutic grade thrombin produced by chromatography |
| US5585007A (en) * | 1994-12-07 | 1996-12-17 | Plasmaseal Corporation | Plasma concentrate and tissue sealant methods and apparatuses for making concentrated plasma and/or tissue sealant |
| GB9503750D0 (en) * | 1995-02-24 | 1995-04-12 | Common Services Agency | Thrombin preparation |
| US5733545A (en) * | 1995-03-03 | 1998-03-31 | Quantic Biomedical Partners | Platelet glue wound sealant |
| US5643192A (en) * | 1995-04-06 | 1997-07-01 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use |
| US5677162A (en) * | 1995-05-01 | 1997-10-14 | New York Blood Center, Inc. | Method for activating prothrombin to thrombin |
| AU712934B2 (en) | 1995-06-06 | 1999-11-18 | Interpore International Inc. | Device and method for concentrating plasma |
| WO2000062828A1 (en) | 1996-04-30 | 2000-10-26 | Medtronic, Inc. | Autologous fibrin sealant and method for making the same |
| JP3944267B2 (ja) * | 1996-08-09 | 2007-07-11 | 財団法人化学及血清療法研究所 | プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法 |
| US5981254A (en) * | 1997-10-30 | 1999-11-09 | Haemacure Corporation | Process for producing thrombin from plasma |
| US6274090B1 (en) | 1998-08-05 | 2001-08-14 | Thermogenesis Corp. | Apparatus and method of preparation of stable, long term thrombin from plasma and thrombin formed thereby |
| AU3862900A (en) | 1999-03-01 | 2000-09-21 | Uab Research Foundation | Porous tissue scaffolding materials and uses thereof |
| US6472162B1 (en) * | 1999-06-04 | 2002-10-29 | Thermogenesis Corp. | Method for preparing thrombin for use in a biological glue |
| WO2001023536A1 (fr) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | International Reagents Corporation | Stabilisation de la thrombine et compositions |
| US20030205538A1 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-06 | Randel Dorian | Methods and apparatus for isolating platelets from blood |
| US7374678B2 (en) * | 2002-05-24 | 2008-05-20 | Biomet Biologics, Inc. | Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components |
| US7992725B2 (en) | 2002-05-03 | 2011-08-09 | Biomet Biologics, Llc | Buoy suspension fractionation system |
| US7832566B2 (en) | 2002-05-24 | 2010-11-16 | Biomet Biologics, Llc | Method and apparatus for separating and concentrating a component from a multi-component material including macroparticles |
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| US20060278588A1 (en) | 2002-05-24 | 2006-12-14 | Woodell-May Jennifer E | Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components |
| DE10392686T5 (de) | 2002-05-24 | 2005-07-07 | Biomet Mfg. Corp., Warsaw | Vorrichtung und Verfahren zum Trennen und Konzentrieren von Flüssigkeiten, welche mehrere Komponenten enthalten |
| GB0216002D0 (en) * | 2002-07-10 | 2002-08-21 | Nat Blood Authority | Process and composition |
| ES2226587B1 (es) * | 2004-10-22 | 2005-12-16 | Probitas Pharma, S.A. | Composicion de trombina estable. |
| US7866485B2 (en) | 2005-02-07 | 2011-01-11 | Hanuman, Llc | Apparatus and method for preparing platelet rich plasma and concentrates thereof |
| EP1848474B1 (en) | 2005-02-07 | 2013-06-12 | Hanuman LLC | Platelet rich plasma concentrate apparatus and method |
| US7824559B2 (en) * | 2005-02-07 | 2010-11-02 | Hanumann, LLC | Apparatus and method for preparing platelet rich plasma and concentrates thereof |
| WO2006099137A1 (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Uab Research Foundation | Endothelial predecessor cell seeded wound healing scaffold |
| US8567609B2 (en) | 2006-05-25 | 2013-10-29 | Biomet Biologics, Llc | Apparatus and method for separating and concentrating fluids containing multiple components |
| US8430813B2 (en) * | 2006-05-26 | 2013-04-30 | Depuy Spine, Inc. | Illuminated surgical access system including a surgical access device and integrated light emitter |
| US8328024B2 (en) | 2007-04-12 | 2012-12-11 | Hanuman, Llc | Buoy suspension fractionation system |
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| US10046081B2 (en) * | 2008-04-11 | 2018-08-14 | The Henry M Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Electrospun dextran fibers and devices formed therefrom |
| US8012077B2 (en) * | 2008-05-23 | 2011-09-06 | Biomet Biologics, Llc | Blood separating device |
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| US10143725B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-12-04 | Biomet Biologics, Llc | Treatment of pain using protein solutions |
| US10208095B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-02-19 | Biomet Manufacturing, Llc | Methods for making cytokine compositions from tissues using non-centrifugal methods |
| US9895418B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-02-20 | Biomet Biologics, Llc | Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions |
| US20140271589A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Biomet Biologics, Llc | Treatment of collagen defects using protein solutions |
| US9713810B2 (en) | 2015-03-30 | 2017-07-25 | Biomet Biologics, Llc | Cell washing plunger using centrifugal force |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA940070A (en) * | 1968-12-23 | 1974-01-15 | Jim S. Berry | Stabilized aqueous enzyme composition |
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| US4627879A (en) * | 1984-09-07 | 1986-12-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Fibrin adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma |
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| JPS6440433A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Green Cross Corp | Aqueous liquid composition of thrombin |
| DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
| DE69011136T3 (de) * | 1989-01-13 | 2003-10-23 | Mitsubishi Pharma Corp | Verfahren zur Herstellung einer Protein enthaltenden Zusammensetzung. |
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