WO2004096267A1 - Intravenöse injektion nicht-neurotoxischer plasminogen-aktivatoren zur behandlung von schlaganfall - Google Patents

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plasminogen activating
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plasminogen
dspa
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Mariola Söhngen
Wolfgang Söhngen
Wolf-Dieter Schleuning
Robert Medcalf
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Paion Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to the intravenous application of non-neurotoxic plasminogen activators, in particular genetically modified plasminogen activators and plasminogen activators from the saliva of Desodus rotundus (DSPA) for the treatment of stroke in humans.
  • non-neurotoxic plasminogen activators in particular genetically modified plasminogen activators and plasminogen activators from the saliva of Desodus rotundus (DSPA) for the treatment of stroke in humans.
  • DSPA Desodus rotundus
  • stroke summarizes various clinical pictures that are similar in their clinical symptoms. A first differentiation of these clinical pictures into the so-called ischemic insults and hemorrhagic insults is possible based on the respective pathogenesis.
  • Ischemic insult is a decrease or interruption of blood flow to the brain due to insufficient arterial blood supply. This is often caused by thrombosis of an arteriosclerotic stenosed vessel, but also by arterio-arterial or cardiac embolism.
  • the haemorrhagic insults are due to perforation of the arteries that supply the brain and are damaged by arterial hypertension. However, only about 20% of all cerebral insults are caused by this form of bleeding, so that the strokes caused by thrombosis are by far the most important.
  • the ischemia of neuronal tissue is particularly associated with the necrosis of the affected cells. According to new understanding, the increased incidence of necrosis can be explained by the phenomenon of so-called excitotoxicity, which is a complex cascade of a large number of reaction steps. This is triggered by the fact that the ischemic neurons suffering from a lack of oxygen quickly lose and depolarize ATP.
  • the glutamate receptors in turn regulate voltage-dependent cation channels that are opened when glutamate binds to its receptor.
  • a Na + and a Ca 2+ influx thus set in the cell, which leads to a massive disruption of the Ca 2+ -dependent cellular metabolism - including the energy metabolism.
  • the activation of Ca 2+ -dependent catabolic enzymes could be responsible for the subsequent cell death (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamate neurotoxicity and deseases of the nervous system ").
  • the body's own fibrinolysis is based on the proteolytic activity of the serine protease plasmin, which results from catalysis (activation) from the inactive precursor plasminogen.
  • the plasminogen is naturally activated by the body's own plasminogen activators u-PA (urokinase-type plaminogen activator) and t-PA (tissue plasminogen activator). In contrast to u-PA, the latter forms a so-called activator complex together with fibrin and plasminogen.
  • u-PA urokinase-type plaminogen activator
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • the catalytic activity of t-PA is therefore dependent on fibrin and is increased by about 550 times in the presence of fibrin.
  • fibrinogen can also stimulate t-PA mediated catalysis from plasmin to plasminogen - albeit to a much lesser extent.
  • the t-PA activity in the presence of fibrinogen is only increased 25-fold.
  • the fibrin degradation products (FDP) in turn also stimulate t-PA activity.
  • Streptokinase forms a complex with plasminogen, which is able to convert other plasminogen molecules into plasmin.
  • Therapy with streptokinase is associated with significant disadvantages, since streptokinase as a bacterial protease can trigger allergic reactions in the body. There may also be a so-called streptokinase resistance with previous streptococcal infection with corresponding antibody formation, which complicate therapy.
  • urokinase - also a "classic" fibrinolytic - is applied, which, in contrast to streptokinase, has no antigenic properties because it is an enzyme found in numerous tissues in the body. It is an activator of the plasminogen independent of cofactors. Urokinase is produced in kidney cell cultures.
  • rt-PA tissue-type plasminogen activator - the so-called rt-PA (see EP 0 093 619, US Pat. No. 4,766,075), which is produced in recombinant hamster cells.
  • t-PA was used in the 1990s to carry out a series of clinical studies worldwide, some of which were still not understood and contradictory.
  • ECASS European Acute Stroke Trial
  • PA was treated and after 90 days the mortality rate and the Barthel index were examined as a measure of the patient's integrity or independent viability. There was no significant improvement in viability, but there was, albeit an insignificant, increase in mortality. This allowed the conclusion to be drawn that thrombolytic treatment of patients with rt-PA individually selected according to their respective medical history could be advantageous immediately after the onset of the stroke. Due to the observed increased risk of intracerebral hemorrhage (ICH) after only a few hours after the onset of the stroke, general use of rt-PA within the examined period of six hours after the onset of the stroke was not advisable (see C. Lewanddowski C and Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Strocke; in: Annais of Emergency Medcine 37: 2; pp. 202 ff).
  • ICH intracerebral hemorrhage
  • rt-PA therapy with rt-PA is currently the only treatment method for acute cerebral ischemia approved by the Food and Drug Administration (FDA) in the USA. However, this is limited to application of rt-PA within three hours after the start of the stroke.
  • FDA Food and Drug Administration
  • Alteplase Recombinant plasminogen activator
  • reteplase Recombinant plasminogen activator
  • the latter is a therapeutically effective t-PA fragment with a lower half-life.
  • the therapeutic dose for Alteplase is approximately 70-100 mg, for Reteplase twice 560 mg, whereby Alteplase is administered essentially via a drip infusion, whereas Reteplase is administered via a double bolus injection at intervals of approximately 30 min. (Mutschier: "Medicinal Effects", 8th edition, pp. 512-513). Side effects of t-PA
  • the rt-PA was approved in 1996. Immediately before, namely in 1995, the first indications for the cause of the neurotoxic or excitotoxic effects of the t-PA became known, which explains the dramatic effects of the t-PA in the treatment of strokes deliver outside of the 3 hour treatment period. Afterwards, microglial cells and neuronal cells of the hippocampus produce the body's own t-PA, which is involved in the excitotoxicity mediated by glutamate. This conclusion came from a comparison of t-PA deficient mice and wild-type mice, each of which was injected with glutamate agonists into the hippocampus.
  • t-PA deficient mice showed a significantly increased resistance to externally (inthrathecal) applied glutamate (Tsirka SE et. Al., Nature, Vol. 377, 1995, "Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator” ). These results were confirmed in 1998 when Wang et al. In t-PA deficient mice, intravenous injection of t-PA almost demonstrated a doubling of the necrotic neuronal tissue.
  • This modification leads to an increase in receptor activity, which in turn is responsible for increased tissue damage after the application of the glutamate agonist NMDA due to induced excitotoxicity.
  • the t-PA is therefore neurotoxic by activating the NMDA-type glutamate receptor. Since the blood-brain barrier breaks down in the affected tissue area during a stroke, soluble plasma proteins such as fibrinogen and therapeutically applied t-PA come into contact with the nerve tissue, where the t-PA stimulated by fibrinogen develops its excitotoxic effect by activating the glutamate prescription.
  • DSPA in particular is a plasminogen ac- tivator with high homology (similarity) to t-PA, so that - along with the disillusionment with the neurotoxic side effects of t-PA - no further hopes were placed in DSPA either.
  • Another novel treatment method does not start with the thrombus, with the liquefaction or anticoagulation, but tries to increase the vitality of the cells damaged by the interruption of the blood supply (WO 01/51613 A1 and WO 01/51614 A1).
  • Antibiotics from the group of quinones, aminoglycosides or chloramphenicol are applied.
  • These cleavage products are components of the neuronal cell membrane and can thus support the regeneration of the damaged tissue (US Pat. No. 5,827,832).
  • plasminogen activators for stroke treatment are known, the enzyme activity of which is increased selectively by fibrin many times, namely by more than 650 times.
  • the nature and use of these plasminogen activators are based on the knowledge that the neurotoxicity of the tissue plasminogen activator (t-PA) is due to the fact that the tissue destruction in the brain caused by the stroke damages or destroys the blood-brain barrier and the fibrinogen circulating in the blood can penetrate into the neural tissue of the brain.
  • t-PA tissue plasminogen activator
  • a plasminogen activator which shows an increased fibrin selectivity and - conversely - a reduced activatability by fibrinogen. It follows that these plasminogen activators are not activated when fibrinogen passes from the blood into the neuronal tissue as a result of the damaged blood-brain barrier - or to a significantly reduced extent compared to the t-PA - because their activator is fibrin cannot enter the neuronal tissue due to its size and insolubility. These plasminogen activators are therefore non-neurotoxic.
  • non-toxic plasminogen activators are used which have at least one element of a so-called zymogen triad.
  • a comparable triad is known from the catalytic center of serine proteases of the chymotrypsin family, which consists of the three interacting amino acids aspartate 194, histidlin 40 and serine 32.
  • this triad is not present in the t-PA belonging to the clhymotrypsin-like serine protease family.
  • the targeted mutagenesis of the native t-PA to introduce at least one of these amino acids at suitable positions leads to a reduction in the activity of the pro-enzyme (single-chain t-PA) and an increase in the activity of the mature enzyme (two-chain t- PA) in the presence of fibrin.
  • Both mutants additionally have a substitution of Arg275 for R275E in order to prevent the cleavage of the single-chain t-PA into the two-chain form at the cleavage site Arg275-Ile276 by plasmin.
  • This mutant R275E alone increases the fibrin specificity of t-PA by 6,900 times (K Tachias, Madison EL 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin, in: Journal of Biological Chemistry 270, 31: 18319 - 18322).
  • Positions 305 and 292 of the t-PA are homologous to positions His40 and Ser32 of the known triad of chymotryptic serine proteases. Through the appropriate substitution with hlistidine or serine, these amino acids can interact with the aspartate 477 of the t-PA, so that the known triad can be functionally formed in the t-PA mutants (Madison et al 1993). These t-PA mutants can be used to treat stroke because, owing to their increased fibrin specificity, they have no neurotoxicity or, compared to the wild type t-PA, only a significantly reduced neurotoxicity. For the purpose of disclosing the mentioned t-PA mutants F305H; F305H, A292S alone or in combination with R275E, the publications of Madison et al 1993 as well as Tachias and Madison 1995 are fully referred to.
  • the fibrin specificity of plasminogen activators can also be increased by a point mutation of the Asp194 (or an aspartate at a homologous position).
  • Plasminogen activators belong to the group of serine proteases of the chymptrypsin family and all have the conserved amino acid Asp194, which is responsible for the stability of the catalytically active conformation of the mature proteases.
  • the Asp194 is known to interact with His40 in the zymogens of the serine proteases. The activating cleavage of the zymogen makes these interactions impossible, and the side chain of the Asp194 rotates by about 170 ° in order to subsequently form a new salt bridge with the Ile16. This salt bridge is involved in the stability of the oxyanion pocket of the catalytic triad of mature serine protease. It is also available in the t-PA.
  • a preferred example of such a non-neurotoxic plasminogen activator is t-PA, the Asp194 of which is substituted by glutamate (D194E) or asparagine (D194N).
  • D194E glutamate
  • D194N asparagine
  • these mutants may also contain a substitution of Arg15 for R15E, which prevents plasmin from cleaving the single-chain t-PA to the two-chain t-PA at the peptide bond Arg15-Ile16.
  • This mutation alone increases the activation of t-PA by fibrin by a factor of 12,000.
  • the 1995 publication by Strandberg and Madison is fully incorporated by reference.
  • An increase in the fibrin dependence on plasminogen activators can also be achieved by introducing point mutations in the so-called "autolysis loop".
  • This amino acid segment is known from trypsin; however, it is also present as a homologous section in serine proteases and is characterized in particular by three hydrophobic amino acids (Leu, Pro and Phe).
  • the autolysis loop in plasminogen activators is responsible for the interaction with plasminogen. Point mutations in this area can lead to the fact that the pirotein / protein interactions between plasminogen and plasmimogen activator can no longer be formed functionally. However, these mutations are only relevant in the absence of fibrin.
  • a t-PA with point mutations in positions 420-423 is used. If these residues are substituted by targeted point mutations, the fibrin dependence of the t-PA increases by a factor of up to 61,000 (K Song-Hua et al.).
  • Song-Hua et al. examined the point mutations L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A and F423E.
  • the publication is hereby incorporated by reference in its entirety for the use according to the invention.
  • modified tissue plasma activator with an amino acid sequence according to SEQ. ID No. 1 (FIG. 13), which differs from the wild-type t-PA in that an exchange of the hydrophobic amino acids in positions 420-423 is carried out in the autolysis loop, which are occupied as follows: His420 , Asp421, Ala422 and Cys423.
  • This t-PA preferably has a phenylalanine at position 194.
  • Position 275 can also be occupied by a glutamate.
  • Position 194 is advantageously occupied by phenylalanine.
  • a modified urokinase can also be used.
  • This urokinase can be the amino acid sequence according to SEQ. ID No. 2 (Fig. 14) in which the hydrophobic amino acids of the autolysis loop are replaced by Val420, Thr421, Asp422 and Ser423.
  • This urokinase advantageously carries an Ile275 and a Glu194.
  • This mutant shows a 500-fold increased fibrin specificity compared to the wild-type urokinase.
  • DSPA plasminogen activator
  • DSPA ⁇ l is the best-studied protease in this group to date. Its amino acid sequence has a homology of over 72% compared to the known human t-PA amino acid sequence (Krfordschmar et al., 1991). However, there are two major differences between t ⁇ PA and DSPA. Firstly, DSPA as a single chain is a fully active molecule compared to peptide substrates, which - unlike t-PA - is not converted into a two-chain form (Gardell et al, 1989; Krhartschmar et al., 1991).
  • the catalytic activity of the DSPA shows an almost absolute fibrin dependence (Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschi et al., 1998).
  • the activity of the DSPA ⁇ l is increased by 100,000 times in the presence of fibrin, while the t-PA activity only increases by approximately 550 times.
  • the DSPA activity is induced by fibrinogen much less strongly; it only experiences a 7- to 9-fold increase (Bringmann et al., 1995). Is DSPA thus much more dependent on fibrin and fibrin specific than the wild-type t-PA, which is activated only about 550-fold by fibrin.
  • DSPA is an interesting candidate for the development of thrombolytic fungi. Due to the involvement of t-PA in glutamate-dependent neurotoxicity, there were no justified hopes, one closely related to t-PA related plasminogen activator successfully used for the treatment of acute stroke.
  • DSPA has no neurotoxic effects. This finding goes hand in hand with the knowledge that DSPA can nevertheless be used as a thrpmbolytic for the treatment of stroke without being associated with an additional risk of damage to the neuronal tissue. In particular, this means that DSPA can also be used later than three hours after the onset of stroke symptoms.
  • the kainic acid model (also kainic acid injury model) is based on the fact that the neurotoxic glutamate cascade through the application of external Kainic acid (KA) is stimulated as an agonist of the glutamate receptor of the kainic acid type (KA type) as well as the NMDA and AMPA glutamate receptors.
  • KA kainic acid type
  • NMDA and AMPA glutamate receptors NMDA and AMPA glutamate receptors.
  • DSPA has at least 100 times less activity than t-PA in promoting neurodegeneration after KA treatment (see also FIGS. 11 and 12).
  • mice were stereotactically injected with NMDA to produce tissue damage in the striatum and administered intravenously 6 or 24 hours after the injection of the NMDA t-PA or DSPA.
  • the test animals showed an approximately 30% increase in the tissue area damaged by NMDA injection when t-PA was infused 24 hours after NMDA injection, while DSPA did not cause such an increase in the tissue damage, although its penetration into the damaged tissue area was medium an antibody staining could be detected (see Fig. 18, 19).
  • DSPA is an essentially inert protease in the central nervous system of a mammal - including humans - and - in contrast to t-PA - does not cause an increase in the neurotoxicity induced by KA or NMDA. Contrary to expectations, this lack of neurotoxicity makes DSPA a suitable thrombolytic agent for the treatment of acute stroke.
  • the object of the invention is therefore to provide an advantageous dosage form for these non-neurotoxic plasminogen activators.
  • plasminogen activators the activity of which is increased by more than 650 times in the presence of fibrin, are administered intravenously for stroke treatment.
  • the therapeutic agent gets into the arterial end vessels.
  • the therapeutic agent therefore also reaches the surrounding tissues in locally high concentrations. There it can cause unwanted side effects.
  • intravenous administration would dilute the therapeutic concentration by the influx of venous blood.
  • tissue-damaging therapeutic agents such as t-PA (Forth, Henschler, Rummel, Starke: “Pharmacology and Toxicology", 6th edition, 1992, p. 29).
  • intra-arterial application is fundamentally a very promising form of administration for non-heurotoxic plasminogen activators. It would therefore have been obvious to take this route in the search for an advantageous form of administration of these therapeutic agents.
  • the dosage form according to the invention also deviates from a common therapeutic practice in which proteins are used an increased immunogenic potential are usually administered intramuscularly or intravenously via drip injection. This makes it possible to reduce the risk of an allergy shock (Mebs: "Poison animals", 2nd edition, 2000).
  • the plasminogen activators used according to the invention are either foreign proteins of animal origin (see, for example, DSPA) or genetically modified body's proteins which have novel epitopes due to their structural changes.
  • DSPA foreign proteins of animal origin
  • genetically modified body's proteins which have novel epitopes due to their structural changes.
  • the associated problems of allergic reactions - especially when administering high therapeutic doses, as are usually required for intravenous administration - also arise with other fibrinolytics consisting of foreign proteins, e.g. Streptokinase.
  • the plasminogen activators used according to the invention are administered via a bolus injection (intravenous rapid injection), which can also be administered as a single intravenous rapid injection with the entire therapeutic dose.
  • a bolus injection intravenous rapid injection
  • the glutamate receptor can serve as competitive or non-competitive inhibitory neuroprotectants.
  • Useful combinations are possible, for example, with the known inhibitors of the glutamate receptors of the NMDA type, the kainic acid type or the quisqualate type, for example with APV, APH, phencyclidine, MK-801, dextrorphan or ketamine.
  • a combination with cations can also be advantageous since cations, in particular Zn ions, block the cation channel regulated by the glutamate receptor and can thus reduce the neurotoxic effects.
  • the non-neurotoxic plasminogen activators can be combined with at least one further therapeutic agent or with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a therapeutic agent which helps to avoid tissue damage through the vitalization of the cells, contributes to regeneration of the already damaged tissue or serves to avoid subsequent strokes is particularly advantageous.
  • Combinations with antibiotics such as quinones, anticoagulants such as heparin or hirudin and with citicholin or aspirin.
  • a combination with at least one fhrombin inhibitor can also be advantageous.
  • thrpmbomodulin, thrombomodulin analogs such as. B. Solulin, triabin or pallidipine who used ⁇ .
  • Combinations with anti-inflammatory substances that influence leukocyte infiltration are also advantageous.
  • the type of application or dosage form according to the invention will be explained on the basis of concrete therapy examples.
  • the proteolytic activity in the brain tissue after infusion of t-PA or DSPA ⁇ l was determined by means of zymographic analysis (Granelli-Piperno and Reich, 1974). After the 7-day infusion into the hippocampus, the mice were anesthetized, then transcardially perfused with PBS and the brains removed. The hippocampus region was removed, placed in Eppendorf tubes and in equal volumes (w / v) (approx. 30-50 ⁇ l) with 0.5% NP-40 lysis buffer without protease inhibitors (0.5% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2 , 1mM EDTA).
  • Brain extracts were homogenized using a hand-operated glass homogenizer and left on ice for 30 min. The samples were then centrifuged and the supernatant removed. The amount of protein present was determined (Bio-Rad reagent). 3. Zymographic analysis of the proteases
  • the proteolytic activity in the samples or extracts of the brain tissue was determined by zymographic analysis according to the method of Granelli-Piperno and Reich (1974).
  • the samples of the recombinant protein (up to 100 nmol) or of the brain tissue extract (20 ⁇ g) were subjected to a 10% SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • the gels were removed from the plates, washed in 1% Triton X100 for two hours and then placed on an agarose gel with polymerized fibrinogen and plasminogen (Granelli-Piperno and Reich, 1974). The gels were incubated at 37 ° C in a humid chamber until proteolyzed zones became visible.
  • the kainic acid injury model is based on the approach of Tsirka et al. (1995).
  • the animals were injected intraperitoneally (ip) with atropine (4 mg / kg), then anesthetized with an ip injection of sodium pentobarbital (70 mg / kg). They were then inserted into a stereotactic frame so that a microosmotic pump (Alzet model 1007D, Alzet CA. USA) with 100 ⁇ l PBS or recombinant human t-PA (0.12 mg / ml; 1.85 ⁇ M) or DSPA ⁇ l (1.85 ⁇ M) subcutaneously could be implanted between the shoulder blades.
  • a microosmotic pump Alzet model 1007D, Alzet CA. USA
  • the pumps were connected to a brain cannula by sterile tubes and inserted through a cranial opening at the coordinates bregma -2.5 mm, midolateral 0.5 mm and dorsoventral 1.6 mm to introduce the fluid near the midline.
  • the cannula was then glued to the desired position and the pumps opened to infuse the appropriate solutions at a flow rate of 0.5 ⁇ l per hour over seven days.
  • the coordinates were: bregma 2.5 mm, medial-lateral 1.7 mm and dorsoventral 1.6 mm.
  • the excitotoxin (KA) was administered over a period of 30 seconds. After the kainic acid treatment, the needle remained at these coordinates for a further 2 minutes to prevent the liquid from flowing back.
  • the animals were anesthetized and transcardially perfused with 30 ml of PBS, followed by 70 ml of a 4% paraformaldehyde solution, fixed in the same fixative for 24 hours, followed by incubation in 30% sucrose for a further 24 hours.
  • Coronal sections (40 ⁇ m) of the brain were then cut on an icable microtome, either counterstained with thionine (BDH, Australia) or prepared for immunohistochemical examination.
  • the quantification of the neuronal loss in the CA1-CA3 hippocampus subfields was carried out as previously described (tsirka et al. 1995; Tsirka et al. 1996). Five successive sections of the dorsal hippocampus from all treated groups were prepared, the sections actually covering the site of the KA injection and the area of the lesion. The hippocampus subfields (CA1-CA3) of these sections were followed using camera lucida drawings of the hippocampus. The total length of these subfields was measured compared to 1mm standards that were tracked at the same magnification.
  • the length of the tissue sections with vital pyramidal neurons (with normal morphology) and the The length of the tissue sections without neurons (no cells present, no thionine staining) was determined.
  • the lengths representing intact neurons and neuronal losses in the area of each hippocampal subfield were averaged between the sections and the standard deviation was determined.
  • Wild-type mice (c57 / Black6) were anesthetized and placed in a stereotactic frame (see above). The mice then received a unilateral injection into the left stratum with 50 nmol NMDA alone or in combination with 46 ⁇ M rt-PA or 46 ⁇ M DSPA ⁇ l. As a control, t-PA and DSPA ⁇ l alone were injected at a concentration of 46 ⁇ M as controls. The injection coordinates were: bregma -0.4 mm, midolateral 2.0 mm and dorsoventral 2.5 mm. The solutions (1 ul total volume for all treatments) were transferred over a 5 minute period at 0.2 ul / min with the needle remaining at the injection site for a further 2 minutes after injection to minimize fluid reflux.
  • mice were anesthetized and perfused with 30 ml of PBS, followed by 70 ml of a 4% paraformaldehyde solution, post-fixation for 24 hours in the same fixative, followed by incubation in 30% sucrose for a further 24 hours.
  • Coronal sections (40 ⁇ m) were then cut on an icable microtome and placed on gelatin-coated glass slides.
  • the striatal lesion volume was quantified using the method of Callaway et al. (2000) method described. 10 consecutive coronal sections covering the area of the damage were prepared. The damaged area was determined using the Callaway The method was visualized and the lesion volume was quantified using a microcomputer imaging device (MCID, Imaging Research Inc., Brock. University, Ontario, Canada).
  • Immunohistochemistry was performed using standard methods. Coronal sections were immersed in a solution of 3% H 2 O 2 /10% methanol for 5 min, followed by incubation with 5% normal goat serum for 60 min. The sections were then overnight either with an anti-GFAP antibody (1: 1,000; Dako, Carpinteria, Ca, USA) for the detection of astrocytes, with an anti-MAC-1 antibody (1: 1,000; Serotec, Raleigh, NC, USA) for the detection of microglia or polyclonal anti-DSPA antibodies (Schering AG, Berlin). After washing, the sections were incubated with the appropriate biotinylated secondary antibodies (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).
  • mice were injected stereotactically with NMDA to induce tissue damage in the striatum. 6 hours after NMDA injection, t-PA or DSPA (100 ⁇ l; 10 mg / kg) were applied by injection into the tail vein. As a negative control, 100 ⁇ l of 0.9% NaCl were injected and then PBS was infused. After a further 24 hours, the animals were sacrificed and the extent of the neuronal tissue damage was determined. In a second test approach, test groups with up to 15 mice were injected with NMDA, t-PA or DSPA infused 24 h after injection of NMDA IV and the increase in tissue damage determined accordingly. To detect DSPA in brain tissue, coronary sections were stained using an anti-DSPA antibody using standard methods.
  • the first trials were designed to confirm that both DSPA and t-PA retain their proteolytic activity over the 7-day duration of the infusion.
  • aliquots of t-PA and DSPA 100 nmol were incubated at 37 ° C and 30 ° C for seven days in a water bath.
  • serial 5-fold dilutions of the samples were subjected to SDS-PAGE with non-reducing conditions and the proteolytic activity was measured by zymographic analyzes.
  • An aliquot of t-PA and DSPA that remained frozen during these seven days was used as a control. As can be seen from Figure 1, there was little loss of DSPA or t-PA activity, both at 25 ° C and 37 ° C incubation over this period.
  • t-PA and DSPA activity can also be found in hippocampal extracts from t-PA - / - mice after the infusion
  • t-PA - / - mice were infused with t-PA or DSPA for seven days (see above). The mice were then sacrificed by transcardial perfusion with PBS and the brains removed. The ipslateral and contralateral hippocampal regions were isolated, as was a region of the cerebellum (as a negative control). Tissue samples (20 ⁇ g) were subjected to SDS-PAGE and zymographic analysis as described in the method section.
  • DSPA infusion does not restore sensitivity to kainic acid-dependent neurodegeneration in vivo
  • t-PA - / - mice are resistant to kainic acid-dependent neurodegeneration.
  • infusion of rt-PA into the hippocampus leads to a complete restoration of sensitivity to damage caused by kainic acid.
  • the concentration of t-PA used for infusion was based on the concentration described by Tsirka et al (1995) (100 ⁇ l of 0.12 mg / ml [1.85 ⁇ M].
  • t-PA and DSPA were also examined in a model of neurodegeneration in wild-type mice.
  • the injection of t-PA into the striatum of these mice has been shown to intensify the neurodegenerative effects caused by the glutamate analog NMDA (Nicole et al., 2001).
  • Indirect chromogenic tests for t-PA activity use the substrates Lys-Plasminogen (American Diagnostica) and Spectrozyme PL (American Diagnostica) and were carried out according to Madison EL, Goldsmith EJ, Gerard RD, Gething M.-J., Sambrook JF ( 1989) Nature 339 721-724; Madison EL, Goldsmith EJ, Gerard RD, Gething MJ, Sambrook JF and Bassel-Duby RS (1990) Proc. Natl. Acad. Be. USA 87, 3530-3533 and Madison EL, Goldsmith EJ, Gething MJ, Sambrook JF and Gerard RD (1990) J. Biol. Chem. 265, 21423-21426.
  • DESAFIB American Diagnostica
  • a preparation of soluble fibrin monomers was obtained by cleaving high-purity human fibrinogen with the protease batroxobin. Batroxobin cleaves the Arg 16 -Gly 17 bond in the A ⁇ chain of the fibrinogen and releases fibrinopeptide A. The resulting des-AA fibrinogen in the form of fibrin I monomers is shown in Presence of the peptide Gly-Pro-Arg-Pro soluble.
  • the concentration of the Lys plasminogen was varied from 0.0125 to 0.2 ⁇ M in the presence of DESAFIB, and from 0.9 to 16 ⁇ M in the absence of the co-factor.
  • Standard indirect chromogenic tests were performed according to the publications cited above. Batches of 100 ⁇ l total volume with 0.25-1 ng enzyme, 0.2 ⁇ M Lys plasminogen and 0.62 mM Spectrozym PL were used. The tests were carried out in the presence of either buffer, 25 ⁇ g / ml DESAFIB, 100 ⁇ g / ml cyanogen bromide fragments of fibrinogen (American Diagnostica) or 100 ⁇ g / ml of the stimulatory 13-amino acid peptide P368. The analyzes were carried out in microtiter plates and the optical density at 405 nm wavelength was measured every 30 seconds in a "Molecular Devices Thermomax" for 1 hour. The reaction temperature was 37 ° C.
  • DSPA does not increase neuronal tissue damage
  • Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron 21: 813-
  • Tissue plasminogen activator increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice. Nat Med. 4: 228-231.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von nicht-neurotoxischen Plasminogen Aktivierenden Faktoren, beispielsweise aus Desmodus rotundus (DSPA) oder genetisch modifizierten Plasminogen Aktivierenden Faktoren insbesondere humaner Herkunft zur Herstellung eines Therapeutikums zur Injektion für die therapeutischen Behandlung des Schlaganfalls bei Menschen.

Description

"Intravenöse Injektion nicht-neurotoxischer Plasminoαen-Aktivatoren zur Behandlung von Schlaαanfall"
Die Erfindung betrifft die intravenöse Applikation nicht-neurotoxischer Plasminogen-Aktivatoren, insbesondere genetisch modifizierter Plasminogen- Aktivatoren und Plasminogen-Aktivatoren aus dem Speichel von Desmodus rotundus (DSPA) zur Behandlung des Schlaganfalls beim Menschen. Die Behandlung von Schlaganfall mit diesen Plasminogen-Aktivatoren ist aus der internationalen Patentanmeldung PCT/EP02/12204 bekannt, auf deren Offenbarung vollumfänglich Bezug genommen wird.
Klinik und Biochemie des Schlaganfalls
Unter dem Begriff "Schlaganfall" werden verschiedene Krankheitsbilder zusammengefaßt, die sich in ihrer klinischen Symptomatik ähneln. Eine erste Differenzierung dieser Krankheitsbilder in die sogenannten ischämischen Insulte und hämörrhagischen Insulte ist ausgehend von der jeweiligen Pathogenese möglich.
Bei ischämischen Insulten (Ischämie) handelt es sich um eine Verminderung oder Unterbrechung der Durchblutung des Gehirns infolge mangelnder arterieller Blutzufuhr. Diese wird häufig durch eine Thrombose eines arterios- klerotisch stenosierten Gefäßes, aber auch durch arterioarterielle bzw. kar- diale Embolien verursacht.
Die hämörrhagischen Insulte gehen dagegen u.a. auf eine Perforation der durch arterielle Hypertonie beschädigten, das Hirn versorgenden Arterien zurück. Von allen zerebralen Insulten werden aber lediglich etwa 20% durch diese Form der Blutungen verursacht, so daß den durch Thrombose verursachten Schlaganfällen die weitaus größte Bedeutung zukommt. Die Ischämie neuronaler Gewebe geht - im Vergleich zu anderen Gewebe- Ischämien - in besonderem Umfang mit der Nekrose der betroffenen Zellen einher. Die erhöhte Nekroseinzidenz kann nach neuerem Verständnis durch das Phänomen der sog. Exzitotoxizität erklärt werden, bei der es sich um eine komplexe Kaskade einer Vielzahl von Reaktionsschritten handelt. Diese wird demnach dadurch ausgelöst, daß die unter Sauerstoffmangel leidenden ischämischen Neuronen schnell ATP verlieren und depolarisieren. Dies führt zu einer verstärkten postsynaptischen Abgabe des Neurotransmitters Glutamat, der seinerseits membrangebundene neuronale Glutamat-Rezepto- ren aktiviert, die Kationenkanäle regulieren. Als Folge der erhöhten Gluta- mat-Ausschüttung werden die Glutamat-Rezeptoren jedoch überaktiviert.
Die Glutamat-Rezeptoren regulieren ihrerseits spannungsabhängige Kationenkanäle, die - bei der Bindung von Glutamat an seinen Rezeptor - geöffnet werden. Damit setzt ein Na+ und ein Ca2+-Einstrom in die Zelle ein, der zu einer massiven Störung des Ca2+-abhängigen zellulären Stoffwechsels - einschließlich des Energiestoffwechsels - führt. Für den nachfolgend eintretenden Zelltod könnte dabei insbesondere die Aktivierung Ca2+-abhän- giger katabolischer Enzyme verantwortlich sein (Lee, Jin-Mo et al., "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamat neurotoxicity and deseases of the nervous System").
Selbst wenn der Mechanismus der Glutamat vermittelten Neurotoxizität derzeit noch nicht im Detail verstanden wird, scheinit dennoch Einigkeit darüber zu bestehen, daß dieses Phänomen in einem erheblichen Umfang zu dem neuronalen Zelltod nach einer zerebralen Ischä mie beiträgt (Jin-Mo Lee et. al.).
Therapie des Schlaganfalls
Bei der Therapie der akuten zerebralen Ischäimie steht neben der Sicherstellung vitaler Funktionen und der Stabilisierung physiologischer Parameter zunächst das Bestreben nach einer Wiedereröffnung des verschlossenen Gefäßes im Vordergrund. Dieses Ziel wird mit verschiedenen Ansätzen verfolgt. Die rein mechanische Wiederveröffentlichung hat bisher noch keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt, wie etwa die PTCA bei Herzinfarkt. Lediglich mit erfolgreicher Fibrinolyse konnte bisher eine ausreichende Besserung des Zustande für die Patienten aufgezeigt werden.
Die körpereigene Fibrinolyse basiert auf der proteolytischen Aktivität der Serin-Protease Plasmin, die durch eine Katalyse (Aktivierung) aus der inaktiven Vorstufe Plasminogen hervorgeht. Die natürliche Aktivierung des Plas- minogens erfolgt durch die körpereigenen Plasminogen-Aktivatoren u-PA (Urokinase-typ Plaminogenaktivator) und t-PA (Tissue Plasminogen Aktivator). Letzterer bildet - im Gegensatz zu u-PA - gemeinsam mit Fibrin und Plasminogen einen sog. Aktivatorkomplex. Die katalytische Aktivität des t-PA ist demnach Fibrin-abhängig und erfährt in Gegenwart von Fibrin eine etwa 550-fache Steigerung. Neben Fibrin kann auch Fibrinogen die t-PA vermittelte Katalyse von Plasmin zu Plasminogen stimulieren - wenn auch in sehr viel geringerem Umfang. So erfährt die t-PA Aktivität in Gegenwart von Fibrinogen lediglich eine 25-fache Steigerung. Die Spaltprodukte des Fibrins (fibrin degradation products (FDP)) stimulieren ihrerseits ebenfalls die t-PA Aktivität.
Bekannte Therapieansätze
a) Streptokinase
Frühe Ansätze der thrombolytischen Behandlung des akuten Schlaganfalls gehen bereits auf die 1950-iger Jahre zurück. Aber erst ab 1995 wurden erste umfangreiche klinische Versuche mit Streptokinase, einem Fibrinolyti- kum aus beta-hämolysierenden Streptokokken, durchgeführt. Streptokinase bildet mit Plasminogen einen Komplex, de^r in der Lage ist, andere Plasmi- nogenmoleküle in Plasmin umzusetzen. Die Therapie mit Streptokinase ist aber mit wesentlichen Nachteilen verbunden, da Streptokinase als bakterielle Protease im Körper allergische Reaktionen auslösen kann. Auch kann eine sog. Streptokinase-Resistenz bei vorheriger Streptokokken-Infektion mit entsprechender Antikörperbildung vorliegen, die eine Therapie erschweren. Darüber hinaus deuteten klinische Studien in Europa (Multicenter Acute Stroke Trial of Europe (MAST-E), Mul- ticenter Acute Stroke Trial of Italy (MAST-I)) und Australien (Australien Streptokinase Trial (AST)) auf ein derart erhöhtes Mortalitätsrisiko und die erhebliche Gefahr von intrazerebralen Blutungen (intracerebral hemorrhage, ICH) nach der Patienten-Behandlung mit Streptokinase hin, daß diese Studien sogar frühzeitig abgebrochen werden mußten.
b) Urokinase
In einem alternativen Therpieansatz wird Urokinase - ebenso ein "klassisches" Fibrinolytikum - appliziert, die im Gegensatz zu Streptokinase keine antigenen Eigenschaften aufweist, da es sich dabei um ein in zahlreichen Geweben vorkommendes körpereigenes Enzym handelt. Es stellt einen von Cofaktoren unabhängigen Aktivator des Plasminogens dar. Urokinase wird in Nierenzellkulturen hergestellt.
c) rekombinantes t-PA (rt-PA)
Umfangreiche Erfahrungen im Bereich der therapeutischen Thrombolyse liegen mit dem Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator - dem sog. rt-PA - vor (siehe EP 0 093 619, US-Patentschrift 4 766 075), der in rekombinanten Hamsterzellen produziert wird. Mit t-PA wurden - neben der Hauptindikation akuter Myokardinfarkt - in den 1990-iger Jahren weltweit eine Reihe klinischer Studien mit zum Teil noch unverstandenen und widersprüchlichen Ergebnissen durchgeführt. So wurden zunächst im sog. European Acute Stroke Trial (ECASS) Patienten innerhalb eines Zeitraums von sechs Stunden nach dem Einsetzen der Symptome des Schlaganfall.s intravenös mit rt- PA behandelt und nach 90 Tagen die Mortalitätsrate sowie der Barthel-Index als Maßstab für die Versehrtheit oder selbständige Lebensfähigkeit der Patienten untersucht. Dabei ergab sich keine signifikante Verbesserung der Lebensfähigkeit, sehr wohl aber eine - wenn auch nicht signifikante - Erhöhung der Mortalität. Dies erlaubte die Schlußfolgerung, daß eine thrombolyti- sche Behandlung von individuell nach ihrer jeweiligen Krankengeschichte gezielt ausgesuchten Patienten mit rt-PA unmittelbar nach dem Beginn des Schlaganfalls möglicherweise vorteilhaft sein könnte. Aufgrund des beobachteten erhöhten Risikos einer intrazerebralen Haemόrrhagie (ICH) nach nur wenigen Stunden nach Einsetzen des Schlaganfalls war aber von einer generellen Anwendung von rt-PA innerhalb des untersuchten Zeitraums von sechs Stunden nach Beginn des Schlaganfalls abzuraten (so C. Lewan- dowski C und Wiliam Barsan, 2001 : Treatment of Acute Strocke; in: Annais of Emergency Medcine 37:2; S. 202 ff).
Die thrombolytische Behandlung des Schlaganfalls war später ebenso Gegenstand einer klinischen Studie des National Institute of Neurologic Disorderand Stroke (sog. NINDS rtPA Stroke Trial) in den USA. Dabei stand jedoch die Untersuchung der Wirkung einer intravenösen rt-PA-Behandlung innerhalb eines nur dreistündigen Zeitraums nach Beginn der Symptome auf den Gesundheitszustand der Patienten nach drei Monaten im Vordergrund. Obwohl die Autoren auch hier ein erhöhtes Risiko für ICH feststellten, wird dennoch die rt-PA Behandlung innerhalb dieses begrenzten Zeitraums von drei Stunden aufgrund der ebenfalls durch die Studie erkannten positiven Effekte dieser Behandlung auf die Lebensfähigkeit der Patienten empfohlen.
In zwei weiteren Studien (ECASS II Trial; Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischemic Stroke (ATLANTIS)) wurde untersucht, ob sich diese positive Aussage über die Wirkung der rt-PA Behandlung innerhalb von drei Stunden nach Beginn des Schlaganfalls auch für ein Behandlung im sechsstündigen Zeitraum bestätigen ließen. Diese Frage konnte jedoch nicht positiv beantwortet werden, da durch eine Behandlung in diesem Zeitraum neben dem erhöhten Risiko für ICH keine Verbesserung der klinischen Symptome oder eine Verringerung der Mortalität beobachtet werden konnte.
Gemäß einer erstmalig 1997 publizierten und im März 2001 aktualisierten Zusammenschau aller "Stroke Trials" führten alle Thrombolytika-Behand- lungen (Urokinase, Streptokinase, rt-PA oder rekombinate Urokinase) insbesondere aufgrund von ICH zu einer signifikant erhöhten Mortalität innerhalb der ersten zehn Tage nach dem Schlaganfall, während sich bei einer Behandlung innerhalb des 6-Stunden-Zeitraums die Gesamtanzahl der entweder toten oder behinderten Patienten reduzierte. Von einer breiten Anwendung von Thrombolytika für eine Schlaganfallbehandlung wird daher abgeraten.
Diese Ergebnisse haben schon vorher andere Autoren zu der eher sarkastischen Aussage bewogen, daß Schlaganfall-Patienten nunmehr die Wahj hätten, zu sterben oder behindert zu überleben (SCRIP 1997: 2265, 26).
Gleichwohl stellt die Therapie mit rt-PA derzeit die einzige von der Food and Drug Administration (FDA) .in den USA zugelassene Behandlungsmethode der akuten zerebralen Ischämie dar. Diese ist allerdings beschränkt auf eine Applikation des rt-PA innerhalb von drei Stunden nach dem Beginn des Schlaganfalls.
Rekombinanter Plasminogen-Aktivator ist derzeit unter der Bezeichnung Alteplase sowie als Analogpräparat Reteplase auf dem Markt. Bei letzterem handelt es sich um ein therapeutisch wirksames t-PA-Fragment mit niedrigerer Halbwertszeit. Die therapeutische Dosis liegt für Alteplase bei etwa 70- 100 mg, für Reteplase bei zweimal 560 mg, wobei Alteplase im wesentlichen über eine Tropf-Infusion, Reteplase dagegen über eine zweimalige Bolusin- jektion im Abstand von etwa 30 min verabreicht wird. (Mutschier: "Arzneimittelwirkungen", 8. Auflage, S. 512-513). Nebenwirkungen des t-PA
Neurotoxizität und Exzitotoxizität
Die Zulassung des rt-PA erfolgte 1996. Unmittelbar zuvor, nämlich im Jahre 1995, wurden erste Hinweise für die Ursache der neurotoxischen, bzw. exzitotoxischen Wirkungen des t-PA bekannt, die einen Erklärungsansatz für die dramatischen Effekte des t-PA bei der Schlaganfallbehandlung außerhalb des 3-Stunden Behandlungszeitraums liefern. Danach produzieren Mikrogliazellen und neuronale Zellen des Hippocampus körpereigenes t-PA, das an der Glutamat vermittelten Exzitotoxizität beteiligt ist. Diese Schlußfolgerung entstand durch einen Vergleich von t-PA defizienten Mäusen und Wildtypmäusen, denen jeweils Glutamat-Agonisten in den Hippocampus injiziert wurden. Dabei zeigten die t-PA defizienten Mäuse eine deutlich erhöhte Resistenz gegen extern (inthrathekal) appliziertes Glutamat (Tsirka SE et. al., Nature, Vol. 377, 1995, "Exzitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator"). Diese Ergebnisse wurden im Jahre 1998 bestätigt, als Wang et al. bei t-PA defizienten Mäusen durch die intravenöse Injektion von t-PA nahezu eine Verdoppelung des nekrotischen neuronalen Gewebes nachweisen konnten. Dieser negative Effekt des externen t-PA lag bei Wildmäusen dagegen nur etwa bei 33% (Wang et al., 1998, Nature, "Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild type and t-PA deficient mice").
Weiterführende Ergebnisse über die Stimulation der Exzitotoxizität durch t- PA publizierten Nicole et al. zu Beginn des Jahres 2001 (Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET;; Vivien D und Buisson A, 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in: Nat Meid 7, 59-64). Sie konnten nachweisen, daß von depolarisierten kortikalen Neuronen ausgeschüttetes t- PA mit der sogenannten NR1 Untereinheit des Glutamat Rezeptors des NMDA Typs interagiert und diese spaltet. Diese Modifikation führt zu einer Erhöhung der Rezeptoraktivität, die ihrerseits für eine erhöhte Gewebeschädigung nach der Applikation des Glutamat Agonisten NMDA durch eine induzierte Exzitotoxizität verantwortlich ist. Das t-PA wirkt somit durch die Aktivierung des Glutamat-Rezeptor des NMDA-Typs neurotoxisch. Da die Blut-Hirnschranke bei einem Schlaganfall im betroffenen Gewebebereich zusammenbricht, gelangen lösliche Plasmaproteine wie Fibrinogen sowie therapeutisch appliziertes t-PA in Kontakt zu dem Nervengewebe, wo das durch Fibrinogen stimulierte t-PA durch die Aktivierung des Glutamat- Rezeptprs seine exzitotoxische Wirkung entfaltet.
Dass trotz dieser Hinweise auf die neurotoxischen Nebeneffekte des t-PA und trotz der nachgewiesenen Erhöhung der Mortalität durch t-PA dennoch eine arzneimittelrechtliche Zulassung durch die FDA erfolgte, kann wohl nur durch den Mangel an ungefährlichen und effektiven Alternativen - und eine sehr pragmatische Kosten-Nutzen Analyse - erklärt werden. Es besteht aber nach wie vor Bedarf für sicherere Therapien, wobei bei der Entwicklung neuer Thrombolytika - sofern denn von der Thromboiyse nicht sogar ganz Abstand zu nehmen ist - das Problem der Neurotoxizität berücksichtigt werden muß (so z.B. Wang et al a.a.O.; Lewandowski und Barsan 2001 a.a.O).
Aus diesem Grund unterblieben weiterführende Untersuchungen bekannter Thrombolytika einschließlich des DSPA (Desmodus rotundus Plasminogen Aktivator) zur Entwicklung eines neuen Therapeutikums für Schlaganfall, obwohl prinzipiell sämtliche Thrombolytika geeignet sein könnten und beispielsweise im Falle des DSPA bereits in einer ersten Veröffentlichung auf dessen mögliche Eignung für dieses Indikationsgebiet hingewiesen wurde (Medan P; Tatlisumak T; Takano K; Carano RAD; Hadley SJ; Fisher M: Thrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogen activator (rDSPA) in a rat embolic stroke model; in:: Cerebrovasc Dis 1996:6; 175-194 (401 International Symposium on Thrombolic Therapy in Acute Ishemic Stroke)). Gerade bei DSPA handelt es sich aber um einen Plasminogen Ak- tivator mit hoher Homologie (Ähnlichkeit) zu t-PA, so daß - zugleich mit der Ernüchterung über die neurotoxischen Nebenwirkungen des t-PA - auch in DSPA keine weiteren Hoffnungen gesetzt wurden.
Alternative Therapieansätze
Die Erforschung alternativer Therapieansätze ist derzeit zum Beispiel auf Antikoagulantien wie Heparin, Aspirin oder Ancrod, dem Wirkstoff aus dem Gift der Malayischen Grubenotter, ausgerichtet. Zwei u.a. auch auf die Untersuchung der Wirkungen von Heparin ausgerichtete klinische Studien (International Stroke Trial (IST) und Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST)) deuten jedoch nicht auf eine signifikante Verbesserung der Mortalität und eine Verhinderung eines erneuten Schlaganfalls hin.
Eine weitere neuartige Behandlungsmethode setzt weder an dem Thrombus noch an der Blutverflüssigung oder Antikoagulation an, sondern versucht, die Vitalität der durch die Unterbrechung der Blutzufuhr geschädigten Zellen zu steigern (WO 01/51613 A1 und WO 01/51614 A1). Dazu werden Antibiotika aus der Gruppe der Quinone, Aminoglycoside oder Chloramphenicol appli- ziert. Aus einem ähnlichen Grund wird zudem vorgeschlagen, unmittelbar nach dem Schlaganfall mit der Gabe von Citicholin zu beginnen, das im Körper zu Cytidin und Cholin gespalten wird. Diese Spaltprodukte sind Bestandteile der neuronalen Zellmembran und können so die Regeneration des geschädigten Gewebes unterstützen (US-Patentschrift 5827 832).
Jüngste Bestrebungen auf der Suche nach sicheren Behandlungsmethoden basieren auf den neuen Erkenntnissen darüber, daß ein Teil der fatalen Folgen des Schlaganfalls nur mittelbar auf die unterbrochene Blutzufuhr unmittelbar aber auf die Exzito- oder Neurotoxizität unter Beteiligung des überangeregten Glutamat-Rezeptors zurückzuführen ist, die wiederum insbesondere auch durch t-PA verstärkt wird (s. o). Ein Ansatz zur Verminderung dieser Exzitotoxizität ist daher die Applikation von sog. Neuroprotektiva. Diese können allein oder in Kombination mit Fibrinolytika verwendet werden, um so deren neurotoxischen Effekt zu minimieren. Sie können dabei entweder direkt, beispielsweise als Glutamat-Rezeptor-Antagonisten oder indirekt über die Blockade von spannungsabhängigen Natrium- oder Kalziumkanälen zu einer Abschwächung der Exzitotoxizität führen (Jin-Mo Lee et. al. a.a.O.).
Eine kompetitive Hemmung (Antagonisierung) des Glutamat-Rezeptors des NMDA Typs ist dabei beispielsweise mit 2-Amino-5-Phosphonovalerat (APV) oder 2-Amino-5-Phosphonoheptanoate (APH) möglich. Eine nicht-kompeti- tive Hemmung kann beispielsweise durch Substanzen erreicht werden, die an die Phencyclidin Seite der Kanäle binden, wie Phencyclidin, MK-801, Dextrorphan oder Ketamin.
Bislang haben die Behandlungen mit Neuroprotektiva jedoch noch nicht den gewünschten Erfolg erbracht, möglicherweise weil sie mit Thrombolytika kombiniert werden müssten, um ihre protektive Wirkung zu entfalten. Dies gilt im gleichen Maße für die anderen Wirkstoffe auch (siehe Fig. 10).
Selbst eine Kombination aus t-PA und einem Neuroprotektivum ermöglicht jedoch allenfalls nur einen Erfolg im Sinne einer Schadensbegrenzung. Die Nachteile der Neurotoxizität des verwendeten Fibrinolytikums selber werden damit aber nicht vermieden.
Nicht-neurotoxische Plasminogenaktivatoren
Aus der internationalen Patentanmeldung PCT/EP02/12204, deren Offenbarung vollumfänglich in Bezug genommen wird, sind Plasminogen-Aktivatoren für die Schlaganfallbehandlung bekannt, deren Enzymaktivitält hochselektiv durch Fibrin um ein Vielfaches gesteigert wird, nämlich um mehr als das 650-fache. Beschaffenheit und Einsatz dieser Plasminogen-Aktivatoren basieren auf der Erkenntnis, daß die Neurotoxizität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators (t- PA) darauf zurückzuführen ist, daß in Folge der aufgrund des Schlaganfalls verursachte Gewebezerstörung im Gehirn die Blut-Hirn-Schranke beschädigt oder zerstört wird und das im Blut zirkulierende Fibrinogen somit in das neuronale Gewebe des Gehirns eindringen kann. Dort aktiviert es t-PA, das - mittelbar durch die Aktivierung des Glutamat-Rezeptors oder durch die Aktivierung des Plasminogens - zu weiteren Gewebeschädigungen führt (s.o.).
Zur Vermeidung dieses Effekts wird ein Plasminogen-Aktivator eingesetzt, der eine erhöhte Fibrinselektivität und - im Umkehrschluß - eine verringerte Aktivierbarkeit durch Fibrinogen zeigt. Daraus folgt, daß diese Plasminogen- Aktivatoren beim Übertritt von Fibrinogen aus dem Blut in das neuronale Gewebe in Folge der beschädigten Blut-Hirn-Schranke nicht - oder in einem im Vergleich zum t-PA deutlich verringertem Ausmaß - aktiviert werden, da ihr Aktivator Fibrin aufgrund seiner Größe und Unlöslichkeit nicht in das neuronale Gewebe eintreten kann. Diese Plasminogen-Aktivatoren sind somit nicht-neurotoxisch.
a) genetisch modifizierte Plasminogen-Aktivatoren
Dabei werden beispielsweise nicht-toxische Plasminogen-Aktivatoren eingesetzt, die wenigstens ein Element einer sog. Zymogen-Triade aufweisen. Eine vergleichbare Triade ist aus idem katalytischen Zentrum von Serinpro- teasen der Chymotrypsin-Familie bekannt, die aus den drei interagierenden Aminosäuren Aspartat 194, Histidlin 40 und Serin 32 besteht. Diese Triade ist bei dem zu der Familie der Clhymotrypsin-artigen Serinproteasen gehörenden t-PA jedoch nicht vorhanden. Es ist aber bekannt, daß die gezielte Mutagenese des nativen t-PA zur Einführung wenigstens einer dieser Aminosäuren an geeigneten Positionein zu einer Verringerung der Aktivität des Pro-Enzyms (einkettiges t-PA) und einer Erhöhung der Aktivität des reifen Enzyms (zweikettiges t-PA) bei Anwesenheit von Fibrin führt. Somit führt die Einführung wenigstens einer Aminosäure aus der Triade - oder von Aminosäuren, die die entsprechende Funktion in der Triade übernehmen - zu einer Erhöhung der Zymogenität des t-PA (Verhältnis der Aktivität des reifen Enzyms zu der Aktivität des Pro-Enzyms) bei deutlicher Erhöhung der Fibrinspezifität, durch konformative Wechselwirkung zwischen den eingeführten Aminosäureresten und/oder Aminosäureresten der wildtypischen Sequenz.
So ist es bekannt, daß die Mutagenese des nativeή t-PA zur Substitution des Phe305 zu His (F305H) sowie des Ala 292 zu Ser (A292S) zu einer 20- fachen Erhöhung der Zymogenität führt, während aber bereits bei der Variante F305H allein eine Steigerung um das 5-fache erzeugt wird (EL Madison, Kobe A, Gething M-J, Sambrook JF, Goldsmith EJ 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory Triad of Asp-His- Ser; Science: 262, 419-421). Diese t-PA Mutanten zeigen bei der Anwesenheit von Fibrin eine Aktivitätssteigerung um das 30.000-fache (F305H) bzw. um das 130.000-fache (F305H, A292S). Beide Mutanten weisen zusätzlich eine Substitution des Arg275 zu R275E auf, um die Spaltung des einkettigen t-PA in die zweikettige Form an der Spaltungsstelle Arg275-Ile276 durch Plasmin zu verhindern. Allein diese Mutante R275E erhöht die Fibrinspezifität des t-PA um das 6.900-fache (K Tachias, Madison EL 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulation by Fibrin, in: Journal of Biological Chemistry 270, 31: 18319- 18322).
Die Positionen 305 und 292 des t-PA sind homolog zu den Positionen His40 und Ser32 der bekannten Triade der chymotryptischen Serinproteasen. Durch die entsprechende Substitution mit Hlistidin bzw. Serin können diese Aminosäuren mit dem Aspartat477 des t-PA interagieren, so daß die bekannte Triade funktionell in den t-PA Mutanten ausgebildet werden kann (Madison et al 1993). Diese t-PA-Mutanten können zur Behandlung des Schlaganfalls eingesetzt werden, da sie aufgrund ihrer erhöhten Fibrinspezifität keine oder - im Vergleich zum Wildtyp t-PA - nur eine deutlich verringerte Neurotoxizität aufweisen. Zu Zwecken der Offenbarung der erwähnten t-PA Mutanten F305H; F305H, A292S allein oder in Kombination mit R275E werden die Veröffentlichungen von Madison et al 1993 sowie Tachias und Madison 1995 vollumfänglich in Bezug genommen.
Die Erhöhung der Fibrinspezifität von Plasminogen-Aktivatoren ist alternativ ebenso möglich durch eine Punktmutation des Asp194 (oder eines Aspartats an homologer Position). Plasminogen-Aktivatoren gehören zu der Gruppe der Serinproteasen der Chymptrypsin-Familie und weisen übereinstimmend die konservierte Aminosäure Asp194 auf, die für die Stabilität der katalytisch aktiven Konformation der reifen Proteasen verantwortlich ist. Es ist bekannt, daß das Asp194 in den Zymogenen der Serinproteasen mit His40 interagiert. Durch die aktivierende Spaltung des Zymogens werden diese Wechselwirkungen unmöglich, und die Seitenkette des Asp194 um etwa 170° rotiert, um anschließend mit dem Ile16 eine neue Salzbrücke auszubilden. Diese Salzbrücke ist an der Stabilität der Oxyanion-Tasche der katalytischen Triade der reifen Serinprotease beteiligt. Sie liegt auch im t-PA vor.
Eine Punktmutation des Asp194 macht die Ausbildung bzw. Stabilität der kata|ytischen Konformation der Serinproteasen zunächst unmöglich. Gleichwohl zeigen die mutierten Plasminogen-Aktivatoren bei Anwesenheit ihres Co-Faktors Fibrin - gerade auch im Vergleich zu der reifen Wildtyp- Form - eine deutliche Aktivitätssteigerung, die nur damit zu erklären ist, daß die Wechselwirkungen mit Fibrin eine eine katalytisch e Aktivität ermöglichende Konformationsänderung erlaubt (L Strandberg, iMadison EL, 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Subs-tantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin Co-factors. in: Journal of Biological Chemistry 270, 40: 2344-23449). Somit zeigen die AspT 94-Mutanten der Plasminogen-Aktivatoren eine hohe Aktivitätsteigerung bei Anwesenheit von Fibrin, die ihre Verwendung als nicht-neurotoxischer Plasminogenaktivator ermöglicht.
Ein bevorzugtes Beispiel für einen derartigen nicht-neurotoxischen Plasminogenaktivator stellt t-PA dar, dessen Asp194 durch Glutamat (D194E) bzw. Asparagin (D194N) substituiert ist. Damit reduziert sich bei Abwesenheit von Fibrin die Aktivität von t-PA um den Faktor 1-2000, während dagegen bei Anwesenheit von Fibrin eine Aktivitätssteigerung um den Faktor 498.000 bis 1.050.000 erreicht werden kann. Diese Mutanten können zudem eine Substitution des Arg15 zu R15E enthalten, die die Spaltung des einkettigen t-PA zu dem zweikettigen t-PA an der Peptidbindung Arg15-Ile16 durch Plasmin verhindert. Durch diese Mutation allein wird die Aktivierung des t-PA durch Fibrin bereits um den Faktor 12.000 erhöht. Zu Zwecken der Offenbarung der Mutationen an den Positionen 194 sowie 15 des t-PA wird die Veröffentlichung von Strandberg und Madison 1995 vollumfänglich in Bezug genommen.
Eine Erhöhung der Fibrin-Abhängigkeit von Plasminogen-Aktivatoren kann zudem über die Einführung von Punktmutationen in die sog. "Autolyse- Schleife" erreicht werden. Dieser Aminosäure-Abschnitt ist aus Trypsin bekannt; er liegt aber als homologer Abschnitt auch in Serinproteasen vor und ist insbesondere gekennzeichnet durc'h drei hydrophobe Aminosäuren (Leu, Pro und Phe). Die Autolyse-Schleife iin Plasminogen-Aktivatoren ist für die Interaktion mit Plasminogen verantwortlich. Punktmutationen in diesem Bereich können dazu führen, daß die Pirotein/Protein Wechselwirkungen zwischen Plasminogen und Plasmimogen-Aktivator funktionell nicht mehr ausgebildet-werden können. Diese Mutationen sind funktionell jedoch nur bei Abwesenheit von Fibrin relevant. Bei Anwesenheit von Fibrin sind sie dagegen für eine Aktivitätssteigerung der Plasminogen-Aktivatoren verantwortlich (K Song-Hua, Tachias K, Lamba D, Bode W, madison EL, 1997: Identifikation of a Hydrophobie exocite on Tissue Type Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen. In: Journal of Biological Chemistry 272; 3, 181-1816).
In einer bevorzugten Form wird ein t-PA mit Punktmutationen in den Positionen 420-423 eingesetzt. Werden diese Reste durch gezielte Punktmutätio- nen substituiert, steigert sich die Fibrin-Abhängigkeit des t-PA um einen Faktor von bis zu 61.000 (K Song-Hua et al.). Song-Hua et al. untersuchten die Punktmutationen L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A und F423E. Die Veröffentlichung wird hiermit vollumfänglich für die erfindungsgemäße Verwendung in bezug genommen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung wird modifizierter Gewebeplasmi- noginaktivator mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 1 (Fig. 13) verwendet, das sich von dem Wildtyp-t-PA dadurch unterscheidet, dass ein Austausch der hydrophoben Aminosäuren in den Positionen 420 - 423 in der Autolyse-Schleife vorgenommen wird, die wie folgt besetzt werden: His420, Asp421, Ala422 und Cys423. Dieses t-PA weist bevorzugt ein Phenylalanin an der Position 194 auf. Zudem kann die Position 275 durch ein Glutamat besetzt sein. Vorteilhafterweise ist die Position 194 von Phenylalanin besetzt.
Weiterhin kann eine modifizierte Urokinase eingesetzt werden. Diese Urokinase kann die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 2 (Fig. 14) aufweisen, in der die hydrophoben Aminosäuren der Autolyse-Schleife durch Val420, Thr421, Asp422 und Ser423 ersetzt sind. Vorteilhafterweise trägt diese Urokinase ein Ile275 sowie ein Glu194. Diese Mutante zeigt im Vergleich zu der Wildtyp-Urokinase eine um das 500-fache erhöhte Fibrinspezifität.
Beide Mutanten - sowohl Urokinase als auch t-PA - wurden in semi-quanti- tativen Tests untersucht und ergaben eine im Vergleich zum Wildtyp t-PA erhöhte Fibrinspezifität. b) Plasminogen-Aktivator aus Desmodus rotundus (DSPA)
Eine hohe Steigerung der Aktivität bei Anwesenheit von Fibrin - nämlich eine Steigerung um das 100.000-fache - zeigt zudem auch der Plasminogen- Aktivator (DSPA) aus dem Speichel der Vampirfledermaus (Desmodus rotundus), der daher als nicht-neurotoxischer Plasminogenaktivator verwendet werden kann. Unter dem Begriff DSPA werden vier verschiedene Pro- teasen zusammengefaßt, die ein grundlegendes Bedürfnis der Vampirfledermaus, nämlich die verlängerte Blutungsdauer der von diesen Tieren verursachten Wunden der Beutetiere erfüllen (Cartwright, 1974). Diese vier Proteasen (DSPAα-i, DSPAα2, DSPAß, DSPAγ) weisen übereinstimmend eine hohe Ähnlichkeit (Homologie) zu humanem t-PA auf. Ebenso weisen sie ähnliche oder übereinstimmende physiologische Aktivitäten auf, die ihre Zusammenfassung zu dem Oberbegriff DSPA rechtfertigen. DSPA ist Gegenstand der EP 0 352 119 A1 sowie der US Patente 6 008 019 und 5 830 849 die hiermit zu Offenbarüngszwecken vollumfänglich in Bezug genommen werden.
Bei DSPAαl handelt es sich um die bisher am besten untersuchte Protease dieser Gruppe. Sie weist in ihrer Aminosäuresequenz eine Homologie von über 72% gegenüber der bekannten humanem t-PA Aminosäuresequenz auf (Krätzschmar et al., 1991). Dennoch bestehen zwischen t^PA und DSPA zwei wesentliche Unterschiede. Erstens nämlich stellt DSPA als Einzelkette gegenüber Peptidsubstraten ein voll aktives Molekül dar, das nicht - wie das t-PA - in eine zweikettige Form überführt wird (Gardell et al, 1989; Krätzschmar et al., 1991). Zweitens zeigt die katalytische Aktivität des DSPA eine nahezu absolute Fibrin Abhängigkeit (Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschi et al., 1998). So wird beispielsweise die Aktivität des DSPAαl bei Anwesenheit von Fibrin um das 100.000-fache gesteigert, während die t- PA-Aktivität nur um das etwa 550-fache ansteigt. Die DSPA-Aktivität wird dagegen durch Fibrinogen wesentlich weniger stark induziert; es erfährt nur eine Steigerung um das 7- bis 9-fache (Bringmann et al., 1995). DSPA ist somit erheblich stärker Fibrin abhängig und Fibrin spezifisch als das Wildtyp t-PA, das nur etwa 550-fach durch Fibrin aktiviert wird.
Aufgrund seiner fibrinolytischen Eigenschaften und der großen Ähnlichkeit zu t-PA stellt DSPA zwar einen interessanten Kandidaten für die Entwicklung eines Thrombolytikurfis dar. Auf Grund der Beteiligung des t-PA an der Glutamat abhängigen Neurotoxizität bestanden daher keine berechtigten Hoffnungen, einen mit t-PA eng verwandten Plasminogen-Aktivator erfolgreich zur Behandlung des akuten Schlaganfalls einzusetzen.
Nun hat sich aber überraschender Weise gezeigt, dass DSPA trotz seiner hohen Ähnlichkeit (Homologie) zu t-PA und trotz der weitgehenden Übereinstimmung seiner physiologischen Wirkung zu t-PA im Gegensatz zu diesem keine neurotoxischen Wirkungen aufweist. Mit dieser Feststellung geht unmittelbar die Erkenntnis einher, dass DSPA als Thrpmbolytikum doch zur Therapie des Schlaganfalls verwendet werden kann, ohne dass damit ein zusätzliches Risiko der Schädigung des neuronalen Gewebes verbunden wäre. Dies bedeutet insbesondere, dass DSPA auch später als drei Stunden nach dem Einsetzen der Symptome beim Schlaganfall eingesetzt werden kann.
Experimenteller Nachweis der fehlenden Neurotoxizität von DSPA
Die Erkenntnisse über die fehlende Neurotoxizität dieser Plasminogen-Aktivatoren basiert wesentlich auf in v/Vo-Vergleichsuntersuchungen der neuro- degenerativen Wirkung des t-PA einerseits und des DSPA andererseits, die unter Zuhilfenahme des sog. "Kainsäure-Modells" sowie eines Modells zur Untersuchung der NMDA induzierten Läsion des Striatums durchgeführt wurden.
Das Kainsäure-Modell (auch Kainsäure Verletzungsmodell) beruht darauf, daß die neurotoxische Glutamat Kaskade durch die Applikation von externer Kainsäure (KA) als Agonist des Glutamat-Rezeptors des Kainsäure Typs (KA-Typ) sowie der NMDA- und AMPA-Glutamat-Rezeptoren stimuliert wird. Durch die Verwendung eines t-PA defizienten Mäusestamms als Versuchsmodell konnte damit gezeigt werden, daß die Sensitivität der Versuchstiere gegen Kainsäure nur bei einer zusätzlichen Gabe externen t-PAs das Niveau der Wildtypmäuse erreichte. Dagegen konnte eine Infusion einer äquimola- ren Konzentration an DSPA unter den gleichen experimentellen Bedingungen die Sensitivität gegenüber der Kain-Säure (KA) nicht wiederherstellen. Die Wirkungen des t-PA konnten demnach durch DSPA nicht substituiert werden. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Fig. 15 (Tabelle 1 ) dargestellt.
Quantitative Untersuchungen an diesem Modell zeigten, daß selbst eine 10- fache Steigerung der DSPA-Konzentration die Sensitivität der t-PA defizienten Mäusen gegen die KA-Behandlung nicht wiederherstellte, während aber bereits eine 10-fach niedrigere t-PA-Konzentration KA-induzierte Gewebeschäden herbeiführte. Daraus folgt, daß DSPA bei der Förderung der Neurodegeneration nach KA Behandlung eine wenigstens 100-fach niedrigere Aktivität als t-PA aufweist (siehe auch Fig. 11 und 12).
In dem zweiten Modell der Neurodegeneration wurden die möglichen Wirkungen des t-PA sowie des DSPA auf die Förderung der NMDA-abhängigen Neurodegeneration in Wildtypmäusen verglichen. Dazu wurde Wildtypmäusen NMDA (als Agonist des Glutamat Rezeptors des NMDA-Typs) allein oder in Kombination mit t-PA oder DSPA injiziert. Dieses Modell erlaubt die Untersuchung der Wirkung dieser Proteasen unter Bedingungen, unter denen eine Neurodegeneration ohnehin eintritt und aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke einen Einstrom von Plasmaproteinen verursacht (Chen et al., 1999).
Bei Arbeiten an diesem Modell führte die Injektion von NMDA zu reproduzierbaren Läsionen im Striatum der Mäuse. Das Volumen dieser Läsionen wurde durch eine gemeinsame Injektion von t-PA und NMDA um mindestens 50% vergrößert. Dagegen führte eine Co-Injektion mit DSPAαl zu keiner Erhöhung der Vergrößerung der durch die NMDA-Injektion verursachten Läsionen. Sogar in Gegenwart von Plasma-Proteinen, die infolge der NMDA- abhängigen Neurodegeneration in das Läsionsgebiet diffundieren konnten, führte DSPA zu keinem Anstieg der Neurodegeneration. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Fig. 16 (Tabelle 2) dargestellt.
Erste Ergebnisse aus klinischen Studien zeigen die Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auch auf die Behandlung des Schlaganfalls beim Menschen. So sind bei Patienten nach erfolgreicher Perfusion deutliche Verbesserungen festzustellen (Verbesserung um 8 Punkte NIHSS oder HIHSS score 0 - 1). Dies macht Fig. 17 (Tabelle 3) deutlich.
In einem weiteren Experiment wurde überprüft, ob t-PA und DSPA bei intravenöser Applikation die geschädigte Blut-Hirnschranke durchdringen können und die Gewebeläsionen im Gehirn vergrößern. Dazu wurden Mäuse zur Erzeugung von Gewebeschäden im Striatum stereotaktisch mit NMDA injiziert und 6, bzw. 24 Stunden nach der Injektion des NMDA t-PA oder DSPA intravenös appliziert. Gegenüber einer Negativkontrolle zeigten die Versuchstiere bei einer Infusion von t-PA 24 Stunden nach NMDA-Injektion eine etwa 30%ige Vergrößerung des durch NMDA-Injektion geschädigten Gewebebereichs, während DSPA keine derartige Verstärkung der Gewebeschädigung verursachte, obwohl sein Eindringen in den geschädigten Gewebebereich mittel einer Antikörperfärbung nachgewiesen werden konnte (siehe Fig. 18, 19). Bei einer entsprechenden intravenösen Applikation von t-PA oder DSPA 6 h nach NMDA-Injektion war noch keine Vergrößerung des geschädigten Gewebebereichs festzustellen. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Blut-Hirnschranke zu diesem Zeitpunkt der t-PA- bzw. DSPA-Applikation noch eine hinreichende Barrierefunktion besaß. Diese Ergebnisse zeigen, daß DSPA im Zentralnervensystem eines Säugers - also auch des Menschen - eine im wesentlichen inerte Protease darstellt und - im Gegensatz zu t-PA - keine Erhöhung der von KA oder NMDA induzierten Neurotoxizität hervorruft. Diese fehlende Neurotoxizität macht DSPA entgegen der Erwartung zu einem geeigneten Thrombolytikum für die Behandlung des akuten Schlaganfalls.
Therapeutisches Potential der nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren
Aufgrund der fehlenden Neurotoxizität des DSPA sowie der übrigen nicht- neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren (s. o.) ergibt sich als besonderer Vorteil für die Schlaganfallbehandlung die Tatsache, daß die Verwendung dieser Plasminogen-Aktivatoren - anders als die des Wildtyp t-PA - nicht nur auf das enge Zeitfenster von bis zu drei Stunden nach Beginn des Schlaganfalls beschränkt ist. Vielmehr kann die Behandlung auch zu einem späteren Zeitpunkt - so also ohne weiteres auch nach sechs Stunden oder noch später - erfolgen, ohne daß dem - wie bei t-PA - das Risiko einer Förderung der Exzitotoxizität entgegenstünde. Erste klinische Untersuchungen mit dem DSPA belegen sogar die unbedenkliche Behandlung von Patienten in einem Zeitraum von mehr als sechs bzw. neun Stunden nach dem Einsetzen der Symptome.
Diese zeitlich unbegrenzte Behandlungsoption mit nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren ist gerade deswegen so bedeutsam, da damit erstmals eine Behandlung von akuten Schlaganfallpatienten bedenkenlos möglich wird, bei denen der Beginn des Schlaganfalls zeitlich nicht mit ausreichender Sicherheit ermittelt werden kann. Diese Patientengruppe war bisher aus Gründen der Vorsicht und der Risikoabschätzung von α'er Thrombolyse mit Plasminogen-Aktivatoren ausgenommen worden. Damit entfällt eine wesentliche Kontraindikation für die zugelassene Verwendung eines Thrombolytikums bei Schlaganfall. Applikation von Plasminogen-Aktivatoren
Im Gegensatz zu dem bereits etablierten Schlaganfall-Therapeutikum rt-PA liegen für die Schlaganfallbehandlung mit den nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren noch keine gesicherten Erkenntnisse über eine mögliche Darreichungsform vor.
Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung einer vorteilhaften Darreichungsform für diese nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren.
Erfindungsgemäß werden Plasminogen-Aktivatoren, deren Aktivität bei Anwesenheit von Fibrin um mehr als 650-fache gesteigert wird, zur Schlaganfallbehandlung intravenös appliziert.
Die intravenöse Darreichung dieser nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren für die Schlaganfallbehandlung hat sich bereits in klinischen Untersuchungen bestätigt, in denen DSPA - als Beispiel für diese Gruppe von Fibrinolytika - den Patienten intravenös verabreicht wurde und nur geringe Nebenwirkungen verursachte.
Diese Ergebnisse der klinischen Studien waren unerwartet, da bekannt war, dass die intravenöse Applikation von t-PA und anderen üblichen Fibrinolytika mit einem hohen zerebralen Blutungsrisiko verbunden ist (siehe oben).
Zur Verminderung intra-zerebraler Blutungen wurden in jüngster Zeit Strategien entwickelt, diese Substanzen nicht mehr intravenös, sondern intra-arte- riell über einen Katheter direkt nahe des intravaskulären Thrombus zu appli- zieren. Erfahrungen dazu liegen bereits mit der rekombinant erzeugten Urokinase vor (PROCAT als Studie mit Pro-Urokinase). Da diese Darreichungsform eine deutliche Reduzierung der Gesamtdosis erlaubt, wird dadurch eine Verminderung dosisabhängiger Nebenwirkungen - also auch der Hirnblutungen - erzielt. Den erheblichen Vorteilen der intra-arteriellen Applikation stehen aber zwei mögliche Nachteile gegenüber. So setzt sie einerseits eine zeitaufwendige Vorbereitung des Patienten voraussetzt, die zur Schlaganfallbehandlung innerhalb des zur Verfügung stehenden Zeitfensters von nur 3-Stunden nicht möglich ist. Andererseits kann damit zwar eine niedrigere Gesamtdosis erreicht werden. Lokal gelangt jedoch eine höhere Konzentration des Thera- peutikums in die arteriellen Endgefäße. Bei der aufgrund eines Schlaganfalls beschädigten Barrierefunktion des Gefäßendothels gelangt das Therapeuti- kum daher auch in lokal hohen Konzentrationen in die umliegenden Gewebe. Dort kann es dann ungewollte Nebenwirkungen verursachen.
Bei. der intravenösen Applikation würde die Konzentration des Therapeuti- kums im Gegensatz dazu durch den Zustrom von venösem Blut verdünnt. Somit ist die intra-arterielle Injektion bei gewebeschädigenden Therapeutika wie t-PA problematisch (Forth, Henschler, Rummel, Starke: „Pharmakologie und Toxikologie", 6. Auflage, 1992, S. 29).
Die eine intra-arterielle Applikation erschwerenden Limitierungen durch das enge Zeitfenster und die gewebeschädigenden Nebenwirkung liegen bei den erfindungsgemäß eingesetzten Plasminogen-Aktivatoren jedoch nicht vor. Somit stell die intra-arterielle Applikation aufgrund ihrer unbestreitbaren Vorteile (siehe oben) grundsätzlich eine für nicht-heurotoxische Plasminogen-Aktivatoren sehr erfolgsversprechende Darreichungsform dar. Es hätte somit nahegelegen, diesen Weg bei der Suche nach einer vorteilhaften Darreichungsform dieser Therapeutika zu beschreiten.
Gleichwohl hat die Anmelderin auch für die nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren auf die eher problematische intravenöse Applikation zurückgegriffen, sie sich allerdings überraschend als vorteilhaft erwies.
Mit der erfindungsgemäßen Darreichungsform wird darüber hinaus auch von einer gängigen therapeutischen Praxis abgewichen, bei der Proteine mit einem erhöhten immunogenen Potential in der Regel intramuskulär oder über eine Tropfinjektion intravenös appliziert werden. Damit wird ermöglicht, das Risiko eines Allergieschocks zu vermindern (Mebs: „Gifttiere", 2. Auflage, 2000).
Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Plasminogen-Aktivatoren handelt es sich - im Gegensatz zum körpereigenen t-PA - entweder um Fremdproteine tierischer Herkunft (siehe z.B. DSPA) oder um genetisch modifizierte körpereigene Proteine, die aufgrund ihrer strukturellen Änderungen neuartige Epitopen aufweisen. Die damit einhergehende Problematik allergischer Reaktionen - insbesondere bei Verabreichung hoher therapeutischer Dosen, wie sie üblicherweise bei der intravenösen Applikation erforderlich sind - stellt sich auch bei anderen aus Fremdproteinen bestehenden Fibrinolytika wie z.B. Streptokinase.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die erfindungsgemäß eingesetzten Plasminogen-Aktivatoren über eine Bolusinjektion (intravenöse Schnellinjektion) verabreicht, die auch als einmalige intravenöse Schnellinjektion mit der gesamten therapeutischen Dosis verabreicht werden kann.
Im Rahmen klinischer Studien wurde nachgewiesen, dass auch die intravenöse Verabreichung überraschend niedriger therapeutischer Dosen zu vorteilhaften Ergebnissen führt. Bevorzugte therapeutische Resultate wurden dabei beispielsweise mit Dosierungen zwischen 90 μg/kg und 230 μg/kg erzielt. Therapeutische besonders vorteilhafte Dosen lagen dabei bei 62,5 bis 90 μg/kg. Bei den untersuchten Patienten betrug die Zeitspanne zwischen dem Schlaganfall und der Verabreichung des Therapeutikums zwischen 3 und 9 Stunden. Mittels geeigneter Untersuchungsmethoden konnte das Einsetzen einer therapeutischen Wirkung ermittelt werden (s. Figuren 20 bis 29). DSPA sowie die übrigen nicht-neurotoxischen Plasminogen-Aktivatoren selber zeigen zwar keine neurotoxischen Nebeneffekte. Gleichwohl kann es vorteilhaft sein, sie zur Behandlung des Schlaganfalls in Kombination mit einem Neuroprotektivum zu verabreichen, um so die durch das körpereigene Glutamat anderenfalls verursachte Gewebeschädigung möglichst zu begrenzen. Dazu können den Glutamat-Rezeptor kompetitiv oder nicht-kom- petitiv hemmende Neuroprotektiva dienen. Sinnvolle Kombinationen sind dabei beispielsweise mit den bekannten Hemmstoffen der Glutamat-Rezeptoren des NMDA-Typus, des Kainsäure-Typs oder des Quisqualat-Typs möglich, so z.B. mit APV, APH, Phencyclidin, MK-801 , Dextrorphan oder Ketamin.
Ebenso kann eine Kombination mit Kationen vorteilhaft sein, da Kationen, insbesondere Zn-Ionen, den vom Glutamat-Rezeptor regulierten Kationenkanal blockieren und so die neurotoxischen Effekte reduzieren können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die nicht-neuoro- toxischen Plasminogen-Aktivatoren mit mindestens einem weiteren Thera- peutikum oder mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger kombiniert werden. Besonders vorteilhaft ist dabei die Kombination mit einem Thera- peutikum, das durch die Vitalisierung der Zellen die Gewebeschädigung vermeiden hilft, zu einer Regeneration des bereits geschädigten Gewebe beiträgt oder der Vermeidung nachfolgender Schlaganfälle dient. Vorteilhaft können z.B. Kombinationen mit Antibiotika wie Quinonen, Antikoagulantien wie Heparin oder Hirudin sowie mit Citicholin oder Aspirin sein.
Vorteilhaft kann zudem auch eine Kombination mit mindestens einem fhrombininhibitor sein. Vorzugsweise können, Thrpmbomodulin, Throm- bomodulinanaloga wie z. B. Solulin, Triabin oder Pallidipin eingesetzt wer^ den. Auch sind Kombinationen mit antiinflammatorischen Substanzen von Vorteil, die die Leukozyten Infiltration beeinflussen. Im folgenden soll die Applikationsart bzw. Darreichungsform gemäß der Erfindung anhand von konkreten Therapiebeispielen erläutert werden.
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VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN VON T-PA UND DSPA
A. Methoden
1. Tiere
Wildtypmäuse (c57/Black 6) und t-PA defiziente Mäuse (t-PA-/- Mäuse) (c57/ Black 6) (Carmeliet et al., 1994) wurden von Dr. Peter Carmeliet, Leuven, Belgien, zur Verfügung gestellt.
2. Protein Extraktion aus Gehirngewebe
Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität im Hirngewebe nach Infusion von t-PA oder DSPAαl erfolgte mittels zymographischer Analyse (Granelli- Piperno und Reich, 1974). Nach der 7-tägigen Infusionsdauer in den Hippocampus wurden die Mäuse betäubt, anschließend transcardial mit PBS perfundiert und die Gehirne entnommen. Die Hippocampus Region wurde entnommen, in Eppendorf Gefäße gegeben und in gleichen Volumina (w/v) (etwa 30-50 μl) mit 0.5% NP-40 Lyse Puffer ohne Protease-Inhibitoren (0.5% NP-40, 10 mM Tris-HCI pH 7.4, 10 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 1mM EDTA) inkubiert. Gehirn-Extrakte wurden mittels eines handbetriebenen Glass- Homogenisators homogenisiert und für 30 min auf Eis belassen. Die Proben wurden danach zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Die vorliegende Protein-Menge wurde bestimmt (Bio-Rad Reagenz). 3. Zymographische Analyse der Proteasen
Die proteolytische Aktivität in den Proben oder den Extrakten des Gehirngewebes wurde durch zymographische Analyse gemäß dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (1974) bestimmt. Dabei wurden die Proben des rekombinanten Proteins (bis zu 100 nmol) oder des Gehirngewebe-Extrakts (20 μg) einer 10%igen SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen unterzogen. Die Gele wurden aus den Platten entnommen, für zwei Stunden in 1% Triton X100 gewaschen und anschließend einem Agarosegel mit polymerisiertem Fibrinogen und Plasminogen aufgelegt (Granelli-Piperno und Reich, 1974). Die Gele wurden bei 37°C in einer Feuchtkammer inkubiert bis proteolysierte Zonen erkennbar wurden.
4. Intra-Hippocampus Infusion von t-PA, DSPA und anschließende Injektion von Kain-Säure
Das Kainsäure-Verletzungsmodell basiert auf dem Ansatz von Tsirka et al. (1995). Die Tiere wurden intraperitonal (i.p.) mit Atropin (4 mg/kg) injiziert, dann mit einer i.p. Injektion von Natrium Pentobarbital (70 mg/kg) betäubt. Anschließend wurden sie in einen stereotaktischen Rahmen eingesetzt, so daß eine mikroosmotische Pumpe (Alzet model 1007D, Alzet CA. USA) mit 100 μl PBS oder rekombinantem humanen t-PA (0.12 mg/ml; 1.85 μM) oder DSPAαl (1.85 μM) subkutan zwischen die Schulterblätter implantiert werden konnte. Die Pumpen wurden durch sterile Röhrchen mit einer Gehirn-Kanüle verbunden und durch eine Schädelöffnung an den Koordinaten bregma -2.5 mm, midolateral 0.5 mm und dorsoventral 1.6 mm eingesetzt, um die Flüssigkeit nahe der Mittellinie einzuführen. Die Kanüle wurde nachfolgend an der gewünschten Position festgeklebt und die Pumpen geöffnet, um die entsprechenden Lösungen bei einer Flußrate von 0.5 μl pro Stunde über sieben Tage zu infundieren. Zwei Tage nach der Infusion der Proteasen wurden die Mäuse erneut betäubt und in den stereotaktischen Rahmen eingebracht. 1.5 nmol Kainsäure in 0.3 μl PBS wurden anschließend unilateral in den Hippocampus injiziert. Die Koordinaten waren: bregma 2.5 mm, medial-lateral 1.7 mm und dorsoventral 1.6 mm. Das Exzitotoxin (KA) wurde über eine Dauer von 30 sec. zugeführt. Nach der Kainsäure-Behandlung verblieb die Nadel für weitere 2 min an diesen Koordinaten, um einen Rückfluß der Flüssigkeit zu verhindern.
5. Gehirn Untersuchung
Fünf Tage nach der KA Injektion wurde die Tiere betäubt und transkardial mit 30 ml PBS perfundiert, gefolgt von 70 ml einer 4% Paraformaldehydlö- sung, für 24 Stunden im gleichen Fixativ nachfixiert, gefolgt von einer Inkubation in 30% Sucrose für weitere 24 Stunden. Coronalschnitte (40 μm) des Gehirns wurden anschließend auf einem vereisbaren Microtom geschnitten, entweder mit Thionin (BDH, Australien) gegengefärbt oder für die immuno- histochemische Untersuchung vorbereitet.
6. Quantifizierung der neuronalen Verlustrate innerhalb des Hippocampus
Die Quantifizierung des neuronalen Verlusts in den CA1-CA3 Hippocampus Subfeldern wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (tsirka et al. 1995; Tsirka et al. 1996). Fünf aufeinander folgende Abschnitte des dorsalen Hippocampus aus allen behandelten Gruppen wurden vorbereitet, wobei die Abschnitte tatsächlich die Stelle der KA Injektion und das Gebiet der Läsion umfaßten. Die Hippocampus Subfelder (CA1-CA3) dieser Abschnitte wurden mittels Camera lucida Zeichnungen des Hippocampus verfolgt. Die Gesamtlänge dieser Subfelder wurde gemessen im Vergleich zu 1 mm Standards, die bei gleicher Vergrößerung verfolgt wurden. Die Länge der Gewebeabschnitte mit vitalen Pyramidenneuronen (mit normaler Morphologie) und die Länge der Gewebeabschnitte ohne Neuronen (keine Zellen anwesend, keine Thionin Färbung) wurde ermittelt. Die Längen, die intakte Neuronen und neuronale Verluste im Bereich jedes Hippocampus Subfeldes darstellten, wurden zwischen den Abschnitten gemittelt und die Standardabweichung bestimmt.
7. Intra-striatale NMDA Exzitoxizitäts-Läsionen mit oder ohne t-PA oder DSPA
Wildtypmäuse (c57/Black6) wurden betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen eingesetzt (s.o.). Die Mäuse erhielten anschließend eine unilaterale Injektion in das linke Stratum mit 50 nmol NMDA allein oder in Kombination mit 46 μM rt-PA oder 46 μM DSPAαl . Als Kontrolle wurden zudem t-PA und DSPAαl allein in einer Konzentration von 46 μM als Kontrollen injiziert. Die Injektions-Koordinaten waren: bregma -0.4 mm, midolateral 2.0 mm und dorsoventral 2.5 mm. Die Lösungen (1 μl Gesamtvolumen für alle Behandlungen) wurden über eine Zeitspanne von 5 Minuten bei 0.2 μl/min übertragen, wobei die Nadel weitere 2 min nach der Injektion am Injektionsort verblieb, um den Rückfluß von Flüssigkeit zu minimieren. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse betäubt und transkardial mit 30 ml PBS perfuii- diert, gefolgt von 70 ml einer 4% Paraformaldehydlösung, einer Nach-Fixie- rung für 24 Stunden im gleichen Fixativ, gefolgt von einer Inkubation in 30% Sucrose für weitere 24 Stunden. Coronalschnitte (40 μm) wurden dann auf einem vereisbaren Microtom geschnitten und auf Gelatine beschichtete Glasträger aufgelegt.
8. Quantifizierung des Läsionsvolumens nach der Injektion von NMDA
Die Quantifizierung des striatalen Läsionsvolumens wurde anhand der von Callaway et al. (2000) beschriebenen Methode durchgeführt. Dabei wurden 10 aufeinander folgende Coronalabschnitte vorbereitet, die das Gebiet der Schädigung umfaßten. Die geschädigte Region wurde anhand der Callaway Methode visualisiert und das Läsionsvolumen durch Verwendung eines Micro Computer Imaging Device (MCID, Imaging Research Inc., Brock .University, Ontario, Canada) quantifiziert.
9. Immunhistochemie
Die Immunhistochemie wurde nach Standardmethoden durchgeführt. Coro- nalsektionen wurden einer Immersion in einer Lösung aus 3% H2O2/10% Methanol für 5 min unterzogen, gefolgt von einer Inkubation mit 5% normal Ziegenserum für 60 min. Die Schnitte wurden dann über Nacht entweder mit einem anti-GFAP Antikörper (1:1,000; Dako, Carpinteria, Ca, USA) zum Nachweis von Astrocyten, mit einem anti-MAC-1 Antikörper (1:1,000; Sero- tec, Raleigh, NC, USA) zum Nachweis von Mikroglia oder polyclonalen anti- DSPA Antikörpern (Schering AG, Berlin) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit den passenden biotinylierten sekundären Antikörpern (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inkubiert. Darauf folgte eine abschließende Inkubation in einem Avidin/Biotin-Komplex (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) für 60 min vor der endgültigen Anfärbung mit 3,3'-Diaminobebzidin/0.03% H202. Die Schnitte wurden dann auf gelatinebeschichtete Träger übertragen, getrocknet, dehydriert und mit permount eingedeckelt.
10. Test auf Verstärkung durch NMDA-Injektion induzierter Gewebeschäden durch intravenöse Applikation von t-PA und DSPA
Zur Induktion von Gewebeschäden im Striatum wurden Mäuse stereotaktisch mit NMDA injiziert. 6 Stunden nach NMDA-Injektion wurden t-PA oder DSPA (100 μl; 10 mg/kg) durch Injektion in die Schwanz-Vene appliziert. Als Negativ-Kontrolle wurden 100 μl 0,9% NaCI injiziert und nachfolgend PBS infundiert. Nach weiteren 24 h wurden die Tiere getötet und das Ausmaß der neuronalen Gewebeschädigung bestimmt. In einem zweiten Versuchsansatz wurden Testgruppen mit bis zu 15 Mäusen entsprechend mit NMDA injiziert, t-PA oder DSPA 24 h nach Injektion von NMDA i.V. infundiert und die Verstärkung der Gewebeschädigung entsprechend bestimmt. Zum Nachweis von DSPA im Hirngewebe wurden Coronar-Schnitte mittels eines Anti-DSPA- Antikörpers nach Standardmethoden gefärbt.
B. Ergebnisse
1. Infusion von t-PA oder DSPA wird über den Hippocampus von t-PA -/- Mäusen verteilt und behält ihre proteolytische Aktivität
Die ersten Versuche wurden konzipiert, um zu bestätigen, daß sowohl DSPA als auch t-PA ihre proteolytische Aktivität über die 7-tägige Dauer der Infusion behalten. Zu diesem Zweck wurden Aliquots von t-PA und DSPA (100 nmol) sowohl bei 37°C als auch bei 30°C für sieben Tage in einem Wasserbad inkubiert. Um die proteolytische Aktivität zu bestimmen, wurden serielle 5-fache Verdünnungen der Proben einer SDS-PAGE mit nicht-reduzierenden Bedingungen unterworfen und die proteolytische Aktivität durch zymographische Analysen gemessen. Jeweils ein Aliquot von t-PA und DSPA, das während dieser sieben Tage eingefroren geblieben war, wurde als Kontrolle benutzt. Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, gab es nur einen geringen Verlust der DSPA- oder t-PA Aktivität, sowohl bei der Inkubation bei 25°C als auch bei 37°C über diesen Zeitraum.
2. t-PA und DSPA Aktivität ist auch in Hippocampus Extrakten von t-PA -/- Mäusen nach der Infusion auffindbar
Zunächst mußte festgestellt werden, daß die bei der Infusion verabreichten Proteasen überhaupt im Gehirn der behandelten Tiere vorhanden waren und auch dort ihre proteolytische Aktivität behielten. Dazu erhielten t-PA -/- Mäuse sieben Tage lang Infusionen mit t-PA oder DSPA (s.o.). Die Mäuse wurden anschließend durch transkardiale Perfusion mit PBS getötet, und die Gehirne entnommen. Die ipsϊlateralen und contralateralen Hippocampus Regionen wurden isoliert, ebenso eine Region des Cerebellums (als Negativ- Kontrolle). Gewebeproben (20 μg) wurden einer SDS-PAGE und zymo- graphischen Analyse gemäß der Beschreibung im Methodenteil unterworfen. Wie aus Figur 2 ersichtlich, wurden sowohl t-PA als auch DSPA Aktivitäten im ipsilateralen Bereich des Hippocampus gemessen, wobei außerdem etwas Aktivität auf der contralateralen Seite gemessen wurde. Dies zeigte, daß die infundierten Proteasen nicht nur ihre Aktivität im Gehirn behalten, sondern sich außerdem in der Hippocampus Region ausgebreitet hatten. Bei der Kontrolle wurde keine Aktivität in dem aus dem Cerebellum präparierten Extrakt nachgewiesen.
3. Immunhistochemischer Nachweis von DSPA
Um nachzuweisen, daß DSPA sich tatsächlich über die Hippocampus Region ausgebreitet hatte, wurden coronale Gehirnschnitte von t-PA -/- Mäusen nach DSPA-Infusion immunohistochemisch analysiert. Dabei wurde DSPA Antigen in der Hippocampus Region nachgewiesen, wobei die Umgebung der Infusionsstelle die stärkste Färbung aufwies. Dieses Ergebnis bestätigt, daß das infundierte DSPA löslich ist und tatsächlich im Hippocampus vorliegt.
4. DSPA-Infusion stellt die Sensitivität gegenüber Kainsäure-abhängi- ger Neurodegeneration in vivo nicht wieder her
t-PA -/- Mäuse sind resistent gegenüber Kainsäure-abhängiger Neurodegeneration. Dagegen führt eine Infusion von rt-PA in den Hippocampus zu einer vollständigen Wiederherstellung der Sensitivität gegenüber Kainsäure- abhängiger Schädigung. Zur Beantwortung der Frage, ob DSPA das t-PA in dieser Wirkung ersetzen kann, erhielten t-PA -/- Mäuse mittels einer mini- osmotischen Pumpe Infusionen mit t-PA öder DSPA in den Hippocampus. Für beide Gruppen wurden 12 Mäuse verwendet. Zwei Tage später erhielten die Tiere Injektionen von Kainsäure bei einer sich anschließenden Ruhephase. Fünf Tage danach wurden die Tiere getötet. Die Gehirne wurden entnommen und aufgearbeitet (s.o.). Als Kontrollen wurden außerdem t- PA -/- Mäuse vor der KA Behandlung mit PBS infundiert (n=3). Es wurden coronale Gehimschnitte präpariert und die Neuronen durch die Färbung nach Nissl detektiert. Es wurde deutlich, daß die t-PA -/- Mäuse nach Infusion von PBS resistent gegenüber KA waren. Dagegen führten Infusionen mit rekombinantem t-PA zur Wiederherstellung der Sensitivität gegenüber der Behandlung mit KA. Im Gegensatz dazu veränderte die Infusion der gleichen Konzentration an DSPA in die Hippocampus-Region die Sensitivität dieser Tiere gegenüber KA nicht (siehe Fig. 4a und. 4b).
Eine Quantifizierung dieser Ergebnisse erfolgte unter Verwendung von 12 Mäusen in jeder Gruppe. Bei 2 der 12 mit DSPA infundierten Mäusen beobachteten wir einige geringfügige Neurodegenerationen. Der Grund hierfür ist noch unklar und möglicherweise unabhängig von der Gegenwart von DSPA. Die kombinierten Daten berücksichtigen den geringfügigen Effekt, der bei diesen beiden Tieren beobachtet wurde. Alle 12 mit t-PA behandelten Mäuse waren empfindlich gegenüber der KA Behandlung. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei einer Infusion von t-PA oder DSPAαl in äquimolaren Konzentrationen nur die Gabe von t-PA zu einer Wiederherstellung der Sensitivität gegenüber KA-induzierter Neurodegeneration führt.
5. DSPA Infusion verursacht keine Mikroglia Aktivierung
Die Wiederherstellung der KA Sensitivität von t-PA -/- Mäusen nach t-PA Infusion resultiert nachweislich in einer Mikroglia-Aktivierung (Rogove et al., 1999). Um das Ausmaß der Mikroglia-Aktivierung nach t-PA- oder DSPA- Infusion und anschließender KA Behandlung zu bestimmen, wurden Coro- nal-Schnitte der Mäuse einer immunohistochemischen Färbung für aktivierte Microglia-Zellen unter Verwendung des Mac-1 Antikörpers unterworfen. Die Wiederherstellung der KA Sensitivität nach t-PA Infusion resultierte in einem klaren Anstieg der Mac-1 positiven Zellen. Dies wurde nicht bei den Mäusen beobachtet, die Infusionen mit DSPA erhalten hatten. Somit führt die Gegenwart von DSPA nicht zu einer Aktivierung von Mikroglia-Zellen nach KA Behandlung. 6. Titration von DSPA und t-PA in der Mäuse Hippocampus Region
Die Konzentration von t-PA, die für die Infusion benutzt wurde, basierte auf der von Tsirka et al (1995) beschriebenen Konzentration (100 μl von 0.12 mg/ml [1.85 μM]. Wir wiederholten die KA Belastungs-Experimente unter Verwendung einer 10-fach niedrigeren t-PA-Menge (0.185 μM) und einer höheren Menge an DSPA (18.5 μM). Die niedrigere t-PA-Konzentration war noch immer in der Lage, die Sensitivität gegenüber der KA-Behandlung wiederherzustellen (n=3). Von besonderem Interesse war, daß die Infusion der 10fach erhöhten DS PA-Konzentration nur geringen neuronalen Verlust nach KA Behandlung verursachte. Diese Daten weisen verstärkt darauf hin, daß DSPA die Sensitivität gegenüber KA nicht erhöht.
7. Auswirkung von t-PA und DSPA auf die NMDA-abhängige Neurodegeneration in Wildtypmäusen
Die Wirkungen von t-PA und DSPA wurden des weiteren in einem Modell der Neurodegeneration an Wildtypmäusen untersucht. Die Injektion von t-PA in das Striatum dieser Mäuse führt nachweislich zu einer Vertärkung der von dem Glutamat Analogen NMDA hervorgerufenen neurodegenerativen Effekte (Nicole et al., 2001).
Dazu wurden NMDA-Injektionen mit einem Gesamtvolumen von 1 μl in die Striatum Region von Wildtypmäusen in Gegenwart von t-PA oder DSPA (jeweils 46 μM) verabreicht. Nach 24 Stunden wurden die Gehirne entnommen und die Größe der Läsionen nach der Callaway Methode (Callaway et al., 2000) quantifiziert (s.o.). Wie aus Figur 7 ersichtlich, verursachte die Injektion von NMDA allein eine reproduzierbare Läsion bei allen behandelten Mäusen (n=4). Wurden t-PA und NMDA jedoch gemeinsam injiziert, nahm die Größe der Läsionen um etwa 50% zu (P<0.01, n=4). In deutlichem Gegensatz dazu verursachte die Co-Injektion von NMDA und der gleichen Konzentration von DSPA keinen Anstieg der Läsionsgröße im Vergleich zu NMDA allein.
Injektionen von t-PA oder DSPA allein führten nicht zu einer nachweisbaren Neurodegeneration. Die fehlende Wirkung von t-PA bei alleiniger Verabreichung ist konsistent mit den Ergebnissen von Nicole et al. (2001). Diese Daten zeigen, daß die Anwesenheit von DSPA die Neurodegeneration auch während eines neurodegenerativen Vorgangs nicht weiter erhöht.
Um zu bestätigen, daß sich die Injektion von DSPA tatsächlich in der Hippocampus Region ausgebreitet hat, wurden immunohistochemische Untersuchungen an Coronar-Schnitten unter Verwendung des DSPA Antikörpers durchgeführt. Untersuchungen zeigen, daß DSPA tatsächlich in die striatale Region eingedrungen ist.
Kinetische Analyse der Plasminogen Aktivierung durch indirekten Chromo- gen-Test
Indirekte chromogene Tests der t-PA-Aktivität verwenden die Substrate Lys- Plasminogen (American Diagnostica) und Spectrozyme PL (American Dia- gnostica) und wurden gemäß Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.-J., Sambrook J.F. (1989) Nature 339 721-724; Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J., Sambrook J.F. and Bassel-Duby R.S. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 3530-3533 sowie Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.J., Sambrook J.F. und Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem. 265, 21423-21426 durchgeführt. Tests wurden sowohl in der An- als auch der Abwesenheit des Co-Faktors DESAFIB (American Diagnostica) durchgeführt. DESAFIB, eine Präparation löslicher Fibrin- Monomere, wurde durch die Spaltung hochreinen humanen Fibrinogens durch die Protease Batroxobin gewonnen. Batroxobin spaltet dabei die Arg16-Gly17-Bindung in der Aα-Kette des Fibrinogens und setzt dabei Fibrinopeptid A frei. Das resultierende des-AA-Fibrinogen in Form von Fibrin I Monomeren ist in Anwesenheit des Peptids Gly-Pro-Arg-Pro löslich. Die Konzentration des Lys-Plasminogens wurde in Anwesenheit von DESAFIB von 0,0125 bis zu 0,2 μM variiert, in Abwesenheit des Co-Faktors von 0,9 bis 16 μM.
Indirekte Chromogen-Tests in Gegenwart verschiedener Stimulatoren
Indirekte chromogene Standardtests wurden gemäß der oben zitierten Veröffentlichungen durchgeführt. Dabei wurden Ansätze von 100 μl Gesamtvolumen mit 0,25-1 ng Enzym, 0,2 μM Lys-Plasminogen und 0,62 mM Spectrozym PL verwendet. Die Tests wurden in Anwesenheit von entweder Puffer, 25 μg/ml DESAFIB, 100 μg/ml Cyanogen Bromid Fragmenten von Fibrinogen (American Diagnostica) oder 100 μg/ml des stimulatorischen 13- Aminosäure-Peptids P368 durchgeführt. Die Analysen wurden in Mikrotiter- Platten durchgeführt und die optische Dichte bei 405 nm Wellenlänge 1 h lang alle 30 sec in einem "Molecular Devices Thermomax" gemessen. Die Reaktionstemperatur betrug 37 °C.
8. DSPA bewirkt auch bei intravenöser Applikation keine Verstärkung neuronaler Gewebeschäden
Durch Injektion von NMDA wurden im Striatum von Mäusen Gewebeschäden induziert und 6, bzw. 24 Stunden danach t-PA oder DSPA intravenös appliziert. Gegenüber einer Negativkontrolle zeigten die Versuchstiere bei einer i.V. Infusion von t-PA 24 Stunden nach NMDA- Injektion eine etwa 30%ige Vergrößerung des durch NMDA-Injektion geschädigten Gewebebereichs, während DSPA keine derartige Verstärkung der Gewebeschädigung verursachte (siehe Fig. 18). Durch Färbung von Coronar-Schnitten mit einem Anti-DSPA-Antikörper konnte nachgewiesen werden, dass das 24 Stunden nach NMDA-Injektion intravenös applizierte DSPA in die geschädigten Gewebebereiche eingedrungen war (siehe Fig. 19). Bei einer entsprechenden intravenösen Applikation von t-PA oder DSPA 6 h nach NMDA-Injektion war noch keine Vergrößerung des geschädigten Gewebebereichs festzustellen. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Blut-Hirnschranke zu diesem Zeitpunkt der t-PA- bzw. DSPA-Applikation noch eine hinreichende Barrierefunktion besaß. DSPA weist somit auch bei intravenöser Applikation keine neurotoxischen Nebenwirkungen auf.
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors, dessen Aktivität durch die Anwesenheit von Fibrin um das mehr als 650-fache gesteigert wird, zur Herstellung eines Therapeutikums zur intravenösen Applikation für die Behandlung des Schlaganfalls beim Menschen.
2. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch den Plasminogen Aktivierenden Faktor aus Desmodus rotundus (DSPA) oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz.
3. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivierende Faktor mindestens einen Histidin- oder Serin-Rest umfaßt, der gemeinsam mit einem Aspartatrest mindestens einen Teil einer Zymogentriade bildet.
4. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch
3, dadurch gekennzeichnet, daß der Serin-Rest an einer zu der Position 292, der Histidin-Rest an einer zu der Position 305 und der Aspartatrest an einer zu der Position 447 des t-PA zumindest homologen Position lokalisiert ist.
5. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch
4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivierende Faktor ausgewählt ist aus der Gruppe folgender Mutanten des t-PA: t- PA/R275E; t-PA/R275E, F305H; t-PA/R275E, F305H, A292S.
6. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen Aktivierende Faktor eine Punktmutation des Asp194 oder eines Aspartats in homologer Position aufweist, die die Stabilisierung der katalytisch aktiven Konformation des Plasminogen Aktivierenden Faktors bei Abwesenheit von Fibrin vermindert.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Asp194 durch Glutamat oder Asparagin substituiert ist.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, durch t-PA mit der Substitution Asp194 zu Glu194 oder Asn194.
9. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen Aktivierende Faktor wenigstens eine Mutation in seiner Autolyse-Schleife aufweist, die die Ausbildung von funktionellen Wechselwirkungen zwischen Plasminogen und Plasminogen-Aktivierendem Faktor bei Abwesenheit von Fibrin vermindert.
10. Verwendung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch mindestens eine Mutation in der Autolyse-Schleife in den Aminosäurepositionen 420 bis 423 des Wildtyp t-PA oder in dazu homologen Positionen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch eine Mutation ausgewählt aus der Gruppe folgender Mutanten: L420A, L420E, S421 G, S421 E, P422A, P422G, P422E, F423A und F423E.
12. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors mach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen Aktivierenden Faktor als Zymogen mindestens eine Punktmutation aufweist, die die Katalyse durch Plasmin verhindert.
13. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Punktmutation an den Positio- nen 15 oder 275 des t-PA oder dazu homologer Positionen lokalisiert ist.
14. Verwendung nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch Glutamat in der Position 15 oder 275.
15. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch einen Gewebe- Plasminogen-Aktivierenden Faktor mit einer Autolyse-Schleife mit His420, Asn421 , Ala422 und Cys423.
16. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Punktmutation in Position 194, die die Stabilisierung der katalytisch aktiven Konformation des Plasminogen-Aktivierenden Faktors bei Abwesenheit von Fibrin vermindert.
17. Verwendung nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch einen Gewebe-Plasminogen-Aktivierender Faktor mit Phe194.
18. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch einen Plasminogen Aktivierenden Faktor mit mindestens einer Punktmutation, die die Katalyse durch Plasmin verhindert.
19. Verwendung nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch einen Gewebe-Plasminogen-Aktivierender Faktor mit Glu275.
20. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch einen Gewebe- Plasminogen-Aktivierender Faktor mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 1.
21. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Urokinase mit einer Autolyse-Schleife mit Fal420, Thr421 , Asp422 und Ser423.
22. Verwendung nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch eine Urokinase mit einer Punktmutation in Position 194, die die Stabilisierung der katalytisch aktiven Konformation der Urokinase bei Anwesenheit von Fibrin vermindert.
23. Verwendung nach Anspruch 22, gekennzeichnet durch eine Urokinase mit Glu194.
24. Verwendung nach Anspruch 21 bis 23, gekennzeichnet durch eine Urokinase mit mindestens einer Punktmutation, die die Katalyse durch Plasmin verhindert.
25. Verwendung nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Urokinase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 2.
26. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Tropf infusion.
27. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Bolusinjektion.
28. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine einfache Bolusinjektion (single Bolus).
29. Verwendung einer Urokinase mit Ile275 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Schlaganfalls, dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase intravenös appliziert wird.
30. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorherigen Ansprüche zur therapeutischen Behandlung des Schlagan- falls beim Menschen nach Ablauf von drei Stunden seit Beginn des Schlaganfalls.
31. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorherigen Ansprüche zur therapeutischen Behandlung des Schlaganfalls beim Menschen nach Ablauf von sechs Stunden seit Beginn des Schlaganfalls.
32. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorherigen Ansprüche zur therapeutischen Behandlung des Schlaganfalls beim Menschen nach Ablauf von neun Stunden seit Beginn des Schlaganfalls.
33. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorherigen Ansprüche zur therapeutischen Behandlung von Schlaganfallpatienten mit zeitlich Ungewissem Beginn des Schlaganfalls.
34. Verwendung eines Plasminogen Aktivierenden Faktors nach einem der vorherigen Ansprüche zur Therapie von Schlaganfall unter Vermeidung der durch Wildtyp-t-PA verursachten Neurotoxizität.
35. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche enthaltend einen der in den vorherigen Ansprüchen genannten Plasminogen Aktivierenden Faktoren und mindestens einen weiteren therapeutisch wirksamen Bestandteil oder dessen pharmazeutisch verträgliches Salz.
36. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch .35, gekennzeichnet durch ein Neuroprotektivum.
37. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, gekennzeichnet durch einen Glutamat Rezeptor Antagonisten.
38. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 37, gekennzeichnet durch einen kompetitiven oder nicht-kompetitiven Antagonisten.
39. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzeichnet durch mindestens einen Thrombininhibitor, vorzugsweise aus der Gruppe folgender Substanzen: Thrombomodulin, Thrombomodulinana- loga, Triabin, Pallidipin oder Solulin.
40. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzeichnet durch mindestens ein Antikoagulans, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe folgender Antikoagulantien: Hirudin, Heparin, Aspirin oderAncrod.
41. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzeichnet durch antiinflammatorische Substanzen.
42. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzei- chet durch ein Antibiotikum.
43. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35, gekennzeichnet durch Citicholin.
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