JP2713467B2 - バンパイアバット唾液プラスミノーゲン賦活体 - Google Patents

バンパイアバット唾液プラスミノーゲン賦活体

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Description

【発明の詳細な説明】 バンパイアバットもしくは吸血コウモリは、犠牲動物
を負傷させて得る新鮮血が食餌として絶対的に必要であ
る。これらの傷は表面的なものであるが数時間血液の浸
出が続く。
吸血コウモリデスモダス・ロタンダス（Desmodus rot
undus）の唾液成分は研究されており、哺乳類血液の止
血機序を３種の異なったレベルで妨害することが明らか
にされている。これらは血小板凝集を阻害し、プラスミ
ノーゲンを賦活化することが示されている（Hawkey,C.C
M,Nature 211:434（1966）,Hawkey,C.Cm.Haemotol.13:1
014（1967））。これらの活性はそれぞれ異なったタン
パク質画分と関連している。プラスミノーゲンを賦活化
させるフラクションはデスモキナーゼと名付けられてい
る（Hawkey,Nature）。Cartwright,T（Blood）は、デス
モダスの唾液から得られたデスモキナーゼの精製を記載
しており、これが予め形成されているクロット（血塊）
の溶解にウロキナーゼ（UK）やストレプトキナーゼより
有効であることが示唆されている。
組織型プラスミノーゲン賦活体（tPA）を血栓溶解剤
として用いるには、深刻な出血合併症、比較的頻繁に起
こる再閉塞、均一に有効でないこと、１型プラスミノー
ゲン賦活体阻害剤（PAI−Ｉ）による不活性化に対する
感受性等の多くの欠点がある（Loskutoff,Seminars in
Thrombosis and Hemostasis,Vol.14,No.1（1988））。
血栓溶解療法に起因する出血合併症は、循環プラスミ
ノーゲンの賦活化によって起こる、少なくとも悪化す
る、と考えられる。tPAのフィブリン結合能は、フィブ
リン結合プラスミノーゲンに対する著しい基質親和性の
原因であると考えられる。しかし理論的考察及び臨床の
結果から、クロットの急速な溶解に必要とされる高レベ
ルのtPAがかなりの量の循環プラスミノーゲンの賦活化
をも生じることが示された。
更に、tPAと血漿中の阻害剤との相互作用が注入中及
び注入後のtPAの機能活性を減少させ、これが再閉塞の
原因となるのではないかと考えられる。
tPAの血栓溶解剤としての用途に付随する欠点として
は他に、tPAの必要服用量が100〜150mgと多量であって
この治療法を非常に高価なものとする事がある。
我々はフィブリン結合プラスミノーゲンに対して、更
に著しい選択性を示し、従って血栓溶解治療に用いた場
合に出血の程度と頻度が減少する可能性があるデスモダ
ス・ロタンダスの唾液及び唾液線に存在するプラスミノ
ーゲン賦活体を見いだした。更に、この賦活化因子は血
漿中の阻害剤例えばPAI−Ｉによって容易には不活性化
されず、従って再閉塞の頻度を減少させる可能性があ
る。
本発明の目的は、安全性及び効能の両方に関してtPA
よりも優れたフィブリン溶解剤を提供することである。
また本発明の目的は、本発明のタンパク質をコードす
るDNA配列を同定し、この配列を組織由来cDNAから作成
して発現ベクターに機能するような形で挿入することで
ある。
また本発明の目的は、タンパク質を産生するように発
現ベクターによって形質転換された宿主微生物または真
核細胞を用いて本発明のタンパク質を産生することであ
る。
また本発明の目的は、本発明のタンパク質に反応性の
抗体を生産することである。
本発明はデスモダス・ロタンダス唾液及び唾液線から
得られた精製または一部精製プラスミノーゲン賦活化タ
ンパク質、吸血コウモリデスモダス・ロタンダス唾液及
び唾液線からタンパク質を精製する方法、これらのタン
パク質をコードするDNA配列、組換体DNA技術を用いる生
産手段、これらのタンパク質と特異的に反応する抗体及
び本発明のタンパク質を包含しているフィブリン結合プ
ラスミノーゲンを賦活化するための医薬組成物を含む。
吸血コウモリ唾液及び唾液線から単離されるタンパク
質プラスミノーゲン賦活体は、いくつかの構造及び機能
からみてtPA及びウロキナーゼのどちらとも異なってい
る。tPAと異なり、本発明のプラスミノーゲン賦活体
は、クリングル２ドメイン及びプラスミン感受性プロセ
シング部位を含んでいない。すでに形成されたプラスマ
クロットを溶解する触媒機能でみると、これらの賦活体
とtPAは同じモル数では同様に有効である。これらの賦
活体のプラスミノーゲンに対する活性は、フィブリン補
因子の存在下で少なくとも27,000倍に刺激される。tPA
ではこの値はわずかに205倍である。tPAの、全長、フィ
ンガー部欠損（フィンガーマイナス）、及びフィンガー
・EGマイナス形のそれぞれに対応する３種の異なった物
質が吸血コウモリ唾液から分離されている。これらは、
各々Bat−PA（Ｈ）、Bat−PA（Ｉ）、Bat−PAL）と呼ば
れる。以下、Bat−PAという場合は、３種の分子形態
Ｈ、Ｉ、Ｌを含む分画されていない標品を意味する。全
長物質は、他の２種と異なりフィブリンにしっかりと結
合する。Bat−PA（Ｈ）、Bat−PA（Ｉ）及びBat−PA
（Ｌ）は、ジチオスレイトールの存在下でのSDS−PAGE
で測定した場合、それぞれMr値49kd、42kd及び40kdを示
す（第１図、レーン１）。Bat−PA（Ｈ）、Bat−PA
（Ｉ）及びBat−PA（Ｌ）の脱グリコシル化形態（Ｎ−
結合炭化水素鎖をエンドグリコシダーゼＦで除去するこ
とにより得られる）の見かけのMr値はSDS−PAGEで測定
した場合それぞれ44kd、40kd及び38kdである（第１図、
レーン２）。これらのタンパク質はフィブリン補因子の
存在を厳密に要求し、プラスマクロットを溶解する著し
い触媒能を示す。フィブリン結合プラスミノーゲンに対
するこれらのタンパク質の選択性機序は、フィブリンへ
の直接結合や、NaClによる強力な阻害がフィブリン存在
下ではなくなることなどのいくつかの要因の結果であ
る。更に、吸血コウモリプラスミノーゲン賦活体は、血
漿中に存在する阻害剤による不活性化に対してtPAより
感受性が低い。
デスモダス・ロタンダス唾液に由来する「完全長」グ
リコプロテインプラスミノーゲン賦活体Bat−PA（Ｈ）
のcDNAから予測されるアミノ酸配列は次の通りである。
第8a図に示すように、Bat−PA（Ｈ）はアミノ酸配列
１−441を含み、Bat−PA（Ｉ）はアミノ酸配列１−３及
び50−441を含み、Bat−PA（Ｌ）はアミノ酸配列１−３
及び87−441を含む。更にタンパク質Ｌでは88位のアミ
ノ酸はスレオニンからプロリンに変わっている。
また次の工程を包含している吸血コウモリ唾液プラス
ミノーゲン賦活体の精製方法も本発明の範囲内である。
ａ）吸血コウモリから得た下顎腺をホモジナイズして混
合液を得、これを遠心して上澄フラクションをとる、 ｂ）この上澄みをホスホセルロースカチオン交換カラム
に加え、カラムにBat−PAを吸着させる、 ｃ）カラムを溶出してBat−PAを含むフラクションを得
る、 ｄ）有効フラクションをプールし、このプールしたもの
をエリスリナトリプシンインヒビターETI）を固定した
アフィニティクロマトグラフィカラムにかけて低pH緩衝
液でBat−PAを溶出させる。
本発明のタンパク質をコードするDNA配列、本発明の
挿入DNA配列を有するクローニングビヒクル、本発明の
タンパク質と反応性の抗体、及び本発明のタンパク質の
有効量を含有する、フィブリン結合プラスミノーゲンを
活性化するための医薬組成物も本発明の範囲内である。
プラスミノーゲン賦活体のそれぞれはフィブリンによ
って活性化される。これらの物質を区別できる唯一の特
徴はBa−PA（Ｈ）がフィブリンにしっかりと結合すると
いう他にみられない能力であり、この特性はフィンガー
ドメインの存在に関係している。フィブリン結合プラス
ミノーゲンに対するBat−PA（Ｉ）とBat−PA（Ｌ）の特
異性は、フィブリン結合能の強さには依存していないと
思われる。
Bat−PA活性の厳密なフィブリン依存性はフィブリン
溶解療法の情況に望ましい特徴である。血栓溶解剤の使
用に伴う出血合併症は、循環プラスミノーゲンの活性化
によってプラスミンが生成することにより悪化する可能
性がある。出血合併症の程度と頻度は本発明のプラスミ
ノーゲン賦活体を用いて減少させることができその作用
はフィブリン凝塊の部位に局在させることができる。
293−Bat−PA−１哺乳類細胞（ATCCNo.CRL10180）、B
PA−CN−pSZ88−104−20細菌細胞（ATCCNo.68050）、、
BPA−CK−pSZ89−111−17細菌細胞（ATCCNo.68052）、B
PA−FK−p89WO−１細菌細胞（ACTTNo.68051）、BPA−FN
−p89WO−2C細菌細胞（ATCCNo.68053）およびBPA−DK−
p89WP−20A細菌細胞（ATCCNo.68049）はブダペスト条約
の要件にしたがってアメリカンタイプカルチュアコレク
ション（ベセスダ、MD.USA）に寄託されている。これら
は米国での本願特許の発行後にまちがいなく入手可能に
なる。寄託物はまた本出願またはその継続の対応出願を
した国の特許法の規定に応じて入手することができる。
しかしながら、寄託物が利用できるということが政府に
よって付与される特許権を減損して発明の主題の実施権
を構成するものでないことは理解されよう。
本発明は、吸血コウモリデスモダス・ロタンダスの唾
液及び唾液腺に関連した天然及び組換え体由来精製プラ
スミノーゲン賦活体（アクチベーター）タンパク質並び
にその微異質（microheterogeneous）形や断片形に関す
る。
タンパク質及びポリペプチドは本明細書においては同
義に用いられ、アミド結合によって互いに結合されたア
ミノ酸の直鎖ポリマーを意味する。鎖中のアミノ酸配列
は、タンパク質またはポリペプチドの生物学的機能にと
って極めて重要である。本明細書で用いられるプラスミ
ノーゲン賦活体とは、アルギニン及びリジンのエステル
及びペプチドを加水分解してフィブリンを可溶性に変換
する酵素であるプラスミンの形成を触媒するタンパク質
を意味する。
そのタンパク質に対するモノクローナル及びポリクロ
ーナル抗体は、本発明のタンパク質を単離かつ同定する
ために有用である。それらは、当業界で公知の通常の技
術によって産生される。例えばポリクローナル抗体は、
デスモダス・ロタンダスのプラスミノーゲン賦活体タン
パク質の注射を受けたウサギのような動物によって合成
される。注射後、動物体内の抗体レベルは上昇する。つ
いで抗血清と呼ばれる抗体含有血液が動物から採取され
る。ついでプラスミノーゲン特異的抗体は、いくつかの
分離技術の一つを用いて、例えばアフィニティクロマト
グラフィによって抗血清中の他の抗体から単離される。
モノクローナル抗体はKohler及びMilstein（Nature,25
6,pp.495−497（1975））の技術を用いて産生すること
ができる。
本明細書で用いられる天然タンパク質とは、対応遺伝
子により産生される完全長のタンパク質を意味する。組
換体由来とは、所望のタンパク質に関する遺伝子または
cDNAの単離及び所望のタンパク質を過剰生産する細胞を
作成するためにその精製遺伝子またはcDNAを使用するこ
とを指す。断片形とは、天然タンパク質よりも少ないア
ミノ酸からなるが、プラスミノーゲン賦活体の活性部位
を含んでいるタンパク質またはポリペプチドを指す。本
明細書で用いられる微異質形とは、翻訳後構造的に修飾
された、DNAの単一遺伝子単位から産生されるタンパク
質である単一遺伝子産物に関する。しかしながら、これ
らの構造の修飾によって、タンパク質の活性に関してい
かなる重要な変化も生じない。修飾はインビボでまたは
単離精製プロセスのいずれかで生じる。インビボ修飾の
結果、特に限定はされないが、Ｎ末端におけるアセチル
化、タンパク質分解、グリコシル化またはホスホリル化
が生じる。タンパク質分解としては、１以上のアミノ酸
が逐次酵素的に開裂されて原遺伝子産物よりも少ないア
ミノ酸を有する微異質形を生じるようなエキソタンパク
質分解がある。タンパク質分解としては更に、アミノ酸
配列の特定位置でペプチドを開裂させるエンドプロテア
ーゼの作用に基づくエンドタンパク質分解修飾も含む。
同様の修飾は、精製プロセス中にも起こって微異質形を
生じる可能性がある。精製中に生じる最も一般的な修飾
はタンパク質分解である。
本発明のもう１つの態様は、第8a図で示されたアミノ
酸１−441のポリペプチド配列と少なくとも95％相同な
ポリペプチド配列を有するプラスミノーゲン賦活タンパ
ク質であって、このタンパク質はフィブリン補因子（co
factor）の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活化
活性を有しており、しかもこのタンパク質はフィブリン
と強固に結合できるものである。
本発明の他の態様は、第8a図で示されたアミノ酸１−
441のポリペプチド配列と少なくとも90％相同なポリペ
プチド配列を有するプラスミノーゲン賦活タンパク質で
あって、このタンパク質はフィブリン補因子の存在下で
促進されるプラスミノーゲン賦活化活性を有しており、
しかもこのタンパク質はフィブリンと強固に結合できる
ものである。
本発明の他の態様は、第8a図で示されたアミノ酸１−
３および50−441のポリペプチド配列と少なくとも95％
相同なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲン賦活
タンパク質であって、このタンパク質はフィブリン補因
子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活化活性を
有しているものである。
本発明の他の態様は、第8a図で示されたアミノ酸１−
３および50−441のポリペプチド配列と少なくとも90％
相同なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲン賦活
タンパク質であって、このタンパク質はフィブリン補因
子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活化活性を
有しているものである。
本発明の他の態様は、第8a図で示されたアミノ酸１−
３および87−441のポリペプチド配列（88位のアミノ酸
はスレオニンからプロリンに変わっている）と少なくと
も95％相同なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活タンパク質であって、このタンパク質はフィブリ
ン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活化
活性を有しているものである。
本発明の他の態様は、第8a図で示されたアミノ酸１−
３および87−441のポリペプチド配列（88位のアミノ酸
はスレオニンからプロリンに変わっている）と少なくと
も90％相同なポリペプチド配列を有するプラスミノーゲ
ン賦活タンパク質であって、このタンパク質はフィブリ
ン補因子の存在下で促進されるプラスミノーゲン賦活化
活性を有しているものである。
本発明は更に、個々のタンパク質に関する遺伝子情報
の単離及び精製と対応タンパク質の発現方法とに関す
る。
第１図は、精製されたコウモリプラスミノーゲン賦活
体のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
を示している。サンプルは25mMジチオスレイトールで前
処理してから、11％濃縮用SDS−ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動を行った。レーン１はコウモリ唾液腺から
精製された賦活体（3.6μｇ）であり、レーン２はエン
ドグリコシダーゼＥ（ベーリンガー・マンハイム）（37
℃で24時間、１単位）で処理された賦活体（3.6μｇ）
であり、レーン３はエンドグリコシダーゼF0.1単位であ
る。タンパク質分子量マーカーは示されているとおりで
ある。唾液腺及び唾液から精製されたコウモリプラスミ
ノーゲン賦活体（レーン１及び２）100ngは、ウサギ抗
コウモリプラスミノーゲン賦活体抗体及びアルカリホス
ファターゼ複合化ヤギ抗ウサギIgGを用いてウェスター
ンブロット法により分析された。唾液腺及び唾液から精
製されたコウモリプラスミノーゲン賦活体（レーン１及
び２）（15IU）のフィブリンオートグラフィは、Laemml
i,U.K.（Nature,227,680−685,1970）に記載されている
ように行った。
第１図に示されたデータを得るために、デスモダス・
ロタンダスコウモリの凍結された顎下腺及び副顎下腺
（6g）をpH7.5の10mMトリスHCl、0.5MNaCl40ml中にい
れ、ブリンクマンホモジナイザーをもちいて直ちにホモ
ジナイズした。ホモジネートは27,000xgで30分間遠心し
た。上清分画は100,000xgで20分間遠心して清澄化し、p
H7.0の20mMトリスHCl、50mMNaCl及び0.01％Tween80で平
衡化したホスホセルロース陽イオン交換カラム（ワット
マンP11）にかけた。サンプルをのせた後、ホスホセル
ロースカラムを上記平衡化緩衝液で徹底的に洗浄した。
コウモリプラスミノーゲン賦活体はpH7.2の20mMトリスH
Cl、0.5MNaCl及び0.01％Tween80でホスホセルロースカ
ラムから溶出され、エリトリナトリプシンインヒビター
（ETI）（American Diagnostica）を結合したCNBr活性
化セファロース4B（ファルマシア）にかけた。アフィニ
ティカラムはpH7.0の20mMNa2PO4、0.5MNaCl、0.1％Twee
n80で洗浄し、pH4.0の50mM酢酸ナトリウム、0.2MNaCl、
0.1％Tween80で賦活体を溶出した。賦活体含有分画をプ
ールし、1Mトリス塩基を最終濃度25mMとなるように加え
た。精製されたサンプルは−70℃で貯蔵された。タンパ
ク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用い、バ
イオラッド色素結合アッセイで評価した。
第６図は、コウモリプラスミノーゲン賦活体及びtPA
で触媒されたクロット溶解について示している。プラス
マクロットは［125I］フィブリノーゲン（10,000cpm/ク
ロット）含有ヒト血漿195μｌにヒトトロンビン（シグ
マ）0.2IU及び7.5mMCaCl2を加えて形成した。各サンプ
ルの最終容量は200μｌであった。小さな木の棒を入れ
た状態でクロットを形成させて棒に付着させ、37℃で30
分間熟成した後圧搾して液体を取り除き血漿250μｌに
移した。これにヒルジン（シグマ）25U/mlを加え、プラ
スミノーゲン賦活体を含むpH8.0の0.1MトリスHCl（0.01
％Tween80）25μｌを加えて37℃でインキュベートし
た。経時的にサンプリングして可溶性フィブリン分解産
物を測定した。唾液腺から精製されたコウモリプラスミ
ノーゲン賦活体及び２本鎖tPAがこの試験に用いられ
た。▼3nMコウモリ−PA;■3nMtPA;●10nMコウモリ−PA;
▲10nM tPA。コウモリプラスミノーゲン賦活体及びtPA
はすでに形成されたプラスマクロットから放射線標識フ
ィブリン分解産物の放出を触媒する能力に関しては同等
の効力を示した。
第７図は、フィブリンに対するプラスミノーゲン賦活
体の結合性を示している。レーン１、コウモリ−PA（1.
8pmol）；レーン２及び３、コウモリプラスミノーゲン
賦活体含有フィブリンサンプルからのペレット及び上清
分画の各々10容量％;4列目、１本鎖tPA1.8pmol;レーン
５及び６、tPA含有フィブリンサンプルからのペレット
及び上清分画の各々10容量％；レーン７、ウロキナーゼ
0.5pmol;レーン８及び９、ウロキナーゼ含有フィブリン
サンプルのペレット及び上清分画からの各々10容量％。
レーン１にみられる３種のコウモリプラスミノーゲン賦
活体は、上清及びペレット分画間で分布が異なってい
る。大部分のコウモリPA（Ｈ）はフィブリンペレット中
に分布しているが（レーン２）、コウモリ−PA（Ｉ）及
びコウモリ−Ｐ−Ａ（Ｌ）はフィブリンに対して認識で
きる程度のアフィニティを有しておらず、上清分画中に
存在する（レーン３）。tPA（レーン４）もウロキナー
ゼ（レーン７）も、フィブリンと結合できる能力を見る
と予想どおり、tPAはフィブリンと強固に結合してペレ
ット分画中に分布しているが（レーン５）、ウロキナー
ゼは上清分画中にのみ存在している（レーン９）。
フィブリンクロットは、ヒトフィブリノーゲン（1mg/
ml）、EDTA（5mM）及び、コウモリプラスミノーゲン賦
活体（18pmol）または１本鎖tPA（18pmol）またはウロ
キナーゼ（5.5pmol）を含有したpH7.4の10mMNaH2PO4、1
40mMNaCl、0.01％Tween80の200μｌにトロンビン0.2IU
を加えて形成された。１本鎖tPAは、１本鎖tPAを優先的
に結合するモノクローナル抗体カラム（PAM−１、Ameri
can Diagnostica）を用いたクロマトグラフィによっ
て、１本鎖と２本鎖の混合物から精製した。フィブリン
クロットは37℃で１時間熟成したのち、100,000xgで10
分間遠心した。ペレット分画はNaH2PO4、NaCl、Tween80
緩衝液400μｌで洗浄し、0.5％SDS150μｌに再懸濁し、
一定の撹拌下、37℃で1.5時間インキュベートした。コ
ウモリプラスミノーゲン賦活体を含有したペレット及び
上清分画はエンドＦで処理した。サンプルはSDS−PAGE
にかけてFA分析により分析した。
プラスミノーゲン賦活体アッセイ フィブリンプレート法：フィブリンプレートは、１％ア
ガロース溶液（55℃保温）にウシもしくはヒトフィブリ
ノーゲン（2mg/ml）及びヒトGlu−プラスミノーゲン
（６μg/ml）を溶解して作成した。ついでヒトトロンビ
ン（1.5単位）を加えてから目盛り付き免疫拡散プレー
トに混合液を流し込んだ。固まったフィブリンプレート
からウェルを打ち抜き、カラム分画をウェルにいれた。
活性が存在することろには溶解ゾーンが観察された。37
℃でインキュベート時間当たりの溶解面積（mm2）は酵
素の活性単位と相関している。
フィブリンオートグラフィ：サンプルを非還元条件下で
SDS−PAGEにかけた。ついでアクリルアミドゲルをTrito
nX−100（2.5％）で徹底的に洗浄し、プラスミノーゲン
含有フィブリンアガロースゲル上におく。プラスミノー
ゲン賦活体はトリトン処理することにより再生され、ア
ガロースゲル中に拡散し、そこでプラスミノーゲンを活
性化してプラスミンを生じる。生じたプラスミンはフィ
ブリンを分解し、その結果未分解フィブリンのバックグ
ラウンドに対してわかりやすいフィブリン溶解ゾーンが
現れる。
共役アミド分解アッセイ：プラスミンを生じるプラスミ
ノーゲン賦活化はDesafibの存在下で試験され、プラス
ミンの生成は比色用プラスミン基質spectrozymePLでモ
ニターされた。コウモリプラスミノーゲン賦活体はヒト
Glu−プラスミノーゲン（20μg/ml）、SpecrozymePL
（0.4mM）及びDesafib（80μg/ml）とともにインキュベ
ートした。インキュベーションは37℃60分間行った。反
応は10％SDS50μｌの添加によって停止させた。開裂さ
れた基質の吸光度は405nmでモニターした。コウモリプ
ラスミノーゲン賦活体の活性単位は、37℃で１分間の間
にspecrtrozymePLの１μmolの代謝を触媒する酵素量に
相当する。
活性部位滴定：吸血コウモリプラスミノーゲン賦活体の
機能的モル濃度を調べるために２つの異なる手法で滴定
を行った。第１の手法はトリプシン及びプラスミノーゲ
ン賦活体双方のインヒビターであるクロロメチルケトン
（CK）の検量済み標準溶液により、検量済みトリプシン
標準品を逆滴定する原理に基づく。トリプシン溶液（50
0nM）は４−メチルウンベリフェリ−ｐ−グアニジンベ
ンゾエート（MUGB）を用いて直接滴定された。クロロメ
チルケトン（ダンシル−グルタミル−グリシル−アルギ
ニンクロロメチルケトン、DNS−EGRCK）は、MUGBで検量
されたトリプシンに対して滴定された。この様な検量化
トリプシン溶液と検量化クロロメチルケトン溶液の反応
により、CK標準品が賦活体と前もってインキュベートさ
れた場合、トリプシン標準品の阻害が減少することが測
定できる。コウモリプラスミノーゲン賦活体が存在する
と、プラスミノーゲン賦活体の量に比例して対照のトリ
プシン−CKよりも活性が高くなる。
第２の手法では、反応が低温（５℃）で行われた場合
に、MUGBEをコウモリプラスミノーゲン賦活体に加えた
後のバーストキネティクスについて観察する。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動：我々はレムリの
システム（Nature,227,pp.680−685（1970））を改変し
たプロトコールを用いた。濃縮用及分離用ゲル（0.75m
m）のポリアクリルアミド含有量はそれぞれ４％と10％
であった。ゲルは75ボルトで20時間泳動した。タンパク
質は銀染色により検出した。
コウモリプラスミノーゲン賦活体蛋白の精製 材料：デスモダス・ロタンダスの唾液及び唾液腺を、テ
キサス州ベッドフォードのAntibody Associates、及び
ペンシルバニア州フィラデルフィアのWistaarInstitute
の狂犬病部のC.Rupprecht博士から購入した。フィブリ
ノーゲン、プラスミノーゲン、トロンビン、及びアミド
分解用の基質はニューヨーク州、ニューヨークのAmeric
an Dianosticaから入手した。電気泳動に使用する材料
はバイオラッド社から、カラムクロマトグラフィに使用
する材料はファルマシアから入手した。HPLCカラムはVy
dacの製品であった。免疫拡散プレートはICNから入手し
た。
手順：吸血コウモリの唾液から賦活体を精製する工程
は、ホスホセルロース、フェニル−セファロース及びC4
逆相HPLCクロマトグラフィを含む。
吸血コウモリ、デスモダス・ロタンダスの唾液を10mM
トリス、pH7.4、50mM NaCl、0.01％Tween80の溶液を
用いて３倍容に希釈した。希釈した唾液をエッベンドル
フ遠心機内で４℃、12000rpmで５分間遠心した。上清を
ホスホセルロースカラム（25x10cm）に直接載せ、希釈
に用いたのと同じ緩衝液で洗浄した。カラムの流速は6m
l/hとした。フィブリンプレート法を用い、溶解ゾーン
で活性を測定し、タンパク質はO.D.280でモニターされ
た。
コウモリプラスミノーゲン賦活体はホスホセルロース
カラムにしっかりと結合した。1MNaClを用いた溶出後の
活性の回収は94％であった（第１表）。
ホスホセルロースカラムからのプラスミノーゲン賦活
活性を含んだフラクションをプールし、2.5MNaClの存在
下でフェニルセファロースカラム（1.5x5.0cm）に直接
かけた。2MNaClから0MNaClの勾配と10mMトリス緩衝液中
10％グリセロールでカラムを洗浄した。すべての活性が
溶出するまで10％グリセロール溶液での洗浄を続けた。
フェニルセファロースカラムを用いたクロマトグラフ
ィは82％の活性を回収することができた（第１表）。し
かしその活性は２つのピーク、１と２に別れ、別々にプ
ールされた。２つのピークはSDS−PAGE後の銀染色とフ
ィブリンオートグラフィによって測定される２つの異な
った分子量を示した（第５図）。
ピーク１はBat−PA（Ｌ）を表すと考えられるが、塩
の勾配（2M−0M）NaCl）の終りの方で溶出した。ピーク
２はBat−PA（Ｉ）と考えられる。
フェニルセファロースの後、Bat−PA（Ｌ）は約660倍
に精製された。Desafibはこのコウモリプラスミノーゲ
ン賦活体にとっては効果的な補因子ではないので、プラ
スミノーゲン/spectrozymePLカップリング系を用いたア
ミド分解アッセイではBatPA（Ｉ）酵素の総活性は最適
には決定されなかった。
タンパク質の最終の精製段階は0.1％（v/v）トリフル
オロ酢酸水溶液で平衡化されたＣ逆相HPLCカラムであ
る。タンパク質のフラクションをプールしたものは凍結
乾燥によって濃縮し、HPLCカラムに直接かけた。酵素は
0.1％TFAの存在下、25％−55％アセトニトリルの勾配に
よって溶出された。タンパク質ピークはO.D.214によっ
てモニターされ別々に集められた。揮発性物質と真空遠
心によって除去し、ついで凍結乾燥した。タンパク質を
10mM酢酸に再溶解した。酢酸をTris・Tween緩衝液で中
和したのち、フィブリンプレート法を用いて活性を評価
した。
吸血コウモリ唾液腺からのコウモリプラスミノーゲン
賦活体の精製は以下のように行った。
吸血コウモリの主及び副顎下腺を10mMtris−HCl、0.5
MNaCl、0.1％Tween80、pH7.5の緩衝液中にいれ、直ちに
ポリトロンでホモジナイズする。遠心してから透明な上
清画分をアミコン撹拌セル（YMメンブレン）を使用し
て、10mMトリス−HCl,50mMNaCl、pH7.2で濃縮して平衡
にする。その濃縮物は10mMトリス−HCl、50mMNaCl、0.0
1％Tween80、pH7.2で平衡化したホスホセルロースカラ
ム（Whatmann）に直接かける。プラスミノーゲン賦活体
タンパク質は定量的にホスホセルロースカラムに吸着さ
れ、吸着時の緩衝液に0.5MNaClを加えたもので１度に溶
出される。回収された活性は概して80％より大である。
賦活体活性を含むフラクションはエリトリナ（Erythr
ina）トリブシンインヒビター（ETI）を結合したセファ
ロース4Bのアフィニティカラムにかけた。活性の大部分
はこのカラムに吸着し、カラムを50mM酢酸ナトリウム、
pH4.0、0.2MNaCl、0.1％Tween80で洗浄することによ
り、効果的に溶出された。このプロトコールを用いた腺
抽出物からのコウモリプラスミノーゲン賦活体活性の最
終的な回収率は91％で、6gの腺から約5.4mgのコウモリ
プラスミノーゲンを得た。コウモリプラスミノーゲン賦
活体標品の均質性は、蛋白濃度と４−メチルウンベリフ
ェリル−ｐ−グアニジノ−ベンゾエートを用いた活性部
位滴定によって決定される計算された機能的モル濃度と
の一致で示された（Urano et al.,Biochem.Biophys.Re
s.Comm.150,45−51（1988））。
プールされた活性フラクションをSDS−PAGE後、タン
パク染色すると、Mr値の範囲を示す一群のバンドの並び
を見ることができる。これらの蛋白種の易動度は、FA分
析による活性のゾーンに対応する。アミノ酸分析、Ｎ−
末端分析及び活性部位滴定データ間の合致に加え、この
相互関係は賦活体が均質に精製されたという証拠とな
る。
タンパク質の特性と活性 本発明のプラスミノーゲン賦活体は、プラスミノーゲ
ンを含まないフィブリンプレートには活性を示さない。
フィブリンＩ（Desafib）の存在下、プラスミノーゲン
と賦活体をインキュベートする事になり、ウェスターン
ブロットや抗プラスミン（プラスミノーゲン）抗体によ
る免疫染色により判定されるようにプラスミンが生成す
る。本発明のプラスミノーゲン賦活体は、ヒトのフィブ
リンに結合したヒトのプラスミノーゲン、並びにウシの
フィブリンに結合したウシのプラスミノーゲンに対して
活性を示す。
セファロースＧ−200ゲルろ過クロマトグラフィにお
いて、粗唾液中に存在するコウモリプラスミノーゲン賦
活体活性は、分子量約130Kのブロードなピークとして溶
出された。
この分子量は、おそらくコウモリプラスミノーゲンが
凝集した分子量でろう。0.01％Tween20の存在下でのFPL
Cセファロースカラムにおいては約32Kの領域にあるよう
にみえた。
精製を検討する中で、コウモリプラスミノーゲン賦活
体はリジン−セファロースとは相互作用しなかった。こ
の方法は、クリングルドメインを介してフィブリンと結
合するタンパク質を精製するための効果的な工程である
ことが分かっている。従ってフィブリンに対する賦活体
の結合メカニズムは明らかにtPAとは異なる。エンドグ
リコシダーゼＦ及びＨにより賦活体を処理すると、低分
子量の活性蛋白を形成する。これは賦活体がグリコプロ
テインであることを示している。これらタンパク質と、
小麦胚芽及びコンカナバリンＡ−アガロースとの相互作
用は、この結論を更に裏付けるものである。
Glu−プラスミノーゲンを活性化するためのコウモリ
−PA（Ｈ）の能力を、プラスミン特異的アミド分解用基
質の代謝をモニターする共役検定により評価した（表I
I）。Glu−プラスミノーゲンとくらべたBat−PA（Ｈ）
の比活性（IU/nmol）は、フィブリン擬薬の非存在下の
検定において、tPAの活性の薬260分の１であった。しか
し、Disfabの存在下、Glu−プラスミノーゲンに対するB
at−PA（Ｈ）の比活性は、tPAによる活性の約85％であ
った。この様にDesafibはtPA及びbat−PA（Ｈ）の活性
を、各々205倍と45,000倍まで刺激した。３種の分子形
態を含むBat−PA標品の示す比活性は、Desafibの非存在
下ではBat−PA（Ｈ）と同等であるが、フィブリン補因
子の存在下ではBat−PA（Ｈ）より約30％少なかった
（表II）。
Bat−PA（Ｉ）及びBat−PA（Ｌ）は、Desafib80μg/m
lによるBat−PA（Ｈ）と同程度までは刺激されないと思
われる。
これらのデータは、前述した共役アミド分解検定を用
いた比活性（IU/nmol）を示すものである。この検定に
は二本鎖tPAを用いた。一本鎖tPAの触媒活性は示してい
ない。というのは、検定中に二本鎖tPAが必ず生じるの
で、結果に混乱を来すからである。示した箇所では検定
はDesafib存在下で行った。刺激倍率の欄の数値はDesaf
ibの非存在下と存在下における比活性の比である。かっ
こ内の数字はDesafibによるtPAの刺激倍率に対するプラ
スミノーゲン賦活体活性の刺激倍率である。
プラスミノーゲン含有フィブリンクロットの溶解を触
媒するtPA及びBat−PA（Ｈ）の活性も比較した。0.25−
10nMの範囲のtPAによる結果と同一の速度でクロットを
溶解するには、やや高い濃度のBat−PA（Ｈ）が必要と
される。規定のクロット溶解速度をもたらすtPA及びBat
−PA（Ｈ）の濃度（容量−反応曲線から導かれる）を表
IIIに示す。tPAに対するBat−PA（Ｈ）の比活性は59−7
2％にわたっており、プラスミノーゲン活性化濃度と相
関関係にあった。濃度が高い方が、tPAと比べたBat−PA
（Ｈ）の比活性が高くなるのは、フィブリン及び／また
はプラスミノーゲンとの相互作用のモードがこれらプラ
スミノーゲン賦活体の間で違っていることを反映してい
るのであろう。
濁度検定を用いたクロット溶解試験を下記濃度の二本
鎖tPAとBat−PA（Ｈ）について４連で行った:0.25、0.5
0、1.0、2.5、5.0、7.5及び10.0nM。クロット溶解速度
は、Softmax kinetic softwareを用いてそれぞれのク
ロット溶解プロフィルを分析して決定される濁度の減少
の最大速度（−mOD/min）によって表示される。tPAにつ
いて４つ、Bat−PA（Ｈ）について６つの独立した一次
用量−反応曲線（速度対log［プラスミノーゲン賦活
体］が作成された。表中には、表示したクロット溶解速
度を生じるプラスミノーゲン賦活体の濃度が記載してあ
る。これらの値は、tPA及びBat−PA（Ｈ）の用量−反応
曲線全部の分析から構成された最適曲線を規定する等式
から導き出したものである。相対効率値は、表示された
クロット溶解速度を与えるBat−PA（Ｈ）とtPAの濃度比
である。
本発明のBat−PA群は急激に作用する１型プラスミノ
ーゲン賦活体阻害剤（PAI−１）による影響をtPAに比べ
て受けにくい。
閉塞血管におけるPAI−１の濃度は、血漿を調べて概
算される濃度よりもはるかに高いと思われる。血漿中の
潜伏性のPAI−１や、トロンビン、アデノシン二リン酸
及び他の血小板作用物質により放出されるPAI−１を有
する血小板が閉塞領域内の相対的に高い局所濃度に寄与
する。PAI−１は、特異的にtPAの活性を妨げる抗賦活体
物質として作用する。
図４はプラスミノーゲン賦活体阻害剤によって、tPA
が吸血コウモリの唾液プラスミノーゲン賦活体よりも容
易に不活性化されることを示している。tPA及び吸血コ
ウモリの唾液のプラスミノーゲン賦活体を、それぞれ血
漿中でインキュベートし、その活性を時間の関数として
モニターした。
フィブリンクロットの溶解を観察した場合、tPA及び4
0kd蛋白のどちらにおいてもプラスミノーゲン活性化のN
aC1による阻害は観察されなかった。この例においてク
ロットは、標識・非標識のフィブリノーゲン、プラスミ
ン、α−２アンチプラスミン、第X III a因子及び0.1M
NaC1含有または非含有バッファー、を含む精製された
成分からできている。
Bat−PAのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と蛋白
のイモビロン（PVDF膜）へのブロッティング トリプシンインヒビターのアフィニティカラムから得
られた活性画分を合したものを、さらにVydacC4HPLCカ
ラムを用いて分画した。カラムからアセトニトリル／ト
リフルオロ酢酸（約40％/1％）でプラスミノーゲン賦活
体蛋白を溶出した。２つの大きな活性ピーク（フィブリ
ンオートリシスで測定）がHPLCカラムからの溶出物中に
検出された。この２つの大きな活性ピークを別々に集
め、Bat−PA（Ｉ）及びBat−PA（II）と名付けた。
SDS−PAGEを行った後フィブリンオートグラフィにか
けると、Bat−PA（Ｉ）及びBat−PA（II）の両者は、42
000−46000ダルトンの分子量範囲で同じような溶解バン
ドのパターンを示す。Bat−PA（Ｉ）及びBat−PA（II）
の両者はセリンプロテイナーゼ用の活性部位標識化剤3H
−DEP（ジイトプロピルフルオロホスフェート）を用い
て標識する事ができた。
Ｉ及びIIと名付けられたコウモリプラスミノーゲン賦
活体のアクリルアミドゲル電気泳動は、Laemmliの系（N
ature,227,p.680−685（1970））の改変プロトコールを
用いて行った。濃縮ゲル及び分離ゲル（0.75mM）はそれ
ぞれ４％及び10％のポリアクリルアミドゲルを含有して
いる。ゲル泳動は75ボルトで20時間行った。
SDS−PAGEによって分離された蛋白をミリポアから購
入したイモビロン（PVDF膜、カタログ番号No.IPVH304F
O）上に電気ブロットした。蛋白の電気ブロットは、Mat
sudaira（J.Biol.Chem.261,pp.10035−10038（1987））
とほぼ同じ方法で行った。要約すると、30ボルトで15時
間、蛋白をSDS−ポリアクリルアミドゲルから電気的に
溶出する。次にイモビロンブロットをクマシーブルーで
染色してブロット上の蛋白のバンドを目にみえるように
する。蛋白バンドは直接ブロットから切り出し、予備調
整ポリブレンフィルターをサンプルの下において477型
気相シーケンサー中に入れる。シーケンサープログラム
と試薬はメーカー（Applied Biosystems）によって供給
されたものである。遊離してくるアミノ酸誘導体をオン
ラインHPLCシステムで同定する。
吸血コウモリ唾液から得られたプラスミノーゲン賦活体
のＮ−末端アミノ酸配列 SDS−PAGE分画プラスミノーゲン賦活体のＮ末端配列
決定をポリビニリデンジフルオライド膜（イモビロン、
ミリポア）とオンラインPTH解析を備えたアプライドバ
イオシステムズの470型シーケンサーを用いて行った（M
atsudaira,P.,J.Biol.Chem.262,10035−10038（198
7））。プラスミノーゲン賦活体のV8フラグメントは、
賦活体蛋白をジチオスレイトール／ヨードアセトアミド
を用いて還元／アルキル化し、この修飾蛋白をスタフィ
ロコッカス・オーレウスのV8プロテアーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム）とインキュベートし、VydacC−18HHPLC
カラムを用いて分解蛋白断片を単離する事により調製し
た。活性部位ペプチド断片T1は次のようにして同定し
た。プラスミノーゲン賦活体を［1,3−3H］ジイソプロ
ピルフルオロホスフェート（New England Nuclear）を
用いてDesafib（American Diagnostica）の存在下でイ
ンキュベートし、ジチオスレイトールとヨードアセトア
ミドを用いて処理し、トリプシンで消化し、HPLCにより
放射性同位元素標識フラグメントを単離して配列の解析
を行った。
プラスミノーゲン賦活体活性を示す８種の蛋白バンド
をイモビロンブロット上で同定し、配列解析を行った。
得られた配列は下記の通りである。−（）−は、その箇
所のアミノ酸が同定されなかったことを示す。これは恐
らくある種のアミノ酸が不安定でシーケンサーからの回
収が低かったためと考えられる。
コウモリプラスミノーゲン賦活体cDNAの分子クローニン
グ ここでは組換えDNA技術とは、異なった細胞、通常異
なった生物から得られた遺伝子情報のセグメントである
DNAを、DNAが得られた生物の外部で末端と末端を結合
し、この雑種DNAを元のDNAがコードしていたタンパク質
を生成できる細胞中に組み入れることを可能にする技術
と定義される。遺伝子情報、DNA或いはmRNAを分離し、
適当なクローニングベクター中に組み入れ、適当な宿主
細胞中に移す。
ここで用いられるクローニングベクターとは、特定の
実験的外来DNAを組み込み、できた複合体DNAが安定に存
在できかつ実験的DNAが指示するタンパク質を発現する
ことのできる宿主細胞中に導入することを可能にするDN
A配列として定義される。ベクターDNAと結合した外来DN
Aは、組換え技術によって得られた組換えDNA分子を構成
する。クローニングベクターはプラスミド、バクテリオ
ファージ、ウィルス及びコスミドを含む。新規Desmodas
蛋白DNA配列をクローニングするにはどのクローニング
ベクターを用いてもよいと理解される。発現ベクターは
ここでは適当な宿主中で遺伝子のクローン化されたコピ
ーの転写及びそのmRNAの翻訳に必要なDNA配列として定
義される。そのようなベクターはバクテリア、酵母、昆
虫、及び哺乳類細胞のような各種の細胞中で原核及び真
核遺伝子を発現させるのに使用される。このタンパク質
は多くのウィルス系でも発現させるこができる。適切に
構築された発現ベクターは以下のものを含む：宿主細胞
での自律複製用複製起点、選択マーカー、いくつかの有
用制限酵素部位、高コピー数、及び強力プロモーターな
どである。プロモーターはRNAポリメラーゼをDNAに結合
させ、RNA合成を開始させるDNA配列として定義される。
強力プロモーターはmRNAの複写の高い頻度で開始させ
る。発現ベクターはクローニングベクター、修飾クロー
ニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウ
ィルスなどを包含するがそれに限定されるものではな
い。
本発明のタンパク質は、その蛋白がフィブリンの存在
を厳密に必要とするデスモダス・ロタンダスの唾液に由
来するプラスミノーゲン賦活体の特性を示すものである
限り、デスモダスの限定された遺伝子で特定される完全
未変性タンパク質、またはその断片またはフラグメン
ト、あるいは完全蛋白、その断片もしくはサブユニット
のハイブリッドとして存在するが、それに限定されるも
のではない。ここで完全蛋白とはデスモダス遺伝子によ
って作られ転写後に修飾されたポリペプチドの全長を示
す。この完全蛋白はデスモダス・ロタンダス唾液から精
製することによって、または適当な発現ベクター中で対
応する組換え遺伝子産物を発現させることによって得る
ことができる。蛋白の断片またはサブユニットは、完全
蛋白よりも少ないアミノ酸からなり、かつ同じ条件下で
元のタンパク質と同様にプラスミノーゲンを賦活する能
力を保持しているタンパク質の部分を指す。雑種蛋白は
融合蛋白或いは発現ベクター中で複数の複数の遺伝子が
発現することにより生じる蛋白を含むがこれに限定され
ない。融合蛋白とは、発現ベクターがコードするアミノ
酸のいくつかが発現し、その結果それらが特定のプラス
ミノーゲン賦活体ポリペプチドに付加された蛋白として
定義される。複数の遺伝子から得られる蛋白とは、活性
を増進させる第二のポリペプチドまたはヘプチドにペプ
チド結合で連結された特定のプラスミノーゲン賦活体ポ
リペプチドを含む。
唾液線を10匹の屠殺直後の吸血コウモリからとり、ポ
リA+RNAを分離するのに用いた。このRNAを使用して２×
106以上の組換えバクテリオファージからなるλgt22単
方向cDNAライブラリーを作成した。ノーザンブロット分
析に使用するRNA標品は別にドライアイスで急速凍結し
た腺から分離して調製した。このRNAの品質は新鮮な組
織から分離されたものと同等であった。
全RNAを吸血コウモリの第一及び副顎下腺から低温グ
アニジウムトリオシアネート法（Han et al.,Biochem.2
6,1617−1625（1987））によって分離した。ポリ（Ａ）
+RNAはオリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィによ
って分離された。二本鎖cDNAはGublerとHoffmanの方法
（Gene 25,263−269（1983））を先に記載したように改
変した方法（Dixon,R.A.F.et al.,Nature 321,75−79）
により作成した。cDNAはアガロースゲル電気泳動法で大
きさにより１−2kb及び２−7kb部分に分画され、λZAP
（Stratagene）の腕のEcoR1部位に結合された。ライブ
ラリーはE.coliLE392株で増幅され、先に述べたように
（Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory M
annual,Cold Spring Harbor,NY）プラークハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングされた。ペプチドＮ
−１、Ｎ−、Ｖ−２及びＴ−１に相当する部分的に重複
した相補的オリゴヌクレオチドをアニールさせ、Klenow
断片及び４種の［32P］λdNTPを用いてライブラリーか
らのニトロセルロースフィルターリフトを調べた。ハイ
ブリダイゼーション及び洗浄条件は先の記載（Maniatis
et al.）と同様とした。陽性クローンを溶菌班から精
製し、挿入されたcDNAをメーカーの指示に従ってヘルパ
ーファージを共感染させて取り出した。一本鎖及び二本
鎖DNAの配列決定はジデオキシヌクレオチド法によって
行われた。Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7
4,7463−5467（1977）参照。
第8a図はプラスミノーゲン賦活体cDNAのヌクレオチド
配列及びその賦活体のアミノ酸配列を示している。ヌク
レオチド配列は一番長いクローンの５′末端から始まり
読み取り枠を含んでいる。ポリ（Ａ）尾部で終わる３′
非翻訳配列の800ntは示されていない。ヌクレオチド配
列は開始コドンとされる塩基から始めて各ラインの左に
番号がふってある。対応するアミノ酸配列は１字コード
で示され、同じく各ラインの右に番号がふってある。
Bat−PA（Ｈ）、Bat−PA（Ｉ）、Bat−PA（Ｌ）につ
いてそれぞれ決定されたアミノ酸配列は下線を引き、Ｎ
−１、Ｎ−２、Ｎ−３と示してある。Bat−PA（Ｈ）は
シグナルペプチドがtPAと同様なシグナル切断部位で開
裂された完全長型に相当する。Bat−PA（Ｉ）はBat−PA
（Ｈ）と同じ３個のアミノ酸で始まり、続いてEGFドメ
インに相当するＮ−２配列が始まる。従ってBat−PA
（Ｉ）はBat−PA（Ｈ）のフィンガーマイナス型に相当
する。Bat−PA（Ｌ）に特有なアミノ酸配列は、同じ３
個のアミノ酸配列から始まり、Ｎ−３から始まるポリペ
プチドが続く。但しＮ−３の２番目のアミノ酸はスレオ
ニンからプロリンに変わっている。Ｎ−３はEGFドメイ
ンの後ろにあるので、フィンガーマイナスかつEGFマイ
ナスの蛋白形となる。スタフィロコッカスV8で蛋白分解
されてできる断片（Ｖ−１、Ｖ−２）のアミノ酸配列、
及びトリプシンで分解されてできる断片（Ｔ−１）も下
線を引いて示した。破線は決定できなかったか、cDNAか
ら予測されたアミノ酸と一致しなかったアミノ酸残基を
示す。
［3H］DIFPでラベルした活性部位Serの位置を（＊）
で示す。予測されたＮ−結合グリコシル化部位はアミノ
酸を四角で囲って示す。
オリゴヌクレオチドプライマーは、Bat−PAのcDNAを
含む３個のファージクローンに基づき合成した。このBa
t−PAcDNAクローンに対してポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）増幅（米国特許第4,800,159号、第２欄第36−68行
目、第３−４欄及び第５欄、引用して援用する）を行っ
た。
cDNA鎖を加熱により分離し、分離した時点で各々の鎖
に結合するプライマーを加えた。このプライマーは複製
を行うDNAポリメラーゼに対して鎖の特定部分を複製す
るように指示するものである。このプロセスは一連の加
熱及び冷却のサイクル、即ち加熱して鎖を分離し、複製
が作られるときは冷却するサイクルを繰り返し続行す
る。このサイクルを繰り返して、特定鎖の複製体を大量
に生産した。増幅により末端制限部位がついたコード領
域が得られた。
３種のコウモリプラスミノーゲン賦活体Bat−PA
（Ｈ）、Bat−PA（Ｉ）、Bat−PA（Ｌ）の発現ベクター
を以下のようにして調製し、一過性とトランスフェクシ
ョンプロトコール（発現が成功したかどうかを定性的に
調べるのに用いる）または安定トランスフェクションプ
ロトコールに従って細胞へのトランスフェクションを行
った。
一過性トランスフェクションプロトコールでは、100m
m培養皿当たり2.5×106個の細胞を10mlの培地に入れ、
トランスフェクションの前24時間培養する。トランスフ
ェクションの２−４時間前に培地を交換する。DNA/CaPO
4沈澱物を作成するため、ろ過滅菌した組換えBat−PA−
pD5プラスミドDNAを、各培養皿当たり５μg/250μldH2O
となるよう調製し、さらに500μｌの0.5MCaCl2及びdH2O
を加えて最終1mlとした。軽く撹拌しながら1mlの２×HB
Sを滴下して加えた。調製物を室温で10−30分間放置し
たのち、穏やかに渦巻き撹拌すると沈澱がプレートに均
一に沈降した。この後の工程はトランスフェクションさ
れる細胞によって手順が少し違ってくる。CV1細胞は37
℃・10％CO2で４時間培養するが、COS7及び293細胞では
37℃・６％CO2で４時間培養する。トランスフェクショ
ン４時間後、293細胞の場合は培地を除去する。CV1及び
COS7細胞の場合はトランスフェクション４時間後、２分
間のグリセロールショック（培地中15％グリセロール）
を与え、PBSで２回すすぐ。その後新鮮な培地を加え
る。細胞は37℃で培養し、トランスフェクション後24時
間、48時間、72時間経過後にアッセイを行う。
安定なトランスフェクションプロトコールでは、上記
の一過性トランスフェクションプロトコールと次の点が
異なる。100mm培養皿当たり、2.5×106個ではなく、５
×105個の細胞を培養する。G418セレクションを行うた
めにNeo発現プラスミド0.5μｇをDNA/CaPO4沈澱物中に
いれておく。細胞は48時間セレクションにかけ、２−３
日おきに培地を交換してやると、やがてG418耐性のコロ
ニーが増殖してくる。
中間体及び発現ベクターは、種々のコウモリプラスミ
ノーゲン賦活体形につき、以下のようにして調製した。
I.Bat−PA（Ｈ） 1.5′天然NTL Bat−PA（Ｈ）cDNAは、下記に示すオリゴデオキシヌ
クレオチドの対141＆142及び27＆19をプライマーとして
用いてcDNAのPCR増幅を行って、cDNAライブラリーから
得た。
PCRは、10mMのTris−HCl、pH8.3、50mMのKCl、1.5mM
のMgCl2、200μＭの各dNTP、100pmolの各PCRプライマ
ー、10−100ngのcDNAまたはライブラリーDNA、及び2.5
ユニットのTaqポリメラーゼからなる100μｌの反応体積
で行った。反応はDNAサーマルサイクラー中で30サイク
ル行なうプログラムとした。各サイクルは94℃で２分間
の変性、60℃で２分間のアニーリング、及び72℃で２分
間の伸長を含むようにした。増幅したcDNAはゲル精製
し、ついでBgl IIで切断し、psp73のBgl II部位に挿入
した。配列を確認しBat−PA（Ｈ）の読み取り枠を、ア
デノウイルス主要後期プロモーターを含む真核細胞性発
現ベクターpD5にサブクローニングして、pSZ88−104−2
0を作成した（第９図参照）。293細胞をpSZ88−104−20
でトランスフェクションして、293−Bat−PA−１の哺乳
類細胞（ATCC番号CRL10180）を作成した。E.coli細胞を
pSZ88−104−20でトランスフェクションして、BPA−CN
−pSZ88−104−20細菌細胞（ATCC番号68050）を作成し
た。
2.5′Kozak NTL Bat−PA（Ｈ）cDNAをオリゴデオキシヌクレオチドの
対18＆19をプライマーとして用いて、上記のようにPCR
増幅した。
増幅したcDNAはゲル精製し、ついでXba I及びHind II
Iで開裂し、これを中間ベクターpSP73のXba I及びHind
III部位間に挿入して、pSZ89−109、pSZ89−110、p89WO
−10及びp89WO−８を作成した。Bat−PA（Ｈ）の読み取
り枠を当初のBamH1クローニング部位の代わりにマルチ
クローニング部位を有するpD−mcsベクターのsac I/Spe
I部位にサブクローニングして、pSZ89−111−17、pSZ8
9−112及びpSZ89−113を作成した（第10図参照）。E.co
li細胞をpSZ89−111−17でトランスフェクションして、
BPA−CK−pSZ89−111−17細菌細胞（ATCC番号68052）を
作成した。
II.Bat−PA（Ｉ） Bat−PA（Ｈ）読み取り枠は上記と同じPCR法によりcD
NAライブラリーから得られ、完全なアイソフォームに比
べて大きさが小さいことが確認された。天然NTLを含むB
at−PA（Ｉ）はオリゴデオキシヌクレオチド27及び19の
ペアから得られ、KozakNTLを含むBat−PA（Ｉ）はオリ
ゴデオキシヌクレオチド18及び19のペアから得られた。
増幅されたBat−PA（Ｉ）読み取り枠はHind III及びXba
Iで切断して、pSP73にクローニングしてp89WO−14、p8
9WO−５、６、p89WO−９、p89WO−12を作成した。また
はSpe I及びSac Iで切断してpD5−mcsベクターにクロー
ニングしてp89WO−１、p89WO−２、Ａ、Ｂ、Ｃ、p89WO
−３及びp89WO−４を作成した（第11図参照）。E.coli
細胞をp89WO−２でＣトランスフェクションして、BPA−
FN−p89WO−2C細菌細胞（ATCC番号68053）を作成した。
III.Bat−PA（Ｌ） Bat−PA（Ｌ）読み取り枠は、オリゴデオキシヌクレ
オチド18及び11.4の組をプライマーとして用いるPCR増
幅により同様にcDNAライブラリーから得られた。
増幅されたDNAは、ゲル精製してからNco Iで切断し、
３つのNco I断片の最小のもの（これがBat−PA（Ｌ）の
５′部分をコードする）を再度ゲル精製してp89WO−11
（pSP73中のBat−PA（Ｈ）の読み取り枠）のNco I切断
部位に挿入し、それぞれp89WP−17及びp89WP−18を得
た。続いてBat−PA（Ｈ）読み取り枠をSac I及びSpe I
を用いて中間ベクターから切り出し、pD5−mcsベクター
にサブクローニングしてp89W−20A＆Ｂ及びp89WP−19A
＆Ｂを作成した（第12図参照）。E.coli細胞をpWP−20A
でトランスフェクションしてBPA−DK−p89WP−20A細菌
細胞（ATCC番号68049）を作成した。
COS−７をトランスフェクションして48時間後に取り
出した馴化培地はフィブリン寒天プレートアッセイでBa
t−PA50ng/mlを示した。
クローンpSZ88−104−20が最良の発現体であることが
分かった。このクローンは293細胞内に安定に存在し、
集密単層当たりのBat−PA活性を0.5μg/ml/日以上発現
した。ブチレートに常に接触させること及び培地を最適
化することにより、発現レベルは10μg/ml/日以上に上
昇した。他の好適な発現ベクターは、pSZ89−111−17
（天然５′−NTLの代わりにkozak5′−NTLを有するpSZ8
8−104−20の派生体）、EBV/EBNA/D5BatPA−Ｃ及びCMVI
E−AKI−BatPA−Ｃ並びにHIV−LTR/BatPA−Ｃである。
ヒト組織型プラスミノーゲン賦活体との比較 本発明のBat−PA（Ｈ）とヒト組織型プラスミノーゲ
ン賦活体（ヒトtPA）の主要なアミノ酸配列の比較を以
下に示す。
ヒトtPA（配列９−46）のフィプロネクチンフィンガ
ードメインはBat−PA（Ｈ）配列６−43と78％のホモロ
ジーを有する。ヒトtPAの上皮成長因子（EGF）ドメイン
（配列46−95）はBat−PA（Ｈ）の配列43−92と75％の
ホモロジーを有している。ヒトtPAの第一クリングルド
メイン（配列95−177）はBat−PA（Ｈ）の配列92−174
と67％のホモロジーを有する。
ヒトtPAの第二のクリングルドメイン（配列178−26
5）に対応する部分はBat−PA（Ｈ）にはない。Bat−PA
（Ｈ）のアミノ酸175と176はそれぞれリジンとアラニン
である。Bat−PA（Ｈ）のアミノ酸190−441、即ち「軽
鎖」はヒトtPAの軽鎖（配列280−531）と74％のホモロ
ジーを有する。
図8bはBat−PA（Ｈ）のアミノ酸配列を模式的に示
し、ヒトtPAと比較したものである（Pennica et al.,Na
ture Vol.301,214−221（1983））。Bat−PAの個々のア
ミノ酸は１字コードで示してある。黒丸はBat−PA
（Ｈ）とヒトｔ−PAの間で同一であるアミノ酸を示し、
白丸は異なる残基を示す。ジスルフィド結合のパターン
はｔ−PAから類推したものである。推定グリコシル化部
位はブラケットで示した。
本プラスミノーゲン賦活体の天然型の派生体であるBa
t−PA（Ｉ）とBat−PA（Ｌ）に加えて、本発明の範囲内
にある他の派生体は、フィンガードメイン（アミノ酸
（−３）−43）或いは上皮成長因子領域（アミノ酸43−
84）のどちらかを欠失したものである。もう一つの派生
体は、Bat−PA（Ｈ）の炭水化物を担持するアミノ酸が
変異したものである。これらはそれぞれ望ましいプラス
ミノーゲン賦活活性とより長い半減期を有する。
また本発明の範囲内にあるものとして、Bat−PAの軽
鎖（配列190−441）とヒトｔ−PAの重鎖（配列１−27
8）との融合タンパク質、及びその派生体であってプラ
スミノーゲン賦活体活性を有するものがあげられる。Ba
t−PAの蛋白分解活性部位は１型プラスミノーゲン賦活
体インヒビターによってさほど不活性されないので、融
合蛋白はヒトｔ−PAに比べて医薬特性が改善されている
と思われる。
先に述べたように、コウモリプラスミノーゲン賦活体
の活性はフィブリン補因子の存在により劇的に促進され
る。フィブリン結合プラスミノーゲンに対するヒトｔ−
PAにくらべ少なくとも約90倍は選択的であるようにみえ
る。ｔ−PAの第二のクリングルドメインは、フィブリン
による活性化のを仲介するのに決定的な役割をはたして
いると考えられるリジン結合部位を有している。反対
に、本発明の賦活体のアミノ酸配列からは、顕著なフィ
ブリン選択性はtPAの第二クリングルドメインに似た領
域が存在するためではないことを示す。更にコウモリプ
ラスミノーゲン賦活体がlys−セファロースに結合でき
ないは、プラスミノーゲンをフィブリン選択的活性化す
るのにリジン結合部位が働いているのではないことを示
す。
本発明の賦活体のクリングルドメインはtPAの第２ク
リングル領域とは異なっているにも係わらず、フィブリ
ン誘導的活性刺激を仲介する。
コウモリの酵素にはプラスミン感受性のプロセシング
部位がないという点でも賦活体とtPAとは構造的に異な
っている。
上記Bat−PA（Ｈ）蛋白は決定されたDNA遺伝子とそれ
から求められるアミノ酸配列によって明らかにされてい
る。天然の対立遺伝子に属する変異が存在することは理
解されよう。これらの変異は全配列中のアミノ酸の違
い、即ち配列中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位、
付加によって示される。更に、グリコシル化の位置や程
度は宿主細胞環境の性質によって決まる。
組換体DNA技術、例えば遺伝子DNAの部位特異的突然変
異、を使用することによって、一つまたは複数のアミノ
酸の置換、欠失、付加或いは置き換えによって様々に修
飾された種々のコウモリプラスミノーゲン賦活体の派生
体を調製できる可能性がある。コウモリプラスミノーゲ
ン賦活体の派生体を生じるこの様な対立遺伝子的変異や
修飾は、コウモリプラスミノーゲン賦活体活性の基本的
特性が本質的に変わっていない限りすべて本発明の範囲
にはいる。コウモリプラスミノーゲン賦活体は、（１）
最初のアミノ酸としてメチオニンを有する（構造遺伝子
の前にATG開始コドンを挿入したために存在する）、或
いは（２）このメチオニンが細胞内或いは細胞外で切断
されて正常な最初のアミノ酸を有する、或いは（３）本
来のシグナルペプチド、または本来のシグナルペプチド
以外の融合蛋白と一緒になっている（この本来のシグナ
ルペプチドまたは融合ペプチドは細胞内または外の環境
で特異的に切断される）（英国特許出願公告第2,007,67
8A参照）、或いは（４）外来の余分なポリペプチドを切
断する必要がないように成熟形で直接発現されている。
後者は、発現ビヒクルがシグナルペプチドと一緒にプラ
スミノーゲン賦活体を発現するようにデザインされてい
て、その宿主細胞がシグナルペプチドを除去できない或
いは除去が不十分である場合に特に重要である。いずれ
にせよこうして作られたコウモリプラスミノーゲン賦活
体はその様々な形で回収され、種々の脈管の状態や病状
を治療するのために使用するのに適したレベルにまで精
製される。
治療的な処置 これらの蛋白は、血流中に実質的な量を配送できるど
のような従来法によっても投与することができる。静脈
内投与が今のところ好ましい経路として考えられてい
る。これら蛋白は水に可溶性であり、溶液として効果的
に投与することができる。
投与例をあげると、適当量の本発明の蛋白を心臓発作
を起こした患者に静脈内投与する。血栓を消失させるの
に適当な投与量は200mgまでであり、好ましくは25mgと1
50mgの間であり、より好ましくは約25mgと50mgの間であ
る。
本タンパク質を、上述の投与量で数時間にわたって連
続的にボーラス注入することによって投与することもで
きる。
本タンパク質を血小板凝集阻害剤と一緒に投与して、
血栓溶解と血小板凝集阻害の両方の効果を得ることがで
きる。同時投与としては、血小板凝集阻害剤を血小板の
凝集を阻害できる濃度、例えば血漿中の定常濃度が0.05
−２μＭとなるような量を静脈投与することがあげられ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は精製吸血コウモリプラスミノーゲン賦活体のSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。試料は吸
血コウモリ唾液腺（レーン１及び３）と唾液（レーン２
及び４）である。各試料はSDS−PAGE前にエンドグリコ
シダーゼＦで処理した。レーン１及び2:ウェスターンブ
ロッティング及び免疫染色、レーン３及び4:フィブリン
オートグラフィ 第２図はtPA及び40kdコウモリプラスミノーゲン賦活体
蛋白によって触媒される貧血小板プラスマクロットの溶
解を示す。 第３図はtPA及び40kdコウモリプラスミノーゲン賦活体
蛋白によって触媒される富血小板プラスマクロットの溶
解％を示す。 第４図は血漿成分によるプラスミノーゲン賦活体の不活
性化を示す。 第５図は、銀染色及びフィブリンオートグラフィで同定
された40kd及び45kdタンパク質のSDS−PAGEによる分子
量を示す。 第６図は、Bat−PA及びtPAによって触媒されるクロット
溶解を示す。 第７図はフィブリンに対するプラスミノーゲン賦活体の
結合を示す。 第8a図は吸血コウモリプラスミノーゲン賦活体cDNAのヌ
クレオチド配列及びプラスミノーゲン賦活体のアミノ酸
配列を示す。 第8b図は吸血コウモリプラスミノーゲン賦活体のアミノ
酸配列の図式及びヒトtPAとの比較を示す。 第９図は、既知のプラスミドpSP73から誘導され、Bat−
PA（Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドpSZ88−100−20の
作成、最終的に、既知のプラスミドpD5から誘導された
プラスミドでBat−PA（Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミ
ドpSZ88−104−20の作成を模式的に示す。 第10図は、既知のプラスミドpSP73から誘導され、Bat−
PA（Ｈ）遺伝子配列を含むプラスミドpSZ89−109、pSZ8
9−110、p89WO−10及びp89WO−８、及び既知のプラスミ
ドpD5から誘導されたプラスミドでBat−PA（Ｈ）遺伝子
配列を含むフラスミドpSZ89−111、pSZ89−112及びpSZ8
9−113の作成を模式的に示す。 第11図は、既知のプラスミドpSP73から誘導され、Bat−
PA（Ｉ）遺伝子配列を含むプラスミドp89WO−14,p89WO
−5,6,p89WO−９及びp89WO−12、及び既知のプラスミド
pD5から誘導されたプラスミドでBat−PA（Ｉ）遺伝子配
列を含むプラスミドp89WO−１、p89WO−2A、Ｂ、Ｃ、p8
9WO−３及びp89WO−４の作成を模式的に示す。 第12図は既知のプラスミドpD5から誘導されたプラスミ
ドp89WP−20A＆Ｂ、及びp89WP−19A＆Ｂおよびp89WP−1
7及びp89WP−18の作成を模式的に示す。p89WP−17はp89
WO−11から、p89WO−18はp89WO−９から得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣＣＲＬ１０１８０ (72)発明者 ステフエン ジエー．ガーデル アメリカ合衆国，19454 ペンシルヴァ ニア，ノース ウエールズ，フオツクス チエイス ドライブ 19 (72)発明者 ジヨン ダブリユ．ジヤコブス アメリカ合衆国，18901 ペンシルヴァ ニア，ドイレスタウン，ダブリユ．コー ト ストリート 298 (72)発明者 リチヤード エー．エフ．デイクソン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァ ニア，ランスデール，ハートレイ ドラ イブ 758 (72)発明者 ジヨージ イー．マーク アメリカ合衆国，08550 ニユージヤー シイ，プリンストン ジヤンクシヨン, リッチモンド コート ４ (72)発明者 ブルース エル．ドーハーテイ アメリカ合衆国，07079 ニユージヤー シイ，サウス オレンジ，サウス リツ ジウツド ロード 204 (56)参考文献 Ｂｌｏｏｄ，43（３）（1974），Ｐ. 317−326

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の精製プラスミノーゲン賦活性糖タン
    パク質の少なくとも１つからなるプラスミノーゲン賦活
    体： 該精製プラスミノーゲン賦活性糖タンパク質は脱グリコ
    シル化された状態でのSDS−PAGEにより決定された分子
    量がそれぞれ約44,000ダルトン、約40,000ダルトンおよ
    び約38,000ダルトンであって、それぞれが ａ）プラスミノーゲンを賦活化するためにフィブリン補
    因子を必要とし、 ｂ）プラスマクロットの溶解を触媒し、 ｃ）フィブリンクロットが存在する場合は、NaClによる
    阻害を受けない、 ｄ）フィブリン結合プラスミノーゲンに対するプラスミ
    ノーゲン賦活化比活性が約８×103U/μmolと約25×103U
    /μmolの間である。
  2. 【請求項２】精製プラスミノーゲン賦活性糖タンパク質
    の脱グリコシル化分子量が約44,000ダルトンである請求
    項１記載のプラスミノーゲン賦活体。
  3. 【請求項３】精製プラスミノーゲン賦活性糖タンパク質
    の脱グリコシル化分子量が約40,000ダルトンである請求
    項１記載のプラスミノーゲン賦活体。
  4. 【請求項４】精製プラスミノーゲン賦活性糖タンパク質
    の脱グリコシル化分子量が約38,000ダルトンである請求
    項１記載のプラスミノーゲン賦活体。
  5. 【請求項５】以下のアミノ酸配列と少なくとも90％の相
    同関係を有し、プラスミノーゲンを賦活するためにフィ
    ブリン補因子を必要とする、グリコシル化されたまたは
    グリコシル化されていないプラスミノーゲン賦活性タン
    パク質：
  6. 【請求項６】以下のアミノ酸配列と少なくとも90％の相
    同関係を有し、プラスミノーゲンを賦活するためにフィ
    ブリン補因子を必要とする、グリコシル化されたまたは
    グリコシル化されていないプラスミノーゲン賦活性タン
    パク質：
  7. 【請求項７】以下のアミノ酸配列と少なくとも90％の相
    同関係を有し、プラスミノーゲンを賦活するためにフィ
    ブリン補因子を必要とする、グリコシル化されたまたは
    グリコシル化されていないプラスミノーゲン賦活性タン
    パク質：
  8. 【請求項８】以下のアミノ酸配列と少なくとも90％の相
    同関係を有し、プラスミノーゲンを賦活するためにフィ
    ブリン補因子を必要とする、グリコシル化されたまたは
    グリコシル化されていないプラスミノーゲン賦活性タン
    パク質：
  9. 【請求項９】請求項５のタンパク質をコードしているDN
    A配列。
  10. 【請求項１０】請求項６のタンパク質をコードしている
    DNA配列。
  11. 【請求項１１】請求項７のDNA配列と90％の相同性を有
    するDNA配列。
  12. 【請求項１２】請求項８のDNA配列と90％の相同性を有
    するDNA配列。
  13. 【請求項１３】請求項９のDNA配列を挿入した複製可能
    なクローニングビヒクル。
  14. 【請求項１４】請求項10のDNA配列を挿入した複製可能
    なクローニングビヒクル。
  15. 【請求項１５】請求項11のDNA配列を挿入した複製可能
    なクローニングビヒクル。
  16. 【請求項１６】請求項12のDNA配列を挿入した複製可能
    なクローニングビヒクル。
  17. 【請求項１７】フィブリンと結合したプラスミノーゲン
    を賦活化するための請求項１のプラスミノーゲン賦活体
    の有効量を含む、フィブリンクロット溶解用医薬組成
    物。
  18. 【請求項１８】請求項１のタンパク質と特異的に反応す
    る抗体。
  19. 【請求項１９】50,000ダルトン未満の分子量を有するプ
    ラスミノーゲン賦活性タンパク質を精製する方法であっ
    て、 （ａ）デスモダス・ロタンダス吸血コウモリの顎下腺を
    ホモジナイズして混合物とし、その混合物を遠心分離し
    て上清画分を形成し、 （ｂ）上清画分を清澄化して濃縮し、 （ｃ）濃縮物をホスホセルロース陽イオン交換カラムに
    かけてカラムにプラスミノーゲン賦活体を吸着させ、 （ｄ）カラムを溶出処理してプラスミノーゲン賦活性タ
    ンパク質を含む画分を得、 （ｅ）その画分を合わせたものを、エリトリナトリプシ
    ンインヒビターを固定化したアフィニティカラムで処理
    し、 （ｆ）高圧液体クロマトグラフィによりプラスミノーゲ
    ン賦活体を分画し、 （ｇ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりプ
    ラスミノーゲン賦活体を分離する、 ことからなる精製方法。
  20. 【請求項２０】請求項15のクローニングビヒクルで形質
    転換された哺乳類細胞。
  21. 【請求項２１】請求項15のクローニングビヒクルで形質
    転換された細菌細胞。
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