FI100406B - Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattoreiden valmist amiseksi - Google Patents

Description

100406

Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktxvaatto-reiden valmistamiseksi Tämä hakemus on jakamalla erotettu patenttihakemuk-5 sesta FI 893500.

Vampyyrilepakot tarvitsevat ehdottomasti tuoreveri-ruokavaliota, jonka ne saavat tekemällä haavan uhriinsa.

Nämä haavat, vaikka ne ovat pinnallisia, tihkuvat verta useiden tuntien ajan.

10 Vampyyrilepakko Desmodus rotunduksen syljen kompo nentteja tutkittiin, ja niiden osoitettiin puuttuvan nisäkkään veren hyytymismekanismiin kolmella eri tasolla.

Niiden osoitettiin estävän verihiutaleiden aggregaatiota ja aktivoivan plasminogeeniä [Hawkey, C. M., Nature 211 15 (1966) 434, ja Hawkey, C. M., Br. J. Haematol. 13 (1967) 1014]. Jokainen näistä aktiivisuuksista liittyi eri proteiinifraktioon. Plasminogeeniä aktivoiva fraktio nimettiin "desmokinaasiksi" (Hawkey, C. M., Nature). Cartwright, T., Blood 43 (1974) 315 - 324, kuvasi desmokinaasin puh- 20 distuksen Desmoduksen syljestä ja esitti fraktion olevan tehokkaampaa kuin urokinaasi (UK) ja streptokinaasi aikaisemmin muodostuneiden hyytymien hajoituksessa: fraktio aiheutti sekä runsaasti plasminogeeniä sisältävien veri-tyytymien että fibriinilevyjen nopean hajoamisen.

25 Kudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin (tPA) käyttöä trombolyyttisenä aineena vaivaavat useat haittapuolet, joihin kuuluvat vakavat vuotokomplikaatiot, uudel-leentukkeutumisen suhteellisen yleinen esiintyminen, kyvyttömyys olla tasaisen tehokas ja herkkyys inaktivaatiol-30 le plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorien, kuten tyypin ·' I plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorin (PAI-1) vaiku tuksesta [Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 14 (1988) 1].

Vuotokomplikaatioiden, jotka aiheutuvat trombolyy-35 sihoidosta, uskotaan johtuvan verenkierrossa olevan plas- 2 100406 minogeenin aktivaatiosta, tai ainakin sen uskotaan niitä pahentavan. tPA:n kyvyn sitoa fibriiniä uskotaan vastaavan sen selvästä substraattipreferenssistä fibriiniin sitoutunutta plasminogeenia kohtaan. Kuitenkin teoreettiset 5 tarkastelut ja kliinisten tutkimusten tulokset ovat osoittaneet, että hyytymien nopeaan liuottamiseen tarvittavat korkeat tPA-tasot myös saavat huomattavan määrän verenkierrossa olevaa plasminogeeniä aktivoitumaan.

Lisäksi uskotaan, että tPA:n interaktiot plasman 10 inhibiittorien kanssa heikentävät tPA:n funktionaalista aktiivisuutta infuusion aikana ja sen jälkeen edistäen siten potentiaalisesti uudelleentukkeutumista.

Vielä eräs haittapuoli, joka liittyy tPA:n käyttöön trombolyyttisenä aineena, on se, että tarvittava annos on 15 suuri, 100 - 150 mg, mikä tekee tästä hoitotoimenpiteestä äärimmäisen kalliin.

Olemme löytäneet Desmodus rotunduksen syljessä ja sylkirauhasissa esiintyviä plasminogeeniaktivaattoreita, joilla on huomattavasti suurempi selektiivisyys fibriiniin 20 sitoutunutta plasminogeeniä kohtaan ja joihin siksi voi liittyä verenvuototaipumuksen vähäisempi vakavuus ja esiintymistaajuus, kun niitä käytetään trombolyysihoidos-sa. Lisäksi aktivaattorit eivät helposti inaktivoidu plasman inhibiittorien, kuten PAI-l:n, vaikutuksesta, ja siksi 25 niihin voi liittyä pienempi uudelleentukkeutumisen esiin-tymistaaj uus.

Tämän keksinnön tarkoitus on tuoda käytettäviksi fibrinolyyttisiä aineita, jotka ovat tPA:ta parempia sekä turvallisuuden että tehon suhteen.

30 Tämä keksintö koskee menetelmää puhdistettujen ja ’· osittain puhdistettujen plasminogeeniaktivaattoriproteii- nien valmistamiseksi, jotka on saatu tai johdettu Desmodus rotunduksen syljestä ja sylkirauhasista. Keksinnön mukaisesti valmistettuja proteiineja voidaan käyttää farmaseut-35 tisissa koostumuksissa fibriiniin sitoutuneen plas-minogeenin aktivoimiseksi.

100406 3

Tarkemmin sanottuna keksintö koskee menetelmää plasminogeeniä aktivoivan proteiinin valmistamiseksi, joka on ainakin 90 % homologinen seuraavan aminohapposekvenssin kanssa 5

Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly

Vai Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala

Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr

Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly 10 Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe

Cys Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg

Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe

Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala 15 Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys

Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu

Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr

Phe Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp 20 Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala

Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr

Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser

Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu • 25 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys

Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser

Gly Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp

Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr

Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys 30 Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly • Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; 4 100406

Met Vai Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu Leu

Leu Cys Gly Ala Val Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu Thr Tyr

Arg Gin Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys

Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin Gin Glu Ser 5 Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val

Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys

Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro

Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala 10 Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser

Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp

Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn

Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val lie Lys Ala 15 Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu

His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp He Thr Ser His Pro

Trp Gin Ala Ala He Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly

Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly He Leu He Ser Ser Cys Trp 20 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys

Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys He

Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp He

Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin 25 Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala He Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr

Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu

Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr

Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu 30 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu He His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys

Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly He He Ser Trp

Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp He Pro Gly Val Tyr Thr

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp He Arg Asp Asn Met Arg 35 Pro;

II

5 1C0406

Ala Tyr Gly Vai Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile

Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Vai Arg Ser

Lys Arg Vai Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin

Cys His Thr Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys 5 Phe As n Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys

Glu Vai Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai

Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin

Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr 10 Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp

Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys

Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys

Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr 15 Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile

Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe

Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly

Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe 20 Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly

Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile

Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu

Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro 2 5 Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr

Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly

Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser

Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu 30 Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; tai 6 100406

Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly

Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin

Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Vai Asp Thr

His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly 5 Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg

Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile

Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai 10 Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser

His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser

Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser

Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr 15 Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys

Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn

Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys

Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu 2 0 Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu

Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg

Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn

Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro 25 Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile

Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai

Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn

Met Arg Pro, 30 joka proteiini vaatii fibriinikofaktoria plasminogeenin aktivoimiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että vam-pyyrilepakon (Desmodus rotundus) sylkeä ja/tai leuanalus-sylkirauhas- ja/tai lisäleuanalussylkirauhashomogenaattia 35 fraktioidaan kromatografisesti, haluttua aktiivista plas- li 100406 7 minogeeniaktivaattoriproteiinia sisältävät fraktiot otetaan talteen, haluttu proteiini eristetään ja mahdollisesti puhdistetaan.

Vampyyrilepakon syljestä ja sylkirauhasista eriste-5 tyt plasminogeeniaktivaattoriproteiinit eroavat sekä tPArsta että urokinaasista useiden rakenteellisten ja funktionaalisten kriteerien suhteen. Toisin kuin tPA, keksinnön mukaisesti saatavat plasminogeeniaktivaattorit eivät sisällä kringle 2 -domeenia eivätkä plasmiiniherkkää 10 prosessointikohtaa. Ekvimolaariset määrät näitä aktivaat- toreita ja tPA:ta ovat likimain yhtä tehokkaita, kun tarkkaillaan niiden kykyä katalysoida aikaisemmin muodostuneiden plasmahyytymien hajotusta. Niiden aktiivisuus plasmi-nogeeniä kohtaan stimuloituu ainakin 27 000-kertaiseksi 15 fibriinikofaktorin läsnä ollessa. Vastaava arvo tPArlle on vain 205-kertainen. Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavat plasminogeeniaktivaattoriproteiinit eroavat myös Cartwrightin [Blood, yllä] kuvaamasta desmokinaasista. Cartwright geelisuodattamalla puhdistetun desmokinaasi-20 fraktion molekyylipaino oli 150 00 daltonia ja se oli ka rakterisoitu puuttuvien funktioiden ja ominaisuuksien avulla.

Vampyyrilepakon syljestä on eristetty kolme eri molekyylilajia, jotka vastaavat tPA:n täysipituista muo-25 toa, muotoa, josta puuttuu finger-domeeni, ja muotoa, josta puuttuvat finger-domeeni ja EGF-domeeni. Niihin viitataan vastaavasti Bat-PA(H):na, Bat-PA(I):nä ja Bat-PA(L) :nä. Tästä lähtien viittaukset "Bat-PA":han vastaavat fraktioimatonta preparaattia, joka sisältää kolme molekyy-30 limuotoa H:n, I:n ja L:n. Täysipituinen molekyylilaji, \ toisin kuin muut kaksi, sitoutuu tiukasti fibriiniin. Bat- PA(H) :11a, Bat-PA(I) :llä ja Bat-PA(L) :llä on vastaavasti Mr-arvot 49, 42 ja 40 kDa määritettynä SDS-PAGE:lla ditio-treitolin läsnäollessa (kuvio 1, kaista 1) . Bat-PA(H) :n, 35 Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n deglykosyloitujen muotojen 8 100406 (saatu poistamalla N-liitetyt hiilihydraattiketjut endo-glykosidaasi F:llä) näennäiset Mr-arvot ovat SDS-PAGE:lla määritettyinä vastaavasti 44, 40 ja 38 kDa (kuvio 1, kaista 2) . Näillä proteiineilla on tiukka vaatimus fibriini-5 kofaktorin läsnäolosta ja huomattava kyky katalysoida plasmahyytyrnien hajoitusta. Näiden proteiinien fibriiniin sitoutunutta plasminogeeniä kohtaan osoittaman selektiivi-syyden mekanismi on useiden tekijöiden tulosta, joihin kuuluu fibriinin suora sitoutuminen ja voimakas inhibitio 10 NaClrlla, joka helpottuu fibriinihyytymän läsnä ollessa. Lisäksi vampyyrilepakon plasminogeeniaktivaattorit ovat vähemmän herkkiä kuin tPA inaktivaatiolle plasmassa olevien inhibiittorien vaikutuksesta.

Desmodus rotunduksen syljestä johdetusta "täysipi-15 tuisen" plasminogeeniaktivaattoriglykoproteiinin [Bat- PA(H)] cDNA:sta ennustettu aminohapposekvenssi on:

Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-Gln-Met-Ile-Tyr-Gln-Gln-Gln-Glu-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-20 Glu-Val-Arg-Ser-Lys-Arg-Val-Glu-His-Cys-Arg-Cys-

Asp-Arg-Gly-Leu-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-LeuT»Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Trp-Gln-Ala-Ala-Ser-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-Cys-Gln-Cys-Pro-Lys-Gly-Tyr-Thr-Gly-Lys-Gln-Cys-25 Glu-Val-Asp-Thr-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-

Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Ser-Thr-Ser-Glu-Ser-Gly-Ala-Gln-Cys-Ile-Asn-Trp-Asn-Ser-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Arg-Thr-Tyr-Asn-Gly-Arg-Arg-Ser-Asp-Ala-Ile-Thr-Leu-Gly-Leu-Gly-Asn-His-Asn-Tyr-Cys-

Arg-Asn-Pro-Asp-Asn-Asn-Ser-Lys-Pro-Trp-Cys-Tyr- 30 . Val-Ile-Lys-Ala-Ser-Lys-Phe-Ile-Leu-Glu-Phe-Cys-

Ser-Val-Pro-Val-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Cys-Gly-Leu-Arg-Lys-Tyr-Lys-Glu-Pro-Gln-Leu-His-Ser-Thr-Gly-Gly-Leu-Phe-Thr-Asp-Ile-Thr-Ser-His-Pro-Trp-Gln-Ala-Ala-Ile-Phe-Ala-Gln-Asn-Arg-Arg-Ser-Ser-Gly-Glu-Arg-Phe-Leu-Cys-Gly-Gly-Ile-Leu-Ile-Ser-Ser-Cys-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Gln-Glu-Arg-Tyr-Pro-Pro-Gln-His-Leu-Arg-Val-Val-Leu-Gly- 100406 9

Arg-Thr-Tyr-Arg-Val-Lys-Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Gln-Thr-Phe-Glu-Val-Glu-Lys-Cys-Ile-Val-His-Glu-Glu-Phe-Asp-Asp-Asp-Thr-Tyr-Asn-Asn-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Gln-Leu-Lys-Ser-Gly-Ser-Pro-Gln-Cys-Ala-Gln-5 Glu-Ser-Asp-Ser-Val-Arg-Ala-Ile-Cys-Leu-Pro-Glu-

Ala-Asn-Leu-Gln-Leu-Pro-Asp-Trp-Thr-Glu-Cys-Glu-Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Lys-His-Lys-Ser-Ser-Ser-Pro-Phe-Tyr-Ser-Glu-Gln-Leu-Lys-Glu-Gly-His-Val-Arg-Leu-Tyr-Pro-Ser-Ser-Arg-Cys-Thr-Ser-Lys-Phe-Leu-10 Phe-Asn-Lys-Thr-Val-Thr-Lys-Asn-Met-Leu-Cys-Ala-

Gly-Asp-Thr-Arg-Ser-Gly-Glu-Ile-His-Pro-Asn-Val-His-Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Met-Asn-Asp-Asn-His-Met-Thr-Leu-Leu-Gly-Ile-Ile-Ser-Trp-Gly-Val-Gly-Cys-Gly-Glu-Lys-Asp-15 Ile-Pro-Gly-Val-Tyr-Thr-Lys-Val-Thr-Asn-Tyr-Leu-

Gly-Trp-Ile-Arg-Asp-Asn-Met-Arg-Pro

Bat-PA(H) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1-441 sekvenssin. Bat-PA(I) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 50 - 441 sekvenssin, 20 ja Bat-PA(L) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 87 - 441 sekvenssin. Lisäksi aminohappo asemassa 88 on proteiinissa "L" vaihtunut treoniinista pro-liiniksi.

Keksintöön kuuluu myös menetelmä vampyyrilepakon 25 syljen plasminogeeniaktivaattoreiden puhdistamiseksi. Me netelmälle on tunnusomaista, että: (a) homogenoidaan Desmodus rotundus -vampyyrilepakon leuanalussylkirauhasia seoksien muodostamiseksi, ja sentrifugoidaan seos supernatanttifraktion muodostamisek- 3 0 si; (b) kirkastetaan ja sitten konsentroidaan supernatanttif raktio; (c) pannaan retentaatti fosfoselluloosakationin-vaihtopylvääseen ja absorboidaan plasminogeeniaktivaattori 35 pylvääseen; 10 100406 (d) eluoidaan pylvästä plasminogeeniä aktivoivia proteiineja sisältävien fraktioiden saamiseksi; (e) yhdistetään fraktiot, ja pannaan yhdistetyt fraktiot affiniteettipylvääseen, jossa on immobilisoitua 5 Erythrinan trypsiini-inhibiittoria; (f) fraktioidaan plasminogeeniaktivaattoreita kor-keapainenestekromatografiällä; ja (g) erotetaan plasminogeeniaktivaattorit SDS-poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla.

10 Jokainen plasminogeeniä aktivoiva molekyylilaji aktivoituu fibriinin vaikutuksesta. Ainoa havaittava piirre, joka erottaa molekyylilajit toisistaan on vain Bat-PA(H) :11a oleva kyky sitoutua tiukasti fibriiniin, ominaisuus, joka korreloi finger-domeenin läsnä olon kanssa. 15 Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n spesifisyys fibriinin sitoutu nutta plasminogeeniä kohtaan ei näytä riippuvan kyvystä sitoutua tiukasti fibriiniin.

Bat-PA:n aktiivisuuden ehdoton fibriiniriippuvuus on ominaispiirre, joka on haluttava fibrinolyysihoidon yh-20 teydessä. Vuotokomplikaatiot, jotka liittyvät trombolyyt-tisten aineiden käyttöön, voivat paheta verenkierrossa olevan plasminogeenin aktivoituessa plasmiiniksi. Vuoto-komplikaatioiden vakavuutta ja niiden esiintymistiheyttä voidaan vähentää käyttämällä tämän keksinnön mukaisesti * 25 saatavaa plasminogeeniaktivaattoria, jonka vaikutus loka lisoituu fibriinihyytymän aluelle.

Kuvio 1 esittää puhdistettujen vampyyrilepakon plasminogeeniaktivaattorien SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia. Näytteet olivat vampyyrilepakon sylki-30 rauhasista (kaistat 1 ja 3) ja syljestä (kaistat 2 ja 4).

Jokaista näytettä käsiteltiin endoglykosidaasi F:llä ennen SDS-PAGE:a. Kaistat 1 ja 2: "Western blotting" ja immuno-värjäys. Kaistat 3 ja 4: fibriiniautografia.

Kuvio 2 esittää vähän verihiutaleita sisältävien 35 plasmahyytymien lyysiprosentin tPA:n ja lepakon 40 kDa:n plasminogeeniaktivaattoriproteiinin katalysoimana.

tt

IX

100406

Kuvio 3 esittää runsaasti verihiutaleita sisältävien plasmahyytymien lyysiprosentin tPA:n ja lepakon 40 kDa:n plasminogeeniaktivaattoriproteiinin katalysoimana.

Kuvio 4 esittää plasminogeeniaktivaattorien inakti-5 vaatiota plasman komponenttien vaikutuksesta.

Kuvio 5 esittää 40 ja 45 kDa:n proteiinien molekyy-lipainot SDS-PAGE:ssa tunnistettuna hopeavärjäyksellä ja fibriiniautografiällä.

Kuvio 6 esittää Bat-PA:n ja tPA:n katalysoimaa hyy-10 tymän hajoitusta.

Kuvio 7 esittää plasminogeeniaktivaattorien sitoutumista fibriiniin.

Kuvio 8a esittää vampyyri lepakon plasminogeeniakti-vaattori-cDNA:n nukleotidisekvenssin ja plasminogeeniakti-15 vaattorien aminohapposekvenssit.

Kuviossa 8b nähdään kaavamainen esitys vampyyrile-pakon plasminogeeniaktivaattorin aminohapposekvenssistä ja sen vertailu ihmisen tPA:han.

Sanoja proteiini ja polypeptidi käytetään tässä 20 keskenään vaihdettavasti, ja ne viittaavat amidisidoksin toisiinsa liitettyjen aminohappojen lineaariseen polymeeriin. Aminohappojen sekvenssi ketjussa on kriittisen tärkeä proteiinin eli polypeptidin biologiselle toiminnalle. Plasminogeeniaktivaattorit, kuten sanaa tässä käytetään, 25 viittaavat proteiineihin, jotka katalysoivat plasmiinin muodostumista, entsyymin, joka hydrolysoi arginiinin ja lysiinin peptidejä ja estereitä, ja muuttaa fibriinin liukoisiksi tuotteiksi.

Proteiinien vastaiset monoklonaaliset ja polyklo-30 naaliset vasta-aineet ovat hyödyllisiä tämän keksinnön mukaisten proteiinien eristämiseen ja tunnistamiseen. Ne voidaan tuottaa millä tahansa normaalilla sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkiksi polyklonaalisia vasta-aineita voidaan syntetisoida eläimessä, kuten kanissa, joka on 35 saanut injektion Desmodus rotunduksen plasminogeeniakti- 12 100406 vaattoriproteiineja. Injektion jälkeen vasta-ainetaso eläimessä nousee. Vasta-ainetta sisältävää verta, jota kutsutaan antiseerumiksi, otetaan sitten eläimestä. Plas-minogeeniaktivaattorille spesifinen vasta-aine erotetaan 5 sitten antiseerumin muista vasta-aineista millä tahansa joukosta erotustekniikoita, esim. affiniteettikromatogra-fiällä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa käyttäen Kohlerin ja Milsteinin tekniikkaa, Nature 256 (1975) 495 - 497.

10 Natiivit proteiinit, kuten termiä käytetään tässä, viittaavat vastaavien geenien tuottamiin täysipituisiin proteiineihin. Rekombinanttimenetelmin saatu viittaa halutun proteiinin geenin tai cDNA:n eristämiseen ja tämän puhdistetun geenin tai cDNA:n käyttöön sellaisen solun 15 tuottamiseksi, joka ylituottaa haluttua proteiinia. Frag-menttimuodot määritellään proteiinien eli polypeptidien osiksi, joissa on vähemmän aminohappoja kuin natiiveissa proteiineissa, mutta jotka sisältävät plasminogeeniakti-vaattorien aktiivisen kohdan tai kohtia. Mikroheterogeeni-20 set muodot, kuten termiä tässä käytetään, viittavat yksittäiseen geenituotteeseen, siis proteiiniin, jota tuotetaan DNA:n yksittäisestä geeniyksiköstä, jonka rakennetta muunnetaan translaation jälkeen. Nämä rakennemuutokset eivät eivät kuitenkaan johda mihinkään merkittäviin muutoksiin 25 proteiinin aktiivisuudessa. Nämä muutokset voivat tapahtua joko in vivo tai eristys- ja puhdistusprosessin kuluessa.

In vivo muuntaminen voi johtaa, näihin rajoittumatta, N-terminaalin asetylaatioon, proteolyysiin, glykosylaatioon tai fosforylaatioon. Proteolyysiin voi kuulua eksoproteo-30 lyysi, jossa yksi tai useampia terminaalisia aminohappoja ‘ pilkotaan peräkkäin irti entsymaattisesti, tuloksena mik- • · roheterogeenisiä muotoja, jotka sisältävät vähemmän aminohappoja kuin alkuperäinen geenituote. Proteolyysiin voi kuulua myös endoproteolyyttinen modifikaatio, joka johtuu 35 sellaisten endoproteaasien toiminnasta, jotka pilkkovat 11 100406 13 peptidin tietyistä kohdista aminohapposekvenssin sisällä. Samankaltaisia muutoksia voi tapahtua puhdistusprosessin aikana, joka voi johtaa mikroheterogeenisten muotojen syntyyn. Tavallisin puhdistuksen aikana tapahtuva muutos on 5 proteolyysi.

Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmistetaan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly-peptidisekvenssi, joka on ainakin 95-%:isesti homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 441 polypepti-10 disekvenssin kanssa, jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka stimuloituu fibriinikofaktorin läsnä ollessa ja mainittu proteiinin kykenee sitoutumaan tiukasti fibriiniin.

Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmiste-15 taan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly- peptidisekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 50 - 441 polypep-tidisekvenssin kanssa, jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka stimuloituu 20 fibriinikofaktorin läsnä ollessa.

Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmistetaan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly-peptidisekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminoappojen 1 - 3 ja 87 - 441 polypep-• 25 tidisekvenssin kanssa (jossa aminohappo asemassa 88 on muutettu treoniinista proliiniksi) , jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka stimuloituu fibriinikofaktorin läsnä ollessa.

Kuvio 1 esittää puhdistetun lepakon plasminogeeni-30 aktivaattorin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE:a). Näytteet käsiteltiin ennalta 25 mM ditiot-reitolilla ennen elektroforeesia ll-%:isessa SDS-polyak-ryyliamidigeelissä. Kaistalla 1 nähdään vampyyrilepakon sylkirauhasista puhdistettu aktivaattori (3,6 Mg); kais-35 talla 2 nähdään aktivaattori (3,6 Mg), jota on käsitelty 14 100406 endoglykosidaasi F:llä (Boehringer Mannheim; 0,1 yksikköä, 24 tuntia, 37 °C:ssa); ja kaistalla 3 0,1 yksikköä endoglykosidaasi F: ä. Proteiinien molekyylipainomarkkerit ovat ilmoitetun mukaiset. Lepakon plasminogeeniaktivaattoria 5 (100 ng) rauhasista (kaista 1) ja syljestä (kaista 2) ana lysoitiin "Western blottingilla" käyttäen kanissa tuotettuja lepakon plasminogeeniaktivaattorin vastaisia vasta-aineita ja alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa tuotettua kanin IgG:n vastaista vasta-ainetta. Rauhasista 10 ja (kaista 3) ja syljestä (kaista 4) saadun aktivaattorin (15 KY) fibriiniautografia suoritettiin, kuten on kuvattu artikkelissa Laemmli, U. K., Nature 227 (1970) 680 - 685.

Kuviossa 1 esitettyjen tietojen saamiseksi Desmodus rotundus -lepakoiden varsinaisia ja lisäleuanalussylkirau-15 hasia (6 g) pantiin 40 ml:aan liuosta 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,5, ja homogenisoitiin välittömästi käyttäen Brinkmann-homogenisaattoria. Homogenaattia sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 27 000 x g 20 minuuttia. Supernatanttifrak-tio kirkastettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 20 100 000 x g 30 minuuttia, laimennettiin 50 mM NaCl-kon- sentraatioon liuoksella 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,01 %

Tween 80, ja vietiin fosfoselluloosakationinvaihtajapyl-vääseen (Whatman PII), joka oli tasapainotettu liuoksella 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 80. Näyt-25 teen pylvääseen viemisen jälkeen fosfoselluloosapylvästä pestiin perusteellisesti edellä mainitulla tasapainotus-puskurilla. Lepakon plasminogeeniaktivaattori eluoitiin fosfoselluloosapylväästä liuoksella 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5 M NaCl ja 0,01 % Tween 80, ja vietiin affiniteet-30 tipylvääseen, joka muodostui Erythrinan trypsiini-inhibiittorista (ETI) (American Diagnostica) liitettynä CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia). Affiniteettipyl-västä pestiin liuoksella 20 mM NaH2P04, 0,5 M NaCl, pH 7,0, ja 0,01 % Tween 80, ja sen jälkeen aktivaattori eluoitiin 35 liuoksella 50 mM Na-asetaatti, 0,2 M NaCl, pH 4,0, 0,1 % I! 100406 15

Tween 80. Aktivaattoria sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja 1 M Tris-emästä lisättiin siten, että lopulliseksi Tris-pitoisuudeksi tuli 25 raM. Puhdistettua näytettä säilytettiin -70 °C:ssa. Proteiinikonsentraatio arvioitiin 5 BioRadin väriaineensitoutumismäärityksellä käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.

Kuvio 6 esittää lepakon plasminogeeniaktivaattorin ja tPA:n katalysoimaa hyytymän hajotusta. Plasmahyytymiä muodostettiin lisäämällä 0,2 KY ihmisen trombiinia (Sigma) 10 ja 7,5 mM CaCl2:a 195 μΐ-.an ihmisen plasmaa, joka sisälsi [125I] -fibrinogeeniä (100 000 cpm/hyytymä) . Jokaisen näytteen lopullinen tilavuus oli 200 μΐ. Hyytymät muodostettiin pienten puutikkujen läsnäollessa, ja niiden annettiin kiinnittyä tikkuihin, vanhennettiin 30 minuuttia 15 37 °C:ssa, litistettiin nesteen ulospuristamiseksi ja siirrettiin 250 μΐ.-aan plasmaa, johon lisättiin 25 Y/ml hirudiinia (Sigma). 25 μΐ liuosta 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 % Tween 80, jossa oli plasminogeeniaktivaattori, lisättiin liuokseen, joka ympäröi hyytymiä, näytteitä inku-20 boitiin 37 °C:ssa, ja otettiin pieniä eriä, joiden laskenta antoi liuokoisten fibriinin hajoitustuotteiden määrän.

Tässä tutkimuksessa käytettiin sylkirauhasista puhdistettua lepakon plasminogeeniaktivaattoria ja kaksiketjuista tPA-.ta. * , 3 nM Bat-PA; | , 3 nM t-PA; ·, 10 nM Bat-PA; 25 ‘, 10 nM t-PA. Lepakon plasminogeeniaktivaattorilla ja t-PA:11a nähtiin samankaltainen tehokkuus, kun tarkkailtiin niiden kykyä katalysoida radioleimattujen fibriinin hajoitustuotteiden vapautumista aikaisemmin muodostuneista plasmahyytymistä.

30 Kuviossa 7 nähdään plasminogeeniaktivaattorien si toutuminen fibriiniin. Kaista 1, Bat-PA, 1,8 pmol; kaistat 2 ja 3, 10 % pohjasakka- ja vastaavasti supernatanttifrak-tion tilavuudesta lepakon plasminogeeniaktivaattoria sisältävästä fibriininäytteestä; kaista 4, yksiketjuinen 35 tPA, 1,8 pmol; kaistat 5 ja 6, 10 % pohjasakka- ja vastaa- 16 100406 vasti supernatanttifraktion tilavuudesta tPA:ta sisältävästä fibriininäytteestä; kaista 7, urokinaasi, 0,5 pmol; kaistat 8 ja 9, 10 % pohjasakka- ja vastaavasti supernatanttifraktion tilavuudesta urokinaasia sisältävästä fib-5 riininäytteestä. Kolme lepakon plasminogeeniaktivaattorien molekyylilajia ovat epätasaisesti jakautuneet supernatant-ti- ja pohjasakkafraktioiden välille. Suurin osa Bat-PA(H):sta jakaantuu fibriinisakkaan (kaista 2), kun taas Bat-PA (I) :llä ja Bat-PA(L) :llä ei ole havaittavaa affini-10 teettiä fibriiniä kohtaan, ja ne sijoittuvat pääasiassa supernatanttifraktioon (kaista 3) . Myös pienistä eristä tPA:ta (kaista 4) ja urokinaasia (kaista 5) tarkastettiin niiden kyky situtua fibriiniin. Odotusten mukaisesti tPA sitoutuu tiukasti fibriiniin ja jakaantuu pohjasakkafrak-15 tioon (kaista 5} , mutta urokinaasi sijoittuu yksinomaan supernatanttifraktioon (kaista 9).

Fibriinihyytymiä muodostettiin lisäämällä 0,2 KY trombiinia 200 /il: aan puskuria 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,4, 0,01 % Tween 80, jossa oli ihmisen fibrinogeeniä 20 (1 mg/ml), EDTA (5 mM) ja lepakon plasminogeeniaktivaatto- ria (18 pmol) tai yksiketjuista tPA:ta (18 pmol) tai urokinaasia (5,5 pmol). Yksiketjuinen tPA puhdistettiin yksi-ja kaksiketjuisen tPA:n seoksesta kromatografiällä pylväässä, jossa oli etupäässä yksiketjuista tPA:ta sitovaa 25 monoklonaalista vasta-ainetta (PAM-1, American Diagnosti-ca) . Fibriinihyytymien annettiin vanheta tunnin ajan 37 °C:ssa, ja ne sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 100 000 x g 10 minuutin ajan. Pohjasakkafraktioita pestiin 400 /il :11a puskuria, jossa oli NaH2P04, NaCl ja Tween 80, jäl-30 leensuspensoitiin 150 μΐ-.aan 0,5 % SDS:ä ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1,5 tuntia jatkuvassa sekoituksessa. Pohjasakka- ja supernatanttifraktioita, jotka sisälsivät lepakon plas-minogeeniaktivaattoria, käsiteltiin Endo F:llä. Näytteet vietiin SDS-PAGE:en ja analysoitiin FA-analyysillä.

It 100406 17

Plasminogeeniaktivaattorimääritykset

Fibriinimaljamenetelmä: Fibriinimaljoja tehtiin liuottamalla naudan tai ihmisen fibrinogeeniä (2 mg/ml) ja ihmisen Glu-plasminogeeniä (6 μg/ml) l-%:iseen agaroosi-5 liuokseen (jota pidettiin 55 °C:ssa). Sitten lisättiin ihmisen trombiinia (1,5 yksikköä), ennen kuin sekoitettu liuos valettiin kalibroituihin immunodiffuusiolevyihin. Kiinteytyneeseen fibriinimaljaan stanssattiin kuopat, ja pylväsfraktioita pantiin niihin. Aktiivisuuden ollessa 10 läsnä havaittiin lyysialueita. Lyysialueen pinta-ala (mm2) jaettuna inkubaatioajalla 37 °C:ssa voidaan korreloida entsyymin aktiivisuusyksiköihin.

Fibriiniautografia: Näytteet pannaan SDS-PAGE:en ei-pelkistävissä olosuhteissa, ja akryyliamidigeeliä pes-15 tään perusteellisesti Triton-X-100:11a (2,5 %), ja sitten se pannaan plasminogeeniä sisältävän fibriini-agaroosi -geelin päälle. Plasminogeeniaktivaattorit renaturoituvat Triton-käsittelyn vaikutuksesta ja diffundoituvat agaroo-sigeeliin, jossa ne aktivoivat plasminogeeniä, josta tulee 20 plasmiinia. Syntynyt plasmiini hajottaa fibriiniä muodostaen fibrinolyysialueen, joka havaitaan helposti hajoamattoman fibriinin taustaa vasten.

Kytketty amidolyysimääritys: Plasminogeenin akti voitumista, josta syntyy plasmiinia, tutkittiin Desafibin 25 läsnä ollessa, ja plasmiinin muodostumista tarkkailtiin kolorimetrisen plasmiinisubstraatin, Spectrozyme PL:n, avulla. Lepakon plasminogeeniaktivaattoreita inkuboitiin ihmisen Glu-plasminogeenin (20 ^g/ml), Spectrozyme PL:n (0,4 mM) ja Desafibin (80 μg/ml) kanssa. Seosta inkuboi-30 tiin 37 °C:ssa 60 minuuttia. Reaktio lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 10-%:ista SDS:ä. Hajotetun substraatin absorbans- • * siä tarkkailtiin aallonpituudella 405 nm. Lepakon plasmi-nogeeniaktivaattoreiden aktiivisuusyksikkö vastaa sitä entsyymimäärää, joka katalysoi yhden mikromoolin Spektro-35 zyme PL:ä hajoamisen yhdessä minuutissa 37 °C:ssa.

18 100406

Aktiivisten kohtien titraus: Vampyyrilepakon plas-minogeeniaktivaattoreita titrattiin kahdella eri tekniikalla funktionaalisen molaarisuuden määrittämiseksi. Ensimmäinen tekniikka perustui kalibroidun trypsiinistandar-5 din takaisintitraukseen kalibroidulla kloorimetyyliketoni- inhibiittoristandardiliuoksella, joka inhiboi sekä tryp-siiniä että plasminogeeniaktivaattoreita. Trypsiiniliuos (500 nM) titrattiin suoraan käyttäen 4-metyyli-umbellife-ryyli-p-guanidiinibentsoattia (MUGB). Kloorimetyyliketoni 10 (dansyyli-glutamyyli-glysyyli-arginiinikloorimetyyliketo- ni, DNS-EGRCK) titrattiin MUGB-kalibroitua trypsiiniä vastaan. Tällaisen kalibroidun trypsiiniliuoksen reaktio kalibroidun kloorimetyyliketoniliuoksen kanssa mahdollistaa trypsiinistandardin inhibition vähenemisen mittauksen, kun 15 CK-standardia esi-inkuboidaan aktivaattoreiden kanssa.

Lepakon plasminogeeniaktivaattoreiden läsnäolo johtaa aktiivisuuden lisääntymiseen verrattuna trypsiini-CK-kont-rolliin plasminogeeniaktivaattorin määrään verrannollisesti .

20 Toiseen tekniikkaan kuuluu "burst"-kinetiikan tark kailu sen jälkeen, kun MUGBE:tä on lisätty lepakon plas-minogeeniaktivaattoriin, kun reaktio toteutetaan matalassa lämpötilassa (5 °C).

SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi: Käytimme 25 muunnettua menettelyä Laemmlin systeemistä fNature 227 (1970) 680 - 685]. Konsentrointi- ja erotusgeelit (0,75 mm) sisälsivät 4 ja vastaavasti 10 % polyakryyliamidia. Geelejä ajettiin 75 voltilla 20 tuntia. Proteiini havaittiin hopeavärjäyksellä.

30 Lepakon plasminogeeniaktivaattoriproteiinien puh distus

Materiaalit: Desmodus rotunduksen sylkeä ja sylkirauhasia hankittiin Antibody Associatesilta, Bedford, TX, ja tri C. Rupprechtilta, Rabies Unit, Wistar Institute, 3 5 Philadelphia, PA. Fibrinogeeni, plasminogeeni, trombiini 11 100406 19 ja substraatit amidolyysimääritykseen olivat American Diagnosticalta, New York, NY. Elektroforeesiin käytetyt materiaalit hankittiin BioRad, Inc:Itä, ja pylväskromato-grafiaan käytetyt materiaalit olivat Pharmacialta. HPLC-5 pylväät olivat Vydacin tuotteita. Immunodiffuusiolevyt olivat ICN:Itä.

Menettely: Aktivaattoreiden puhdistukseen vampyyri-lepakon syljestä kuuluu fosfoselluloosa-, fenyyli-Sepharo-se- ja C4-käänteisfaasi-HPLC-kromatografiavaiheet.

10 Vampyyrilepakon Desmodus rotunduksen sylkeä laimen nettiin kolminkertaiseen tilavuuteen liuoksella 10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 20. Laimennettua sylkeä sentrifugoitiin viisi minuuttia nopeudella 12 000 rpm 4 °C:ssa Eppendorf-sentrifuugilla. Supernatantti la-15 dattiin suoraan fosfoselluloosapylvääseen (25 x 10 cm) ja pestiin samalla puskurilla, jota käytettiin syljen laimentamiseen. Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 6 ml tunnissa. Aktiivisuus määritettiin lyysialueen pinta-alan mukaan käyttäen fibriinimaljamenetelmää, ja proteiinia tarkkail-20 tiin absorbanssilla aallonpituudella 280 nm.

Lepakon plasminogeeniaktivaattorit sitoutuivat tiukasti fosfoselluloosapylvääseen. Aktiivisuuden saanto eluution, käyttäen 1 M NaCl:a, jälkeen oli 94 % (taulukko I) - * 25 Plasminogeeniaktivaattoria sisältävät fraktiot fos- foselluloosapylväästä yhdistettiin ja pantiin suoraan fe-nyyli-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 5,0 cm) 2,5 M NaCl:n läsnäollessa. Pylvästä pestiin 2 M - 0 M NaCl-gradientilla 10 mM Tris-puskurissa, jossa oli 10 % glyserolia. Pesu 10-30 %:isella glyseroliliuoksella jatkui, kunnes kaikki aktii-' visuus oli eluoitunut.

Kromatografiästä fenyyli-Sepharose-pylvästä käyttäen saatiin tuloksena 82 %:n aktiivisuuden saanto (taulukko I). Kuitenkin aktiivisuus oli jakautunut kahteen huippuun, 35 1 ja 2, jotka koottiin erikseen yhteen. Näillä kahdella 20 100406 huipulla nähtiin eri molekyylipainot SDS-PAGE:n ja fibrii-niautorafian jälkeisellä hopeavärjäyksellä määritettynä (kuvio 5) . Huippu 1, jonka uskomme edustavan Bat-PA(L) ·.ä, eluoitui suolagradientin (2 M - 0 M NaCl) loppupuolella.

5 Uskomme huippu 2:n edustavan Bat-PA(I):tä.

Fenyyli-Sepharosen jälkeen saavutimme Bat-PA(L):n noin 660-kertaisen puhdistumisen. Bat-PA(I)-entsyymin ko-konaisaktiivisuutta ei määritetty optimaalisesti plasmi-nogeeni/Spectrozyme PL -kytkentäsysteemiä käyttäen, koska 10 Desafib ei ole tehokas kofaktori tälle lepakon plasmino-geeniaktivaattorille.

Taulukko I Puhdis tustaulukko 15 Vaihe Aktiivisuus Saanto Proteiini

Yksikköä % OD 280

Lepakon sylki (4ml) 206 100 76,230

Fosfoselluloosa 194 94 7,000 20 Fenyyli-Sepharose

Huippu 1 142 69 0,079

Huippu 2 27* 13* 0,083

C4-käänteisfaasi-HPLC

Huippu 1 119 57 N.D.

25 *Desafib ei ole oikea kofaktori tälle Bat-PA:n mo-lekyylilajille. N.D. ei määritetty.

Lopullinen puhdistusvaihe proteiineille oli C4-käänteisfaasi-HPLC-pylväs, joka oli tasapainotettu 0,1 % 30 (v/v) trifluorietikkahapolla vedessä. Proteiinien yhdiste tyt fraktiot konsentroitiin kylmäkuivauksella ja pantiin suoraan HPLC-pylvääseen. Entsyymi eluoitiin gradientilla 25 - 55 % asetonitriiliä 0,1 % TFA:n läsnäollessa. Pro-teiinihuipuja tarkkailtiin absorbanssilla aallonpituudella 35 214 nm, ja ne kerättiin erikseen. Haihtuvat ainekset pois- I) 100406 21 tettiin tyhjiösentrifugoinnilla, mitä seurasi kylmä-kuivaus. Proteiinit liuotettiin uudelleen 10 mM etikkahap-poon. Aktiivisuus määritettiin käyttäen fibriinimaljamene-telmää sen jälkeen, kun etikkahappo oli neutraloitu Tris-5 Tween-puskurilla.

Lepakon plasminogeeniaktivaattorit puhdistettiin vampyyrilepakon sylkirauhasista seuraavasti.

Vampyyrilepakoiden varsinaisia ja lisäleuanalus-sylkirauhasia pannaan puskuriin, joka sisältää 10 mM Tris-10 HC1, 0,5 M NaCl, 0,1 % Tween 80, pH 7,5, ja homogenisoidaan välittömästi polytronilla. Sentrifugoinnin jälkeen kirkastunut supernatanttifraktio samanaikaisesti konsentroidaan ja tasapainotetaan puskuriin 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,2, käyttäen sekoituksessa pidettyä Amicon-kam-15 miota (YM 10-kalvo). Retentaatti pannaan suoraan fosfosel-luloosapylvääseen (Whatman), joka on tasapainotettu puskurilla 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 80, pH 7,2. Plasminogeeniaktivaattoriproteiini absorboituu kvantitatiivisesti fosfoselluloosapylvääseen, ja se eluoidaan hyp-20 päyksellä aloituspuskuriin, jota on täydennetty 0,5 M NaCl:11a. Aktiivisuuden saanto on tyypillisesti yli 80 %.

Aktivaattoriaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja pantiin affiniteettipylvääseen, joka koostui Sepharose 4B:hen liitetystä Erythrinan trypsiini-inhibiit-25 torista (ETI). Suurin osa aktiivisuudesta absorboitui tähän pylvääseen ja eluoitui tehokkaasti, kun pylvästä pestiin 50 mM Na-asetaattipuskurilla, pH 4,0, jossa oli 0,2 M NaCl ja 0,1 % Tween 80. Lopullinen lepakon plasminogeeni-aktivaattoriaktiivisuuden saanto rauhasuutteesta tätä me-30 nettelyä käyttäen oli 91 %, josta saatiin noin 5,4 mg lepakon plasminogeeniaktivaattoria 6 g:sta rauhasia. Lepakon plasminogeeniaktivaattoripreparaatin homogeenisuuteen viittasi arvioidun proteiinikonsentraation ja lasketun funktionaalisen molaarisuuden, määritettyn aktiivisten 100406 22 kohtien titrauksella käyttäen 4-metyyli-umbelliferyyli-p-guanidinobentsoaattia [Urano ym., Biochem. Biophys. Res. Comm. 150 (1988) 45 - 51], vastaavuus.

Yhdistettyjen aktiivisten fraktioiden SDS-PAGE:n 5 jälkeinen proteiinivärjäys paljastaa monimutkaisen sarjan vyöhykkeitä, joilla on joukko eri Mr-arvoja. Näiden mole-kyylilajien liikkuvuus vastaa FA-analyysin määrittelemiä aktiivisuusvyöhykkeitä. Tämä vastaavuus ja lisäksi yhteensopivuus aminohappoanalyysissä, N-terminaalisessa analyy-10 sissä ja aktiivisten kohtien titraustuloksissa ovat todisteina siitä, että aktivaattori on puhdistettu onnistuneesti homogeeniseksi.

Proteiinin karakterisointi ja aktiivisuus: Tämän keksinnön mukaisesti saaduilla plasminogee-15 niaktivaattoreilla ei havaita aktiivisuutta plasminogee-nittömillä fibriinimaljoilla. Aktivaattorien inkubointi plasminogeenin kanssa fibriini I:n (Desafibin) ollessa läsnä johtaa plasmiinin muodostumiseen päätellen "Western blottingista" ja immunovärjäyksestä plasmiinin/plasmino-20 geenin vastaisella vasta-aineella. Niillä nähdään aktiivisuus ihmisen fibriiniin sitoutunutta ihmisen plasminogee-niä kohtaan kuin myös naudan fibriiniin sitoutunutta naudan plasminogeeniä kohtaan.

Sepharose G-200 -geelisuodatuskromatografiässä 25 puhdistamattomassa syljessä oleva lepakon plasminogeeniak-tivaattoriaktiivisuus eluoitui leveänä huippuna, jonka likimääräinen molekyylipaino oli 130 kDa. Tämä molekyyli-paino oli todennäköisesti lepakon plasminogeeniaktivaatto-rin aggregoitunut molekyylipaino. Se näytti olevan 32 kDa 30 paikkeilla FPLC-Sepharose-pylväässä 0,01 % Tween 20:n läsnäollessa.

Puhdistusta tutkittaessa lepakon plasminogeeniak-tivaattori ei reagoinut lysiini-Sepharosen kanssa, jonka oli aikaisemmin osoitettu olevan tehokas vaihe puhdistet-35 tessa proteiineja, jotka sitoutuvat fibriiniin kringle- 100406 23 domeenilla. Siten aktivaattoreiden fibriiniinsitoutumisme-kanismin on toinen kuin tPA:11a.

Aktivaattorien käsittely endoglykosidaasi H:lla ja F:llä muodostaa aktiivisia proteiineja, joilla on alempi 5 molekyylipaino, mikä viittaa siihen, että aktivaattorit ovat glykoproteiineja. Näiden proteiinien interaktio aga-roosin kanssa, johon on liitetty vehnänalkiolektiiniä tai konkanavaliini A:ta, edelleen tukee tätä johtopäätöstä.

Bat-PA(H):n kykyä aktivoida Glu-plasminogeeniä ar-10 vioitiin kytketyllä määrityksellä, joka mittasi plasmiini-spesifisen amidolyysisubstraatin hajoamista (taulukko II). Bat-PA(H):n spesifinen aktiivisuus (KY/nmol) Glu-plasminogeeniä kohtaan oli noin 260 kertaa vähemmän kuin tPA:lla, kun määritys tehtiin ilman fibriinin kaltaista ainetta.

15 Kuitenkin Bat-PA(H):n spesifinen aktiivisuus Glu-plasminogeeniä kohtaan Desafibin läsnäollessa oli noin 85 % tPA:lla nähdystä. Siten Desafib stimuloi tPA- ja Bat-PA(H)-aktiivisuutta vastaavasti 205- ja 45 000-kertaises-ti. Bat-PA:lla, kolmea molekyylimuotoa sisältävällä pre-20 paraatilla, nähty spesifinen aktiivisuus oli Bat-PA(H):n luokkaa ilman Desafibiä, mutta noin 30 % vähemmän kuin Bat-PA(H):11a tämän fibriinikofaktorin läsnäollessa (taulukko II) . Päättelemme, että Bat-PA(I) :n ja Bat-PA(L) :n aktiivisuudet eivät stimuloidu siinä määrin kuin Bat-25 PA(H):11a 80 Mg/ml Desafibin vaikutuksesta.

Taulukko II

Plasminogeenin aktivaatio Bat-PA(H):n, Bat-PA:n ja tPA:n vaikutuksesta 30 ' Stimulaatio , Aktivaattori Pesäfib-konsentraatio_ kertaa 0 μ g/ml ΑΔ.μς/ιη1

Bat-PA(H) 1,05 ± 0,04 47,700 ± 4500 45,000 (220) 'Bat-PA 1,24 ± 0,08 33,500 ± 970 27,000 (130) 35 tPA 270 ± 20 55,400 ± 1500 205 (1) 24 100406 Näissä tuloksissa annetaan spesifiset aktiivisuudet (KY/nmol) käyttäen edellä kuvattua kytkettyä amido-lyysimääritystä. Kaksiketjuista tPA:ta käytettiin näihin määrityksiin; yksiketjuisen tPA:n katalyyttistä aktiivi-5 suutta ei ole raportoitu, koska tulokset sekoittaa kaksiket juisen tPA-.n väistämätön syntyminen määrityksen aikana. Desafib on mukana määrityksessä ilmoitetun mukaisesti.

Arvot otsikon Stimulaatio kertaa alla ovat spesifisten aktiivisuuksien suhteita Desafibin läsnäollessa spesifisiin 10 aktiivisuuksiin ilman Desafibia. Sulkeissa oleva luku on plasminogeeniaktivaattoriaktiivisuuden stimulaatio Desafibin vaikutuksesta suhteessa tPA:lla nähtyyn stimulaatioon.

Myös tPA:n ja Bat-PA(H):n kykyä katalysoida plas-minogeeniä sisältävien fibriinihyytyrnien hajoitusta ver-15 tailtiin. Bat-PA(H):ta tarvitaan hiukan korkeampia pitoisuuksia, jotta saavutetaan täysin samat hyytymien hajotus-nopeudet, jotka saadaan tPA-pitoisuuksilla 0,25 - 10 nM.

Ne tPA- ja Bat-PA(H)-pitoisuudet (johdettu niiden annos-vastekäyristä), joilla saadaan tietty hyytymän hajotusno-20 peus, esitetään taulukossa III,· Bat-PA(H) :n spesifinen aktiivisuus suhteessa tPA:han vaihteli välillä 59-72 % ja korreloi plasminogeeniaktivaattoripitoisuuden kanssa. Bat-PA(H) :n tPA-.n suhteen lisääntynyt spesifinen aktiivisuus suuremmissa pitoisuuksissa voi heijastaa eroja näiden 25 plasminogeeniaktivaattorien välillä niiden vuorovaikutus-tavoissa fibriinin ja/tai plasminogeenin kanssa.

11 100406 25

Taulukko III

tPA:n ja Bat-PA(H):n välittämä fibriinihyytymien hajotus

Suhteellinen tehokkuus , N°Pe.u.s. tPAJnM) Bat-rPAiHl-tiiMl (S)_ 5 0,850 9 ^ 33 ± 1,11 12,9 ± 1,05 72,3 0,825 7,52 ± 0,88 10,53 ± 0,83 71,4 0,800 6,05 ± 0,69 8,60 ± 0,66 70,4 0,775 4,88 ± 0,54 7,02 ± 0,52 69,5 0,725 3,16 ± 0,34 4,68 ± 0,32 67,5 0 0,675 2,05 ± 0,21 3,12 ± 0,20 65,7 0,625 1,33 ± 0,13 2,08 ± 0,12 63,9 0,575 0,86 ± 0,08 1,39 ± 0,07 61,9 0,525 0,56 i 0,05 0,92 ±0,05 60,9 0,475 0,36 ±0,03 0,61 ±0,03 59,0 0,425 0,24 ± 0,02 0,41 ± 0,02 58,5

Hyytymänhajoituskokeet turbidometristä määritystä käyttäen tehtiin neljällä rinnakkaisella seuraavilla pitoisuuksilla kaksiketjuista tPA:ta tai Bat-PA(H):ta: 0,25, 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 ja 10,0 nm. Hyytymän hajoitusno-20 peudella tarkoitetaan turbiditeetin vähenemisen maksiminopeutta (-mOD/minuutti) määritettynä jokaisen hyytymänha-joitusprofiilin analyysistä Softmax-kinetiikkaohjelmistol-la. Neljä ja kuusi riippumatonta annosvastekäyrää (nopeus plasminogeeniaktivaattoripitoisuuden logaritmin funktiona) 25 tuotettiin vastaavasti tPArlle ja Bat-PA(H):lle. Taulukossa on tulostettuna ne plasminogeeniaktivaattoripitoisuu-det, jotka johtavat ilmoitettuihin hyytymänhajoitusnopeuk-siin. Nämä arvot johdettiin yhtälöistä, jotka kuvaavat kaikkien tPA:n ja Bat-PA(H):n annosvastekäyrien analyysis-30 tä konstruoituja "best-fit"-käyriä. Suhteellisen tehokku-den arvot ovat ilmoitettuun hyytymänhajoitusnopeuteen johtavan tPA-pitoisuuden suhteita Bat-PA(H)-pitoisuuksiin.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavat lepakon plas-minogeeniaktivaattorit ovat vähemmän herkkiä kuin tPA ina-35 ktivaatiolle nopeasti toimivan tyypin 1 plasminogeeniakti-vaattori-inhibiittorin (PAI-1) vaikutuksesta.

26 100406

Uskotaan, että PAI-l:n pitoisuus tukkeutuneen suonen aluella voi olla paljon korkeampi kuin plasmatutkimuk-sista arvioidut pitoisuudet. Latentin PAI-l:n läsnäolo plasmassa ja se, että verihiutaleissa on PAI-l:tä, joka 5 voi vapautua trombiinin, adenosiinidifosfaatin ja muiden verihiutaleagonistien vaikutuksesta, vaikuttavat osaltaan suhteellisen korkeisiin paikallisiin pitoisuuksiin tukkeutuneilla alueilla. PAI-1 toimii anti-aktivaattorina, joka salpaa spesifisesti tPA:n aktiivisuuden.

10 Kuviosta 4 nähdään, että tPA inaktivoituu helpom min plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorien vaikutuksesta kuin vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattorit. Kutakin tPA:ta ja vampyyrilepakon syljen plasminogeeniak-tivaattoreita inkuboitiin plasmassa, ja kunkin aktiivi-15 suutta tarkkailtiin ajan funktiona.

NaCl:n välittämää plasminogeeniaktivaation inhibi-tiota ei havaittu kummallakaan tPArlla eikä 40 kDa proteiinilla, kun tarkkailimme fibriinihyytymien hajoitusta. Tässä tapauksessa hyytymät tehtiin puhdistetuista kompo-20 nenteista, joihin kuuluivat fibrinogeeni (sekä leimattu että leimaamaton), plasminogeeni, a2-antiplasmiini, faktori XHIa ja puskuri, jossa oli 0,1 M NaCl:a tai joka oli sitä ilman.

Bat-PA:n SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 25 ja proteiinien "blotting" Immobilonille (PVDF-kalvoille)

Trypsiini-inhibiittoriaffiniteettipylväästä saatiin yhdistetyt aktiiviset fraktiot, ja niitä fraktioitiin edelleen käyttäen Vydac C4-HPLC -pylvästä, josta plasmino-geeniaktivaattoriproteiini eluoitui kohdalla noin 30 40-%:inen asetonitriili/0,l-%:inen trifluorietikkahappo.

HPLC-pylväästä voitiin havaita eluoituvan kaksi aktiivisuuden päähuippua (fibriinimalja-autolyysillä määritettynä) . Nämä kaksi aktiivisuushuippua koottiin erikseen yhteen, ja niille annettiin nimet Bat-PA (I) ja Bat-PA (II).

Il 100406 27 Käyttäen SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE:a), jota seuraa fibriiniatografia, sekä Bat-PA (I) :llä että Bat-PA (II) :11a nähdään samanlainen lyysivyö-hykkeiden kuvio, joka kattaa molekyylipainot 42 000 5 46 000 daltonia. Sekä Bat-PA (I) että Bat-PA (II) voitiin leimata 3H-DFP:llä (di-isopropyylifluorifosfaatilla) , se-riiniproteaasien aktiivisen keskuksen leimausreagenssilla.

Lepakon I:ksi ja II:ksi nimettyjen plasminogeeniaktivaattoreiden polyakryyliamidigeelielekt-10 roforeesi suoritettiin käyttäen muunnettua menettelyä Lae-mmlin systeemistä [Nature 227 (1970) 680 - 685]. Konsent-rointi- ja erotusgeelit (0,75 mm) sisältävät 4 ja vastaavasti 10 % polyakryyliamidia. Geelejä ajetaan 75 voltilla 20 tuntia.

15 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla erote tut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilo-nille (PVDF-kalvoille) , jota oli hankittu Milliporelta, luettelonumero IPVH304FO. Proteiinien elektroforeettinen siirto ("electroblotting") suoritettiin olennaisesti kuten 20 Matsudaira [J. Biol. Chem. 262 (1987) 10 035 - 10 038] on kuvannut. Lyhyesti kuvattuna, proteiinit eluoidaan elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeelistä 30 voltilla 15 tunnin ajan. Sitten Immobilon-blottia värjätään Coomas-sie Bluella proteiinivyöhykkeiden havaitsemiseksi blotil-25 la. Proteiinivyöhykkeet leikataan suoraan irti blotista ja pannaan mallin 477A kaasufaasisekvensoijaan, jossa on po-lybreeniesikäsittelysuodatin blotatun näytteen alapuolella. Sekvensoijan ohjelmat ja reagenssit ovat valmistajan (Applied Biosystems) toimittamat. Vapautuneet aminohappo-30 johdannaiset tunnistetaan suoraan laitteeseen kytketyllä HPLC-systeemillä.

Vampyyri lepakon syljen plasminogeeniaktivaattoreiden N-terminaaliset aminohapposekvenssit SDS-PAGE:lla fraktioidun plasminogeeniaktivaatto-35 rin N-terminaalinen sekvensointi suoritettiin käyttäen 28 100406 polyvinylideenidifluoridikalvoa (Immobilon, Millipore) ja Applied Biosystemsin malli 470 sekvensoijaa, jossa on suoraan laitteeseen kytketty PTH-analyysi [Matsudaira, P., J.

Biol. Chem. 262 (1987) 10 035 - 10 038]. Plasminogeeniak-5 tivaattorin V8-fragmentteja tuotettiin aktivaattorin pelkistys /alkylointi- käsittelyllä ditiotreitoli/jodiasetamidilla, muunnetun proteiinin inkubaatiolla Staphylococcus aureuksen V8-proteaasilla (Boehringer Mannheim), ja prote-olyyttisten fragmenttien eristyksellä käyttäen Vydac C18-10 HPLC -pylvästä. Aktiivisen keskuksen peptidifragmentti,

Tl, tunnistettiin seuraavasti: plasminogeeniaktivaattoria inkuboitiin [1,3-3H]-di-isopropyylifluorifosfaatin (New England Nuclear) kanssa Desafibin (American Diagnostica) läsnä ollessa, käsiteltiin ditiotreitolilla ja jodiaset-15 amidilla, hajoitettiin trypsiinillä, ja radioleimattu fragmentti eristettiin HPLC:llä ja pantiin sekvenssianalyysiin .

Kahdeksan piasminogeeniaktivaattoriaktiivisuutta sisältävää proteiinivyöhykettä tunnistettiin Immobilon-20 blotilla ja pantiin sekvenssianalyysiin. Saadut sekvenssit annetaan seuraavassa: -( )- ilmaisee, että mitään aminohappoa ei voitu tunnistaa kyseisessä asemassa, luultavimmin tiettyjen aminohappojen instabiilisuuden ja heikon saannon proteiinisekvensoijasta takia.

25 Vyöhyke 1 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-Arg-Tyr-Phe

Vyöhyke 2 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-( )-Tyr-( )-

Asp-Gln-Gly-Val

Vyöhyke 3 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr 30 Vyöhyke 4 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-Thr-

Gln-Met-(Thr)-Tyr-Lys

Vyöhyke 5 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-Phe-

Ile-Gly-Gly

Vyöhyke 6 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-Lys-35 Asp-Gln-Gly-Val n 100406 29

Vyöhyke 7 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly Vyöhyke 8 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr 5 Lepakon plasminogeeniaktivaattorin cDNA:n moleky- laarinen kloonaus on esitetty tämän hakemuksen kantahake-muksessa 893 500.

Vertailu ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoriin Seuraavassa esitetään vertailu ihmisen kudosplas-10 minogeeniaktivaattorin ja keksinnön mukaisesti saatavan

Bat-PA(H):n aminohapposekvenssiprimaarirakenteen välillä.

30 1 0 0 4 0 6 1 10

Ihmisen t-PA GARSYQVICRDE Bat-PA(H) GSRAYGVACRDE -3 7 5 20

KTQMIYQQHQSW KTQMIY QQQESW

17 30

10 LRPVLRSNRVEY

LRPEVRSKRVEH

27 40

CWCNSGRAQCHS 15 CRCDRGLAQCHT

37 50 60 VPVKSCSEPRCF VPVKSCSELRCF 20 47 57 70

NGGTCQNALYFS

NGGTRWNAASFS

67

25 SO

DFVCNCPEGFAG DF VCNCPKGYTG

77 90

30. KCCE JDTRATCY

KQCE VDTHATCY

87

K

31 100406 100

Ihmisen t—PA EDQGI S Y R G T W S Bat-PA(H) KDQGVTYRGTWS

97 5 110 120 TAESGAECTNWN TSESGAQ.CINWN 107 117 130

10 SSALANKPYSGR

SNLLTRRTYNGR

127 140

RPDAIRLGLGNH 15 RSDAITLGLGNH

137 150 nycrnpdrdskp nycrnpdnnskp 20 147 160

WCYVFKAGKYSS

WCYVIKASKFIL

157 25 170 180 efcstpacsegn ef csvpvcska 167 176 190

30 -Ihmisen t-PA SDCY FGNGSAYR

32 1 0 0 4 0 6 200

Ihmisen t-PA GTHSLTESGASC

5 210

LPWNSMILIGKV

220

10 YTAQNPSAQALG

230 240 LGKHNYCRNPDG 15 250

DAKPWCHVLKNR

20 260

RLTWEYCDVPSC

25 270

Ihmisen t-PA STCGLRQYSQPQ Bat-PA(H) T CGLRKYKEPQ

177 180 280

30 FRIKGGLFADIA

LHST GGLFTD I T 190 11 33 100406 290 300

Ihmisen t-PA SHPWQAAIFAKH Bat-PA(H) SHPWQAAI FAQN 200 210 5 310

RRSPGERFLCGG RRSSGE -RFLCGG

220 320

10 ILISSCWILSAA

ILISSCWVLTAA

230 330 hcfqerfpphhl 15 hcfqeryppqhl 240 340 TVILGRTYRVVP RVVLGRTYRVKP 20 250 350 360 geeeqkfeveky gkeeqtfevekc 260 270 25 370

IV, HKEFDDDTYD IVHEEFDDDTYN

280 380

30 NDIA LLQLKSDS

ndiallqlksgs 290 34 100406 390

Ihmi sen t-PA SRCAQESSVVRT Bat-PA(H) PQCAQESDSVRA

300 5 400

VCLPPADLQLPD

ICLPEA.NLQLPD

310 410 * 420

10 WTECELSGYGKH

WTECELSGYGKH

320 330 430

EALSPFYSERLK 15 KSSSPFYSEQLK

340 440 eahvrlypssrc eghvrlypssrc 20 350 450

TSQHLLNRTVTD

TSKFLFNKTVTK

360 25 460 nmlcagdtrsgg nmlcagdtrsge 370 470 480

30 PQAN IiHDACQGD

IHPNVHDACQGD

380 390 fi 490 100406 35

Ihmisen t-PA SG GPLVCLNDGR Bat-PA(H) SGGPLVCMNDNH 5 400 500

MTLVGI I SWGLG

M T L L G I I S W G V G

410 10 510

CGQKDVPGVYTK CGEKD I P GVYTK

420 520

15 VTNYLDWIRDNM

VTNYLGWIRDNM

430

530 R P

20 R P

440

Ihmisen tPA:n fibronektiinin finger-domeenilla 25 (sekvenssi 9 - 46) on 78 % homologia Bat-PA(H):n sekvenssin 6-43 kanssa. Ihmisen tPA:n epidermaalisen kasvutekijän kaltaisella domeenilla (sekvenssi 46 - 95) on 75 % homologia Bat-PA(H):n sekvenssin 43 - 92 kanssa. Ihmisen tPA: n ensimmäisellä kringle-domeenilla (sekvenssi 95 30 177) on 67 % homologia Bat-PA (H) :n sekvenssin 92 -174 *' kanssa.

Ihmisen tPA:n toisella kringle-domeenilla ei ole vastinetta Bat-PA(H):ssa. Bat-PA(H):n aminohapot 175 ja 176 ovat lysiini ja alaniini. Bat-PA(H):n aminohapoilla 35 190 - 441, "kevytket julla", on 74 %:n homologia ihmisen tPA:n kevytketjun sekvenssin 280 - 531 kanssa.

100406 36

Kuvio 8b on kaavamainen esitys Bat-PA(H):n aminohapposekvenssistä ja vertailu ihmisen tPA:han [Pennica ym., Nature 301 (1983) 214 - 221]. Bat-PA:n yksittäiset aminohapot on esitetty yksikirjaimisella koodilla. Umpi-5 naiset ympyrät osoittavat samoja aminohappoja Bat-PA(H):ssa ja ihmisen tPA:ssa. Avoimet ympyrät osoittavat toisistaan poikkeavia aminohappotähteitä. Ehdotettu disul-fidisidosten muodostumistapa perustuu analogiaan tPA:n kanssa. Oletetut N-liitetyt glykosylaatiokohdat on osoi-10 tettu aminohapossa kiinni olevalla kulmasululla.

Kuten aikaisemmin on mainittu, lepakon plasmino-geeniaktivaattoreiden aktiivisuus stimuloituu dramaattisesti fibriinikofaktorin läsnäollessa. Se vaikuttaa olevan ainakin 90 kertaa tPA:ta selektiivisempi fibriiniin sitou-15 tunutta plasminogeeniä kohtaan. tPA:n toisessa kringle-domeenissa on lysiiniä sitova kohta, jonka uskotaan näyttelevän ratkaisevaa roolia fibriinin indusoimassa aktiivisuuden stimulaatiossa. Sitä vastoin tämän keksinnön mukaisesti saatavan aktivaattorin aminohapposekvenssi paljas-20 taa, ettei sen selvä fibriiniselektiivisyys johdu alueesta, joka muistuttaa tPA:n toista kringle-domeenia. Lisäksi lepakon plasminogeeniaktivaattoreiden kyvyttömyys sitoutua Lys-Sepharoseen osoittaa, että lysiinin sitoutumiskohdan läsnäolo ei vastaa plasminogeenin fibriinispesifisestä 25 aktivaatiosta.

Keksinnön mukaisesti saatavien aktivaattoreiden kringle-domeeni välittää fibriinin indusoimaa aktiivisuuden stimulaatiota huolimatta sen eroista tPA:n toiseen kringle-alueeseen.

30 Aktivaattorit myös eroavat rakenteellisesti tPA:sta siinä, että lepakon entsyymistä puuttuu plas-miiniherkkä prosessointikohta.

Edellä kuvatut Bat-PA-proteiinit on määritelty tietyn DNA-geenin avulla ja päättelyyn perustuvalla amino-35 happosekvensoinnilla. On ymmärrettävä, että luonnollista 100406 37 alleelivariaatiota esiintyy. Nämä variaatiot voivat ilmetä aminohappoero(i)na sekvenssissä tai deleetioina, substituutioina, insertioina, inversioina tai aminohapon/amino-happojen lisäyksinä mainitussa sekvenssissä. Lisäksi gly-5 kosylaation sijainti ja aste riippuu ympäristön laadusta isäntäsolussa.

Terapeuttinen hoito Näitä proteiineja voidaan antaa millä tahansa tavanomaisella tavalla, joka johtaa sen joutumiseen veren-10 kiertoon huomattavassa määrin. Antamista laskimonsisäisesti pidetään tällä hetkellä edullisena antotapana. Ne ovat vesiliukoisia, ja siksi ne voidaan antaa tehokkasti liuoksessa .

Yhdessä esimerkkisovellutuksessa sopiva määrä tä-15 män keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja annetaan laskimonsisäisesti sydänkohtauksen uhrille. Sopivat annokset trombolyysin aikaansaamiseksi ovat 200 mg:an asti, edullisesti välillä 25 - 150 mg ja edullisemmin välillä noin 25 - 50 mg.

20 Proteiineja voidaan myös antaa edellä mainittuina annoksina peräkkäisinä bolusinjektioina usean tunnin kuluessa .

Proteiineja voidaan antaa yhdessä verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreiden kanssa yhdistetyn trombolyy-25 si- ja verihiutaleiden aggregaation inhibitiovaikutuksen tuottamiseksi. Yhdessä antamiseen kuuluu verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreiden laskimonsisäinen antaminen sellaisena määränä, joka estää verihiutaleiden aggregaa-tiota, esim. määränä, joka saavuttaa tasapainotilaplasma-30 pitoisuuden välillä 0,05 - 2 μΜ.

Claims (2)

100406

1. Menetelmä plasminogeeniä aktivoivan proteiinin valmistamiseksi, joka on ainakin 90 % homologinen seuraa-5 van aminohapposekvenssin kanssa Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr

10 Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe

15 Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr

20 Phe Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser

2. Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr

3. Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; Met Vai Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Vai Leu Leu 3 5 Leu Cys Gly Ala Vai Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu Thr Tyr il 100406 Arg Gin Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val

5 Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser

10 Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val lie Lys Ala Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu

15 His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp lie Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys

20 Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys Cys He Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp He Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala He Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr ' 25 Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu He His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys

30 Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly He He Ser Trp ‘ Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp He Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro;

3. Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met He Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser 100406 Lys Arg Vai Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys

5 Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp

10 Cys Tyr Val lie Lys Ala Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp lie Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie

15 Leu lie Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys lie Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly

20 Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala lie Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr

25 Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu lie His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly lie lie Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp lie Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp 30 lie Arg Asp Asn Met Arg Pro; tai Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr

3. His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly 100406 Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val lie

5 Lys Ala Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp lie Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser

10 Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys lie Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys

15 Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala lie Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn

2. Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu lie His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly lie lie Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp lie Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp lie Arg Asp Asn * 25 Met Arg Pro, joka proteiini vaatii fibriinikofaktoria plasminogeenin aktivoimiseksi, tunnettu siitä, että vampyyrilepakon (Desmodus rotundus) sylkeä ja/tai 30 leuanalussylkirauhas- ja/tai lisäleuanalussylkirauhashomo- ' genaattia fraktioidaan kromatografisesti, haluttua aktii vista plasminogeeniaktivaattoriproteiinia sisältävät fraktiot otetaan talteen, haluttu proteiini eristetään ja mahdollisesti puhdistetaan. 100406

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (a) homogenoidaan Desmodus rotundus -vampyyrilepakon leuanalussylkirauhasia seoksien muodostamiseksi, ja 5 sentrifugoidaan seos supernatanttifraktion muodostamiseksi; (b) kirkastetaan ja sitten konsentroidaan supernatant tifraktio; (c) pannaan retentaatti fosfoselluloosakationin- 10 vaihtopylvääseen ja absorboidaan plasminogeeniaktivaattori pylvääseen; (d) eluoidaan pylvästä plasminogeeniä aktivoivia proteiineja sisältävien fraktioiden saamiseksi; (e) yhdistetään fraktiot, ja pannaan yhdistetyt 15 fraktiot affiniteettipylvääseen, jossa on immobilisoitua Erythrinan trypsiini-inhibiittoria; (f) fraktioidaan plasminogeeniaktivaattoreita kor-keapainenestekromatografiällä; ja (g) erotetaan plasminogeeniaktivaattorit SDS-poly- 20 akryyliamidigeelielektroforeesilla. 100406