FI100403B - Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI100403B
FI100403B FI893500A FI893500A FI100403B FI 100403 B FI100403 B FI 100403B FI 893500 A FI893500 A FI 893500A FI 893500 A FI893500 A FI 893500A FI 100403 B FI100403 B FI 100403B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gly
ser
leu
thr
cys
Prior art date
Application number
FI893500A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI893500A (fi
FI893500A0 (fi
Inventor
Paul A Friedman
Le Thi Duong
Stephen J Gardell
John W Jacobs
Richard A F Dixon
George E Mark Iii
Bruce L Daugherty
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of FI893500A0 publication Critical patent/FI893500A0/fi
Publication of FI893500A publication Critical patent/FI893500A/fi
Priority to FI953849A priority Critical patent/FI100406B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI100403B publication Critical patent/FI100403B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

100403
Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyy-rilepakon syljen plasminogeeniaktiivaattoreiden valmistamiseksi 5 Vampyyrilepakot tarvitsevat ehdottomasti tuoreveri- ruokavaliota, jonka ne saavat tekemällä haavan uhriinsa. Nämä haavat, vaikka ne ovat pinnallisia, tihkuvat verta useiden tuntien ajan.
Vampyyrilepakko Desmodus rotunduksen syljen kompo-10 nentteja tutkittiin, ja niiden osoitettiin puuttuvan nisäkkään veren hyytymismekanismiin kolmella eri tasolla. Niiden osoitettiin estävän verihiutaleiden aggregaatiota ja aktivoivan plasminogeeniä [Hawkey, C. M., Nature 211 (1966) 434, ja Hawkey, C. M., Br. J. Haematol. 13 (1967) 15 1014]. Jokainen näistä aktiivisuuksista liittyi eri pro teiinifraktioon. Plasminogeeniä aktivoiva fraktio nimettiin "desmokinaasiksi" (Hawkey, C. M., Nature). Cartwright, T., Blood 43 (1974) 315 - 324, kuvasi desmokinaasin puhdistuksen Desmoduksen syljestä ja esitti fraktion ole-20 van tehokkaampaa kuin urokinaasi (UK) ja streptokinaasi aikaisemmin muodostuneiden hyytymien hajoituksessa: fraktio aiheutti sekä runsaasti plasminogeeniä sisältävien verityytymien että fibriinilevyjen nopean hajoamisen.
Kudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin (tPA) ;· 25 käyttöä trombolyyttisenä aineena vaivaavat useat haitta puolet, joihin kuuluvat vakavat vuotokomplikaatiot, uudel-leentukkeutumisen suhteellisen yleinen esiintyminen, kyvyttömyys olla tasaisen tehokas ja herkkyys inaktivaatiol-le plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorien, kuten tyypin 30 I plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorin (PAI-1) vaiku- · tuksesta [Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 14 (1988) 1].
Vuotokomplikaatioiden, jotka aiheutuvat trombolyy-sihoidosta, uskotaan johtuvan verenkierrossa olevan plas-35 minogeenin aktivaatiosta, tai ainakin sen uskotaan niitä 2 100403 pahentavan. tPA:n kyvyn sitoa fibriiniä uskotaan vastaavan sen selvästä substraattipreferenssistä fibriiniin sitoutunutta plasminogeenia kohtaan. Kuitenkin teoreettiset tarkastelut ja kliinisten tutkimusten tulokset ovat osoit-5 taneet, että hyytymien nopeaan liuottamiseen tarvittavat korkeat tPA-tasot myös saavat huomattavan määrän verenkierrossa olevaa plasminogeeniä aktivoitumaan.
Lisäksi uskotaan, että tPA:n interaktiot plasman inhibiittorien kanssa heikentävät tPA:n funktionaalista 10 aktiivisuutta infuusion aikana ja sen jälkeen edistäen siten potentiaalisesti uudelleentukkeutumista.
Vielä eräs haittapuoli, joka liittyy tPA:n käyttöön trombolyyttisenä aineena, on se, että tarvittava annos on suuri, 100 - 150 mg, mikä tekee tästä hoitotoimenpiteestä 15 äärimmäisen kalliin.
Olemme löytäneet Desmodus rotunduksen syljessä ja sylkirauhasissa esiintyviä plasminogeeniaktivaattoreita, joilla on huomattavasti suurempi selektiivisyys fibriiniin sitoutunutta plasminogeeniä kohtaan ja joihin siksi voi 20 liittyä verenvuototaipumuksen vähäisempi vakavuus ja esiintymistaajuus, kun niitä käytetään trombolyysihoidos-sa. Lisäksi aktivaattorit eivät helposti inaktivoidu plasman inhibiittorien, kuten PAI-l:n, vaikutuksesta, ja siksi niihin voi liittyä pienempi uudelleentukkeutumisen esiin-:· 25 tymistaajuus.
Tämän keksinnön tarkoitus on tuoda käytettäviksi fibrinolyyttisiä aineita, jotka ovat tPA:ta parempia sekä turvallisuuden että tehon suhteen.
Tämän keksinnön on myös tarkoitus tunnistaa tämän 30 keksinnön mukaisia proteiineja koodaavia DNA-sekvenssejä, · muokata kudosperäisestä cDNArsta saatavia sekvenssejä, ja sijoittaa ne toiminnallisesti ekspressiovektoreihin.
Tämän keksinnön on myös tarkoitus tuottaa proteiineja mikro-organismi- tai eukaryyoottisoluisännissä, 35 jotka on transformoitu ekspressiovektoreilla proteiinin tuottamiseksi.
n 1 CC 4 03 3 Tämän keksinnön on myös tarkoitus tuottaa vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia tämän keksinnön mukaisia proteiineja kohtaan.
Tämä keksintö koskee menetelmää puhdistettujen ja 5 osittain puhdistettujen plasminogeeniaktivaattoriproteii- nien valmistamiseksi, jotka on saatu tai johdettu Desmodus rotunduksen syljestä ja sylkirauhasista, geeniteknologisin menetelmin, näitä proteiineja koodaavia DNA-sekvenssejä ja näiden proteiinien kanssa spesifisesti reaktiivisia vasta-10 aineita. Keksinnön mukaisesti valmistettuja proteiineja voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa fibriiniin sitoutuneen plasminogeenin aktivoimiseksi.
Tarkemmin sanottuna keksintö koskee menetelmää gly-kosyloidun tai glykosyloimattoman plasminogeeniä akti-15 voivan proteiinin valmistamiseksi, joka on ainakin 90 % homologinen seuraavan aminohapposekvenssin kanssa
Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly
Vai Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala 20 Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly
Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro
Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe
Cys Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg 25 Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala
Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly
Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys
Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu 30 Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp
Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser
Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala
Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr 35 Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser 4 100403
Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu
Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys
Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser
Gly Glu lie His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp 5 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly lie lie Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys
Asp lie Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly
Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro; 10 Met Val Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu Thr Tyr
Arg Gin Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys
Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin Gin Glu Ser
Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys 15 Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys
Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro
Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala
Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp 20 Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp
Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn
Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val lie Lys Ala
Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser 25 Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp lie Thr Ser His Pro
Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly
Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser Cys Trp
Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro 30 Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys lie
Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp lie
Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin
Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala lie Cys Leu Pro Glu Ala Asn 35 Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr 5 100403
Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu
Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr
Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu
Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu lie His Pro Asn Val 5 His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly lie lie Ser Trp
Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp lie Pro Gly Val Tyr Thr
Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp lie Arg Asp Asn Met Arg
Pro; 10
Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie
Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser
Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin
Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys 15 Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp
Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys
Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val
Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin
Cys lie Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr 20 Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn
His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp
Cys Tyr Val lie Lys Ala Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys
Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys
Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr 25 Asp lie Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin
Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie
Leu lie Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe
Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly
Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe 30 Glu Val Glu Lys Cys lie Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp • Thr Tyr Asn Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly
Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala lie
Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu
Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro 35 Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr
Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr 6 100403
Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser
Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu
Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp 5 Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; tai
Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly
Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin 10 Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Vai Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly
Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp
Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg
Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys 15 Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai
Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro
Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser
His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser 20 Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr
Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly Arg Thr Tyr Arg
Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys
Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn 25 Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu
Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser
Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu
Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg 30 Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro
Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile
Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai 35 Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro, 7 100403 joka proteiini vaatii fibriinikofaktoria plasminogeenin aktivoimiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että kasvatetaan bakteeri- tai nisäkäsisäntäsoluja, jotka on transformoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää DNA:ta, 5 joka koodaa haluttua plasminogeeniaktivaattoriproteiinia, ja otetaan talteen haluttu proteiini.
Vampyyrilepakon syljestä ja sylkirauhasista eristetyt plasminogeeniaktivaattoriproteiinit eroavat sekä tPArsta että urokinaasista useiden rakenteellisten ja 10 funktionaalisten kriteerien suhteen. Toisin kuin tPA, keksinnön mukaisesti saatavat plasminogeeniaktivaattorit eivät sisällä kringle 2 -domeenia eivätkä plasmiiniherkkää prosessointikohtaa. Ekvimolaariset määrät näitä aktivaat-toreita ja tPArta ovat likimain yhtä tehokkaita, kun tark-15 käillään niiden kykyä katalysoida aikaisemmin muodostuneiden plasmahyytymien hajotusta. Niiden aktiivisuus plasmi-nogeeniä kohtaan stimuloituu ainakin 27 000-kertaiseksi fibriinikofaktorin läsnä ollessa. Vastaava arvo tPA:lle on vain 205-kertainen. Esillä olevan keksinnön mukaisesti 20 saatavat plasminogeeniaktivaattoriproteiinit eroavat myös
Cartwrightin [Blood, yllä] kuvaamasta desmokinaasista. Cartwright geelisuodattamalla puhdistetun desmokinaasi-fraktion molekyylipaino oli 150 00 daltonia ja se oli karakterisoitu puuttuvien funktioiden ja ominaisuuksien • 25 avulla.
Vampyyrilepakon syljestä on eristetty kolme eri molekyylilajia, jotka vastaavat tPA:n täysipituista muotoa, muotoa, josta puuttuu finger-domeeni, ja muotoa, josta puuttuvat finger-domeeni ja EGF-domeeni. Niihin viita-30 taan vastaavasti Bat-PA(H):na, Bat-PA(I):nä ja Bat- • PA(L):nä. Tästä lähtien viittaukset "Bat-PA":hän vastaavat fraktioimatonta preparaattia, joka sisältää kolme molekyy-limuotoa H:n, I:n ja L:n. Täysipituinen molekyylilaji, toisin kuin muut kaksi, sitoutuu tiukasti fibriiniin. Bat- 35 PA(H):11a, Bat-PA(I):llä ja Bat-PA(L):llä on vastaavasti 8 100403
Mr-arvot 49, 42 ja 40 kDa määritettynä SDS-PAGE:lla ditio-treitolin läsnäollessa (kuvio 1, kaista 1) . Bat-PA(H):n, Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n deglykosyloitujen muotojen (saatu poistamalla N-liitetyt hiilihydraattiketjut endo-5 glykosidaasi F:llä) näennäiset Mr-arvot ovat SDS-PAGE:lla määritettyinä vastaavasti 44, 40 ja 38 kDa (kuvio 1, kaista 2) . Näillä proteiineilla on tiukka vaatimus fibriini-kofaktorin läsnäolosta ja huomattava kyky katalysoida plasmahyytymien hajoitusta. Näiden proteiinien fibriiniin 10 sitoutunutta plasminogeeniä kohtaan osoittaman selektiivi-syyden mekanismi on useiden tekijöiden tulosta, joihin kuuluu fibriinin suora sitoutuminen ja voimakas inhibitio NaClrlla, joka helpottuu fibriinihyytymän läsnä ollessa. Lisäksi vampyyrilepakon plasminogeeniaktivaattorit ovat 15 vähemmän herkkiä kuin tPA inaktivaatiolle plasmassa olevien inhibiittorien vaikutuksesta.
Desmodus rotunduksen syljestä johdetusta "täysipi-tuisen" plasminogeeniaktivaattoriglykoproteiinin [Bat-PA(H) ] cDNA:sta ennustettu aminohapposekvenssi on': ^ ® Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-Gln-
Met-Ile-Tyr-Gln-Gln-Gln-Glu-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Glu-Val-Arg-Ser-Lys-Arg-Val-Glu-His-Cys-Arg-Cys-Asp-Arg-Gly-Leu-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-LeuT»Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-^ Thr-Cys-Trp-Gln-Ala-Ala-Ser-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-
Cys-Gln-Cys-Pro-Lys-Gly-Tyr-Thr-Gly-Lys-Gln-Cys-Glu-Val-Asp-Thr-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Ser-Thr-Ser-Glu-Ser-Gly-Ala-Gln-Cys-Ile-Asn-Trp-Asn-Ser-Asn-Leu-30 Leu-Thr-Arg-Arg-Thr-Tyr-Asn-Gly-Arg-Arg-Ser-Asp- • Ala-Ile-Thr-Leu-Gly-Leu-Gly-Asn-His-Asn-Tyr-Cys-
Arg-Asn-Pro-Asp-Asn-Asn-Ser-Lys-Pro-Trp-Cys-Tyr-Val-Ile-Lys-Ala-Ser-Lys-Phe-Ile-Leu-Glu-Phe-Cys-Ser-Val-Pro-Val-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Cys-Gly-Leu-35 Arg-Lys-Tyr-Lys-Glu-Pro-Gln-Leu-His-Ser-Thr-Gly-
Gly-Leu-Phe-Thr-Asp-Ile-Thr-Ser-His-Pro-Trp-Gln-Ala-Ala-Ile-Phe-Ala-Gln-Asn-Arg-Arg-Ser-Ser-Gly- tl 9 100403
Glu-Arg-Phe-Leu-Cys-Gly-Gly-Ile-Leu-Ile-Ser-Ser-
Cys-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Gln-Glu-
Arg-Tyr-Pro-Pro-Gln-His-Leu-Arg-Val-Val-Leu-Gly- 5
Arg-Thr-Tyr-Arg-Val-Lys-Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Gln-Thr-Phe-Glu-Val-Glu-Lys-Cys-Ile-Val-His-Glu-Glu-Phe-Asp-Asp-Asp-Thr-Tyr-Asn-Asn-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Gln-Leu-Lys-Ser-Gly-Ser-Pro-Gln-Cys-Ala-Gln-Glu-Ser-Asp-Ser-Val-Arg-Ala-Ile-Cys-Leu-Pro-Glu-10 Ala-Asn-Leu-Gln-Leu-Pro-Asp-Trp-Thr-Glu-Cys-Glu-
Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Lys-His-Lys-Ser-Ser-Ser-Pro-Phe-Tyr-Ser-Glu-Gln-Leu-Lys-Glu-Gly-His-Val-Arg-Leu-Tyr-Pro-Ser-Ser-Arg-Cys-Thr-Ser-Lys-Phe-Leu-Phe-Asn-Lys-Thr-Val-Thr-Lys-Asn-Met-Leu-Cys-Ala-^ Gly-Asp-Thr-Arg-Ser-Gly-Glu-Ile-His-Pro-Asn-Val-
His-Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Met-Asn-Asp-Asn-His-Met-Thr-Leu-Leu-Gly-Ile-Ile-Ser-Trp-Gly-Val-Gly-Cys-Gly-Glu-Lys-Asp-Ile-Pro-Gly-Val-Tyr-Thr-Lys-Val-Thr-Asn-Tyr-Leu-20 Gly-Trp-Ile-Arg-Asp-Asn-Met-Arg-Pro
Bat-PA(H) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 441 sekvenssin. Bat-PA(I) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 50 - 441 sekvenssin, 25 ja Bat-PA(L) sisältää kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 87 - 441 sekvenssin. Lisäksi aminohappo asemassa 88 on proteiinissa "L" vaihtunut treoniinista pro-liiniksi.
Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniakti-30 vaattoreiden puhdistamiseksi on tästä hakemuksesta jaka-·· maila erotetun suomalaisen patenttihakemuksen 953849 koh teena. Menetelmälle on tunnusomaista se, että: (a) homogenisoidaan vampyyrilepakon leuanalussylki-rauhasia seoksen muodostamiseksi, ja sentrifugoidaan seos 35 supernatanttifraktion muodostamiseksi; 10 100403 (b) pannaan supernatantti fosfoselluloosakationin-vaihtajapylvääseen, mikä johtaa Bat-PA:n absorptioon pylvääseen; (c) eluoidaan pylvästä Bat-PA:ta sisältävien frak-5 tioiden saamiseksi; (d) yhdistetään aktiiviset fraktiot, pannaan yhdistetty pooli affiniteettikromatogfafiapylvääsen, jossa on immobilisoitua Erythrinan trypsiini-inhibiittoria (ETI), ja eluoidaan Bat-PA puskurilla, jolla on matala pH.
10 Tähän keksintöön kuuluvat myös DNA-sekvenssit, jot ka koodaavat tämän keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja, kloonausvehikkelit, joissa on keksinnön mukaisia insertoituja DNA-sekvenssejä, ja keksinnön mukaisesti saatavien proteiinien kanssa reaktiiviset vasta-aineet.
15 Jokainen plasminogeeniä aktivoiva molekyylilaji aktivoituu fibriinin vaikutuksesta. Ainoa havaittava piirre, joka erottaa molekyylilajit toisistaan on vain Bat-PA (H) :11a oleva kyky sitoutua tiukasti fibriiniin, ominaisuus, joka korreloi finger-domeenin läsnä olon kanssa.
20 Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n spesifisyys fibriinin sitoutunutta plasminogeeniä kohtaan ei näytä riippuvan kyvystä sitoutua tiukasti fibriiniin.
Bat-PA:n aktiivisuuden ehdoton fibriiniriippuvuus on ominaispiirre, joka on haluttava fibrinolyysihoidon yh-25 teydessä. Vuotokomplikaatiot, jotka liittyvät trombolyyt-tisten aineiden käyttöön, voivat paheta verenkierrossa olevan plasminogeenin aktivoituessa plasmiiniksi. Vuoto-komplikaatioiden vakavuutta ja niiden esiintymistiheyttä voidaan vähentää käyttämällä tämän keksinnön mukaisesti 30 saatavaa plasminogeeniaktivaattoria, jonka vaikutus lokalisoituu fibriinihyytymän aluelle.
293-Bat-PA-l nisäkässolut (tunnuksella ATCC No. CRL 10180), BPA-CN-pSZ88-104-20 bakteerisolut (tunnuksella ATCC No. 68050), BPA-CK-pSZ89-111-17 bakteerisolut (tun-35 nuksella ATCC No. 68052), BPA-FK-p89WO-l bakteerisolut 11 100403 (tunnuksella ATCC No. 68051), BPA-FN-p89WO-2C bakteerisolut (tunnuksella ATCC No. 68053), ja BPA-DK-p89WP-20A bakteerisolut (tunnuksella ATCC No. 68049) on tallennettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, Bet-5 hesda, MD, USA, Budapestin sopimuksen vaatimusten mukaisesti. Ne ovat peruuttamattomasti saatavana tämän patentin tullessa julkiseksi. Kuitenkin on ymmärrettävä, että tal-lentusten saatavana olo ei anna lupaa käyttää keksintöä hallinnollisen toimien takaamien patenttioikeuksien vas-10 taisesti.
Kuvio 1 esittää puhdistettujen vampyyrilepakon plasminogeeniaktivaattorien SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia. Näytteet olivat vampyyrilepakon sylkirauhasista (kaistat 1 ja 3) ja syljestä (kaistat 2 ja 4).
15 Jokaista näytettä käsiteltiin endoglykosidaasi F:llä ennen SDS-PAGE:a. Kaistat 1 ja 2: "Western blotting" ja immuno-värjäys. Kaistat 3 ja 4: fibriiniautografia.
Kuvio 2 esittää vähän verihiutaleita sisältävien plasmahyytymien lyysiprosentin tPA:n ja lepakon 40 kDa:n 20 plasminogeeniaktivaattoriproteiinin katalysoimana.
Kuvio 3 esittää runsaasti verihiutaleita sisältävien plasmahyytymien lyysiprosentin tPA:n ja lepakon 40 kDa:n plasminogeeniaktivaattoriproteiinin katalysoimana.
Kuvio 4 esittää plasminogeeniaktivaattorien inakti-25 vaatiota plasman komponenttien vaikutuksesta.
Kuvio 5 esittää 40 ja 45 kDa:n proteiinien molekyy-lipainot SDS-PAGE:ssa tunnistettuna hopeavärjäyksellä ja fibriiniautografiällä.
Kuvio 6 esittää Bat-PA:n ja tPA:n katalysoimaa hyy-30 tymän hajoitusta.
Kuvio 7 esittää plasminogeeniaktivaattorien sitoutumista fibriiniin.
Kuvio 8a esittää vampyyrilepakon plasminogeeniakti-vaattori-cDNAin nukleotidisekvenssin ja plasminogeeniakti-35 vaattorien aminohapposekvenssit.
12 100403
Kuviossa 8b nähdään kaavamainen esitys vampyyrile-pakon plasminogeeniaktivaattorin aminohapposekvenssistä ja sen vertailu ihmisen tPA:han.
Kuvio 9 kuvaa kaavamaisesti tunnetusta plasmidista 5 pSP73 johdetun ja Bat-PA(H)-geenisekvenssin sisältävän plasmidin pSZ88-100-20 synteesiä ja lopulta tunnetusta plasmidista pD5 johdetun ja joka Bat-PA(H)-geenisekvenssin sisältävän plasmidin pSZ88-104-20 synteesiä.
Kuvio 10 kuvaa kaavamaisesti tunnetusta plasmidista 10 pSP73 johdettujen ja Bat-PA(H)-geenisekvenssin sisältävien plasmidien pSZ89-109, pSZ89-110, p89-WO-10 ja p89WO-8 synteesiä ja tunnetusta plasmidista pD5 johdettujen ja Bat-PA (H) -geenisekvenssin sisältävien plasmidien pSZ89-lll, pSZ89-112 ja pSZ89-113 synteesiä.
15 Kuvio 11 kuvaa kaavamaisesti tunnetusta plasmidista pSP73 johdettujen ja Bat-PA(I}-geenisekvenssin sisältävien plasmidien p89-WO-14, p89-WO-5,6, p89-WO-9 ja p89WO-12 synteesiä ja tunnetusta plasmidista pD5 johdettujen ja Bat-PA(I)-geenisekvenssin sisältävien plasmidien p89WO-l, 20 p89WO-2A,B,C, p89WO-3 ja p89WO-4 synteesiä.
Kuvio 12 kuvaa kaavamaisesti plasmidien p89WP-20A&B ja p89WP-19A&B synteesiä vastaavasti tunnetuista plasmi-deista pD5 ja p89WP-17:sta ja p89WP-18:sta. p89WP-17 saatiin p89WO-ll:sta ja p89WP-18 p89WO-9:stä.
25 Sanoja proteiini ja polypeptidi käytetään tässä keskenään vaihdettavasta ja ne viittaavat amidisidoksin toisiinsa liitettyjen aminohappojen lineaariseen polymeeriin. Aminohappojen sekvenssi ketjussa on kriittisen tärkeä proteiinin eli polypeptidin biologiselle toiminnalle.
30 Plasminogeeniaktivaattorit, kuten sanaa tässä käytetään, viittaavat proteiineihin, jotka katalysoivat plasmiinin muodostumista, entsyymin, joka hydrolysoi arginiinin ja lysiinin peptidejä ja estereitä, ja muuttaa fibriinin liukoisiksi tuotteiksi.
13 100403
Proteiinien vastaiset monoklonaaliset ja polyklo-naaliset vasta-aineet ovat hyödyllisiä tämän keksinnön mukaisten proteiinien eristämiseen ja tunnistamiseen. Ne voidaan tuottaa millä tahansa normaalilla sinänsä tunne-5 tulla tavalla. Esimerkiksi polyklonaalisia vasta-aineita voidaan syntetisoida eläimessä, kuten kanissa, joka on saanut injektion Desmodus rotunduksen plasminogeeniakti-vaattoriproteiineja. Injektion jälkeen vasta-ainetaso eläimessä nousee. Vasta-ainetta sisältävää verta, jota 10 kutsutaan antiseerumiksi, otetaan sitten eläimestä. Plas-minogeeniaktivaattorille spesifinen vasta-aine erotetaan sitten antiseerumin muista vasta-aineista millä tahansa joukosta erotustekniikoita, esim. affiniteettikromatogra-fiällä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa 15 käyttäen Kohlerin ja Milsteinin tekniikkaa, Nature 256 (1975) 495 - 497.
Natiivit proteiinit, kuten termiä käytetään tässä, viittaavat vastaavien geenien tuottamiin täysipituisiin proteiineihin. Rekombinanttimenetelmin saatu viittaa halu-20 tun proteiinin geenin tai cDNArn eristämiseen ja tämän puhdistetun geenin tai cDNArn käyttöön sellaisen solun tuottamiseksi, joka ylituottaa haluttua proteiinia. Frag-menttimuodot määritellään proteiinien eli polypeptidien osiksi, joissa on vähemmän aminohappoja kuin natiiveissa 25 proteiineissa, mutta jotka sisältävät plasminogeeniakti- vaattorien aktiivisen kohdan tai kohtia. Mikroheterogeeni-set muodot, kuten termiä tässä käytetään, viittavat yksittäiseen geenituotteeseen, siis proteiiniin, jota tuotetaan DNA:n yksittäisestä geeniyksiköstä, jonka rakennetta muun-30 netaan translaation jälkeen. Nämä rakennemuutokset eivät eivät kuitenkaan johda mihinkään merkittäviin muutoksiin proteiinin aktiivisuudessa. Nämä muutokset voivat tapahtua joko in vivo tai eristys- ja puhdistusprosessin kuluessa.
In vivo muuntaminen voi johtaa, näihin rajoittumatta, 35 N-terminaalin asetylaatioon, proteolyysiin, glykosylaa- 14 100403 tioon tai fosforylaatioon. Proteolyysiin voi kuulua ekso-proteolyysi, jossa yksi tai useampia terminaalisia aminohappoja pilkotaan peräkkäin irti entsymaattisesti, tuloksena mikroheterogeenisiä muotoja, jotka sisältävät 5 vähemmän aminohappoja kuin alkuperäinen geenituote. Proteolyysiin voi kuulua myös endoproteolyyttinen modifikaatio, joka johtuu sellaisten endoproteaasien toiminnasta, jotka pilkkovat peptidin tietyistä kohdista aminohapposekvenssin sisällä. Samankaltaisia muutoksia voi tapahtua 10 puhdistusprosessin aikana, joka voi johtaa mikrohetero-geenisten muotojen syntyyn. Tavallisin puhdistuksen aikana tapahtuva muutos on proteolyysi.
Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmistetaan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly-15 peptidisekvenssi, joka on ainakin 95-%:isesti homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 441 polypepti-disekvenssin kanssa, jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka stimuloituu fibriinikofaktorin läsnä ollessa ja mainittu proteiinin 20 kykenee sitoutumaan tiukasti fibriiniin.
Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmistetaan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly-peptidisekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminohappojen 1 - 3 ja 50 - 441 polypep-25 tidisekvenssin kanssa, jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka stimuloituu fibriinikofaktorin läsnä ollessa.
Erään keksinnön sovellutusmuodon mukaan valmistetaan plasminogeeniä aktivoivaa proteiinia, jolla on poly-30 peptidisekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen kuviossa 8a esitettyjen aminoappojen 1 - 3 ja 87 - 441 polypep-tidisekvenssin kanssa (jossa aminohappo asemassa 88 on muutettu treoniinista proliiniksi), jolloin mainitulla proteiinilla on plasminogeeniä aktivoiva aktiivisuus, joka 35 stimuloituu fibriinikofaktorin läsnä ollessa.
15 100403
Edelleen keksintö koskee sellaisen geneettisen informaation eristämistä ja puhdistamista, joka on vastuussa yksittäisistä proteiineista, ja vastaavien proteiinien ekspressiomenetelmiä.
5 Kuvio 1 esittää puhdistetun lepakon plasminogeeni- aktivaattorin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE:a). Näytteet käsiteltiin ennalta 25 mM ditiot-reitolilla ennen elektroforeesia ll-%:isessa SDS-polyak-ryyliamidigeelissä. Kaistalla 1 nähdään vampyyrilepakon 10 sylkirauhasista puhdistettu aktivaattori (3,6 gg) ; kaistalla 2 nähdään aktivaattori (3,6 pg) , jota on käsitelty endoglykosidaasi F:llä (Boehringer Mannheim; 0,1 yksikköä, 24 tuntia, 37 °C:ssa); ja kaistalla 3 0,1 yksikköä endoglykosidaasi F:ä. Proteiinien molekyylipainomarkkerit ovat 15 ilmoitetun mukaiset. Lepakon plasminogeeniaktivaattoria (100 ng) rauhasista (kaista 1) ja syljestä (kaista 2) analysoitiin "Western blottingilla" käyttäen kanissa tuotettuja lepakon plasminogeeniaktivaattorin vastaisia vasta-aineita ja alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohessa 20 tuotettua kanin IgG:n vastaista vasta-ainetta. Rauhasista ja (kaista 3) ja syljestä (kaista 4) saadun aktivaattorin (15 KY) fibriiniautografia suoritettiin, kuten on kuvattu artikkelissa Laemmli, U. K., Nature 227 (1970) 680 - 685.
Kuviossa 1 esitettyjen tietojen saamiseksi Desmodus 25 rotundus -lepakoiden varsinaisia ja lisäleuanalussylkirau-hasia (6 g) pantiin 40 mlraan liuosta 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,5, ja homogenisoitiin välittömästi käyttäen Brinkmann-homogenisaattoria. Homogenaattia sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 27 000 x g 20 minuuttia. Supernatanttifrak-30 tio kirkastettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä • 100 000 x g 30 minuuttia, laimennettiin 50 mM NaCl-kon- sentraatioon liuoksella 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,01 %
Tween 80, ja vietiin fosfoselluloosakationinvaihtajapyl-vääseen (Whatman PII), joka oli tasapainotettu liuoksella 35 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 80. Näyt- 16 100403 teen pylvääseen viemisen jälkeen fosfoselluloosapylvästä pestiin perusteellisesti edellä mainitulla tasapainotus-puskurilla. Lepakon plasminogeeniaktivaattori eluoitiin fosfoselluloosapylväästä liuoksella 20 mM Tris-HCl, pH 5 7,2, 0,5 M NaCl ja 0,01 % Tween 80, ja vietiin affiniteet- tipylvääseen, joka muodostui Erythrinan trypsiini-inhi-biittorista (ETI) (American Diagnostica) liitettynä CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia). Affiniteettipyl-västä pestiin liuoksella 20 mM NaH2P04, 0,5 M NaCl, pH 7,0, 10 ja 0,01 % Tween 80, ja sen jälkeen aktivaattori eluoitiin liuoksella 50 mM Na-asetaatti, 0,2 M NaCl, pH 4,0, 0,1 % Tween 80. Aktivaattoria sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja 1 M Tris-emästä lisättiin siten, että lopulliseksi Tris-pitoisuudeksi tuli 25 mM. Puhdistettua näytettä säi-15 lytettiin -70 °C:ssa. Proteiinikonsentraatio arvioitiin BioRadin väriaineensitoutumismäärityksellä käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Kuvio 6 esittää lepakon plasminogeeniaktivaattorin ja tPA:n katalysoimaa hyytymän hajotusta. Plasmahyytymiä 20 muodostettiin lisäämällä 0,2 KY ihmisen trombiinia (Sigma) ja 7,5 mM CaCl2:a 195 μΐ.-an ihmisen plasmaa, joka sisälsi [125I]-fibrinogeeniä (100 000 cpm/hyytymä) . Jokaisen näytteen lopullinen tilavuus oli 200 μΐ. Hyytymät muodostettiin pienten puutikkujen läsnäollessa, ja niiden annet-25 tiin kiinnittyä tikkuihin, vanhennettiin 30 minuuttia 37 °C:ssa, litistettiin nesteen ulospuristamiseksi ja siirrettiin 250 pl:aan plasmaa, johon lisättiin 25 Y/ml hirudiinia (Sigma). 25 μΐ liuosta 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 % Tween 80, jossa oli plasminogeeniaktivaattori, li-30 sättiin liuokseen, joka ympäröi hyytymiä, näytteitä inku-boitiin 37 °C:ssa, ja otettiin pieniä eriä, joiden laskenta antoi Huokoisten fibriinin hajoitustuotteiden määrän. Tässä tutkimuksessa käytettiin sylkirauhasista puhdistettua lepakon plasminogeeniaktivaattoria ja kaksiketjuista 35 tPA:ta. * , 3 nM Bat-PA; | , 3 nM t-PA; ·, 10 nM Bat-PA; *, 10 nM t-PA. Lepakon plasminogeeniaktivaattorilla ja 17 100403 t-PA:lla nähtiin samankaltainen tehokkuus, kun tarkkailtiin niiden kykyä katalysoida radioleimattujen fibriinin hajoitustuotteiden vapautumista aikaisemmin muodostuneista plasmahyytymistä.
5 Kuviossa 7 nähdään plasminogeeniaktivaattorien si toutuminen fibriiniin. Kaista 1, Bat-PA, 1,8 pmol; kaistat 2 ja 3, 10 % pohjasakka- ja vastaavasti supernatanttifrak-tion tilavuudesta lepakon plasminogeeniaktivaattoria sisältävästä fibriininäytteestä; kaista 4, yksiketjuinen 10 tPA, 1,8 pmol; kaistat 5 ja 6, 10 % pohjasakka- ja vastaavasti supernatanttifraktion tilavuudesta tPA:ta sisältävästä fibriininäytteestä; kaista 7, urokinaasi, 0,5 pmol; kaistat 8 ja 9, 10 % pohjasakka- ja vastaavasti supernatanttifraktion tilavuudesta urokinaasia sisältävästä fib-15 riininäytteestä. Kolme lepakon plasminogeeniaktivaattorien molekyylilajia ovat epätasaisesti jakautuneet supernatant-ti- ja pohjasakkafraktioiden välille. Suurin osa Bat-PA(H):sta jakaantuu fibriinisakkaan (kaista 2), kun taas Bat-PA(I):llä ja Bat-PA(L):llä ei ole havaittavaa affini-20 teettiä fibriiniä kohtaan, ja ne sijoittuvat pääasiassa supernatanttifraktioon (kaista 3) . Myös pienistä eristä tPA:ta (kaista 4) ja urokinaasia (kaista 5) tarkastettiin niiden kyky situtua fibriiniin. Odotusten mukaisesti tPA sitoutuu tiukasti fibriiniin ja jakaantuu pohjasakkafrak-25 tioon (kaista 5), mutta urokinaasi sijoittuu yksinomaan supernatanttifraktioon (kaista 9).
Fibriinihyytymiä muodostettiin lisäämällä 0,2 KY trombiinia 200 pl:aan puskuria 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,4, 0,01 % Tween 80, jossa oli ihmisen fibrinogeeniä 30 (1 mg/ml), EDTA (5 mM) ja lepakon plasminogeeniaktivaatto ria (18 pmol) tai yksiketjuista tPA:ta (18 pmol) tai urokinaasia (5,5 pmol). Yksiketjuinen tPA puhdistettiin yksi-ja kaksiketjuisen tPA:n seoksesta kromatografialla pylväässä, jossa oli etupäässä yksiketjuista tPA:ta sitovaa 35 monoklonaalista vasta-ainetta (PAM-1, American Diagnos-tica). Fibriinihyytymien annettiin vanheta tunnin ajan 18 100403 37 °C:ssa, ja ne sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 100 000 x g 10 minuutin ajan. Pohjasakkafraktioita pestiin 400 plrlla puskuria, jossa oli NaH2P04, NaCl ja Tween 80, jäl-leensuspensoitiin 150 pl:aan 0,5 % SDS:ä ja inkuboitiin 37 5 °C:ssa 1,5 tuntia jatkuvassa sekoituksessa. Pohjasakka- ja supernatanttifraktioita, jotka sisälsivät lepakon plas-minogeeniaktivaattoria, käsiteltiin Endo F:llä. Näytteet vietiin SDS-PAGE:en ja analysoitiin FA-analyysillä.
Plasminogeeniaktivaattorimääritykset 10 Fibriinimaljamenetelmä: Fibriinimaljoja tehtiin liuottamalla naudan tai ihmisen fibrinogeeniä (2 mg/ml) ja ihmisen Glu-plasminogeeniä (6 pg/ml) l-%:iseen agaroosi-liuokseen (jota pidettiin 55 °C:ssa). Sitten lisättiin ihmisen trombiinia (1,5 yksikköä), ennen kuin sekoitettu 15 liuos valettiin kalibroituihin immunodiffuusiolevyihin.
Kiinteytyneeseen fibriinimaljaan stanssattiin kuopat, ja pylväsfraktioita pantiin niihin. Aktiivisuuden ollessa läsnä havaittiin lyysialueita. Lyysialueen pinta-ala (mm2) jaettuna inkubaatioajalla 37 °C:ssa voidaan korreloida 20 entsyymin aktiivisuusyksiköihin.
Fibriiniautografia: Näytteet pannaan SDS-PAGE:en ei-pelkistävissä olosuhteissa, ja akryyliamidigeeliä pestään perusteellisesti Triton-X-100:11a (2,5 %), ja sitten se pannaan plasminogeeniä sisältävän fibriini-agaroosi , 25 -geelin päälle. Plasminogeeniaktivaattorit renaturoituvat
Triton-käsittelyn vaikutuksesta ja diffundoituvat agaroo-sigeeliin, jossa ne aktivoivat plasminogeeniä,-josta tulee plasmiinia. Syntynyt plasmiini hajottaa fibriiniä muodostaen fibrinolyysialueen, joka havaitaan helposti hajoamat-30 toman fibriinin taustaa vasten.
Kytketty amidolyysimääritys: Plasminogeenin akti voitumista, josta syntyy plasmiinia, tutkittiin Desafibin läsnä ollessa, ja plasmiinin muodostumista tarkkailtiin kolorimetrisen plasmiinisubstraatin, Spectrozyme PL:n, 35 avulla. Lepakon plasminogeeniaktivaattoreita inkuboitiin ihmisen Glu-plasminogeenin (20 pg/ml), Spectrozyme PL:n 19 100403 (0,4 mM) ja Desafibin (80 pg/ml) kanssa. Seosta inkuboi-tiin 37 °C:ssa 60 minuuttia. Reaktio lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 10-%:ista SDS:ä. Hajotetun substraatin absorbans-sia tarkkailtiin aallonpituudella 405 nm. Lepakon plasmi-5 nogeeniaktivaattoreiden aktiivisuusyksikkö vastaa sitä entsyymimäärää, joka katalysoi yhden mikromoolin Spektro-zyme PL:ä hajoamisen yhdessä minuutissa 37 °C:ssa.
Aktiivisten kohtien titraus: Vampyyrilepakon plas-minogeeniaktivaattoreita titrattiin kahdella eri teknii-10 kalla funktionaalisen molaarisuuden määrittämiseksi. En simmäinen tekniikka perustui kalibroidun trypsiinistandar-din takaisintitraukseen kalibroidulla kloorimetyyliketoni-inhibiittoristandardiliuoksella, joka inhiboi sekä tryp-siiniä että plasminogeeniaktivaattoreita. Trypsiiniliuos 15 (500 nM) titrattiin suoraan käyttäen 4-metyyli-umbellife- ryyli-p-guanidiinibentsoattia (MUGB). Kloorimetyyliketoni (dansyyli-glutamyyli-glysyyli-arginiinikloorimetyyliketöni, DNS-EGRCK) titrattiin MUGB-kalibroitua trypsiiniä vastaan. Tällaisen kalibroidun trypsiiniliuoksen reaktio ka-20 libroidun kloorimetyyliketoniliuoksen kanssa mahdollistaa trypsiinistandardin inhibition vähenemisen mittauksen, kun CK-standardia esi-inkuboidaan aktivaattoreiden kanssa. Lepakon plasminogeeniaktivaattoreiden läsnäolo johtaa aktiivisuuden lisääntymiseen verrattuna trypsiini-CK-kont-25 rolliin plasminogeeniaktivaattorin määrään verrannolli sesti .
Toiseen tekniikkaan kuuluu "burst"-kinetiikan tarkkailu sen jälkeen, kun MUGBE:tä on lisätty lepakon plas-minogeeniaktivaattoriin, kun reaktio toteutetaan matalassa 30 lämpötilassa (5 °C).
SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi: Käytimme muunnettua menettelyä Laemmlin systeemistä [Nature 227 (1970) 680 - 685]. Konsentrointi- ja erotusgeelit (0,75 mm) sisälsivät 4 ja vastaavasti 10 % polyakryyliamidia.
35 Geelejä ajettiin 75 voltilla 20 tuntia. Proteiini havait tiin hopeavärjäyksellä.
20 100403
Lepakon plasminogeeniaktivaattoriproteiinien puhdistus on tästä hakemuksesta jakamalla erotetun hakemuksen 953 849 kohteena.
Materiaalit: Desmodus rotunduksen sylkeä ja sylki-5 rauhasia hankittiin Antibody Associatesilta, Bedford, TX, ja tri C. Rupprechtilta, Rabies Unit, Wistar Institute, Philadelphia, PA. Fibrinogeeni, plasminogeeni, trombiini ja substraatit amidolyysimääritykseen olivat American Diagnosticalta, New York, NY. Elektroforeesiin käytetyt 10 materiaalit hankittiin BioRad, Inc:ltä, ja pylväskromato-grafiaan käytetyt materiaalit olivat Pharmacialta. HPLC-pylväät olivat Vydacin tuotteita. Immunodiffuusiolevyt olivat ICNrltä.
Menettely: Aktivaattoreiden puhdistukseen vampyyri-15 lepakon syljestä kuuluu fosfoselluloosa-, fenyyli-Sepharo-se- ja C4-käänteisfaasi-HPLC-kromatografiavaiheet.
Vampyyrilepakon Desmodus rotunduksen sylkeä laimennettiin kolminkertaiseen tilavuuteen liuoksella 10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 20. Laimennettua 20 sylkeä sentrifugoitiin viisi minuuttia nopeudella 12 000 rpm 4 °C:ssa Eppendorf-sentrifuugilla. Supernatantti ladattiin suoraan fosfoselluloosapylvääseen (25 x 10 cm) ja pestiin samalla puskurilla, jota käytettiin syljen laimentamiseen. Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 6 ml tunnis-25 sa. Aktiivisuus määritettiin lyysialueen pinta-alan mukaan käyttäen fibriinimaljamenetelmää, ja proteiinia tarkkailtiin absorbanssilla aallonpituudella 280 nm.
Lepakon plasminogeeniaktivaattorit sitoutuivat tiukasti fosfoselluloosapylvääseen. Aktiivisuuden saanto 30 eluution, käyttäen 1 M NaCl:a, jälkeen oli 94 % (taulukko I) .
Plasminogeeniaktivaattoria sisältävät fraktiot fos-foselluloosapylväästä yhdistettiin ja pantiin suoraan fe-nyyli-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 5,0 cm) 2,5 M NaCl:n 35 läsnäollessa. Pylvästä pestiin 2 M - 0 M NaCl-gradientilla 21 100403 10 πιΜ Tris-puskurissa, jossa oli 10 % glyserolia. Pesu 10-%:isella glyseroliliuoksella jatkui, kunnes kaikki aktiivisuus oli eluoitunut.
Kromatografiasta fenyyli-Sepharose-pylvästä käyttä-5 en saatiin tuloksena 82 %:n aktiivisuuden saanto (taulukko I). Kuitenkin aktiivisuus oli jakautunut kahteen huippuun, 1 ja 2, jotka koottiin erikseen yhteen. Näillä kahdella huipulla nähtiin eri molekyylipainot SDS-PAGE:n ja fibrii-niautorafian jälkeisellä hopeavärjäyksellä määritettynä 10 (kuvio 5). Huippu 1, jonka uskomme edustavan Bat-PA(L):ä, eluoitui suolagradientin (2 M - 0 M NaCl) loppupuolella. Uskomme huippu 2:n edustavan Bat-PA(I):tä.
Fenyyli-Sepharosen jälkeen saavutimme Bat-PA(L):n noin 660-kertaisen puhdistumisen. Bat-PA(I)-entsyymin ko-15 konaisaktiivisuutta ei määritetty optimaalisesti plasmi-nogeeni/Spectrozyme PL -kytkentäsysteemiä käyttäen, koska Desafib ei ole tehokas kofaktori tälle lepakon plasmino-geeniaktivaattorille.
Taulukko I
20 Puhdistustaulukko
Vaihe Aktiivisuus Saanto Proteiini yksikköä % OD 280 25 Lepakon sylki (4ml) 206 100 76,230
Fosfoselluloosa 194 94 7,000
Fenyyli-Sepharose
Huippu 1 142 69 0,079
Huippu 2 271 131 0,083
30 C4-käänteisfaasi-HPLC
Huippu 1 119 57 N.D.
35
Desafib ei ole oikea kofaktori tälle Bat-PA:n mo-lekyylilajille. N.D. ei määritetty.
22 100403
Lopullinen puhdistusvaihe proteiineille oli C4-käänteisfaasi-HPLC-pylväs, joka oli tasapainotettu 0,1 % (v/v) trifluorietikkahapolla vedessä. Proteiinien yhdistetyt fraktiot konsentroitiin kylmäkuivauksella ja pantiin 5 suoraan HPLC-pylvääseen. Entsyymi eluoitiin gradientilla 25 - 55 % asetonitriiliä 0,1 % TFA:n läsnäollessa. Pro-teiinihuipuja tarkkailtiin absorbanssilla aallonpituudella 214 nm, ja ne kerättiin erikseen. Haihtuvat ainekset poistettiin tyhjiösentrifugoinnilla, mitä seurasi kylmä-10 kuivaus. Proteiinit liuotettiin uudelleen 10 mM etikkahap- poon. Aktiivisuus määritettiin käyttäen fibriinimaljamene-telmää sen jälkeen, kun etikkahappo oli neutraloitu Tris-Tween-puskurilla.
Lepakon plasminogeeniaktivaattorit puhdistettiin 15 vampyyrilepakon sylkirauhasista seuraavasti.
Vampyyrilepakoiden varsinaisia ja lisäleuanalus-sylkirauhasia pannaan puskuriin, joka sisältää 10 mM Tris-HC1, 0,5 M NaCl, 0,1 % Tween 80, pH 7,5, ja homogenisoidaan välittömästi polytronilla. Sentrifugoinnin jälkeen 20 kirkastunut supernatanttifraktio samanaikaisesti konsent roidaan ja tasapainotetaan puskuriin 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,2, käyttäen sekoituksessa pidettyä Amicon-kam-miota (YM 10-kalvo). Retentaatti pannaan suoraan fosfosel-luloosapylvääseen (Whatman), joka on tasapainotettu pusku-25 rilla 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,01 % Tween 80, pH 7,2.
Plasminogeeniaktivaattoriproteiini absorboituu kvantitatiivisesti fosfoselluloosapylvääseen, ja se eluoidaan hyppäyksellä aloituspuskuriin, jota on täydennetty 0,5 M NaCl:11a. Aktiivisuuden saanto on tyypillisesti yli 80 %.
30 Aktivaattoriaktiivisuutta sisältävät fraktiot yh- • distettiin ja pantiin affiniteettipylvääseen, joka koostui
Sepharose 4B:hen liitetystä Erythrinan trypsiini-inhibiit-torista (ETI). Suurin osa aktiivisuudesta absorboitui tähän pylvääseen ja eluoitui tehokkaasti, kun pylvästä pes-35 tiin 50 mM Na-asetaattipuskurilla, pH 4,0, jossa oli 0,2 M
23 100403
NaCl ja 0,1 % Tween 80. Lopullinen lepakon plasminogeeni-aktivaattoriaktiivisuuden saanto rauhasuutteesta tätä menettelyä käyttäen oli 91 %, josta saatiin noin 5,4 mg lepakon plasminogeeniaktivaattoria 6 g:sta rauhasia. Lepakon 5 plasminogeeniaktivaattoripreparaatin homogeenisuuteen viittasi arvioidun proteiinikonsentraation ja lasketun funktionaalisen molaarisuuden, määritettynä aktiivisten kohtien titrauksella käyttäen 4-metyyli-umbelliferyyli-p-guanidinobentsoaattia [Urano ym., Biochem. Biophys. Res. 10 Comm. 150 (1988) 45 - 51], vastaavuus.
Yhdistettyjen aktiivisten fraktioiden SDS-PAGE:n jälkeinen proteiinivärjäys paljastaa monimutkaisen sarjan vyöhykkeitä, joilla on joukko eri Mr-arvoja. Näiden mole-kyylilajien liikkuvuus vastaa FA-analyysin määrittelemiä 15 aktiivisuusvyöhykkeitä. Tämä vastaavuus ja lisäksi yhteen sopivuus aminohappoanalyysissä, N-terminaalisessa analyysissä ja aktiivisten kohtien titraustuloksissa ovat todisteina siitä, että aktivaattori on puhdistettu onnistuneesti homogeeniseksi.
20 Proteiinin karakterisointi ja aktiivisuus: Tämän keksinnön mukaisesti saaduilla plasminogee-niaktivaattoreilla ei havaita aktiivisuutta plasminogee-nittömillä fibriinimaljoilla. Aktivaattorien inkubointi plasminogeenin kanssa fibriini I:n (Desafibin) ollessa 25 läsnä johtaa plasmiinin muodostumiseen päätellen "Western blottingista" ja immunovärjäyksestä plasmiinin/plasmino-geenin vastaisella vasta-aineella. Niillä nähdään aktiivisuus ihmisen fibriiniin sitoutunutta ihmisen plasminogee-niä kohtaan kuin myös naudan fibriiniin sitoutunutta nau-30 dan plasminogeeniä kohtaan.
Sepharose G-200 -geelisuodatuskromatografiässä puhdistamattomassa syljessä oleva lepakon plasminogeeniak-tivaattoriaktiivisuus eluoitui leveänä huippuna, jonka likimääräinen molekyylipaino oli 130 kDa. Tämä molekyyli-35 paino oli todennäköisesti lepakon plasminogeeniaktivaatto- 24 100403 rin aggregoitunut molekyylipaino. Se näytti olevan 32 kDa paikkeilla FPLC-Sepharose-pylväässä 0,01 % Tween 20:n läsnäollessa .
Puhdistusta tutkittaessa lepakon plasminogeeniak-5 tivaattori ei reagoinut lysiini-Sepharosen kanssa, jonka oli aikaisemmin osoitettu olevan tehokas vaihe puhdistet-tessa proteiineja, jotka sitoutuvat fibriiniin kringle-domeenilla. Siten aktivaattoreiden fibriiniinsitoutumisme-kanismin on toinen kuin tPA:lla.
10 Aktivaattorien käsittely endoglykosidaasi H:11a ja F:llä muodostaa aktiivisia proteiineja, joilla on alempi molekyylipaino, mikä viittaa siihen, että aktivaattorit ovat glykoproteiineja. Näiden proteiinien interaktio aga-roosin kanssa, johon on liitetty vehnänalkiolektiiniä tai 15 konkanavaliini A:ta, edelleen tukee tätä johtopäätöstä.
Bat-PA(H):n kykyä aktivoida Glu-plasminogeeniä arvioitiin kytketyllä määrityksellä, joka mittasi plasmiini-spesifisen amidolyysisubstraatin hajoamista (taulukko II) . Bat-PA(H):n spesifinen aktiivisuus (KY/nmol) Glu-plasmino-20 geeniä kohtaan oli noin 260 kertaa vähemmän kuin tPAclla, kun määritys tehtiin ilman fibriinin kaltaista ainetta. Kuitenkin Bat-PA(H):n spesifinen aktiivisuus Glu-plasmino-geeniä kohtaan Desafibin läsnäollessa oli noin 85 % tPA:lla nähdystä. Siten Desafib stimuloi tPA- ja Bat-25 PA(H)-aktiivisuutta vastaavasti 205- ja 45 000-kertaises-ti. Bat-PA:lla, kolmea molekyylimuotoa sisältävällä preparaatilla, nähty spesifinen aktiivisuus oli Bat-PA(H):n luokkaa ilman Desafibiä, mutta noin 30 % vähemmän kuin Bat-PA(H):11a tämän fibriinikofaktorin läsnäollessa (tau-30 lukko II). Päättelemme, että Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n aktiivisuudet eivät stimuloidu siinä määrin kuin Bat-PA (H) :11a 80 pg/ml Desafibin vaikutuksesta.
25 1 0 0 4 0 3
Taulukko II
Pl&smxnogeenin aktivaatio Bat-PA(B):n, Bat-PA:n ja tPA:n vaikutuksesta
Stimulaatio ^ Aktivaattori Desafib-konsentraatio kertaa 0 μα/ml fiQ pq/ml
Bat-PA(H) 1,05 ± 0,04 47,700 ± 4500 45,000 (220)
Bat-PA 1,24 i 0,08 33,500 ± 970 27,000 (130) tPA 270 ± 20 55,400 ± 1500 205 (1) 10 Näissä tuloksissa annetaan spesifiset aktiivisuudet (KY/nmol) käyttäen edellä kuvattua kytkettyä amido-lyysimääritystä. Kaksiketjuista tPA:ta käytettiin näihin määrityksiin; yksiketjuisen tPA:n katalyyttistä aktiivi-15 suutta ei ole raportoitu, koska tulokset sekoittaa kaksiket juisen tPA:n väistämätön syntyminen määrityksen aikana. Desafib on mukana määrityksessä ilmoitetun mukaisesti. Arvot otsikon Stimulaatio kertaa alla ovat spesifisten aktiivisuuksien suhteita Desafibin läsnäollessa spesifisiin 20 aktiivisuuksiin ilman Desafibia. Sulkeissa oleva luku on plasminogeeniaktivaattoriaktiivisuuden stimulaatio Desafibin vaikutuksesta suhteessa tPA:lla nähtyyn stimulaatioon.
Myös tPA:n ja Bat-PA(H):n kykyä katalysoida plas-minogeeniä sisältävien fibriinihyytymien hajoitusta ver-25 tailtiin. Bat-PA(H):ta tarvitaan hiukan korkeampia pitoisuuksia, jotta saavutetaan täysin samat hyytymien hajotus-nopeudet, jotka saadaan tPA-pitoisuuksilla 0,25 - 10 nM.
Ne tPA- ja Bat-PA(H)-pitoisuudet (johdettu niiden annos-vastekäyristä), joilla saadaan tietty hyytymän hajotusno-30 peus, esitetään taulukossa III. Bat-PA(H):n spesifinen aktiivisuus suhteessa tPA:han vaihteli välillä 59 - 72 % ja korreloi plasminogeeniaktivaattoripitoisuuden kanssa. Bat-PA(H):n tPA:n suhteen lisääntynyt spesifinen aktiivisuus suuremmissa pitoisuuksissa voi heijastaa eroja näiden 35 plasminogeeniaktivaattorien välillä niiden vuorovaikutus-tavoissa fibriinin ja/tai plasminogeenin kanssa.
26 100403
Taulukko III
tPA:n ja Bat-PA(H):n välittämä fibriinihyytyrnien hajotus
Suhteellinen tehokkuus
Nopeus _ tPA (nMV BatrEAiH).-£nM) _ 5 0,850 9f33 ± 1,11 12,9 ± 1,05 72,3 0,825 7,52 ± 0,88 10,53 ± 0,83 71,4 0,800 6,05 ± 0,69 8,60 ± 0,66 70,4 0,775 4,88 ± 0,54 7,02 ± 0,52 69,5 0,725 3,16 ± 0,34 4,68 ± 0,32 67,5 10 0,675 2,05 ± 0,21 3,12 ± 0,20 65,7 0,625 1,33 ± 0,13 2,08 ± 0,12 63,9 0,575 0,86 ± 0,08 1,39 ± 0,07 61,9 0,525 0,56 ± 0,05 0,92 ± 0,05 60,9 0,475 0,36 ± 0,03 0,61 ± 0,03 59,0 15 0,425 0,24 ± 0,02 0,41 ± 0,02 58,5
Hyytymänhajoituskokeet turbidometristä määritystä käyttäen tehtiin neljällä rinnakkaisella seuraavilla pitoisuuksilla kaksiketjuista tPA:ta tai Bat-PA(H):ta: 0,25, 20 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 ja 10,0 nm. Hyytymän hajoitusno- peudella tarkoitetaan turbiditeetin vähenemisen maksiminopeutta (-mOD/minuutti) määritettynä jokaisen hyytymänha-joitusprofiilin analyysistä Softmax-kinetiikkaohjelmistol-la. Neljä ja kuusi riippumatonta annosvastekäyrää (nopeus 25 plasminogeeniaktivaattoripitoisuuden logaritmin funktiona) tuotettiin vastaavasti tPA:lle ja Bat-PA(H):lie. Taulukossa on tulostettuna ne plasminogeeniaktivaattoripitoisuu-det, jotka johtavat ilmoitettuihin hyytymänhajoitusnopeuk-siin. Nämä arvot johdettiin yhtälöistä, jotka kuvaavat 30 kaikkien tPA:n ja Bat-PA(H):n annosvastekäyrien analyysis-“ tä konstruoituja "best-fit"-käyriä. Suhteellisen tehokku- den arvot ovat ilmoitettuun hyytymänhajoitusnopeuteen johtavan tPA-pitoisuuden suhteita Bat-PA(H)-pitoisuuksiin.
Tämän keksinnön mukaisesti saatavat lepakon plas-35 minogeeniaktivaattorit ovat vähemmän herkkiä kuin tPA in- 27 100403 aktivaatiolle nopeasti toimivan tyypin 1 plasminogeeniak-tivaattori-inhibiittorin (PAI-1) vaikutuksesta.
Uskotaan, että PAI-1:n pitoisuus tukkeutuneen suonen aluella voi olla paljon korkeampi kuin plasmatutkimuk-5 sista arvioidut pitoisuudet. Latentin PAI-1:n läsnäolo plasmassa ja se, että verihiutaleissa on PAI-l:tä, joka voi vapautua trombiinin, adenosiinidifosfaatin ja muiden verihiutaleagonistien vaikutuksesta, vaikuttavat osaltaan suhteellisen korkeisiin paikallisiin pitoisuuksiin tukkeu-10 tuneilla alueilla. PAI-1 toimii anti-aktivaattorina, joka salpaa spesifisesti tPA:n aktiivisuuden.
Kuviosta 4 nähdään, että tPA inaktivoituu helpommin plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorien vaikutuksesta kuin vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattorit.
15 Kutakin tPA:ta ja vampyyrilepakon syljen plasminogeeniak-tivaattoreita inkuboitiin plasmassa, ja kunkin aktiivisuutta tarkkailtiin ajan funktiona.
NaClrn välittämää plasminogeeniaktivaation inhibi-tiota ei havaittu kummallakaan tPA:lla eikä 40 kDa prote-20 iinilla, kun tarkkailimme fibriinihyytymien hajoitusta.
Tässä tapauksessa hyytymät tehtiin puhdistetuista komponenteista, joihin kuuluivat fibrinogeeni (sekä leimattu että leimaamaton), plasminogeeni, a2-antiplasmiini, faktori XHIa ja puskuri, jossa oli 0,1 M NaCl:a tai joka oli 25 sitä ilman.
Bat-PA:n SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja proteiinien "blotting" Immobilonille (PVDF-kalvoille)
Trypsiini-inhibiittoriaffiniteettipylväästä saatiin yhdistetyt aktiiviset fraktiot, ja niitä fraktioi-30 tiin edelleen käyttäen Vydac C4-HPLC -pylvästä, josta " plasminogeeniaktivaattoriproteiini eluoitui kohdalla noin 40-%:inen asetonitriili/0,l-%:inen trifluorietikkahappo. HPLC-pylväästä voitiin havaita eluoituvan kaksi aktiivisuuden päähuippua (fibriinimalja-autolyysillä määritetty-35 nä) . Nämä kaksi aktiivisuushuippua koottiin erikseen yh teen, ja niille annettiin nimet Bat-PA (I) ja Bat-PA (II).
28 100403 Käyttäen SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (SDS-PAGE:a), jota seuraa fibriiniatografia, seka Bat-PA (I):llä että Bat-PA (II) :11a nähdään samanlainen lyysivyö-hykkeiden kuvio, joka kattaa molekyylipainot 42 000 - 5 46 000 daltonia. Sekä Bat-PA (I) että Bat-PA (II) voitiin leimata 3H-DFP:llä (di-isopropyylifluorifosfaatilla), se-riiniproteaasien aktiivisen keskuksen leimausreagenssilla.
Lepakon I:ksi ja II:ksi nimettyjen plas-minogeeniaktivaattoreiden pölyäkryyliamidigeelielektrofo-10 reesi suoritettiin käyttäen muunnettua menettelyä Laemm-lin systeemistä [Nature 227 (1970) 680 - 685]. Konsent- rointi- ja erotusgeelit (0,75 mm) sisältävät 4 ja vastaavasti 10 % polyakryyliamidia. Geelejä ajetaan 75 voltilla 20 tuntia.
15 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla erote tut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilo-nille (PVDF-kalvoille), jota oli hankittu Milliporelta, luettelonumero IPVH304FO. Proteiinien elektroforeettinen siirto ("electroblotting") suoritettiin olennaisesti kuten 20 Matsudaira [J. Biol. Chem. 262 (1987) 10 035 - 10 038] on kuvannut. Lyhyesti kuvattuna, proteiinit eluoidaan elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeelistä 30 voltilla 15 tunnin ajan. Sitten Immobilon-blottia värjätään Coomas-sie Bluella proteiinivyöhykkeiden havaitsemiseksi blotil-25 la. Proteiinivyöhykkeet leikataan suoraan irti blotista ja pannaan mallin 477A kaasufaasisekvensoijaan, jossa on po-lybreeniesikäsittelysuodatin blotatun näytteen alapuolella. Sekvensoijan ohjelmat ja reagenssit ovat valmistajan (Applied Biosystems) toimittamat. Vapautuneet aminohappo-30 johdannaiset tunnistetaan suoraan laitteeseen kytketyllä HPLC-systeemillä.
Vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattorei-den N-terminaaliset aminohapposekvenssit SDS-PAGE:lla fraktioidun plasminogeeniaktivaatto-35 rin N-terminaalinen sekvensointi suoritettiin käyttäen 29 100403 polyvinylideenidifluoridikalvoa (Immobilon, Millipore) ja Applied Biosystemsin malli 470 sekvensoijaa, jossa on suoraan laitteeseen kytketty PTH-analyysi [Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262 (1987) 10 035 - 10 038]. Plasminogeeniak-5 tivaattorin V8-fragmentteja tuotettiin aktivaattorin pelkistys /aikylointi-käsittelyllä ditiotreitoli/jodiasetamidilla, muunnetun proteiinin inkubaatiolla Staphylococcus aureuksen V8-proteaasilla (Boehringer Mannheim), ja pro-teolyyttisten fragmenttien eristyksellä käyttäen Vydac 10 C18-HPLC -pylvästä. Aktiivisen keskuksen peptidifragment-ti, Tl, tunnistettiin seuraavasti: plasminogeeniaktivaat-toria inkuboitiin [ 1,3—3H]-di-isopropyylifluorifosfaatin (New England Nuclear) kanssa Desafibin (American Diagnos-tica) läsnä ollessa, käsiteltiin ditiotreitolilla ja jodi-15 asetamidilla, hajoitettiin trypsiinillä, ja radioleimattu fragmentti eristettiin HPLC:llä ja pantiin sekvenssianalyysiin .
Kahdeksan plasminogeeniaktivaattoriaktiivisuutta sisältävää proteiinivyöhykettä tunnistettiin Immobilon-20 blotilla ja pantiin sekvenssianalyysiin. Saadut sekvenssit annetaan seuraavassa: -( )- ilmaisee, että mitään aminohappoa ei voitu tunnistaa kyseisessä asemassa, luultavimmin tiettyjen aminohappojen instabiilisuuden ja heikon saannon proteiinisekvensoijasta takia.
25 Vyöhyke 1 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-Arg-Tyr-Phe
Vyöhyke 2 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-( )-Tyr-( )-Asp-Gln-Gly-Val
Vyöhyke 3 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr 30 Vyöhyke 4 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr-Lys
Vyöhyke 5 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-Phe-Ile-Gly-Gly
Vyöhyke 6 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-Lys-35 Asp-Gln-Gly-Val 30 100403
Vyöhyke 7 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly Vyöhyke 8 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr 5 Lepakon plasminogeeniaktivaattorin cDNA:n moleky- laarinen kloonaus
Yhdistelmä-DNA-teknologia määritellään tässä teknologiana, joka mahdollistaa geneettisen informaation, DNA:n, eri soluista, yleensä eri organismeista, olevien 10 segmenttien liittämisen peräkkäin yhteen niiden eliöiden ulkopuolella, joista DNA saatiin, ja tämän hybridi-DNA:n viemisen soluun, mikä mahdollistaa alkuperäisen DNA:n koodaaman proteiinin tuotannon. Geneettinen informaatio, DNA tai mRNA, eristetään ja sijoitetaan sopivaan kloonausvek-15 toriin ja transfektoidaan sopivaan isäntäsoluun.
Kloonausvektori, kuten termiä tässä käytetään, määritellään DNA-sekvenssiksi, johon on mahdollista sijoittaa spesifistä vierasta koe-DNA:ta ja viedä yhdistetty DNA isäntäsoluun, joka pysyy stabiilina ja pystyy eks-20 pressoimaan koe-DNA:n sanelemaa proteiinia. Vieras DNA yhdistettynä vektorin DNA:n kanssa muodostaa yhdistelmä-DNA-molekyylin, joka on rekombinanttimenetelmin saatu. Kloonausvektoreihin voivat kuulua plasmidit, bakteriofaa-git, virukset ja kosmidit. On ymmärrettävä, että mitä ta-25 hansa kloonausvektoria voidaan käyttää uusien Desmoduksen proteiinien DNA-sekvenssien kloonaamiseksi. Ekspressiovek-torit määritellään tässä DNA-sekvensseiksi, joita tarvitaan geenien kloonattujen kopioiden transkriptioon ja niiden mRNA:iden translaatioon sopivassa isännässä. Tällaisia 30 vektoreita voidaan käyttää ekspressoimaan joko prokaryoot-ti- tai eukaryoottigeenejä joukosssa eri soluja kuten bakteeri-, hiiva-, hyönteis- ja nisäkässoluissa. Proteiineja voidaan myös ekspressoida joukossa virussysteemeitä. Asianmukaisesti konstruoidussa ekspressiovektorissa pitäi-35 si olla: replikaation alkukohta autonomista replikaatiota 31 100403 varten isäntäsoluissa, selektoitavia merkkiominaisuuksia, rajoitettu määrä hyödyllisiä restriktioentsyymikohtia, suuri kopiolukumäärä ja vahvat promoottorit. Promoottori määritellään DNA-sekvenssiksi, joka ohjaa RNA-polymeraasin 5 sitoutumaan DNA:han ja aloittamaan RNA-synteesin. Vahva promoottori on sellainen, joka saa mRNA:ita alkamaan korkealla frekvenssillä. Ekspressiovektoreihin voivat kuulua, näihin rajoittumatta, kloonausvektorit, muunnetut kloo-nausvektorit, erityisesti suunnitellut plasmidit tai vi-10 rukset.
Sylkirauhasia saatiin kymmenestä vastatapetusta vampyyrilepakosta, ja niitä käytettiin polyA+-RNA:n eristykseen. Tätä RNArta käytettiin yksisuuntaisen lambda gt 22 cDNA-kirjaston konstruoimiseen, joka koostui yli 2 x 15 106 rekombinanttibakteriofaagista. Toinen RNA-preparaatti, jota käytettiin "Northern blotting" -analyysiin, eristettiin rauhasista, jotka oli nopeasti jäädytetty hiilihappo-jäällä. Tämän RNA:n laatu oli verrattavissa tuoreesta kudoksesta eristettyyn.
20 Kokonais-RNA eristettiin vampyyrilepakoiden (Des- modus rotundus) varsinaisista ja lisäleuanalussylkirauha-sista matalan lämpötilan guanidiumtiosyanaattimenetelmällä [Han, J. ym., Biochem. 26 (1987) 1617 - 1625]. Poly(A)+-RNA eristettiin oligo(dT)-selluloosakromatografiällä. Kak-25 sijuosteista cDNArta valmistettiin muunnoksella Gublerin ja Hoffmanin menetelmästä [Gene 25 (1983) 263 - 269], kuten aikaisemmin on kuvattu [Dixon, R. A. F. ym., Nature 321 (1986) 75 - 79] . cDNA fraktioitiin koon mukaan aga-roosigeelielektroforeesilla pooleihin, jossa pituudet oli-30 vat 1 - 2 kb ja 2 - 7 kb, jotka ligatoitiin EcoRI-kohtaan ’ lambda ZAP-"käsivarsiin" (Stratagene). Kirjastoja ampli- fioitiin E. coli -kannassa LE392 ja seulottiin plakkihyb-ridisaatiolla, kuten on kuvattu (Maniatis, T. ym., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-35 ratory, Cold Spring Harbor, NY). Peptidejä N-l, N-3, V-2 32 100403 ja T-l vastaavien, osittain päällekkäisten, toisilleen komplementaaristen oligonukleotidien parien annettiin pariutua, leimattiin Klenowin fragmentilla ja neljällä [a-32P]-dNTP:llä, ja käytettiin koettimena kirjastojen nit-5 roselluloosalle poimittujen kopioiden tutkimisessa. Hybridisaatio- ja pesuolosuhteet olivat, kuten on kuvattu (Ma-niatis ym., em. teos). Positiiviset kloonit plakkipuhdis-tettiin, ja cDNA-insertit pelastettiin infektoimalla yhdessä apufaagin kanssa valmistajan ohjeiden mukaan. Yksilö ja kaksijuosteista DNA:ta sekvensoitiin dideoksinukleoti-dimenetelmällä [Sanger, F. ym., Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 74, (1977) 5463 - 5467].
Kuviossa 8a nähdään plasminogeeniaktivaattori(e)n cDNArn nukleotidisekvenssi ja aktivaattori(e)n aminohap-15 posekvenssi. Nukleotidisekvenssi yltää pisimmän kloonin 5'-päästä ja läpi avoimen lukukehyksen. Vielä 800 nukleotidia translatoimatonta, poly(A)-häntään loppuvaa 3'-pään sekvenssiä jätetään näyttämättä. Nukleotidisekvenssi on numeroitu jokaisen rivin vasemmalla puolella ehdotetun 20 aloituskodonin ollessa ensimmäinen emäs. Ennustettu aminohapposekvenssi esitetään yksikirjaimisella koodilla, ja se on numeroitu jokaisen rivin oikealla puolella. Bat-PA(H):lle, Bat-PA(I):lie ja Bat-PA(L):lie määritetyt aminohapposekvenssit on alleviivattu ja merkitty vastaavasti 25 N-l:ksi, N-2:ksi ja N-3:ksi. Bat-PA(H) vastaa täysipituis-ta muotoa, josta signaalipeptidi on katkaistu tPA:n sig-naalinkatkaisukohdan kanssa analogisesta asemasta. Bat-PA ( I ) alkaa samoilla kolmella aminohapolla kuin Bat-PA(H), joita seuraavat sekvenssit, jotka alkavat EGF-domeenia 30 vastaavalla N-2:lla. Siten Bat-PA(I) vastaa Bat-PA(H):ta, josta puuttuu finger-domeeni. Bat-PA(L):n ainoalaatuinen aminohapposekvenssi alkaa samoilla kolmella aminohapolla, joita seuraa N-3:sta alkava polypeptidin osuus, paitsi että N-3:n toinen aminohappo on muutettu treoniinista pro-35 liiniksi, EGF-domeenin jälkeen, ja näin saadaan proteiinin 100403 33 muoto, josta puuttuvat finger-domeeni ja EGF-domeeni. Myös kahden Staphylococcus V8:n proteolyysifragmentin (V-l, V-2) ja yhden tryptisen fragmentin (T—1) aminohapposekvenssit on alleviivattu. Katkoviivalla alleviivaus ilmai-5 see aminohappotähteet, joita ei voitu määrittää tai jotka ovat ristiriidassa cDNArsta ennustettujen aminohappojen kanssa. Aktiivisen keskuksen [3H]-DIFP:llä leimautuneen seriinin asema on näytetty (*). Ennustetut N-liitetyt gly-kosylaatiokohdat on merkitty suorakaiteella ympäröidyillä 10 aminohapoilla.
Oligonukleotidialukkeita syntetisoitiin kolmen Bat-PA:n cDNArta sisältävän faagiklooniin perusteella. Bat-PA-cDNA-kloonit amplifioitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) (ks. US-patentti 4 800 159, palsta 2, rivit 15 36 - 38, palstat 3 - 4 ja palsta 5, rivit 1 - 20, joka annetaan tässä viitteeksi). cDNA-juosteita kuumennettiin, kunnes ne erosivat toisistaan, jossa vaiheessa lisättiin alukkeet, jotka sitoutuvat kumpaankin juosteeseen. Aluk-keet ohjasivat DNA-polymeraasia, joka suorittaa replikaa- 20 tiotehtävänsä, kopioimaan tietyn osan juosteesta. Menette lyä jatkettiin sarjalla kuumennus- ja jäähdytyssyklejä, kuumentaen juosteiden erottamiseksi ja jäähdyttäen, kun kopioita tehtiin. Syklejä toistettiin yhä useampien kopioiden tuottamiseksi tietyistä juosteista. Amplifioinnin ' 25 kautta saatiin koodaava alue, johon on liitetty restrik- tiokohdat päihin.
Lepakon plasminogeeniaktivaattorien kolmen muodon (Bat-PA(H):n, Bat-PA(I):n ja Bat-PA(L):n) ekspressiovekto-rit valmistettiin kuten myöhemmin kuvataan, ja sitten 30 transfektoitiin soluihin transientin transfektion menette- * lyllä (jotta määritettäisiin kvalitatiivisesti, päästäänkö onnistuneeseen ekspressioon) tai stabiilin transfektion • menettelyllä (jota käytetään edullisesti elinkykyisten kloonien perustamiseen).
I · 34 100403
Transientin transfektion menettelyssä 2,5 x 106 solua/100 mm malja maljataan 10 ml:an elatusainetta 24 tuntia ennen transfektiota. Kahdesta neljään tuntia ennen transfektiota elatusaine vaihdetaan. DNA/CaP04-sakka val-5 mistetaan valmistamalla suodattamalla steriloitua BatPA-pD5-rekombinanttiplasmidi-DNA:ta pitoisuudessa 5 pg/250 μΐ kahdesti tislattua vettä kohti kutakin 100 mm:n maljaa kohti. Tämä sekoitetaan 500 pl:aan 0,5 M CaCl2:a ja kahdesti tislattua vettä 1 ml:n lopulliseen tilavuuteen. Yksi 10 millilitra liuosta 2 x HBS lisätään tipoittain kevyesti sekoittaen. Preparaatti jätetään seisomaan huoneenlämpötilaan 10 - 30 minuutiksi, ja sakka tiputetaan maljalle tasaisesti, kevyesti heiluttaen. Tämän vaiheen jälkeen menettely vaihtelee hieman riippuen transfektoitavista so-15 luista. CVl-soluja inkuboidaan neljä tuntia 37 °C:ssa ja 10-%:isessa C02:ssa, kun taas COS7- ja 293-soluja inkuboidaan neljä tuntia 37 °C:ssa ja 6-%:issa C02:ssa. Neljä tuntia transfektion jälkeen elatusaine poistetaan 293-soluil-ta. Neljä tuntia transfektion jälkeen CV1- ja COS7-soluil-20 le annetaan glyserolishokki kahden minuutin ajan (15 % glyserolia elatusaineessa) ja huudellaan kahdesti PBSrllä. Sitten lisätään uutta elatusainetta. Soluja inkuboidaan 37 °C:ssa, ja määritykset tehdään 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen.
:· 25 Stabiilin transfektion menettelyssä transientin transfektion menettelyä seurataan seuraavin muutoksin. Maljataan 5 x 105 solua 100 mm:n maljaa kohti eikä 2 x 106 solua 100 mm:n maljaa kohti. 0,5 pg Neo-ekspressioplasmi-dia pannaan mukaan DNA/CaP04-sakkaan G148-selektiota var-30 ten. Soluja pidetään selektiossa 48 tuntia, ja elatusainetta vaihdetaan 2-3 päivän välein, kunnes G148-resis-tenttejä pesäkkeitä kehittyy.
Välivaiheen vektorit ja ekspressiovektorit valmistettiin seuraavasti lepakon plasminogeeniaktivaattorien 35 eri muodoille.
35 100403 I. Bat-PA(H)
1. Luonnollinen 5'-pään NTL
Bat-PA(H):n cDNA:t saatiin cDNA-kirjastosta cDNArn PCR-amplifioinnilla käyttäen alukkeina seuraavassa esitet-5 tyjä oligodeoksinukleotidipareja 141 & 142 ja 27 & 19:
Bgl II
5' > ATA TAT AGA TCT AGG GAC ACC GCA CAA ATG 10 GTG > 3'
Spe I Bgl II
5* > ATA TAT GAG CTC AGA TCT CAG GGA GTT GCG
TAT TCT TGG > 3'
Hind III spe I
15 5* > ATA TAA GCT T AC TAG TAG GGA CAC CGC
ACA AAT GGT G > 3* met
Xbal Sac I
5 > TAT ATC TAG A GA GCT CCA GGG AGT TGC GTG 2Q TTC TTG G > 3‘ PCR suoritettiin 100 pl:n reaktiotilavuudessa, jonka koostumus oli 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 200 μΜ kutakin dNTPrtä, 100 pmol kutakin PCR-alu-·. 25 kettä, 10 - 100 ng cDNArta tai kirjaston DNA:ta ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia. Reaktio ohjelmoitiin DNA-lämpö-syklilaitteeseen 30 syklille. Jokaiseen sykliin kuului kaksi minuuttia denaturaatiota 94 °C:ssa, kaksi minuuttia pariutumista 60 °C:ssa ja kaksi minuuttia polymerisaatiota 30 72 °C:ssa. Amplifioidut cDNA:t puhdistettiin geelillä ja ·· käsiteltiin sitten Bglll-restriktioentsyymillä ja ligatoi- tiin pSP73:n Bglll-kohtaan. Sekvenssin varmistuksen jälkeen Bat-PA(H):n avoimet lukukehykset jatkokloonattiin eukaryoottiekspressiovektoriin pD5, jossa on adenoviruksen 36 100403 pääasiallinen myöhäispromoottori, tuloksena pSZ88-104-20 (ks. kuvio 9). 293-soluja transfektoitiin pSZ88-104-20:llä 293-Bat-PA-l-nisäkässolujen (ATCC No. CRL 10180) muodostamiseksi. E. coli -soluja transfektoitiin pSZ88-104-20:llä 5 BPA-CN-pSZ88-104-20-bakteerisolujen (ATCC No. 68050) muo dostamiseksi .
2. Kozakin 5'-pään NTL:
Bat-PA(H):n cDNArita PCR-amplifioitiin kuten edellä on kuvattu käyttäen alukkeina oligodeoksinukleotidipa-10 ria 18 & 19:
Hind lii Spe I Neo I
5' > ATA TAA GCT TAC TAG TCC ACC ATG GTG
met 15 AAT ACA ATG AAG AC > 3 *
Amplifioidut cDNArt puhdistettiin geelillä ja katkaistiin sitten Xbalrllä ja Hindlllrlla, mitä seurasi li-gaatio välivaiheen vektoriin pSP73 sen Xbal- ja Hindlll-20 kohtien väliin tuloksena pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 ja p89WO-8. Lisäksi Bat-PA(H):n avoimet lukukehykset jatko-kloonattiin SacI/Spel-kohtaan pD5-mcs-vektorissa, joka sisältää moninkertaisen kloonauskohdan alkuperäisen BamHI-kloonauskohdan paikalla, tuloksena pSZ89-lll-17, pSZ89-112 25 ja pSZ89-113 (ks. kuvio 10). E. coli -soluja transfektoitiin pSZ89-lll-17:11a BPA-CK-pSZ89-lll-17-bakteerisolujen (ATCC No. 68052) muodostamiseksi.
II. Bat-PA(I)
Bat-PA(I):n avoimet lukukehykset johdettiin cDNA-30 kirjastosta samalla PCR-menettelyllä kuin edellä on kuvattu, ja tunnistettiin niiden täydelliseen isoformiin suhteessa pienemmän koon perustella. Luonnollisen NTL:n sisältävä Bat-PA(I) johdettiin oligodeoksinukleotidiparista 27 & 19, kun taas Kozakin NTL:n sisältävä Bat-PA(I) joh-35 dettiin oligodeoksinukleotidiparista 18 & 19. Amplifioidut 37 100403
Bat-PA(I):n avoimet lukukehykset katkaistiin HindIII:lla ja Xbalrllä pSP73:een kloonausta varten, josta saatiin p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 ja p89FWO-12, tai katkaistiin Spel:llä ja Sacl:llä pD5-mcs-vektoriin kloonausta varten, 5 josta saatiin p89WO-l, p89WO-2,A,B,C, p89WO-3 ja p89WO-4 (ks. kuvio 11). E. coli -soluja transfektoitiin p89WO-1: llä BPA-FK-p89WO-l-bakteerisolujen (ATCC No. 68051) muodostamiseksi. E. coli -soluja transfektoitiin p89WO-2C:llä BPA-FN-p89WO-2C-bakteerisolujen (ATCC No. 68053) muodosta-10 miseksi.
III. Bat-PA(L)
Bat-PA(L):n avoimet lukukehykset johdettiin cDNA-kirjastosta samalla kirjaston DNA:n PCR-amplifioinnilla oligodeoksinukleotidipari 18 & 11.4 alukkeina.
15 11.4 5' > CCT TTC TCC TGA TGA CCT TC > 3'
Ammplifioitu DNA puhdistettiin geelillä ja katkaistiin sitten Ncolrllä, ja pienin kolmesta Ncol-fragmen-20 tista, joka koodaa Bat-PA(L):n 5'-osaa, puhdistettiin taas geelillä ja ligatoitiin NcoI:llä katkaistuun p89WO-ll:en (Bat-PA(H):n avoin lukukehys pSP73:ssa) p89WP-17:n ja p89WP-18:n saamiseksi. Sitten Bat-PA(L):n avoimet lukukehykset vapautettiin välivaiheen vektoreista katkaisemalla 25 Sacl:llä ja Spel:llä ja jatkokloonattiin pD5-mcs-vekto-riin, josta saatiin p89W-20A&B ja p89WP-19A&B (ks. kuvio 12) . E. coli -soluja transfektoitiin p89WP-20A:11a BPA-DK-p89WP-20A-bakteerisolujen (ATCC No. 68049) muodostamiseksi .
30 48 tuntia transfektion jälkeen poistetun COS-7:n muokatun elatusaineen fibriiniagarmaljamääritykset paljastivat 50 ng/ml Bat-PA:ta.
Kloonin pSZ-104-20 havaittiin olevan paras eks-pressoija. Tämä klooni perustettiin 293-soluihin, ja sen 35 havaittiin ekspressoivan yli 0,5 pg/ml päivässä Bat-PA-ak-tiivisuutta konfluenttia yksikerrosviljelmää kohti. Jatku- 38 100403 va altistus butyraatille ja elatusaineen optimointi nostivat ekspressiotason yli kymmeneen mikrogrammaan millilit-raa kohti päivässä. Muita sopivia ekspressiovektoreita ovat pSZ89-lll-17 (pSZ88-104-20:n johdannainen, jossa on 5 Kozakin eikä luonnollinen 5'-pään NTL), EBV/EBNA/D5BatPA-C ja CMVIE-AKl-BatPA-C ja HIV LTR/BatPA-C.
Vertailu ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoriin Seuraavassa esitetään vertailu ihmisen kudosplas-minogeeniaktivaattorin ja keksinnön mukaisesti saatavan 10 Bat-PA(H):n aminohapposekvenssiprimaarirakenteen välillä.
39 100403 1 10
Ihmisen t-PA GARSYQVICRDE Bat-PA(H) GSRAYGVACRDE -3 7 5 20
KTQMIYQQHQSW
KTQMIYQQQESW
17 30
10 LRPVLRSNRVEY
LRPEVRSKRVEH
27 40
CWCNSGRAQCHS 15 CRCDRGLAQCHT
37 50 60 VPVKSCSEPRCF VPVKSCSELRCF 20 47 57 70
NGGTCQNALYFS
nggtrwnaasfs 67 25 80
DFVCNCPEGFAG
dfvcncpkgytg 77 90
30 KCCEJDTRATCY
KQCE VDTHATCY
87 40 100403 100
Ihmisen t-PA EDQGI SYRGTWS Bat-PA(H) KDQGVTYRGTWS
97 5 110 120 TAESGAECTNWN TSESGAQCINWN 107 117 130
10 SSALANKPYSGR
SNLLTRRTYNGR
127 140
RPDAIRLGLGNH 15 RSDAITLGLGNH
137 150 NYCRNPDRDSKP NYCRNPDNNSKP 20 147 160
WCYVFKAGKYSS
WCYVIKASKFIL
157 25 170 180 EFCSTPACSEGN EFCSVPVCSKA 167 176 190
30 Ihmisen t-PA SDCY FGNGSAYR
41 100403 200
Ihmlsjea t-PA GTHSLTESGASC
5 210
LPWNSMILIGKV
220
10 YTAQNPSAQALG
230 240 LGKHNYCRNPDG 15 250 dakpwchvlknr 20 260
RLTWEYCDVPSC
25 270
Ihmisen t-PA STCGLRQYSQPQ Bat-PA(H) TCGLRKYKEPQ 177 180 280
30 FRIKGGLFADIA
LHST GGLFTDIT 190 42 100403 290 300
Ihmisen t-PA SHPWQAAIFAKH Bat-PA(H) SHPWQAAIFAQN 200 210 5 310
RRSPGERFLCGG
RRSSGERFLCGG
220 320
10 ILISSCWILSAA
ILISSCWVLTAA
230 330
HCFQERFPPHHL 15 HCFQERYPPQHL
240 340 TVILGRTYRVVP RVVLGRTYRVKP 20 250 350 360 GEEEQKFEVEKY GKEEQTFEVEKC 260 270 25 370
IVHKEFDDDTYD
IVHEEFDDDTYN
280 380
30 NDIA.ELQLKSDS
ndiallqlksgs 290 43 100403 390
Ihmi sen t—PA SRCAQESSVVRT Bat-PA(H) PQCAQESDSVRA
300 5 400
VCLPPADLQLPD
ICLPEANLQLPD
310 410 420
10 WTECELSGYGKH
WTECELSGYGKH 320 330 430
EALSPFYSERLK 15 KSSSPFYSEQLK
340 440
EAHVRLYPSSRC
eghvrlypssrc 20 350 450
TSQHLLNRTVTD
TSKFLFNKTVTK
360 25 460
NMLCAGDTRSGG
nmlcagdtrsge 370 470 480
30 pQAN IiHDACQGD
IHPNVH DACQGD 380 390 490 44 100403
Ihmisen t-PA SG GPLVCLNDGR Bat-PA(H) S GGPLVCMNDNH 5 400 500
MTLVGI ISWGLG MTLLGI ISWGVG
410 10 510 CGQKDVPGVYTK CGEKDI PGVYTK 420 520
15 VTNYLDWIRDNM
VTNYLGWIRDNM
430
530 R P
20 R P
440
Ihmisen tPA:n fibronektiinin finger-domeenilla 25 (sekvenssi 9 - 46) on 78 % homologia Bat-PA(H):n sekvenssin 6-43 kanssa. Ihmisen tPA:n epidermaalisen kasvutekijän kaltaisella domeenilla (sekvenssi 46 - 95) on 75 % homologia Bat-PA(H):n sekvenssin 43 - 92 kanssa. Ihmisen tPA:n ensimmäisellä kringle-domeenilla (sekvenssi 95 - 30 177) on 67 % homologia Bat-PA(H):n sekvenssin 92 -174 kanssa.
Ihmisen tPA:n toisella kringle-domeenilla ei ole vastinetta Bat-PA(H):ssa. Bat-PA(H):n aminohapot 175 ja 176 ovat lysiini ja alaniini. Bat-PA(H):n aminohapoilla 35 190 - 441, "kevytketjulia", on 74 %:n homologia ihmisen tPA:n kevytketjun sekvenssin 280 - 531 kanssa.
45 100403
Kuvio 8b on kaavamainen esitys Bat-PA(H):n aminohapposekvenssistä ja vertailu ihmisen tPArhan [Pennica ym., Nature 301 (1983) 214 - 221]. Bat-PA:n yksittäiset aminohapot on esitetty yksikirjaimisella koodilla. Umpi-5 naiset ympyrät osoittavat samoja aminohappoja Bat- PA(H):ssa ja ihmisen tPArssa. Avoimet ympyrät osoittavat toisistaan poikkeavia aminohappotähteitä. Ehdotettu disul-fidisidosten muodostumistapa perustuu analogiaan tPA:n kanssa. Oletetut N-liitetyt glykosylaatiokohdat on osoi-10 tettu aminohapossa kiinni olevalla kulmasululla.
Kuten aikaisemmin on mainittu, lepakon plasmino-geeniaktivaattoreiden aktiivisuus stimuloituu dramaattisesti fibriinikofaktorin läsnäollessa. Se vaikuttaa olevan ainakin 90 kertaa tPA:ta selektiivisempi fibriiniin sitou-15 tunutta plasminogeeniä kohtaan. tPA:n toisessa kringle- domeenissa on lysiiniä sitova kohta, jonka uskotaan näyttelevän ratkaisevaa roolia fibriinin indusoimassa aktiivisuuden stimulaatiossa. Sitä vastoin tämän keksinnön mukaisesti saatavan aktivaattorin aminohapposekvenssi paljas-20 taa, ettei sen selvä fibriiniselektiivisyys johdu alueesta, joka muistuttaa tPA:n toista kringle-domeenia. Lisäksi lepakon plasminogeeniaktivaattoreiden kyvyttömyys sitoutua Lys-Sepharoseen osoittaa, että lysiinin sitoutumiskohdan läsnäolo ei vastaa plasminogeenin fibriinispesifisestä 25 aktivaatiosta.
Keksinnön mukaisesti saatavien aktivaattoreiden kringle-domeeni välittää fibriinin indusoimaa aktiivisuuden stimulaatiota huolimatta sen eroista tPA:n toiseen kringle-alueeseen.
30 Aktivaattorit myös eroavat rakenteellisesti tPA:- ' stta siinä, että lepakon entsyymistä puuttuu plas- miiniherkkä prosessointikohta.
Edellä kuvatut Bat-PA-proteiinit on määritelty tietyn DNA-geenin avulla ja päättelyyn perustuvalla amino-35 happosekvensoinnilla. On ymmärrettävä, että luonnollista 100403 46 alleelivariaatiota esiintyy. Nämä variaatiot voivat ilmetä aminohappoero(i)na sekvenssissä tai deleetioina, substituutioina, insertioina, inversioina tai aminohapon/amino-happojen lisäyksinä mainitussa sekvenssissä. Lisäksi gly-5 kosylaation sijainti ja aste riippuu ympäristön laadusta isäntäsolussa.
Yhdistelmä-DNA-teknologian käytössä on mahdollisuudet valmistaa erilaisia lepakon plasminogeeniaktivaat-torijohdannaisia, joita on eri tavoin muunnettu tuloksena 10 olevin yhden tai useamman aminohapon substituutioin, de-leetioin, lisäyksin tai korvauksin, esimerkiksi käyttäen apuna perustana olevan DNA:n kohdennettua mutageneesiä. Kaikki tällaiset alleeliset variaatiot ja muunnokset, joista tuloksena saadaan lepakon plasminogeeniaktivaatto-15 rin johdannaisia, kuuluvat tämän keksinnön alaan kunhan vain olennaisen, tunnusomaisen lepakon plasminogeeniakti-vaattoriaktiivisuuden laatuun ei vaikuteta. Lepakon plas-minogeeniaktivaattoria valmistetaan (1) metioniinin ollessa sen ensimmäisenä aminohappona (läsnä johtuen aloitus-20 signaalikodonin ATG sijoittumisesta rakennegeenin eteen) tai (2) silloin, kun metioniini lohkaistaan irti solun-sisäisesti tai -ulkoisesti, normaalin aminohapon ollessa ensimmäisenä tai (3) yhdessä joko signaalipeptidinsä tai muun konjugoidun proteiinin kuin tavanomaisen signaalipo-• 25 lypeptidin kanssa, signaalipeptidin tai konjugaatin olles sa spesifisesti lohkaistavissa irti solunsisäisessä tai -ulkoisessa ympäristössä (ks. brittiläinen patenttihakemus-julkaisu No. 2 007 676A) tai (4) suoralla ekspressiolla kypsässä muodossa ilman, että tarvitsee lohkaista irti 30 mitään ulkonaista, ylimääräistä polypeptidiä. Viimeksi mainittu on erityisen tärkeä silloin, kun tietty isäntä ei pysty irrottamaan signaalipeptidiä, tai ei tee sitä tehokkaasti, silloin, kun ekspressiovektori on suunniteltu eks-pressoimaan plasminogeeniaktivaattoria yhdessä sen signaa-35 lipeptidin kanssa. Joka tapauksessa, näin tuotettu lepakon
II
47 100403 plasminogeeniaktivaattori sen eri muodoissa otetaan talteen ja puhdistetaan sellaiselle tasolle, joka sopii sen käyttöön erilaisten verisuoniston häiriötilojen ja sairauksien hoidossa.
5 Terapeuttinen hoito Näitä proteiineja voidaan antaa millä tahansa tavanomaisella tavalla, joka johtaa sen joutumiseen verenkiertoon huomattavassa määrin. Antamista laskimonsisäisesti pidetään tällä hetkellä edullisena antotapana. Ne ovat 10 vesiliukoisia, ja siksi ne voidaan antaa tehokkasti liuoksessa .
Yhdessä esimerkkisovellutuksessa sopiva määrä tämän keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja annetaan laskimonsisäisesti sydänkohtauksen uhrille. Sopivat annok-15 set trombolyysin aikaansaamiseksi ovat 200 mg:an asti, edullisesti välillä 25 - 150 mg ja edullisemmin välillä noin 25 - 50 mg.
Proteiineja voidaan myös antaa edellä mainittuina annoksina peräkkäisinä bolusinjektioina usean tunnin ku-20 luessa.
Proteiineja voidaan antaa yhdessä verihiutaleiden aggregaation inhibiittoreiden kanssa yhdistetyn trombolyy-si- ja verihiutaleiden aggregaation inhibitiovaikutuksen tuottamiseksi. Yhdessä antamiseen kuuluu verihiutaleiden 25 aggregaation inhibiittoreiden laskimonsisäinen antaminen sellaisena määränä, joka estää verihiutaleiden aggregaa-tiota, esim. määränä, joka saavuttaa tasapainotilaplasma-pitoisuuden välillä 0,05 - 2 μΜ.

Claims (8)

100403
1. Menetelmä glykosyloidun tai glykosyloimattoman plasminogeeniä aktivoivan proteiinin valmistamiseksi, joka 5 on ainakin 90 % homologinen seuraavan aminohapposekvenssin kanssa Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala
10 Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg
15 Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu
20 Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr ·. 25 Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp
30 Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr *' Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; 100403 Met Vai Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu Thr Tyr Arg Gin Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin Gin Glu Ser
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin spesifinen plasminogee-niä aktivoiva aktiivisuus fibriiniin sitoutunutta plasmi-nogeeniä kohtaan on noin 8 x 103 - 25 x 103 Y/pmol.
3. Eristetty ja puhdistettu DNA-sekvenssi, tun nettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua proteiinia.
4. Replikoitavissa oleva kloonausvehikkeli, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka 10 koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua proteiinia .
5. Patenttivaatimuksen 4 mukaisella kloonausvehik-kelillä transfektoitu nisäkäs- tai bakteerisolu.
5 Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai
10 Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr
15 Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu
20 Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro
25 Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro, 30 ' joka proteiini vaatii fibriinikofaktoria plasminogeenin aktivoimiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan bakteeri- tai nisäkäsisäntäsoluja, jotka on transformoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää DNA:ta, joka koodaa 35 haluttua plasminogeeniaktivaattoriproteiinia, ja otetaan talteen haluttu proteiini. 100403
5 Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Vai Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr
10 Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Vai Pro Vai Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr
15 Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Vai Vai Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe
20 Glu Vai Glu Lys Cys Ile Vai His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Vai Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro
25 Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Vai Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Vai His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu
30 Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Vai Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro; tai 100403 Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Vai Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Vai Thr Tyr Arg Gly
5 Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala
10 Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys lie Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala lie Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val lie Lys Ala
15 Ser Lys Phe lie Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp lie Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie Ser Ser Cys Trp
20 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys lie Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp lie Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin
25 Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala lie Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu
30 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu lie His Pro Asn Val ' His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly lie lie Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp lie Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp lie Arg Asp Asn Met Arg
35 Pro; 100403 Ala Tyr Gly Vai Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Vai Arg Ser Lys Arg Vai Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen nisäkässolu, 15 tunnettu siitä, että se on 293-Bat-PA-l-nisäkässo- lu (ATCC CRL 10180).
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen bakteerisolu, tunnettu siitä, että se on BPA-CN-pSZ88-104-20-bakteerisolu (ATCC 68050), BPA-CK-pSZ89-lll-17-bakteeriso- 20 lu (ATCC 68052), BPA-FK-p89WO-l-bakteerisolu (ATCC 68051), BPA-FN-p89WO-2C-bakteerisolu (ATCC 68053) tai BPA-DK- p89WP-20A-bakteerisolu (ATCC 68049).
8. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se on jonkin patenttivaatimuksessa 1 määritellyn proteiinin vas- 25 täinen. 100403 Patentkxav
FI893500A 1988-07-20 1989-07-19 Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi FI100403B (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI953849A FI100406B (fi) 1988-07-20 1995-08-15 Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattoreiden valmist amiseksi

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22169788A 1988-07-20 1988-07-20
US22169788 1988-07-20
US37722189A 1989-07-13 1989-07-13
US37722189 1989-07-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI893500A0 FI893500A0 (fi) 1989-07-19
FI893500A FI893500A (fi) 1990-01-21
FI100403B true FI100403B (fi) 1997-11-28

Family

ID=26916041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI893500A FI100403B (fi) 1988-07-20 1989-07-19 Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5830849A (fi)
EP (1) EP0352119B1 (fi)
JP (1) JP2713467B2 (fi)
KR (1) KR0138997B1 (fi)
AT (1) ATE126269T1 (fi)
AU (1) AU621389B2 (fi)
CA (1) CA1341090C (fi)
DE (1) DE68923741T2 (fi)
DK (1) DK176140B1 (fi)
ES (1) ES2076965T3 (fi)
FI (1) FI100403B (fi)
GR (1) GR3017587T3 (fi)
IE (1) IE69054B1 (fi)
IL (1) IL91059A (fi)
NO (2) NO302954B1 (fi)
NZ (1) NZ230017A (fi)
PT (1) PT91236B (fi)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01500322A (ja) * 1986-03-28 1989-02-09 クリエイティブ　バイオモレクレス，インコーポレーテッド 組織プラスミノーゲンアクテイベーター類縁蛋白質
WO1990009438A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen Novel thrombolytic
US6008019A (en) * 1989-02-13 1999-12-28 Schering Aktiengesellschaft Plasminogen activator from saliva of the vampire bat
DE3943241A1 (de) * 1989-12-22 1991-06-27 Schering Ag Thrombolytisch wirkendes kombinationspraeparat
EP0455424A3 (en) 1990-05-02 1992-04-29 Merck & Co. Inc. Mammalian inducible promoter cascade system
EP0580685B1 (de) * 1991-04-16 1996-01-03 Roche Diagnostics GmbH Pharmazeutische verpackungseinheit enthaltend plasminogenaktivatoren zur mehrfachbolusgabe
US5910481A (en) * 1995-11-13 1999-06-08 Immuno Ag Hybrid proteins with modified activity
US5945432A (en) * 1995-12-22 1999-08-31 The University Of Vermont And State Agricultural College Thrombolytic agents and thienopyridine derivatives in acute stroke
US5731186A (en) * 1996-02-05 1998-03-24 Schering Aktiengesellschaft Method for the production of rDSPA α1
DE10153601A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
US20060135425A1 (en) * 2003-05-02 2006-06-22 Paion Deutschland Gmbh Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke
WO2004096267A1 (de) * 2003-05-02 2004-11-11 Paion Gmbh Intravenöse injektion nicht-neurotoxischer plasminogen-aktivatoren zur behandlung von schlaganfall
KR101212631B1 (ko) * 2003-05-02 2012-12-14 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 뇌졸중을 치료하기 위한 플라스미노겐 비-신경독성활성인자의 정맥내 주사 방법
DE10342518A1 (de) * 2003-09-12 2005-05-12 Paion Gmbh Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität
TWI482628B (zh) * 2007-10-18 2015-05-01 Lundbeck & Co As H 新穎之血栓溶解病患次群
EP2289541A1 (en) 2009-08-31 2011-03-02 PAION Deutschland GmbH Treatment of neurological or neurodegenerative disorders
EP2289542A1 (en) 2009-08-31 2011-03-02 PAION Deutschland GmbH Treatment of neurological or neurodegenerative disorders
KR20240046168A (ko) 2017-02-03 2024-04-08 액티코어 바이오테크 항-인간 gpvi 항체를 이용한 혈소판 응집의 억제
EP3624832A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of acute ischemic stroke
US20210238605A1 (en) 2018-06-15 2021-08-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3kc2b inhibitors for the preservation of vascular endothelial cell barrier integrity
WO2021148439A1 (en) 2020-01-21 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for stimulating cerebrovascular function
EP4161579A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Fucoidan-functionalized polysaccharide particles with t-pa for targeted thrombolytic therapy
WO2023156683A1 (en) 2022-02-21 2023-08-24 Acticor Biotech Treatment of cardiovascular diseases using anti-human gpvi antibodies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US5010002A (en) * 1983-01-19 1991-04-23 Genentech, Inc. Human t-PA production using vectors coding DHFR protein
WO1987005934A1 (en) * 1986-03-28 1987-10-08 Roberto Crea Protein analogues of tissue plasminogen activator
JPH01132377A (ja) * 1987-10-09 1989-05-24 Monsanto Co 修正型組織プラスミノーゲンアクチベーター
WO1990009438A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen Novel thrombolytic

Also Published As

Publication number Publication date
US5830849A (en) 1998-11-03
FI893500A (fi) 1990-01-21
DK357589A (da) 1990-01-23
KR0138997B1 (ko) 1998-04-30
CA1341090C (en) 2000-08-29
AU3891589A (en) 1990-01-25
EP0352119A2 (en) 1990-01-24
NZ230017A (en) 1992-05-26
NO970603L (no) 1990-01-22
NO892976L (no) 1990-01-22
DK176140B1 (da) 2006-09-25
GR3017587T3 (en) 1995-12-31
AU621389B2 (en) 1992-03-12
IE892354L (en) 1990-01-20
EP0352119A3 (en) 1990-07-04
IE69054B1 (en) 1996-08-07
PT91236B (pt) 1995-03-01
JPH02167075A (ja) 1990-06-27
PT91236A (pt) 1990-02-08
NO970603D0 (no) 1997-02-10
ATE126269T1 (de) 1995-08-15
IL91059A0 (en) 1990-02-09
NO302954B1 (no) 1998-05-11
FI893500A0 (fi) 1989-07-19
ES2076965T3 (es) 1995-11-16
KR910003094A (ko) 1991-02-26
JP2713467B2 (ja) 1998-02-16
EP0352119B1 (en) 1995-08-09
DK357589D0 (da) 1989-07-19
IL91059A (en) 1995-06-29
NO314548B1 (no) 2003-04-07
DE68923741D1 (de) 1995-09-14
DE68923741T2 (de) 1996-02-15
NO892976D0 (no) 1989-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI100403B (fi) Menetelmä glykosyloitujen tai glykosyloimattomien vampyyrilepakon sylj en plasminogeeniaktivaattoreiden valmistamiseksi
JP2851423B2 (ja) 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質
JP4163517B2 (ja) フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）切断酵素
US5302529A (en) Plasmid coding for human protein C
EP0383417B1 (en) Vampire bat salivary Plasminogen activator vPA-alpha 1
JPH06502986A (ja) ハイブリッドプロテインｃ
JPH04505554A (ja) 可溶性トロンボモジュリン類似体
US6008019A (en) Plasminogen activator from saliva of the vampire bat
FI110669B (fi) Menetelmiä luonnosta eristettävissä tai synteettisesti valmistettavissa olevien trombiini-inhibiittorien valmistamiseksi
EP0395375A1 (en) Novel DNA sequences which encode ancrod-like polypeptides and compositions comprising the expression products thereof
US5801017A (en) Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis
CA2083286C (en) Recombinant fibrinogenases, preparation and use thereof
FI100406B (fi) Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattoreiden valmist amiseksi
JPH09505733A (ja) エンドテリン変換酵素
WO2002014514A1 (en) A fibrinogen clotting inhibitor derived from snake venom and process for preparing the same
WO1996003434A1 (fr) Facteur de differenciation/proliferation de megacaryocytes
BG60507B2 (bg) човешки тъканен плазминогенен активатор
JPH02273179A (ja) 新規な血栓溶解蛋白質，その製造法および該蛋白質からなる医薬

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: SCHERING AG

FG Patent granted

Owner name: SCHERING AG