PT91236B - Metodo para a purificacao de activadores do pasminogeneo de glandulas salivares de morcegos vampiros - Google Patents
Metodo para a purificacao de activadores do pasminogeneo de glandulas salivares de morcegos vampiros Download PDFInfo
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Description
MÉTODO PARA
A PURIFICAÇÃO DE ACTIVADORES DO PLASMINOGÉNIO DE
GLÂNDULAS SALIVARES DE MORCEGOS VAMPIROS
O método de purificação consiste essencialmente na homogeneização de glandulas submandibulares a partir de morcegos vampiros Desmodus rotundus para formar uma mistura, e centrifugação da mistura para formar uma fracção sobrenadante; clarificação e subsequente concentração da fracção sobrenadante; aplicação de fetentado numa coluna de permuta catiónica de fosfocelulose e adsorção do activador do plasminogénio à coluna; eluição da coluna para obter fracções contendo proteínas de activação do plasminogénio; reunião das fracções e aplicação do conjunto a uma coluna de afinidade que tem imobilizado o inibidor da tripsina de Erythrina; fracciona mento dos activadores do plasminogénio por meio de cromatografia líquida de alta pressão; e separação dos activadores do plasminogénio por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.
/
-3referSncia cruzada
Este pedido é uma continuação em parte do NS de Série dos Estados Unidos 221.697, entregue em 20 de Julho de 1988.
FUNDAMENTO DO INVENTO
Os morcegos vampiros são absolutamente dependentes de uma dieta de sangue fresco gue eles obtêm fazendo uma ferida na sua vítima. Estas feridas, se bem gue superficiais continuam a perder sangue durante um período de várias horas.
Os componentes da saliva dos morcegos vampiro Desmodus rotundus foram estudados e verificou-se que interferem com o mecanismo hemostático do sangue de mamíferos a três níveis distintos. Encontrou-se que inibem a agregação de plaquetas e activam o plasminogénio (Hawkey, C.M. Nature 211:434 (1966) e Hawkey, C.M. Br. J. Haematol. 13:1014 (1967)). Cada uma destas actividades foi associada a uma fracção proteica distinta. A fracção que activou o plasminogénio foi designado desmoquinase (Hawkey, C.M., Nature). Cartwright
T., Blood descreveu a purificação da desmoquinase da saliva de Desmodus e sugeriu ser mais eficaz do que a uroquinase (UK) e estreptoquinase na lise de coágulos pré-formados.
O uso do activador do plasminogénio tipo tecido (tPA) como agente trombolítico é contrariado por uma série de obstáculos, incluindo complicações do tipo hemorregia grave, uma incidência relativamente frquente de
reoclusão, uma incapacidade em ser eficaz uniformemente e susceptibilidade à inactivação pelos inibidores do activador do plasminogénio como seja o inibidor do activador do plasminogénio tipo 1 (PAI-1) (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 14, N°1 (1988)).
As complicações hemorrágicas que resultam da terapia trombolitica pensa-se serem causadas, ou, pelo menos, potenciadas pela activação do plasminogénio circulante. A capacidade do tPA para se ligar à fibrina pensa-se ser responsável pela sua preferência marcada para o substrato plasminogénio ligado a fibrina. No entanto, as considerações teóricas e os resultados de estudos clínicos mostraram que os níveis elevados de tPA necessários para a dissolução rápida de coágulos também causam activação de quantidades apreciáveis de plasminogénio circulante.
Ainda, pensa-se que as interacções do t-PA com inibidores do plasma atenuam a actividade funcional do t-PA durante e após a infusão, contribuindo assim potencialmente para a reoclusão.
Uma desvantagem adicional que acompanha o uso do t-PA como agente trombolítico é que a dose necessária de t-PA é grande, entre 100 e 150 mg, o que torna esta intervenção terapêutica extremamente dispendiosa.
Encontrámos que os activadores do plasminogénio presentes na saliva e nas glândulas salivares de Desmodus rotundus apresentam uma selectividade notávelmente superior para o plasminogénio ligado à fibrina e portanto podem estar associados a uma diminuição de gravidade e frequência das hemorragias quando usada na terapia trombolitica. Ainda, os activadores não são fácilmente inactivados pelos inibidores do plasma tais como PAI-1 e portanto podem estar associados a uma frequência menor de reoclusão.
-5O presente invento tem por finalidade proporcionar agentes fibrinolíticos superiores ao tPA no que respeita a segurança e eficácia.
É também uma finalidade do presente invento identificar sequências de DNA codificadoras de proteínas no presente invento, adaptar as sequências do cDNA derivado de tecido e inserir operacionalmente as sequências em vectores de expressão.
Constitui também uma finalidade do presente invento produzir proteínas do presente invento a partir de microorganismos hospedeiros ou células eucarioticas que tenham sido transformadas por vectores de expressão para produzir a proteína.
É também finalidade do presente invento produzir anticorpos reactivos contra proteínas do presente invento.
SUMARIO DO INVENTO invento inclui proteínas activadoras do plasminogénio purificadas e parcialmente purificadas obtidas ou derivadas da saliva e glândulas salivares de Desmodus rotundus, métodos para a purificação de proteínas da saliva e das glandulas salivares de Desmodus rotundus, métodos para a purificação das proteínas a partir da saliva e das glândulas salivares do morcego vampiro Desmodus rotundus, sequências de DNA codificadoras destas proteínas, meios para a sua produção usando metodologia de DNA recombinante, anticorpos especificamente reactivos com estas proteínas e composi-6ções farmacêuticas para activação do plaminogénio ligado a fibrina compreendendo proteínas do invento. As proteínas activadoras do plasminogénio isoladas a partir da saliva e das glandulas salivares do morcego vampiro são distintas do tPA e da urocinase por vários critérios estruturais e funcionais.
Ao contrário do tPA, os activadores do plasminogénio do invento não contêm o domínio de ansas múltiplas e o sítio de processamento sensível à plasmina. Quantidades equimolares destes activadores e de t-PA são igualmente eficazes quando avaliados as suas'capacidades para catalisar a lise dos coágulos de plasma pré-formados. A sua actividade contra o plasminogénio é estimulada pelo menos 27.000 vezes na presença de um cofactor de fibrina. O valor correspondente para o tPA é apenas 205 vezes. A partir da saliva do morcego vampiro foram isoladas três espécies distintas correspondendo às-:formas de tamanho completo, sem o domínio me dedo e sem os domínios em dedo e EGF, do tPA. Eles são referidos como Bat-PA(H), Bat-PA(I) e Bat-PA(L) respectivamente. Daqui em diante as referências Bat-PA corresponde à preparação não fraccionada contendo as três formas moleculares Η, I e L. A espécie de tamanho completo, ao contrário das outras duas, liga-se fortemente à fibrina. Bat-PA(H), Bat-PA(I) e Bat-PA(L) apresentam valores de Mr de 49, 42 e 40 kD, respectivamente, conforme determinado por SDS-PAGE na presença de ditiotreitol (Fig. 1, faixa 1). Os valores aparentes de M das formas desglicosiladas de Bat-PA(H), Bat-PA(I) e Bat-PA(L) (obtidos por remoção das cadeias de glúcidos ligados em N com endoglicosidase F) conforme determinado por SDS-PAGE são 44, 40 e 38 kD respectivamente (Fig. 1, faixa 2). Estas proteínas apresentam uma necessidade absoluta para a presença de um cofactor de fibrina e uma capacidade notável para catalisar a lise de coágulos de plasma. O mecanismo da selectividade destas proteínas contra plasminogénio ligado a fibrina é um resultado de vários factores incluindo ligação directa à fibrina e forte inibição por NaCl que é aliviada na presença do coágulo de fibrina. Ainda, os activadores do plasminogénio do morcego vampiro são menos susceptíveis do que o t-PA para a inactivação por inibidores presentes no
-7plasma.
A sequência de aminoácidos prevista a partir do cDNA da glicoproteína de tamanho completo do activador do plasminogénio (Bat-PA(H)) derivado de Desmodus rotundos é:
Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-GlnMet-Ile-Tyr-Gln-Gln-Gln-Glu-Ser-Trp-Leu-Arg-ProGlu-Val-Arg-Ser-Lys-Arg-Val-Glu-His-Cys-Arg-CysAsp-Arg-Gly-Leu-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Pro-ValLys-Ser-Cys-Ser-Glu-Leu-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-GlyThr—Cys—Trp—Gin—Ala—Ala—Ser-Phe—Ser-Asp—Phe—Va1— Cys-Gln-Cys-Pro-Lys-Gly-Tyr-Thr-Gly-Lys-Gln-CysGlu-Val-Asp-Thr-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-GlnGly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Ser-Thr-Ser-GluSer-Gly-Ala-Gln-Cys-Ile-Asn-Trp-Asn-Ser-Asn-LeuLeu-Thr-Arg-Arg-Thr-Tyr-Asn-Gly-Arg-Arg-Ser-AspAla-Ile-Thr-Leu-Gly-Leu-Gly-Asn-His-Asn-Tyr-CysArg-Asn-Pro-Asp-Asn-Asn-Ser-Lys-Pro-Trp-Cys-TyrVal-Ile-Lys-Ala-Ser-Lys-Phe-Ile-Leu-Glu-Phe-CysSer-Val-Pro-Val-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Cys-Gly-LeuArg-Lys-Tyr-Lys-Glu-Pro-Gln-Leu-His-Ser-Thr-GlyGiy-Leu-Phe-Thr-Asp-Ile-Thr-Ser-His-Pro-Trp-GlnAla-Ala-Ile-Phe-Ala-Gln-Asn-Arg-Arg-Ser-Ser-GlyGlu-Arg-Phe-Leu-Cys-Gly-Gly-Ile-Leu-Ile-Ser-SerCys-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Gln-GluArg-Tyr-Pro-Pro-Gln-His-Leu-Arg-Val-Val-Leu-Gly-8-
Arg-Thr-Tyr-Arg-Val-Lys-Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-GlnThr-Phe-Glu-Val-Glu-Lys-Cys-Ile-Val-His-Glu-GluPhe-Asp-Asp-Asp-Thr-Tyr-Asn-Asn-Asp-Ile-Ala-LeuLeu-Gln-Leu-Lys-Ser-Gly-Ser-Pro-Gln-Cys-Ala-GlnGlu-Ser-Asp-Ser-Val-Arg-Ala-Ile-Cys-Leu-Pro-GluAla-Asn-Leu-Gln-Leu-Pro-Asp-Trp-Thr-Glu-Cys-GluLeu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Lys-His-Lys-Ser-Ser-Ser-ProPhe-Tyr-Ser-Glu-Gln-Leu-Lys-Glu-Gly-His-Val-ArgLeu-Tyr-Pro-Ser-Ser-Arg-Cys-Thr-Ser-Lys-Phe-LeuPhe-Asn-Lys-Thr-Val-Thr-Lys-Asn-Met-Leu-Cys-AlaGly-Asp-Thr-Arg-Ser-Gly-Glu-Ile-His-Pro-Asn-ValHis-Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-LeuVal-Cys-Met-Asn-Asp-Asn-His-Met-Thr-Leu-Leu-GlyIle-Ile-Ser-Trp-Gly-Val-Gly-Cys-Gly-Glu-Lys-AspIle-Pro-Gly-Val-Tyr-Thr-Lys-Val-Thr-Asn-Tyr-LeuGly-Trp-Ile-Arg-Asp-Asn-Met-Arg-Pro
-9Bat-PA(H) contem a sequência de aminoácidos 1-441 mostrada na Fig. 8a. Bat-PA(I) contem a sequência de aminoácidos 1-3 e 50-441 mostrada na Fig. 8a e Bat-PA(L) contem a sequência de aminoácidos 1-3 e 50-441 apresentada na Fig. 8a e Bat-PA(L) contem a sequência de aminoácidos 1-3 e 87-441 mostrada na Fig. 8a. Ainda o aminoácido na posição 88 foi mudado de treonina para prolina na proteína L.
Também dentro do invento inclui-se um método para a purificação dos activadores do plasminogénio salivares do morcego vampiro compreendendo os passos de:
(a) homogenização das glandulas submandibulares de morcegos vampiros para formar uma mistura e centrifugação da mistura para formar a fracção sobrenadante :
(b) aplicação do sobrenadante a uma coluna de fosfocelulose de permuta iónica que resulta em absorção do Bat-PA à coluna;
(c) eluição da coluna para se obter fracções contendo Pat-PA;
(d) reunião das fracções activas, aplicação do conjunto a uma coluna de afinidade tendo imobilizado o inibidor da tripsina de Erythrina (ETI) e eluição de Bat-PA com tampão de pH baixo.
Também estão incluídos no presente invento as sequências de DNA que codificam proteínas do presente invento, veículos de clonagem tendo inseridos sequências de DNA do invento, anticorpos reactivos com proteínas do presente invento e composições farmacêuticas para activação do plasminogénio ligado a fibrina tendo quantidades eficazes das proteínas do invento.
Cada uma das espécies activadoras do plasminogénio é activado pela fibrina. A única característica discernível que diferencia a espécie é a capacidade exclusiva de Bat-PA(H) para se ligar fortemente à fibrina, uma propriedade que está relacionado com a presença do domínio em dedo. A especificidade do Bat-PA(I) e de Bat-PA(L) para o plasminogénio ligado a fibrina parece ser independente de uma capacidade para se ligar fortemente à fibrina.
A dependência absoluta da fibrina para a actividade Bat-PA é uma caracteristica desejável no contexto da terapia fibrinolítica. As complicações hemorrágicas que acompanham a utilização de agentes trombolíticos podem ser aumentadas pela activação do plasminogénio circulante para dar a plasmina. A gravidade e frequência das complicações hemorrágicas pode ser diminuída usando um activador do plasminogénio do presente invento cuja acção está localizada no sítio do coágulo de fibrina.
As células de mamíferos 293-Bat-PA-1 (designadas ATCC NQ . _), as células bacterianas
BPA-CN-pSZ88-104-20 (designadas ATCC NQ. ), as células bacterianas BPA-Ck-pSZ89-lll-17 (designados ATCC NS. _), as células bacterianas BPA-Fk-p89WO-l (designados ATCC NQ .
_) , as células bacterianas BPA-FN-p89XO-2C (designadas
ATCC NQ. _) e as células bacterianas BPA-Dk-p89-WP-20A (designadas ATCC NQ. _) foram depositadas na American
Type Culture Collection, Bethesda, MD, USA, de acordo com os requesitos do tratado de Budapeste. Elas estarão irrevogávelmente disponíveis quando da publicação desta patente. O depósito está também disponível conforme requerido pelas leis de patentes estrangeiras em países onde tenham sido entregues contra partes do presente pedido ou seus derivados. No entanto, deverá ser entendido que a disponibilidade dos depósitos não constitui uma licença para praticar o presente invento em prejuízo dos direitos de patente regulamentados pela acção governamental.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida de activadores do plasminogénio purificados do morcego vampiro. As amostras foram de glândulas salivares (faixas 1 e 3) e de saliva (faixas 2 e 4). Cada amos tra foi tratada com endoglicosidase F antes de SDS-PAGE. Faixas 1 e 2: transferência Western e imunocoloração Faixas 3 e 4: Autografia com fibrina.
A Figura 2 mostra a % de lise de coágulos do plasma empobrecido em plaquetas catalisada pelo tPA e pela proteína activadora do plasminogénio de morcego de 40 kd.
A Figura 3 mostra a % de lise de coágulos de plasma rico em plaquetas catalisada pelo tPA e pela proteína activador do plasminogénio de morcego.
A Figura 4 mostra a inactivação de activadores do plasminogénio por componentes do plasma.
A Figura 5 mostra o peso molecular em SOS-PAGE de proteínas com 40 kd e 45 kd, identificadas por coloração com prata e Autografia com fibrina.
A Figura 6 mostra a lise de coágulos catalisada pelo Bat-PA e pelo tPA.
A Figura 7 mostra a ligação deactivadores do plasminogénio à fibrina.
A Figura 8a mostra a sequência de nucleotídeos do cDNA de activador do plasminogénio de morcego vampiro e as sequências de aminoácidos dos activadores do plas^ minogénio.
-12A Figura 8b mostra uma representação esquemática da sequência de aminoácidos de activador do plasminogénio de morcego vampiro e comparação com t-PA humano.
A Figura 9 descreve da forma esquematizada a síntese do plasmídeo p(88)SZ-100-20 que deriva do conhecido plasmídeo pSP73 e que contem a sequência do gene Bat-PA(H) e finalmente a síntese do plasmídeo pSZ88-104-20 que deriva do plasmídeo conhecido pD5 e que contem a sequência do gene Bat-PA(H).
A Figura 10 descreve de forma esquemática a síntese dos plasmídeos pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 e p89WO-8 que derivam do plasmídeo conhecido pSP73 e que contêm a sequência do gene Bat-PA(H) e dos plasmídeos pSZ89-lll, pSZ89-112 e pSZ89-113 que derivam do plasmídeo conhecido pD5 e que contêm a sequência do gene Bat-(PA(H).
A Figura 11 descreve de forma esquemática a síntese dos plasmídeos p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 e p89WO-12 que derivam do plasmídeo conhecido pSP37 e que contêm a sequência do gene Bat-PA(I) e dos plasmídeos p89WO-l, p89WO-2A, B,C, p89WO-3 e p89WO-4 que derivam do plasmídeo conhecido pD5 e que contêm a sequência do gene Bat-PA(I)T
A Figura 12 descreve de modo esquemático a síntese dos plasmídeo p89WP-20A e B e p89WP-19A & B a partir do plasmídeo conhecido pD5 e de p89WP-17 e p89WP-18, respectivamente, p89WP-19 foi obtido a partir de p89WO-ll e p89WO-18 foi obtido a partir de p89WO-9.
DESCRIÇÃQ DETALHADA DO INVENTO
O invento está relacionado com proteínas nativas e recombinantes de activador do plasminogénio purificado e quaisquer formas micro-heterogéneas ou fragmentos das proteínas associadas à saliva ou às glândulas salivares do morcego vampiro Desmodus rotundus.
Proteína e polipeptídeo são aqui usados como sinónimos e referem-se a um polímero linear de aminoácidos ligados uns aos outros com ligação amidas. A sequência de aminoácidos na cadeia é de importância crítica no funcionamento biológico da proteína ou polipeptídeo. Activadores do plasminogénio conforme aqui usados referem-se a proteínas que catalisam a formação de plasmina, uma enzima que hidroliza peptídeos e ésteres de arginina e lisina e converte a fibrina em produtos solúveis.
Os anticorpos monoclonais e policlonais para as proteínas são úteis para o isolamento e identificação de proteínas do presente invento. Eles podem ser produzidos por qualquer uma das técnicas convencionais bem conhecidas. Por exemplo, os anticorpos policlonais podem ser sintetizados por um animal, como seja um coelho que recebeu uma injecção das proteínas activadores do plasminogénio de Desmodus rotundus. Após injecção, aumenta o nível de anticorpos no animal. 0 sangue contendo anticorpos, designados anti-soro, é então colhido do animal. 0 anticorpo específico do activador do plasminogénio é então isolado de entre outros anticorpos presentes no anti-soro, através de qualquer uma de uma série de técnicas de separação, e.g. cromatografia de afinidade. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando a técnica de Kohler e Milstein, Nature, 256, pág. 495-497 (1975).
-14Proteínas nativas conforme aqui usado refere-se a proteínas de tamanho completo produzidas pelos correspondentes genes. Derivado recombinante refere-se ao isolamento de um gene ou cDNA para uma proteína pretendida e a utilização dequele gene purificada ou cDNA para contruir uma célula que produzirá em abundância a proteína pretendida. As formas de fragmento são definidas como porções de proteínas ou polipeptídeos que têm menos aminoácidos do que as proteínas nativas mas que contêm o sítio ou sítios activos dos activadores do plasminogénio. Formas micro-heterogéneas conforme aqui é usado refere-se ao produto de um único gene, ou seja uma proteína produzida a partir do DNA de uma única unidade de gene, a qual é estruturalmente modificada após tradução. Estas modificações estruturais, no entanto, não resultam em quaisquer alterações significativas da actividade da proteína. As modificações podem ter lugar in vivo ou durante o processo de isolamento e purificação. A modificação in vivo pode resultar em acetilação do extremo N, proteólise, glicosilação ou fosforilação, ou aindas outras. A proteólise pode incluir exoproteolise em que um ou mais aminoácidos terminais são salivados enzimáticamente em sequência para produzir formas micro-heterogéneas que têm menos aminoácidos do que o produto do gene original. A proteólise pode também incluir modificação endoproteolítica que resulta da acção de endoproteases as quais clivam o peptideo em sítios específicos dentro da sequência de aminoácidos. Modificações semelhantes específicos dentro da sequência de aminoácidos. Modificações semelhantes podem acorrer durante o processo de purificação podendo resultar na produção de formas micro-heterogéneas. A modificação mais comum que corre durante a purificação é a proteólise.
Uma outra realização do invento é uma proteína activador do plasminogénio tendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% homóloga da sequência polipeptídica dos aminoácidos 1-441 mostrado na Figura 8a, a referida proteína tendo actividade de activador do plasminogénio
-15que é estimulada na presença de um cofactor de fibrina e a referida proteína sendo capaz de se ligar fortemente à fibrina.
Uma outra execução do invento é uma proteína activadora do plasminogénio tendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 90% homóloga da sequância polipeptídica dos aminoácidos 1-441 mostrada na Fig. 8a, a referida proteína tendo actividade de activador do plasminogénio que é estimulada na presença de um cofactor de fibrina e a referida proteína sendo capaz de se ligar fortemente à fibrina.
Uma outra execução do invento é uma proteína activadora do plasminogénio tendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% homóloga da sequência polipeptídica dos aminoácidos 1-3 e 50-441 mostrado na Fig. 8a, a referida proteína tendo actividade de activador do plasminogénio que é estimulada na presença de um cofactor de fibrina.
Uma outra execução do invento é uma proteína activadora do plasminogénio tendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 90% homóloga da frequência polipeptídica dos aminoácidos 1-3 e 50-441 mostrada na Fig. 8a, a referida proteína tendo actividade de activador do plasminogénio que é estimulada na presença de um cofactor de fibrina .
Uma outra execução do invento é uma proteína activadora do plasminogénio tendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% homóloga com a sequência polipeptídica dos aminoácidos 1-3 e 87-441 (com o arninoácido na posição 88 mudado de treonina para prolina) mostrada na Fig. 8a, a referida proteína tendo actividade de activador do plasminogénio que é estimulado na presença de um cofactor de fibrina.
Uma outra execução do invento é uma proteína activadora do plasminogénio tendo uma sequência
-16polipeptídica que é pelo menos 90% homóloga com a sequência polipeptídica dos aminoácidos 1-3 e 87-441 (com o aminoàcido na posição 88 mudado de treonina para prolina) mostrada na Fig. 8a, a referida proteína tendo actividade de activados do plasminogénio que é estimulado na presença de um cofactor de fibrina.
O invento está ainda relacionado com o isolamento e purificação da informação genética responsável pelas proteínas individuais e com os métodos de expressão das proteínas correspondentes.
A Figura 1, mostra a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) de activador do plasminogénio purificado de morcego. As amostras foram pré-tratadas com ditiotreitol 25mM antes da electroforese numa de concentração de SDS-11% de poliacrilamida. A faixa 1 mostra o activador purificado (3,6 ug) a partir das glândulas salivares do morcego vampiro, a faixa 2 mostra o activador (3,6 ug) tratado com endoglicosidase F (Boehringer Mannheim) (0,1 unidades durante 24 horas a 37°C); e a faixa 3, 0,1 unidades de endoglicosidase F. Os marcadores de peso molecular são como descritos. O activador do plasminogénio de morcego (100 ng) das glândulas (faixas 1) e da saliva (faixa 2) foram analisadas por transferência Western usando anticorpos de coelho anti activador do plasminogénio de morcego e conjugado de fosfatase alcalina com IgG de cabra anti IgG de coelho. A autografia com fibrina do activador (15 IU) derivado de glândulas (faixa 3) e de saliva (faixa 4) foi efectuada como descrito em Laemmli, U.K. Nature, 227, pág. 680-685 (1970).
Para se obter os dados apresentados na Figura 1, glândulas submandibulares primárias e acessórias congeladas (6 g) de morcegos Desmodus rotundus foram colocados em 40 ml de lOmM Tris-HCl, 0,5M NaCl, pH 7,5 e imediatamente homogeneizadas usando um homogenizador Brinkmann. O homogenato foi centrifugado a 27.000 x g durante 20 minutos.
-17A fracção do sobrenadante foi clarificada por centrifugação a 100.000 x g durante 30 minutos, diluída para 50mM NaCl com 20mM Tris-HCl pH 7,0, 0,01% Tween 80 e aplicada numa coluna de permuta catiónica de fosfocelulose (Whatmann Pll) equilibrada em 20mM Tris-HCl, pH 7,2, 50mM NaCl e 0,01% Tween 80.
Após a aplicação da amostra, a coluna de fosfocalulose foi lavada exaustivamente com o tampão de equilíbrio atrás. A activador do plasminogénio de morcego foi eluido da coluna de fosfocelulose com 20mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5M NaCl e 0,01% Tween 80 e aplicado numa coluna de afinidade consistindo no inibidor da tripsina de Erythrina (ETI) (American Diagnostica) acoplado a Sepharose 4B activada com CNBr (Pharmacia). A coluna de afinidade foi lavada com 20mM NaH2PO^, 0,5M NaCl, pH 7,0, 0,1% Tween 80 e o activador foi subsequentemente eluido com acetato 50mM, 0,2M NaCl, pH 4,0, 0,1% Tween 80. As fraeções contendo o activador foram reunidas e adicionada uma base Tris 1M para uma dar uma concentração final de 25mM. A amostra purificada foi guardada a -70QC. A concentração de proteína foi calculada pelo ensaio de ligação de corante Biorad usando albumina do soro bovino como padrão.
A Figura 6, mostra a lise de coágulos catalisada pelo activador do plasminogénio de morcego e pelo tPA. Os coágulos de plasma foram formados pela adição de
0,2 UI de trombina humana (Sigma) e 7,5mM CaCl„ a 195 ml de 125 plasma humano contendo fibrinogénio marcado com [ l] (100 000 cpm/coágulo) . O volume final de cada amostra foi de 200jil. Os coágulos foram formados na presença de pequenos paus de madeira a que aderiram, deixados durante 30 minutos a 37ÔC, comprimidos para sair líquido e transferidos para 250pl de plasma a que se adicionou 25U/ml de Hirudina (Sigma). Vinte e cinco jjI de 0,1M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01% Tween 80 contendo o activador do plasminogénio foram adicionados à solução que banhava os coágulos, as amostras foram incubadas a 37SC e removidas amostras em que se contaram os produtos solúveis de degradação da fibrina. O activador do plasminogénio de morcego purificado a partir de glândulas salivares e o t-PA de duas cadeias
-18foram usados neste estudo, ▼ , 3nM PA de morcego; 3nM t-PA;
• lOnM PA de morcego; A lOnMt-PA. O activador do plasminogénio de morcego e o t-PA apresentam eficácias semelhantes quan do controlados relativamente às suas capacidades para catalisar a libertação dos produtos ou degradação de fibrina marcados radioactivamente a partir dos coágulos de plasma pré-formados.
A Figura 7 mostra a ligação de actividades do plasmídeo à fibrina. Faixa 1, PA de morcego,
1,8 pmoles; Faixas 2 e 3, 10% do volume das fracções do sedimento e sobrenadante, respectivamente, da amostra de fibrina contendo activador do plasminogénio de morcego; Faixa 4, t-PA de uma única cadeia, 1,8 pmole; Faixas 5 e 6, 10% do volume de fracções do sedimento e sobrenadante, respectivamente, da amostra de fibrina contendo t-PA; Faixa 7, uroquinase, 0,9 pmoles; Faixas 8 e 9, 10% do volume das fracções do sedimento e sobrenadante, respectivamente das amostras de fibrina con tendo uroquinase. As três espécies de activador do plasminog<á nio de morcego (faixa 1) estão desigualmente distribuídas entre as fracções do sedimento e do sobrenadante. O grosso do PA(H) de morcego distribui-se pelo sedimento de fibrina (Faixa 2) enquanto que PA(I) de morcego e PA(L) de morcego não têm afinidade discernível para a fibrina e estão predominante, mente localizados na fracção do sobrenadante (faixa 3). Amos tras de tPA (faixa 4) e de uroquinase (faixa 7) foram também controladas quanto à sua capacidade de ligação à fibrina.Confome esperado, tPA liga-se fortemente à fibrina e distribui-se pela fracção do sedimento ((faixa 5) mas a uroquinase está localizada exclusivamente na fracção do sobrenadante (faixa 9).
Os coágulos de fibrina formaram-se pela adição de 0,2 IU de trombina a 200ul de lOmM NaF^PO^, 140mM Nall, pH 7,4, 0,001% Tween 80 contendo fibrinogénio huma no (1 mg/ml), EDTA (5mM) e activador do plasmogénio de morcego (18 pmoles) ou tPA de uma única cadeia (18 pmoles) ou uroquinase (5,5 pmoles). O tPA de uma única cadeia foi purificado a
-19partir de uma mistura de tPA de uma única cadeia e de duas ca deias por cromatografia com uma coluna de anticorpo monoclo nal que preferencialmente se liga a t-PA de uma única cadeia (PAM-1, American Diagnostica). Os coágulos de fibrina foram deixados durante 2 h a 37°C e centrifugados a 100,000 x g durante 10 minutos. As fracçoes do sedimento foram lavadas com 400 μΐ de tampão NaF^PO^, Nall, Tween 80, ressuspensas com 150μ1 de 0,5% SDS e incubadas a 37SC durante 1,5 horas com agitação constante. O sedimento e as fracçoes do sobrenadante contendo o activador do plasminogénio de morcego foram tra tados com Endo F. As amostras foram sujeitas a SDS-PAGE e ;analizadas por análise FA.
Ensaios do activador do plasminogénio
Método da Placa de Fibrina: Formaram-se placas de fibrina por dissolução de fibrinogénio bovino ou humano (2 mg/ml) e Glu-plasminogénio humano (6jjg/ml) numa solução de 1% de agarose (mantida a 55°C). Adicionou-se então trombina humana (1,5 un_i dades) antes de colocar a solução nas placas de imunodifusão calibradas. Fizeram-se cavidades na placa de fibrina endureci^ da e aplicaram-se as fracçoes da coluna. Observaram-se áreas de lise onde estava presente a actividade. A área de lise 2 (mm ) por tempo de incubação a 37SC pode ser correlacionada com as unidades de actividade da enzima.
Autografia de Fibrina: As amostras foram sujeitas a SDS-PAGE em condições não redutoras e o gel de acrilamida foi extensivamente lavada em Triton X-100 (2,5%) e depois colocado num gel de agarose onde activam o plasminogénio para dar plasmina A plasmina gerada degrada a fibrina resultante no aparecimento de uma zona de fibrinólise que á facilmente reconhecida contra o fundo de fibrina não degradada.
-20Ensaio Amidolítico Acoplado: A activação do plasminogénio para dar plasmina foi examinada na presença de Desafib e a produção de plasmina foi controlada com um substrato corado da plasmina, Spectrozyme PL. Os activadores do plasminogénio de morcego foram incubados com Glu-plasminogénio humano (20ug/ml) Spectrozyme PL (0,4mM) e Desafib (80ug/ml). A mistura foi incubada a 37QC durante 60 min. A reacção terminou pela adição de 50 jil de 10% SDS. A absorção do substrato clivado foi controlada a 405nm. Uma unidade de actividade dos activadores do plasminogénio de morcego corresponde à quantidade de enzima que catalisa a renovação de 1 |imole de Spectrozyme Ph em 1 minuto a 37QC.
Titulação do Sítio Activo: Os activadores do plasminogénio de morcego vampiro foram titulados por duas técnicas diferentes para determinar a molaridade funcional. A primeira técnica baseou-se no principio de retro-titulação back titration de um padrão tripsina calibrado com uma solução padrão calibrada de um inibidor clorometilcetona da tripsina e dos activadores do plasminogénio. Uma solução de tripsina (500 mM) foi titulei da directamente usando 4-metil-umbeliferi-p-guanidinobenzoato (MUGB). A clorometilcetona (Dansil-glutamil-glicil-arginina-clorometilcetona, DNS-EGRCK) foi titulada òontra a tripsina calibrada com MUGB. A reacção de tal solução de tripsina calibrada com uma solução de clorometilcetona calibrada permite a medição da redução na inibição do padrão tripsina quando o padrão (K é pré-incubado com os activadores. A presença de activadores do plasminogénio de morcego resulta num aumento de actividade relativamente ao controlo tripsina-CK gue é pro porcional à quantidade de actividade do plasminogénio.
A segunda técnica envolveu a obser vação da cinética de explosões após a adição de MUGBE ao acti^ vador do plasminogénio de morcego quando a reacção foi da a temperaturas baixas (5QC).
efectua
-21Electroforese em Gel de SDS-poliacrilamida: Usámos um protocolo modificado do sistema de Laemmli (Nature, 227, pág. 680-685 (1970)). Os géis de concentração e de separação (0,75 mm) continham 4% e 10% de poliacrilamida, respectivamente. Os géis correram a 75 volts durante 20 horas. A proteína foi detectada por coloração com prata.
Purificação de Proteínas dos Activadores do Plasminogénio de Morcego
Materiais: A saliva e as glândulas salivares de Desmodus rotundus foram adquiridas à Antibody Associates, Bedford, TX e ao Dr. C. Rupprecht, Rabies Unit, Wistar Institute, Philadelphia, PA. O fibrinogénio, plasminogénio, trombina e substratos para o ensaio amidolítico foram da American Diagnostica, New York, NY. Os materiais usados na electroforese foram adquiridos à BioRad, Inc. e os materiais usados na cromatografia em coluna foram da Pharmacia. As colunas de HPLC foram da Vydac. As placas de imunodifusão foram da ICN.
Processo: A purificação dos activadores da saliva de morcego vampiro envolve os passos de cromatografia em fosfocelulose, fenil-separose e HPLC de fase reversa em C4.
A saliva de morcego vampiro Desmodus rotundus foi diluida 3 vezes o seu volume com uma solução lOmM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Tween-20. A saliva diluida foi centrifugada durante 5 min. a 12.000 rpm, a 42C, numa centrífuga Eppendorf. O sobrenadante foi aplicado directamente numa coluna de fosfocelulose (25 x 10 cm) e lavado com o mesmo tampão usado para diluição da saliva. A coluna foi elui-
-22da a um caudal de 6 ml/h. A actividade foi determinada pela área de lise usando o método das placas de fibrina e a proteína foi controlada pela D.O. 280.
Os activadores do plasminogénio de morcego ligaram-se fortemente à coluna de fosfocelulose. A recuperação da actividade após eluição usando 1M NaCl foi de 94% (Tabela 1).
As fracções da coluna de fosfocelulose contendo actividade activador do plasminogénio foram reunidas e aplicadas directamente a uma coluna de fenil-sefarose (1,5 x 5,0 cm) na presença de 2,5M NaCl. A coluna foi lavado com um gradiente de 2M NaCl até OM NaCl e 10% de glicerol em tampão 10mM Tris. A lavagem com 90% de glicerol continuou até toda a actividade ter eluido.
A cromatografia usando a coluna de fenil-sefarose resultou em 82% de recuperação da actividade (Tabela I). No entanto, a actividade foi fraccionada em dois picos, 1 e 2, os quais foram reunidos separadamente. Os dois picos apresentaram diferentes pesos moleculares conforme determinado por coloração com prata após SDS-PAGE e Autografia com Fibrina (Figura 5). O pico 1, que pensamos representar PA(L) de morcego, eluiu para o fim do gradiente salino (2M-OM NaCl). Pensamos que o pico 2 representa PA(I) de morcego.
Após cromatografia em fenil-sefarose conseguimos uma purificação de cerca de 660 vezes do PA(L) de morcego. A actividade total da enzima PA(I) de morcego não foi determinado de modo óptimo pelo ensaio amidolítico usando o sistema de acoplamento plasminogénio/Spectrozyme PL, uma vez que Desafib não é um cofactor eficaz para este activador do plasminogénio de morcego.
-23TABELA I
Tabela de Purificação
| Passo | Actividade | Rendimento | Proteína |
| Saliva de morcego (4 ML) | Unidades 206 | % 100 | OD280 76.230 |
| Fosfocelulose | 194 | 94 | 7.000 |
| Fenil-separose | |||
| Pico 1 | 142 | 69 | 0.079 |
| Pico 2 | 2 7* | 13* | 0.083 |
| HPLC de fase reversa C4 Pico 1 | 119 | 57 | N.D. |
| * < Desafib não é cofactor | adequado para | esta espécie | de PA de |
morcego. N.D. não determinado.
passo de purificação final para as proteínas foi uma coluna de HPLC de fase reversa C4 que foi préviamente equilibrada com 0,1 x (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água. Os conjuntos de fracções de proteína foram concentrados por liofilização e aplicados directamente à coluna de HPLC. A enzima foi eluida com um gradiente de 25% a 55% de acetonitrilo na presença de 0,1% TFA. Os picos de proteínas foram controladas a D.O. 214 e colhidos separadamente. Os ma-24teriais voláteis foram removidos por centrifugação sob vácuo, seguido de liofilização. As proteínas foram redissolvidas em ácido acético lOmM. A actividade foi testada usando o método das placas de fibrina após o ácido acético ter sido neutralizado por tampão Tris Tween.
A purificação do activador do plasminogénio a partir das glândulas salivares do morcego vampiro foi efectuada como se segue.
As glândulas submandibulares primárias e acessórios de morcegos vampiros foram colocados em tampão contendo 10 mM Tris-HCl, 0,5M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5 e imediatamente homogenizado usando um Polytron. Após centrifugação, a fracção SN clarificada foi concentrada e equilibrada em lOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, pH7,2 através da utilização de uma célula Amicon (membrana YM 10). O retentato foi directamente aplicado na coluna de fosfocelulose (Whatmann) equilibrada com lOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,2. A proteína activadora do plasminogénio foi quantativamente adsorvida à coluna de fosfocelulose e eluida por passos com tampão de aplicação suplementar com 0,5M NaCl. A recuperação de actividade é tipicamente superior a 80%.
As fracções contendo actividade de activador foram reunidas e aplicadas a uma coluna de afinidade consistindo no inibidor da tripsina de Erythrina (ETI) acoplado a Sepharose 4B. O grosso da actividade foi adsorvido a esta coluna e eficazmente eluida por lavagem da coluna com Naacetato 50mM, pH 4,0, 0,2M NaCl e 0,1% Tween 80. A recuperação final da actividade do activador do plasminogénio de morcego a partir do extracto de glândulas usando este protocolo foi de 91% dando aproximadamente 5,4 mg de activador do plasminogénio de morcego partindo de 6 g de glândulas. A homogeneidade da preparação do activador do plasminogénio de morcego foi indicada por uma correspondência da concentração de proteina estimada e da molaridade funcional calculada conforme determinado por titulação de sítios activos usando 4-metil-um-25beliferil-p-guanidinobenzoato (Urano et al., Biochem. Biophys Res. Coram. 150, 45-51 (1988)).
A coloração das proteínas após
SDS-PAGE das fracções activas reunidas revelou um arranjo complexo de bandas que apresentam uma gama de valores de Mr. A migração destas espécies corresponde as zonas de actividade conforme definido por análise FA. Esta correlação além de estar de acordo com a análise de aminoácidos, análise N-terminal e titulação de sítios activos proporciona evidência de que o activador foi purificado com êxito até à homogeneidade.
Caracterização das Proteínas e Actividade
Os activadores do plasminogénio do presente invento não apresentam actividade com placas de fibrina em plasminogénio. A incubação dos activadores com pias, minogénio na presença de Fibrina I (Desafib) resulta na geração de plasmino conforme avaliado por transparência Western e imunocoloração com um anticorpo anti-plasmin(ogénis). Eles apresentam actividade contra plasminogénio humano ligado a fibrina humana assim como plasminogénio bovino ligado a fibrina bovina.
Na cromatografia de filtração em gel Sepharose G-200, a actividade de activador do plasminogénio de morcego presente na saliva bruta foi eluida como um pico largo com um peso molecular aproximadamente de 130K. Este peso molecular foi provávelmente um peso molecular de agregados do activador do plasminogénio de morcego. Surgir à volta da região 32k na coluna de HPLC de Sepharose na presença de 0,01% Tween 20.
-26Durante os estudos de purificação o activador do plasminogénio de morcego não interactuou com lisina-sefarose, que anteriormente se tinha mostrado um passo eficaz na purificação de proteínas de ligação à fibrina via domínio de ansas múltiplas. Assim, o mecanismo de ligação dos activadores à fibrina é distinta do tPA.
O tratamento dos activadores com endoglicosidase H e F forma proteínas activas de peso molecular mais baixo, indicando que os activadores são glicoproteínas. A interacção destas proteínas com gérmen de trigo - e concanavalina A - agarose, proporciona mais apoio a esta conclusão .
A capacidade de PA(H) de morcego de activar Glu-plasminogénio foi avaliado com um ensaio acoplado que controlou a renovação de um substrato amidolítico específico para a plasmina (Tabela II). A actividade específica (UI/mmole) de PA(H) de morcego contra Glu-plasminogénio foi de aproximadamente 260 vezes menos do que o tPA quando testado na ausência de uma simulação de fibrina. No entanto, a actividade específica de PA(H) de morcego contra Glu-plasminogénio na presença de Desafib foi de aproximadamente 85% da apresentada pelo tPA. Portanto, Desafib estimulou a actividade tPA e PA(H) de morcego 205 e 45.000 vezes, respectivamente.
A actividade específica apresentada pelo PA de morcego, a preparação contendo as três formas moleculares, foi comparável à de PA(H) de morcego na ausência de Desafib mas aproximadamente 30% inferior à de PA(H) de morcego na presença deste cofactor de fibrina (Tabela II). Deduzimos que as actividades de PA(I) e PA(L) de morcego não são estimulados no mesmo grau que PA(H) de morcego por 80 jig/ml de Desafib.
-2 7TABELA II
Activação do Plasminogénio por PA(H) de morcego, PA de morcego e tPA
| Activador do | de Desafib | Estimulação | ||
| plasminogénio | Concentração | NS. de | vezes | |
| 0 ug/m1 | 80 ug/ml | |||
| Bat-PA(H) | 1,05 í 0,04 | 47,700- 4500 | 45.000 | (220 ) |
| Bat-PA | 1,24 + 0,08 | 33.500+ 970 | 27.000 | (130 ) |
| tPA | 270 + 20 | 55.400+ 1500 | 205 | (1) |
Estes dados estão relacionados con. actividades específicas (Ul/mmole) usando o ensaio amidolítico acoplado descrito atrás. 0 t-PA de duas cadeias foi usado nestes ensaios; a actividade catalítica do t-PA de uma única cadeia não está divulgado uma vez que os resultados surgem perturbados pela geração inevitável de tPA de duas cadeias durante o ensaio. Desafib foi incluído no ensaio quando indicado. As entradas sob o título Estimulação NS. de vezes são as razões entre as actividades específicas na presença e na ausência de Desafib.
Os números estre parêntesis são a estimulação da actividade de activador de plasminogénio pelo Desafib relativamente à apresentada pelo tPA.
As capacidades do tPA e de PA(H) de morcego de catalisar a lise dos coágulos de fibrina contendo plasminogénio foram também comparadas. São necessárias con-
-28centrações ligeiramente mais altas de PA(H) de morcego para se conseguir velocidades de lise de coágulos idênticos às que resultam das concentrações de tPA variando entre 0,25 e lOnM. As concentrações de tPA e de PA(H) de morcego (derivadas das suas curvas de dose-resposta) que dão origem a velocidades de lise de coágulos seleccionados estão apresentadas na Tabela
III. A actividade específica de PA(H) de morcego relativamente à do tPA varia de 59 a 72% e foi relacionada com a concentração de plasminogénio activado. A maior actividade específica do PA(H) de morcego relativamente ao tPA em concentrações mais altas pode reflectir diferenças entre estes activadores do plasminogénio relativamente aos seus modos de interacção com fibrina e/ou plasminogénio.
TABELA III
Eficácia
| Velocidade | tPA(nM) | PA(H) de | morcego(nM) | relativa |
| 0,850 | 9,33 ± 1,11 | 12,9 ± 1,05 | 72,3 | |
| 0,825 | 7,52 ± 0,88 | 10,53 | + 0,83 | 71,4 |
| 0,800 | 6,05 ± 0,69 | 8,60 | ± 0,66 | 70,4 |
| 0,775 | 4,88 + 0,54 | 7,02 | ± 0,52 | 69,5 |
| 0,725 | 3,16 ± 0,34 | 4,68 | ± 0,32 | 67,5 |
| 0,675 | 2,05 ± 0,21 | 3.12 ! | + 0.20 “ / | 65,7 |
| 0,625 | 1,33 ± 0,13 | 2,08 | ±0,12 | 63,9 |
| 0,575 | 0,86 ± 0,08 | 1,39 | + 0.07 — 1 | 61,9 |
| 0,525 | 0,56 ± 0,05 | 0,92 | ± 0,05 | 60,9 |
| 0,475 | 0,36 ± 0,03 | 0,61 | + 0,03 | 59,0 |
| 0,425 | 0,24 ± 0,02 | 0,41 | ± 0,02 | 58,5 |
As experiências de lise de coágulos usando o ensaio turbidimétrico foram efectuadas em quadruplicado com as seguintes concentrações de tPA de 2 cadeias ou PA(H) de morcego: 0,25, 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10,0 nM. A velocidade de lise de coágulos foi definida como a velocidade máxima do decréscimo da turbidez (-mOD/min) conforme determinado por análise de cada perfil da lise de coágulos com o software para cinética Softmax. Obtiveram-se quatro e seis curvas lineares de dose-resposta (velocidade vs. log /activador do plasminogénio/) para o tPA e PA(H) de morcego respectivamente . Na tabela estão descritos as concentrações de activador do plasminogénio que resultam nas velocidades de lise de coágulos indicadas. Estes valores foram derivados das equações que descrevem as linhas mais adaptadas construídas a partir da análise de todas as curvas de dose-resposta para tPA e PA(H) de morcego. Os valores da eficácia relativa são as razões das concentrações de tPA sobre PA(H) de morcego que resultam na velocidade de lise de coágulos indicada.
Os activadores do plasminogénio de morcego do presente invento são menos susceptíveis do que o tPA à inactivação pelo inibidor do activador do plasminogénio tipo 1 (PAI-1) de actuação rápida.
Pensa-se que a concentração de
PAI-1 na área de um vaso com uma oclusão pode ser muito maior do que as concentrações calculadas a partir dos estudos com plasma. A existência de PAI-1 latente no plasma e plaquetas contendo PAI-1 que pode ser libertado pela trombina, difosfato de adencsina e outros agonistas das plaquetas, contribui para as concentrações locais relativamente altas nas áreas com oclusões. PAI-1 actua como um anti-activador que bloqueia especificamente a actividade do tPA.
A Figura 4, mostra que o tPA é mais fácilmente inactivado por inibidores do activador do plas^ minogénio do que são os activadores do plasminogénio da saliva de morcegos vampiros. O tPA e os activadores do plasminogénio da saliva de morcegos vampiros foram incubados individualmente em plasma e as suas respectivas actividades controladas em função do tempo.
A inibição da activação do plasmi nogénio mediada por NaCl pelo tPA e pela proteína de 40kd não foi observada quando controlamos a lise de coágulos de fibrina. Neste caso os coágulos foram feitos a partir dos componen tes purificados que incluíram fibrinogénio (marcado e não mar cado), plasminogénio, p( 2-antiplasmina, Factor XIII a e tampão com ou sem 0,IM NaCl.
Electroforese de PA de morcego em gel de SDS-poliacrilamida e transferência de proteínas para Immobilon (Membrana PVDF)
As fracções activas reunidas deri vadas de uma coluna de afinidade com inibidor da tripsina foram obtidas e posteriormente fraccionadas utilizando uma colu na de HPLC Vydac C4, a partir da qual foi eluida a proteína activadora do plasminogénio a aproximadamente 40% acetonitrilo/0,l% ácido trifluoroacético. Detectaram-se dois picos prin cipais de actividade (conforme determinado pela análise de placas de fibrina) que eluiram da coluna de HPLC. Os dois picos de actividade foram reunidos separadamente e designados PA(I) e PA(II) de morcego.
Usando electroforese em gel de
SDõ-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido de autografia com fibrí na, o PA(I) e o PA(II) de morcego apresentam um padrão semelhante de zonas líticas que variam nos pesos moleculares entr
42.000 e 46.000 daltons. Os PA(I) e (II) de morcego foram marcados com ^H-DFP (Diisopropilfluorofosfato) um reagente de marcação de sítios activos para proteínas serina.
A electroforese em gel de poliacrilamida dos activadores do plasminogénio de morcego designados I e II foi efectuada usando um protocolo modificado do sistema Laemmli (Nature, 227, pág. 680-685 (1970)). Os géis de concentração e separação (0,75mM) contêm 4% e 10% de poliacrilamida, respectivamente. Os géis migraram a 75 volts durante 20 horas.
As proteínas separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida foram electrotransferidas para Immobilon (membranas PVDF) adquiridas à Millipore,
NS Catálogo IPVH304FO. A electrotransferência de proteínas foi efectuada essencialmente como descrito por Matsudaira (J. Biol. Chem. 261, pág. 10035-10038, 1987). Resumidamente as proteínas foram electroeluidas do gel de SDS-poliacrilamida a 30 volts durante um período de 15 horas. A transferência Immobilon foi então corada com Azul Coomassie para revelar bandas de proteína na transferência. As bandas de proteína foram cortadas directamente da transferência e colocadas no Sequenciador de Fase Gassa Modelo 477A com um filtro de polibreno por detrás da amostra transferida. Os programas do seguênciador e os reagentes foram os fornecidos pelo fabricante (Applied Biosystems) Os derivados de aminoácidos libertados foram identificados por um sistema de HPLC acoplador.
Sequências de aminoácidos N-terminais de activadores do plasminogenos de saliva de morcego vampiro
A sequenciação N-terminal do activador do plasminogénio fraccionado por SDS-PAGE foi efectuada usando uma membrana de polivinilideno-difluoreto (Immobilon, Millipore) e um sequenciador Applied Biosystems modelo 470 com uma análise de PTH acoplada (Matsudaira, P., J. Biol. Chem.
262, 10035-10038 (1987)). Os fragmentos Vtí do activador do plasminogénio foram gerados por redução/alquilação do activador com ditiotreitol/iodoacetamida, incubação da proteína modificada com protease V8 de Staphylococcus aureus (Boehringer Mannhein) e isolamento de fragmentos proteolíticos usando uma coluna de HPLC Vydac C-18. O fragmento peptídico do sítio activo, TI, foi identificado como se segue: o activador do plasminogénio foi incubado com /1,3-^h7 diisopropil-fluorofosfato (New England Nuclear) na presença de Desafib (American Diagnostica), tratado com ditiotreitol e iodoacetamida, digerido com tripsina e o fragmento marcado radioactivamente foi isolado por HPLC e submetido para análise da sequência.
Oito bandas de proteína com actividade de activador do plasminogénio foram identificados na transferência de Immobilon e sujeitas à análise da sequência.
As sequências obtidas estão descritas abaixo: A-( )-indica que nenhum aminoácido foi identificado naquela posição particular, provávelmente devido à instabilidade e fraca recuperação de certos aminoácidos do sequenciador de proteínas.
BANDAS 1- Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-Arg-Tyr-Phe BANDAS 2- Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ala-( )-( )-Tyr-( )Asp-Gln-Gly-Val
BANDAS 3- Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thri Gln-Met-(Thr)-Tyr bandas 4!- Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-ThrGln-Met-(Thr )-Tyr-Lys
BANDAS 5- Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-PheBANDAS 6
Ile-Gly-Gly
Al a-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-LysAsp-Gln-Glv-Val
BANDAS ,7- Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys/ Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly
BANDASJ8- Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-LysAsp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr
Clonagem molecular do cDNA do activador do plasminogénio de morcego
A tecnologia de DNA recombinante e aqui definida como a tecnologia que permite que segmentos de informação genética, DNA de diferentes células, geralmente de organismos defirentes, sejam ligados extremo a extremo fora dos organismos a partir dos quais se obteve o DNA e incorporar este DNA híbrido numa célula que permitirá a produção da pro-34-
teína que o DNA original codifica. A informação genética, DNA ou mRNA, é isolada e incorporada num veículo de clonagem adequado e transfectuada para uma célula hospedeira adequada.
Vector de clonagem conforme aqui é usado define-se como uma sequência de DNA que permite a incorporação de DNA estranho experimental específico, sendo o DNA combinado introduzido numa célula hospedeira que pode exi£ tir de modo estável e expressar a proteína ditada pelo DNA experimental. 0 DNA estranho combinado com o DNA vector constitui uma molécula de DNA recombinante que deriva de tecnologia recombinante. Os vectores de clonagem podem incluir plasmideos, bacteriófago, virus e cosmídeos. Deve-se entender que qualquer vector de clonagem pode ser usado para clonar as novas sequências de DNA codificadoras de proteínas de Desmodus. Os vectores de expressão são aqui definidos como as sequências de DNA que são necessárias para a transcrição de cópias clonadas de genes e para a tradução dos seus mRNAs num hospedeiro adequado. Tais vectores podem ser usados para expressar genes procarióticos ou eucarióticos numa variedade de células tais como bactérias, leveduras, insectos e células de mamíferos..As proteínas podem também ser expressas numa série de sistemas virais. Um vector de expressão constituido adequadamente deverá conter: uma origem de replicação para replicação autónoma em células hospedeiras, marcas selectivas, um número limitado de sítios de restrição úteis, um número elevado de cópias e promotores fortes. Um promotor é definido como uma sequência de DNA que dirige a RNA-polimerase para se ligar o DNA e iniciar a síntese de RNA. Um promotor forte é aquele que provoca a iniciação de mRNAs numa frequência elevada. Os vectores de expressão podem incluir, mas não estão limitados a, vectores de clonagem, vectores de clonagem modificados, plasmideos de vírus especificamente projectados.
As proteínas do presente invento podem existir mas não obrigatoriamente como proteínas completas especificadas pelos genes definidos em proteína nativas de
-35Desmodus ou como qualquer fragmento ou subunidade dela, ou como híbridos da proteína completa ou dos seus fragmentos ou subunidades, desde que as proteínas apresentem propriedades de um activador do plasminogénio derivado da saliva de Desmodus rotundus tendo uma necessidade absoluta da presença da fibrina. As proteínas completas, como aqui são usadas, referem-se ao polipeptídeo de tamanho completo modificado após tradução produzido pelos genes adequados de Desmodus. As proteínas completas podem ser obtidas por purificação a partir da saliva de Desmodus rotundus ou por expressão num vector de expressão adequado do correspondente produto do gene recombinante. Os fragmentos ou subunidades de proteínas referem-se a qualquer fracção da proteína que contenha menos aminoácidos do que a proteína completa e que retenha a capacidade de activar o plasminogénio nas mesmas condições da proteína nativa.
As proteínas híbridas incluem, mas não estão limitadas a proteínas de fusão ou proteínas resultantes da expressão de vários genes dentro do vector de expressão. (Jma proteína de fusão é definida como aquela em que um número limitado de aminoácidos codificados pelo vector de expressão são expressos e a expressão resulta na sua ligação ac polipeptídeo específico activados do plasminogénio. As proteínas resultantes de vários genes podem incluir o polipeptídeo activador específico ligado a um segundo polipeptídeo de peptídeos por ligação peptídicas que aumentam a activação do plasminogénio.
As glandulas salivares foram obtidas a partir de 10 morcegos vampiros mortos recentemente e usados para o isolamento de RNA poliA+. Este RNA foi usado para construir uma biblioteca de cDNA unidireccionais em lgt22 consistindo em mais de 2 x 10θ bacteriofagos recombinantes.
Uma outra preparação de RNA usada na análise de transferências Western foi isolada a partir de glândulas que foram congeladas em neve carbónica. A qualidade deste RNA mostrou-se comparável à isolada a partir de tecido fresco.
-36Isolou-se RNA total a partir de glândulas submandibulares primárias e acessória de morcegos vampiros (Desmodus rotundos) pelo método de tiocianato de guanidinio a baixa temperatura (han, J. et al., Biochem. 26, 1617-1625 (1987). Isolou-se RNA poli (A)+ por cromatografia em oligo(dt)-celulose. Preparou-se cDNA de cadeia dupla por uma modificação do método de Gubler e Hoffman (Gene 25, 263-269 (1983)) como préviamente descrito (Dixon, R.A.F. et al., Nature 321, 75-79 (1986)). O cDNA foi fraccionado de acordo com o tamanho por electroforese em gel de agarose em zonas de comprimentos de l-2kb e 2-7 kb que foram ligadas ao sítio EcoRI dos braços de lambda ZAP (Stratagene). As bibliotecas foram amplificadas em E. coli estirpe LE 392 e depositadas por hibridação de placas como descrito (Mamiatis, Τ. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Paras de oligonucleotídeos complementares parcialmente sobreponíveis correspondendo aos peptideos N-l, N-3, V-2 e T-l foram emparelhados, marcados com o fragmento Klenow e quatro ^32P_7 alfa-dNTPs e usados como sondas de bibliotecas transferidas para nitrocelulose. As condições de hibridação e de lavagem foram as descritas por Maniatis et al., ibid. Os elones positivos foram purificados por placas e as inserções de cDNA repescadas por coinfecção com um fago auxiliar de acordo com as instruções dos fornecedores. A sequenciação de DNA de cadeia simples e dupla foi efectuada pelo método de didesoxinucleotídeos Sanger, F et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., vol 74, pág. 5463-5467 (1977).
A Figura 8a mostra a sequência de nucleotídeos do cDNA do(s) activador(es) do plasminogénio e a sequência de aminoácidos do(s) activadores. A sequência de nucleotídeos estende-se desde o extremo 5' do clone maior até à grelha de leitura aberta. Não estão apresentados 800 nucleotídeos adicionais de sequência 3' não traduzida, terminando numa cauda poli(A). A sequência de nucleotídeos está numerada à esquerda de cada linha com o codão de iniciação proposta sendo a primeira base. A sequência do arninoácido prevista está
apresentada em código de uma só letra e numerada à direita de cada linha. As sequências de aminoácidos determinadas para PA(H), Pa(I) e PA(L) de morcego estão sublinhadas e designadas N-l, N-2 e N-3 respectivamente. PA(H) de morcego correspondendo a uma forma de tamanho completa em gue o peptideo sinal foi clivado numa posição análoga do sítio da clivagem sinal no tPA. PA(I) de morcego começa com os mesmos três aminoácidos de PA(H) de morcego seguido de seguências começando com N-2 correspondendo os domínios EGF. Portanto PA(I) de morcego correspondente a uma forma não em dedo de PA(H) de morcego. A sequência de aminoácidos exclusiva do PA(L) de morcego começa com os mesmos três aminoácidos, seguido da fracção do polipeptídeo que começa em N-3, excepto o segundo aminoácido de N-3 estar alterado de treomina para prolina, a seguir ao domínio EGF e dá origem a uma forma da proteína sem domínio em dedo e sem domínio EGF. Estão também sublinhadas as sequências de aminoácidos de dois fragmentos proteolíticos obtidos com V8 de estafilococus (V-l, V-2) e um fragmento triptico (T-l). O sublinhado a tracejado indica resíduos de aminoácidos que não poderam ser determinados ou gue não estão de acordo com os aminoácidos previstos a partir do cDNA. A localização do síβ tio activo ser que foi marcado com [ H/DIFP está indicado (*). Os sítios de glicosilação ligada em N previstos estão indicados pelos aminoácidos dentro de caixas.
Os oligonucleotideos iniciadores foram sintetizadas com base em três clones fágicos contendo cDNA de PA de morcego. Os clones de cDNA de PA de morcego foram sejeitos a amplificação de cadeias efectuada por polimerase (PCR) (ver Patentes dos Estados Unidos 4 800 159, col. 2, linhas 36-68, col. 3-4 e col. 5, linhas 1-20, aqui incluídas como referência). As cadeias de cDNA foram aquecidas até se separarem, altura em que se adicionou os iniciadores que se vão ligar a cada uma das cadeias. Os iniciadores vão dar a indicação à DNA-polimerase, que desempenha a sua função de replicação, para copiar uma fracção particular da cadeia. O processo foi continuado com uma série de ciclos de aquecimento
-38e arrefecimento, aquecimento para separar as cadeias e arrefecimento à medida que as cópias são feitas. Os ciclos foram repetidos para se obter cada vez mais cópias das cadeias especiais. Através de amplificação obteve-se o domínio codificador a que se ligaram sítios de restrição terminais.
Prepararam-se vectores de expressão para as três formas do activador do plasminogénio de morcego {PA(H) de morcego, PA(I) de morcego e PA(L) de morcego, como descrito abaixo, e usaram-se então para transfectar células de acordo com um protocolo de transfecção transitório (usado para determinar quantitativamente se se conseguir expressão) ou um protocolo de transfecção estável (de preferência usado para estabelecer clones viáveis).
No protocolo de transfecção transitório, 2,5 x 10^ células/placa foram semeadas em 20 ml de meio 24 horas antes da transferência. Mudou-se o meio duas a quatro horas antes da transfecção. Preparou-se um precipitado de DNA/CaPO^ preparando DNA recombinante do plasmídeo.Bat-PA-pD^ esterilizado por filtração numa concentração de 5 jig/250 μΐ de ddf^O para cada placa de 100 mm. Isto foi misturado com 500 μΐ de 0,5M CaC^ θ ddt^O para o volume final de 1 ml. Um ml de HBS 2x foi adicionado gota a gota com agitação suave. A preparação foi deixada à temperatura ambiente durante 10-30 minutos e o precipitado foi gotejado sobre a placa ao acaso com agitação suave. Após este passo, o protocolo difere ligeiramente dependendo das células a serem transfectadas. Células CV1 foram incubadas durante quatro horas a 37°C e 10% de CC^ , enquanto que as células COS7 e 293 foram incubadas quatro horas a 379C e 6% CC>2. Quatro horas após a transfecção removeu-se o meio das células 293. Quatro horas após a transfecção as células CV1 e COS7 foram sujeitas a choque com glicerol durante 2 minutos (15% glicerol em meio) e lavadas com PBS 2x. Adicionou-se então meio fresco. As células foram incubadas a 37°C e testadas 24, 48 e 72 horas após transfecção.
-39No protocolo de transfecção estável, o protocolo de transfecção transitório é seguido com as seguintes modificações. Foram semeadas 5 x 10^ células por placa de 100 mm em vez de 2,5 x 10θ células por placa de 100 mm. 0,5 |ig do plasmideo de expressão Neo foi incluído no precipitado de DNA/CaPO^ para selecção com G418. As células foram mantidas em selecção durante 48 horas com mudança de meio com intervalos de 2-3 dias até se desenvolverem colónias resistentes' a G418.
Vectores intermediários e de expressão foram preparados como se segue para as várias formas do activador do plasminogénio de morcego.
I. Bat-PA(H)
1. NTL 5' natural:
Obtiveram-se cDNAs de Bat-PA(H) a partir da biblioteca de cDNA por amplificação PCR do cDNA usando os pares de oligodesoxinucleotídeos 141 & 142 e 27 & 19 apresentados abaixo como iniciadores:
Bgl II
5’ > ATA TAT AGA TCT AGG GAC ACC GCA CAA ÔIQ GTG > 3'
Spe I Bgl II
5’ > ATA TAT GAG CTC AGA TCT CAG GGA GTT GCG TAT TCT TGG > 3’
Hind III spe I
5’ > ATA TAA GCT T AC TAG TAG GGA CAC CGC ACA AAT GGT G > 3' met
Xbal Sac I > TAT ATC TAG A GA GCT CCA GGG AGT TGC GTG TTC TTG G > 3'
-40PCR foi efectuada num volume de 100 μΐ de reacção composto por lOmM Tris-Cl pH 8,3, 50mM KCl,
1,5mM MgClz, dNTPs 200 yM para cada, 100 pmoles de cada um dos iniciadores de PCR, 10-100ng de cDNA ou DNA da biblioteca e 2,5 unidades de polimerase Tag. A reacção foi programada num sistema de formação de ciclos de temperatura para DNA durante 30 ciclos. Cada ciclo inclui dois minutos de desnaturação a 94°C, dois minutos de emparelhamento a 60QC e dois minutos de polimerização a 72SC. Os cDNA amplificados foram purificados em gel e depois cortados com BglII e ligados a pSP73 no sítio BglIII. Após verificação da sequência, as grelhas de leitura abertas de Bat-PA(H) foram subclonadas no vector de expressão eucariótico pD5 contendo o principal promotor tardio de adenovírus para gerar pSZ88-104-20 (ver Fig. 9). As células 293 foram transfectados com pSZ88-104-20 para gerar células de mamíferos 293-Bat-PA-l (ATCC N9_). Células de E. coli foram transfectadas com pSZ88-104-20 para dar origem a células bacterianas BPA-CN-pSZ88-104-20 (ATCC N°_).
2. NTL 5' Kozak:
cDNAs de Bat-PA(H) foram amplificados por PCR como descrito atrás usando como iniciadores os pares de oligodesoxinucleotídeos 18 & 19:
| HindIII | Spe I | Nco | I | ||
| 5' > | ATA TAA GCT | TAC TAG | TCC ACC ATG | GTC | |
| met | |||||
| AAT ACA ATG AAG | AC > 3 ' | ||||
| Os cDNAs | amplificados | foram puri- | |||
| ficados | em gel e depois | clivados com | Xba I e Hind | III | seguido |
de ligação ao vector intermidiário pSP73 entre os seus sítios Xba I e Hind III para gerar pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 e p89WO-8. As grelhas de leitura abertas de Bat-PA(H) foram
ainda subclonadas no sítio Sac I/Spe I do vector pD5-mcs que contem um sítio de clonagem múltipla em vez do sítio de clonagem BamHI original para gerar pSZ89-lll-l7, pSZ89-112 e ? pSZ89-113 (ver Fig. 10). As células de E. coli foram transfec tadas com pSZ89-ll-17 para gerar células bacterianas BPA-CKpSZ89-lll-17 (ATCCN2_).
II. Bat-PA(I)
As grelhas de leitura abertas de Bat-PA(I) foram obtidas a partir da biblioteca de cDNA pelo mesmo processo PCR descrito atrás e reconhecido pelo seu tama nho mais pequeno relativamente à isoforma completa. Bat-PA(I) contendo o NTL natural foi derivado do par de oligodesoxinucletídeos 27 & 19 enquanto que Bat-PA(I) contendo o NTL Kozak foi derivada do par de oligodesoxinucleotídeos 18 & 19. As grelhas de leitura abertas de Bat-PA(I) amplificadas foram clivadas com Hind III e Xba I para clonagem em pSP73 para gerar p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 e p89FWO-12 ou clivadas por Spel e Saci para clonagem no vector pD5- mas para gerar p89WO -1, p89-WO-2, A, B, C, p89WO-3 e p89WO-4 (ver Fig. 11). As cé lulas de E. coli foram transfutadas com p89WO-l para gerar as células bacterianas BPA-FK-p89WO-1 (ATCC N2_). As células de E. coli foram transfectadas com p89-WO-2C para gerar as células bacterianas BPA-FN-p89WO-2C (ATCC N2_).
III. Bat-PA(L)
As grelhas de leitura abertas de Bat-PALL) foram derivadas da biblioteca de cDNA por meio da mesma amplificação PCR do DNA de biblioteca com os pares de oligodesoxinucleotídeos 18 & 11,4 como iniciadores.
11,4 5 ? CCT TTC TCC TGA TGA CCT TC > 3 '
DNA amplificado foi purificado em gel e depois cortado com Ncol e a mais pequeno dos três fragmentos Ncol, que codifica a porção 5' de Bat-PA(L), foi novamente purificado em gel e ligado a p89WO-ll clivado com Ncol (uma grelha de leitura aberta de Bat-PA(H) em pSP73) para se obter p89WP-17 e p89WP-18, respectivamente. As grelhas da leitura abertas de Bat-PA(L) foram então removidas dos vectores intermediários por clivagem com Saci e Spel e subclonados no vector pD5-mcs dando origem a p89W-20A&B e p89WP-19A&B (ver Fig. 12). As células de £. coli foram transfectadas por p89WP-20A para gerar células bacterianas BPA-DK-p89WP-20A (ATCC N2._).
Os ensaios em placas de agar com fibrina do meio condicionado removido às 48 horas após-transfecção de COS-7 revelou 50 ng/ml de BatPA.
O clone pSZ88-104-20 foi considerado com sendo o de melhor expressão. Este clone foi estabelecido nas células 293 e expressou mais de 0,5 microgramas por mililitro por dia de actividade BatPA/ monocamada confluente.
A exposição crónica a butirato e optimização do meio aumentou o nível de expressão para mais de 10 microgramas por mililitro por dia. Outros vectores de expressão adequadas são pSZ89-111-17 (um derivado de pSZ88-104-20 com um Kozak em vez de um 5'-NTL natural), EBN/EBNA/D5BatPA-C e CMVIE-AKl-BatPA-C e HIV LTR/BatPA-C.
Comparação com o activador do plasminogénio tipo tecido humano
Está apresentada abaixo uma comparação da estrutura primária de sequência de aminoácidos do activador do plasminogénio tipo tecido humano e Bat-PA(H) do invento.
| 1 | 10 | |||||||||||
| t-PA HUMANO | G | ‘ A | R | S | Y | Q | V | I | C | R | D | E |
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O domínio fibronectina em dedo do tPA humano (sequência 9-46) tem 78% de homologia com a sequên cia 6-43 de Bat-PA(H). O domínio do factor de crescimento epidérmico do tPA humano (sequência 46-95) tem 75% de homologia com a mesma sequência 43-92 de Bat-PA(H). 0 primeiro domí. nio de essas múltiplas do t-PA humano (sequência 95-177) tem 67% de homologia com a sequência 92-174 de Bat-PA(H).
O segundo domínio de essas múltiplas do t-PA humano (sequência 178-265) não tem contraparte
-50em Bat-PA(H). Os aminoácidos 175 e 176 de Bat-PA(H) são lisina e alamina. Os aminoácidos 190-441 de Bat-PA(H), a cadeia leve, tem 74% de homologia com sequência 280-531 da cadeia leve do tPA humano.
A Figura 8B é uma representação esquemática da sequência de aminoácidos de Bat-PA(H) e comparação com t-PA humano (Pennica et al., Nature vol. 301, 214221 (1983)). Os aminoácidos individuais de Bat-PA estão indicados com o código de uma só letra. Os circulos fechados mostram a identidade de aminoácidos entre Bat-PA(H) e t-PA humano. Os circulos abertos representam resíduos divergentes. O padrão dissulfureto proposto é por analogia com t-PA. Os sítios de glicosilada ligada em N postulados estão indicados por um parêntesis recto ligado.
Além dos derivados naturais Bat-PA(I) e Bat-PA(L) deste activador do plasminogénio, outros derivados incluídos no presente invento são utilizadores de activadores do plasminogénio excluindo a região do domínio em dedo (aminoácidos (-3)-43) ou a região do factor de crescimento epidérmico (aminoácidos 43-84). (Jm outro derivado é Bat-PA(H) tendo alteradas resíduos aminoácidos que possam ligar açúcares. Todos apresentam as características de activação do plasminogénio desejáveis, incluindo uma semi-vida maior.
Também estão dentro do âmbito do invento proteínas de fusão da cadeia leve de Bat-PAs (sequência 190-441) e de cadeia pesada do tPA humana/sequência 1-278) e seus derivados tendo propriedades de activação do plasminogénio. Uma vez que os domínios proteolíticos de Bat-PAs não são significativamente inactivados pelo inibidor do activador do plasminogénio tipo 1, pensamos que as proteínas de fusão melhorariam as propriedades farmacológicas relativamente ao activador do plasminogénio de tecido humano.
-51Conforme préviamente mencionado a actividade dos activadores do plasminogénio de morcego é dramáticamente estimulada na presença de um cofactor de fi brina. Parece ser pelo menos 90 vezes mais selectivo do gue o tPA contra o plasminogénio ligado a fibrina. O segundo domínio de ansas múltiplas do tPA é portador de um sítio de ligação à lisina que se pensa desempenhar um papel decisivo na mediação da estimulação da actividade induzida por fibrina. Pelo contrário a sequência de aminoácidos do activador do presente invento revela que a sua marcada afinidade para a fibrina não é devido à presença de uma região semelhante no segundo domínio de causas múltiplas do t-PA. Ainda a incapacidade dos activadores do plasmideo de morcego em se ligarem a Lis-sefarose mostra que a presença de um sítio de ligação à lisina não é responsável pela activação do plasminogénio espicifica de fibrina.
O domínio de ansas múltiplas dos activadores do invento medeia a estimulação da actividade induzida por fibrina apesar das suas diferenças relativamente à segunda região de ansas múltiplas do tPA.
Os activadores também diferem estruturalmente do tPA pela ausência de um sítio de processameri to sensível à plasmina na enzima de morcego.
As proteínas Bat-PA descritas atrás foram definidas por meio da sequenciação do DNA do gene e da sequência do aminoácidos deduzida. É óbvio que existem variações alélicas naturais. Estas variações podem ser demonstradas por uma ou mais diferenças de aminoácidos na sequência total ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de um ou mais aminoácidos na referida sequência. Ainda, a localização e grau de glicosilação dependerá da natureza do ambiente celular do hospedeiro.
-52Na utilização de tecnologia de DNA recombinate existe o potencial para a preparação de vários derivados dos activadores do plasminogénio de morcego, modifX cados de modo diverso por uma ou várias substituições, dele ções ou adições, por exemplo, por meio de mutagénese dirigi da do DNA de base. Todas estas variações e modificações alél^ cas resultando em derivados do activador do plasminogénio de morcego estão incluídas dentro do âmbito deste invento desde que permaneça inafectada a actividade característica de activador do plasminogénio de morcego. O activador do plasminogénio de morcego for preparado (1) tendo metionina no seu pri meiro aminoácido (presente à inserção do codão do sinal de iniciação ATG antès do gene estrutural) ou (2) sempre que a metionina é clivada intra ou extracelularmente, tendo o seu primeiro aminoácido normal ou (3) juntamente com o seu polipeptídeo sinal ou uma proteína conjugada além do polipeptídeo sinal convencional, o polipeptídeo sinal ou conjugado sendo especificamente clivável num ambiente intra ou extracelular (ver Publicação do Pedido de Patente Britânica Ní.2007676 A) ou ((4) por expressão directa na forma madura sem a necessid de de clivar qualquer polipeptídeo estranho supérfluo. 0 últ mo é particularmente importante quando um claro hospedeiro não pode remover um peptideo sinal ou não o faz eficazmente quando o veículo de expressão for destinado a expressar o activador do plasminogénio juntamente com o seu peptideo si nal. Em qualquer dos casos, o activador do plasminogénio de morcego assim produzido, nas suas várias formas, é recuperado e purificado até um nível adequado à sua utilização no tratamento de vários estados vasculares ou doenças.
m| -H|
Tratamento terapêutico
Estas proteínas podem ser administradas por qualquer meio adequado que resultará na sua líber-53
tação para a corrente sanguínea em quantidade substancial. A administração intravenosa é presentemente comtemplada como a via de administração preferida. Elas são solúveis em água e podem portanto ser eficazmente administrados em solução.
Num exemplo de aplicação, uma quantidade adequada de proteínas do presente invento é administrada intravenosamente a uma vítima de ataque cardíaco.
As doses adequadas para se conseguir trombólise são até 200mg de preferência entre 25 mg e 15G mg e mais preferencialmente entre cerca de 25 mg e 50 mg.
As proteínas podem também ser aplicadas nas doses atrás referidas por injecções de bolus sucessivas durante um período de várias horas.
As proteínas podem ser coadministradas com inibidores da agregação de plaquetas para produzir o efeito combinado de trombólise e de inibição da agregação de plaquetas. A coadministração inclui administração intravenosa dos inibidores de agregação de plaquetas numa quantidade que iniba a agregação de plaquetas, e.g. uma quantidade que atinga um estado estacionário da concentração no plasma entre 0,06 e 2pM.
Claims (2)
-
< 1- X CJ H CJ X X CJ o o CJ CJ CJ X CJ UI o 06 o cu X X CJ CJ CJ H CJ CJ X X Ι- CJ {— H co CJ cr CJ Ul Ο > H to u X CJ 1— H H o CJ CJ X b CJ CJ 1- to CJ Pu CJ X X co H co <· CJ Ι- o CJ X X CJ Ο Ι- X CJ X X 06 o QU Ο > CJ Q Ι- co X X H CJ H Ο CJ CJ X H CJ X X X 06 H u* X X CO X >6 X CJ CJ CJ CJ I- H X CJ o X X H X z X 06 H CJ CJ UI CJ X H CJCJCJCJCJCJ CJCJ CJu. CJ HCJ JH l—H tu CJCJCJXHCJHCJH cj :cj fCJCJCJCJXΗ LO CJ <CJ QHCJCJ CJ CJ <CJ « CJo CJ X CJ μ f- CJ X X CJ X H X co CJ Q Ι- CJ μ Cu Ι- Cu b > ί- CJ H >> X ΪΖ ί- o H CJ X Ο CJ ο X ο CJ CJ ο X X O CJ fu CJ X X o CJ o CJ o X z CJ Pu X H X u» ί- o CJ UI o ar CJ CJ f- to o X X o o CJ CJ ο 1— X H X f— H CJ X CJ o X í- CJ o O X CJ > H X Z CJ X CJ X o a H Cu CJ PU H to X ί- CJ α X O X CJ H CJ X CJ CJ CJ o X CJ «! 3 Z CJ X pi 3 tZ O O X CJ CJ X CJ X H CJ H (O G u CJ H ο X o X ao r*. Ό ·— CM ΓΊ o* oo r9» O «-·< H X H X H o CJ > X CJ o X o X US o o o o < ·< H o o o < H f- >- o < o Ι- H ο H > G o O o O o < o D o Ou O H o í- o < μ- CJ O X X o o α o X o X ί- X tZ ο o u X o CJ Ul H CJ o CJ X o o X H o O CJ H o o CJ X CJ o O CJ X sD (ACM d <CD <α z>u e uma sequência da cadeia pesada do activador do activador do plasminogénio tipo tecido; tendo a referida proteína maior actividade de activação do plasminogénio na presença do inibi dor do activador do plasminogénio tipo 1 do que o activador do plasminogénio tipo tecido na presença do inibidor do activador do plasminogénio tipo 1.185. - Método de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA que codifica uma glicoproteina de acordo com a reivindica ção 7.195. - Método de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA que codifica uma glicoproteina de acordo com a reivindica ção 8 .205. - Método de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA que tem 90% de homologia com a sequência de DNA de acordo com a reivindicação 9.215. - Método de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA que tem 90% de homologia com a sequência de DNA de acordo com a reivindicação 10.225. - Veículo de clonagem replicável, caracterizado por compreender uma sequência de DNA inserida, de acordo com a reivindicação 18.23ã. - Veículo de clonagem replicável, caracterizado por compreender uma sequência de DNA inserida, de acordo com a reivindicação 19.24§. - Veículo de clonagem replicável, caracterizado por compreender uma sequência de DNA inserida, de acordo com a reivindicação 20.25â. - Veículo de clonagem replicável, caracterizado por compreender uma sequência de DNA inserida, de acordo com a reivindicação 21.de uma ligado ef icaz26ê. - Processo para a preparação composição farmacêutica para activação de plasminogénio a fibrina, caracterizado por se incluir uma quantidade da glicoproteína de acordo com a reivindicação 2.27ã.ser especificamente com a reivindicação reactivo com1 atggtgaatacaatgaagacaaagctcttgtctctactcctgctttgtcgagcagtcttctcgttccccaggcaggaaacctacagccaa (-36) NVNTMKTKLLCVLLLCGAVFSLPRQETTRQ (-07)91 ttggcaagggcatccacaccatatgctctcgcctccacacaccaaaaaacccagatcatataccaccaacaagactcctggctgcgcccc cr mCMo CJ β CJ CJ H Vi X CJ cr CJ CJ X >- CJ CJ H CJ CJ CJ H :* G X H CJ X CJ H CJ H z CJ e> CJ cu CJ -J X H tu CJ CJ CJ CJ X CJ X CJ CJ X CJ CJ CJ Q X tz CJ CJ CJ CJ CJ CJ X ¢- CJ O υ CJ H Vi *5 to x H H CJ F CJ CJ CJ H H X H X H X p4 CJ X X co K u CJ e> CJ a CJ u CJ UI CJ u CJ o CJ CJ CJ CJ H H (J CJ X X H H X CJ CJ H CJ CP X tz CJ X H Pu CJ > CJ o f- CJ H co X Σ CJ CJ w CJ CJ H CJ H CJ o H f— o CJ X f— X X CJ CJ X CJ οέ X 06 CJ Q X Í-M H >* X z 1- CJ CJ X H CJ CJ CJ O <CJX cj cr cjCJCJ XHH cj >H o8°CJI- 5HCJX to oHX ·—CJI—XOOCJ CJ <CJCJCJI—XCJCJ cuCJCJCJ PCCJH5* gCJCJCJXCJI—HCJHH fCJXCJCJ <CJXCJ _f— X CJ > X to O CJ ο H CJ •“CJ X O CJ ’ f- CJ O X o e£ μ _) o 06 H CJ H f- Ε- o CJ H υ CJ X ί- X H» X HU CJ u CJ CJ H X f— CJ X Ul CJ ο X X Ι- Zt X X CJ Ο o CJ X CJ X »4 CJ O o X CJ CJ o -I G CJ X o 3 z X b o CJ CJ X f— O o X CJ X X o cr H CJ CJ o μ >- X CJ H μ o 5:G - 2 .Anticorpo caracterizado por a glicoproteína de acordo28â. - Célula de mamífero caracterizada por ser transfectada com um veículo de clonagem da reivindicação 24.29â. - Célula bacteriana caracte rizada por se transfectada com um veículo de clonagem da rei vindicação 24.
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