JP2006525270A - 脳梗塞の処置のための非神経毒性プラスミノーゲン活性剤の静脈内注射 - Google Patents
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Abstract
Description
さまざまな臨床像が、臨床症状に関連した「脳梗塞」という用語にまとめられている。それぞれの病因によって、まず、これらの臨床像は、いわゆる虚血発作と出血性発作に区別することが可能である。
急性脳虚血の治療においては、生体機能の保全と生理的なパラメータを安定させること以外に、閉じた血管を再開させることが優先される。この再開は、さまざまな手段で行なうことができる。例えば、心臓発作後のPTCAなどのように、単なる機械的な再開は、今までのところ、満足の行く結果には至っていない。線維素溶解に成功することによってのみ、患者の健康状態を許容できるまで改善することができる。これは、カテーテルを用いる局所適用によって行うことができる(PROCAT、プロウロキナーゼを用いた研究)。しかしながら、最初に良好な結果が得られたにもかかわらず、この方法は薬品治療としてまだ公式には承認されていない。
(a)ストレプトキナーゼ)
急性脳梗塞を血栓溶解治療しようとした初期の試みは1950年代に遡る。β溶連菌由来の線維素溶解因子であるストレプトキナーゼを用いた最初の広範な臨床試験は1995年に始められたばかりである。ストレプトキナーゼは、プラスミノーゲンと一緒に、他のプラスミノーゲン分子をプラスミンに触媒する複合体を形成する。
あるいは、古典的な線維素溶解因子でもあるウロキナーゼを適用することもできる。ストレプトキナーゼとは対照的に、これは、様々な身体組織の中に存在する酵素であるため、抗原特性は示さない。それはプラスミノーゲンの活性化因子であって、補助因子には依存しない。ウロキナーゼは腎臓培養細胞において産生される。
血栓溶解療法に関する広範囲な実験結果が、組織型プラスミノーゲン活性化因子であって、組換えハムスター細胞で産生される、いわゆるrt−PA(欧州特許第0093619号、米国特許第4,766,075号)について利用可能である。90年代に、急性心筋梗塞を主な適応症として、t−PAを用いた世界規模の臨床試験がいくつか行なわれたが、一部理解できない矛盾した結果がもたらされた。いわゆる欧州急性脳梗塞試験(ECASS)では、脳梗塞の症状が発生した後6時間という時間枠内でrt−PAを静脈内に投与して患者を治療した。90日後に、患者の身体障害と治療とは無関係な生存率に関する指数として死亡率およびバーテル(Barthel)指数を調べた。生存率の有意な改善は報告されなかっただけでなく、有意とはいえなかったが、死亡率の増加が報告された。したがって、脳梗塞を発症した直後に各自の病歴によって個別に選抜された患者をrt−PAによって血栓溶解治療することが有利でありえると結論づけることができよう。しかし、脳梗塞を発症した後6時間という時間枠内でrt−PAを一般的に使用することは推奨されなかった。なぜなら、この時間内における適用が脳内出血(ICH)の危険を増加させるからである(C.Lewandowski C and Wiliam Barsan,2001:Treatment of Acute Stroke;in:Annals of Emergency Medicine 37:2; S.202ff.)。
(神経毒性および興奮毒性)
rt−PAの承認は1996年に得られた。その前の1995年に、t−PAのマイナスの副作用に関する最初の発表が知られるようになり、それらが、3時間という時間枠を外れて脳梗塞の治療に適用されたときの劇的効果に対する説明の根拠となっている。従って、海馬の小グリア細胞およびニューロン細胞が、グルタミン酸塩を介する興奮毒性に寄与するt−PAを生産する。このことは、t−PA欠乏マウスと野生型マウスのそれぞれの海馬にグルタミン酸アゴニストを注入したときの比較実験から結論されている。t−PA欠乏マウスは、外部から(くも膜下)に適用されたグルタミン酸に対して有意に高い抵抗性を示した(Tsirka SE et al.,Nature Vol.377,1995,”Excitoxin−induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator”)。これらの結果は、1998年になって、t−PAを静脈内注射するとt−PA欠乏マウスの壊死神経組織の量がほぼ2倍になることをWangらが証明できたときに確認された。野生型マウスに対する外部t−PAのこのマイナスの効果は、約33%にすぎなかった(Wang et al.,1998,Nature,”Tissue plasminogen activator(t−PA)increases neuronal damage after focal cerebral ischaemia in wild type and t−PA deficient mice”)。
代替的な治療法の検討は、現在、例えば、ヘパリン、アスピリン、または、マレーマムシ(Malayan pit viper)の毒から得られる活性物質であるアンクロド(ancrod)などの抗凝血剤に集中している。ヘパリンの効果を検討する、さらに2つの臨床試験(国際脳梗塞試験(IST)および急性脳梗塞治療におけるORG 10172の試験)が行われているが、有意な死亡率の改善または脳梗塞の予防を示していない。
脳梗塞を治療するためのプラスミノーゲン活性化因子は、その酵素活性がフィブリンによって、非常に選択的に何倍にも、すなわち、650倍以上に増加し、国際特許出願PCT/EP02/12204から知られている。なお、この文献の開示内容は、完全に参考文献に組み込まれる。
本発明の好ましい実施形態によれば、非毒性のプラスミノーゲン活性化因子であって、いわゆるシモゲントライアド(cymogene triade)の成分の少なくとも1つを含むものが用いられる。同等のトライアドは、アスパラギン酸194、ヒスチジン40およびセリン32の相互作用するアミノ酸からなるキモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼの触媒活性中心から知られている。しかし、このトライアドは、セリンプロテアーゼ同様キモトリプシンファミリーに属するt−PAには存在しない。それにもかかわらず、上記アミノ酸の一つ以上を適当な位置に導入する目的で、天然型t−PAを部位特異的に変異誘発すると、フィブリン存在下でプロ酵素(一本鎖t−PA)の活性が低下し、成熟酵素(二本鎖t−PA)の活性が上昇することが知られている。したがって、トライアドの、または、トライアド中でそれぞれの機能をもつアミノ酸のアミノ酸を一つ以上導入すれば、t−PAのシモゲン性(すなわち、成熟酵素とプロ酵素の活性の比率)を上昇させることができる。その結果、フィブリンの特異性が顕著に高まる。これは、導入されたアミノ酸残基および/または野生型配列のアミノ酸残基との立体構造的な相互作用によるものである。
吸血コウモリ(Desmodus rotundus)の唾液由来のプラスミノーゲン活性化因子(DSPA)も、フィブリン存在下で、非常に高い活性、具体的には100,000倍の増加を示す。したがって、本発明によって優先的に使用することができる。DSPAという用語は、4種類の異なったプロテアーゼであって、Desmodus rotundusに必要な機能を充足させるもの、すなわち、獲物の傷口からの出血を長引かせるプロテアーゼを含む(Cartwringht,1974)。これら4つのプロテアーゼ(DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ、DSPAγ)は、互いに、およびヒトt−PAに高い類似性(相同性)を示す。また、それらは、類似した生理活性を示し、総称であるDSPAに一般的に分類された。DSPAは、欧州特許第0352119A1号ならびに米国特許第6,008,019号および第5,830,849号に開示されているので、開示の目的で、その全文を本明細書に参照してと組み込む。
この新しい教示は、いわゆるカイニン酸モデルおよび線条体のNMDA誘導による損傷実験用モデルを用いて行われる、一方ではt−PAの、他方ではDSPAの神経変性作用のインビボにおける比較実験に基づいている。
DSPA、およびその他の非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子に神経毒性がないこと(上記参照)は、これらのプラスミノーゲン活性化因子の使用が、野生型のt−PAとは対照的に、脳梗塞発症後最長でも3時間という短い時間に制限されないという、脳梗塞の治療における利点を提供する。それどころか、興奮毒性反応を刺激するリスクがほとんどないため、遅くなっても、例えば、6時間以上経過した後でも治療を開始することができる。DSPAによる最初の臨床試験で、脳梗塞症状が発現してから6から9時間にわたる時間的範囲でも、患者を安全に治療できることが証明される。
すでに確立されている脳梗塞治療剤rt−PAとは対照的に、非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子による脳梗塞治療についての可能な適用方式に関して利用可能な有効な情報はまだない。
(A.方法)
(1.動物)
野生型マウス(c57/Black6)およびt−PA欠乏マウス(t−PA−/−マウス)(c57/Black6)(Carmeliet et al.,1994)をベルギー国ルーバン(Leuven, Belgium)のPeter Carmeliet博士から入手した。
t−PAまたはDSPAのいずれかを注入した後の脳組織における蛋白質分解活性の測定をザイモグラフ解析によって行った(Granelli−Piperno and Reich,1974)。7日間にわたって海馬に注入した後、マウスを麻酔してから、PBSで経心臓的に灌流してから脳を切除した。海馬領域を取り出して、エッペンドルフチューブに移して、プロテアーゼインヒビターを含まない0.5%NP−40溶解用バッファーの等量液(w/v)(約30−50μm)(0.5%NP−40,10mM Tris−HCl pH7.4,10mM NaCL,3mM MgCl2,1mM EDTA)中でインキュベートした。手動式のガラス製ホモジナイザーで脳抽出物をホモジナイズし、氷上に30分間放置した。そして、サンプルを遠心分離して、上清を取り出した。存在する蛋白質の量を測定し(Bio−Rad−reagent)。
Granelli,Piperno and Reich(1974)の方法に従い、ザイモグラフ解析によってサンプルおよび脳組織抽出物における蛋白質分解活性を測定した。組換え蛋白質(最大100nM)または脳組織抽出物(20μg)を含むサンプルに、非還元条件下で(10%)SDS−PAGEを行った。ゲルをプレートから取り出して、1%トリトン×100で2時間洗浄してから、重合されたフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンを含むアガロースゲルの上に重ねた(Granelli,Piperno and Reich,1974)。このゲルを、蛋白質分解ゾーンが現れるまで加湿チャンバーにおいて37℃でインキュベートした。
カイニン酸損傷モデルは、Tsirka et al.(1995)の研究に基づいていた。動物にアトロピン(4 mg/kg)を腹腔内(i.p.)注射した後、ペントバルビタール・ナトリウム(70 mg/kg)のi.p.注射によって麻酔した。その後、マウスを定位固定式の枠に置いて、100μlのPBSまたは組換えヒトt−PA(0.12mg/ml,1.85μM)またはDSPAα1(1.85μM)のいすれかを含む小型浸透圧ポンプ(Alzet model 1007D,Alzet CA.USA)を肩胛骨の間の皮下に埋め込んだ。このポンプを、無菌チューブを経由して脳カニューレに接続してから、正中部付近にある液体を導入するため、ブレグマ方向に−2.5mm、内外方向に0.5mm、また背腹方向に1.6mmという座標で頭蓋骨に作ったギザギザの開口部を通して挿入した。カニューレを所望の位置に固定して、ポンプからそれぞれの溶液を1時間あたり0.5μlという速度で、全部で7日間注入した。
KA注射から5日後に、動物を麻酔して、30mlのPBSで、その後70mlの4%パラホルムアルデヒド溶液で経心臓的に灌流して、同じ固定液で後固定した後、30%ショ糖液でさらに24時間インキュベートした。そして、凍結ミクロトーム上で脳の冠状断面(40μm)を切り出し、チオニン(BDH、Australia)で対比染色するか、後述するような免疫組織化学的検査を行うために処理した。
CA1〜CA3の海馬亜領域における神経細胞脱落の定量を既述されている通りに行った(Tsirka et al.,1995;Tsirka et al.,1996)。すべての処理群から背側海馬の連続した5つの部分を、その部位が、CA注射した場所と損傷領域を実際に含むように注意しながら調製した。これらの切片の海馬亜領域(CA1〜CA3)を、海馬のカメラルシーダ画像法によってトレースした。これら亜領域の全長を、同じ倍率下で、1mm基準で比較して測定した。生きた錐体神経(正常な形態を有する)をもつ組織の長さと、神経細胞のない(細胞がなく、チオニン染色されない)組織の長さを測定した。各海馬亜領域にわたる完全な神経細胞および神経細胞脱落を示す長さを、切片の全域について平均して、標準偏差を決定した。
野生型マウス(c57/Black6)を麻酔して、定位固定式の枠に入れた(上記参照)。そして、左側の線条体に50nmolのNMDAを片側的に、単独、または46μMのrt−PAまたは46μMのDSPAα1と併用して注射した。対照として、t−PAおよびDSPAも単独で注射した(どちらも濃度46μM)。注射した座標は、ブレグマ方向に−0.4mm、内外方向に2.0mm、また背腹方向に2.5mmであった。溶液(すべての処置につき全量で1μl)を5分間にわたって0.2μl/分の速度で移動させ、注射後さらに2分間、針をそのままにして、液体が逆流するのを抑えた。24時間後、マウスに麻酔をかけ、30mlのPBS、その後70mlの4%パラホルムアルデヒド溶液で経心臓的に灌流して、同じ固定液で24時間後固定した後、30%ショ糖液でさらに24時間インキュベートした。そして、凍結ミクロトーム上で脳を切り出し(40μm)、ゼラチンコートしたスライドガラスにマウントした。
Callaway et al.(2000)によって記載された方法を用いて、線条体損傷容量の定量を行った。損傷された領域にまたがる10個の連続した冠状断面を調製した。Callaway法を用いて、損傷された領域を可視化し、マイクロコンピュータ画像化装置(MCID,Imaging Research Inc.,Brock University,Ontario,Canada)によって損傷量を定量した。
標準的な方法を用いて免疫組織化学法を行った。冠状断面を3%H2O2および10%メタノールの溶液に5分間浸した後、5%の正常なヤギ血清中で60分間インキュベートした。切片を、星状細胞を検出するための抗GFAP抗体(1:1,000;Dako,Carpinteria,CA.,USA)、小グリア細胞を検出するための抗MAC−1抗体(1:1,000;Serotec,Raleigh,N.C.,USA)、または、ポリクローナル抗体である抗DSPA抗体(Schering AG,Berlin)のいずれかとともに一晩インキュベートした。洗浄した後、切片を、適当なビオチン化二次抗体(Vector Laboratories,Burlingame,CA.,USA)とともにインキュベートした。その後、3,3’−ジアミンベブシジン(diaminebebcidine)/0.03%H2O2で可視化するまえに、最後にアビジン/ビオチン複合体とともに60分間インキュベートした。そして、切片をゼラチンコートしたスライドにマウントして、乾燥、脱水し、パーマウントでカバースリップをのせた。
線条体内に組織損傷を生じさせるために、マウスを定位固定してNMDAを注射した。NMDAを注射してから6時間後、t−PAまたはDSPA(100μl;10mg/kg)を尾静脈から注射した。対照として、100μlの0.9%NaClを注射した後、PBSを注入した。28時間後、動物を殺して損傷量を測定した。
(1.t−PAまたはDSPAを注入すると、t−PA−/−マウスの海馬に分散し、蛋白質分解活性を保持する)
t−PAおよびDSPAがともに、7日間の注入期間の間蛋白質分解活性を保持することを確認するために最初の実験を設計した。この目的で、t−PAおよびDSPAの等量液(100nmol)を湯浴槽中37℃および30℃でインキュベートした。蛋白質分解活性を測定するために、プローブの5倍段階希釈液について、非還元的条件下でSDS−PAGEを行って、ザイモグラフ解析によって蛋白質分解活性を測定した。7日間凍結しておいたt−PAおよびDSPAの等量液を対照として使用した。図1から分かるように、この時間内では、25℃でインキュベートしても、37℃でインキュベートしても、t−PAまたはDSPAの活性はわずかに失われただけであった。
まず、注入を受けた動物の脳の中に注入されたプロテアーゼが存在していて、また、このコンパートメントに存在する間、蛋白質分解活性を保持していることを確認する必要があった。この点を扱うために、t−PA−/−にt−PAまたはDSPAのいずれを7日間注入した(上記参照)。そして、マウスを、PBSで経心臓的に灌流し、脳を取り出した。同側および対側にある海馬領域と、小脳の一領域(陰性対照として)とを単離した。方法の部の記載に従って、組織サンプル(20μg)に対してSDS−PAGEおよびザイモグラフ解析を行った。図2から分かるように、t−PAおよびDSPAの活性は両方とも、海馬の同側領域で検出され、一方、対側でもいくらかの活性が検出された。このことは、注入されたプロテアーゼが、脳の中で活性を保持しただけでなく、海馬領域内にさらに分散したことを示している。対照として、小脳から調製された抽出物では活性を検出できなかった。
DSPAが海馬領域に確かに分散したことを確認するために、DSPA注入後、t−PA−/−マウスの脳の冠状断面を免疫組織化学的に解析した。DSPA抗原が、海馬領域において、注入部位領域で最も顕著な染色を示して検出された。この結果は、注入されたDSPAが可溶性であり、実際に海馬に存在することが確認するものである。
特徴的なことに、t−PA−/−マウス徴は、カイニン酸(KA)が介在する神経変性に耐性である。しかし、rt−PAの海馬内注入によって、KA介在型損傷に対する感受性が完全に回復される。このモデルにおいて、DSPAがt−PAに代用しうるか否かを判定するために、ミニ浸透圧ポンプを用いて、t−PA−/−マウスの海馬内にt−PAまたはDSPAを注入した。両群につき12匹のマウスをテストした。2日後、動物にカイニン酸を注射して、回復させた。5日後、動物を殺して、脳を取り出して調製した(上記参照)。対照として、t−PA−/−マウスに、KA処理する前にPBSを注入した(N=3)。
t−PA注入によってもたらされた、t−PA−/−マウスのKA感受性の回復は、小グリア活性化ももたらす(Rogove et al,1999)。t−PAまたはDSPAの注入、およびその後KA処理した後の小グリア活性化の程度を測定するために、Mac−1抗体を用いて、マウスの冠状断面に対し、活性化小グリア細胞のため免疫組織化学染色を行った。t−PA注入後にKA感受性を回復した結果、Mac−1陽性細胞が明らかに増加した。これは、DSPAを注入されたマウスでは観察されなかった。したがって、DSPAが存在しても、KA処理の後に小グリア細胞を活性化させる結果とはならない。
注入に使用したt−PAの濃度は、Tsirka et al.(1995)に記載されている濃度(0.12mg/mlを100μl[1.85μM]).10倍低いt−PA(0.185μM)および10倍高いDSPA量(18.5μM)を用いて、KA損傷実験を反復した。低t−PA濃度でも、なお、KA処理に対する感受性を回復することができた(n=3)。特に興味があるのは、10倍高いDSPA濃度を注入すると、KA処理後わずかな神経細胞脱落が起きるという発見である。これらのデータは、DSPAが、KAに対する感受性を増強させないことを強く示している。
t−PAおよびDSPAの効果も、野生型マウスにおける神経変性のモデルにおいて調べた。これらマウスの線条体にt−PAを注入すると、グルタミン酸の類似化合物であるNMDAによって引き起こされる神経変性作用が明らかにもたらされた(Nicole et al.,2001)。
t−PA活性の間接的な色原体テストを、Madisan E.L.,Goldsmith E. J., Gerard R. D., Gething M.−J., Sambrook J.F.(1989)Nature 339 721−724;Madison E.LO.,Goldsmith E.J.,Gething M.J.,Sambrook J.F.and Bassel−Duby R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87,3530−3533、また、Madison E.L.,Goldsmith E.J.,Gething M.J.,Sambrook J.F.and Gerard R.D.(1990)J.Biol.Chem 265,21423−21426に記載されている基質であるLys−プラスミノーゲン(American Diagnostica)およびスペクトロザイム(spectrocyme)PL(American Diagnostica)を用いて行った。試験は、補助因子であるDESAFIB(American Diagnostica)の存在下および非存在下で行った。DESAFIBは、非常に純度の高いヒトフィブリノーゲンをプロテアーゼであるバトロキソビンで切断して得られる可溶性フィブリンモノマー製剤である。バトロキソンビンは、フィブリノーゲンのAα−鎖中のArg16−Gly17結合およびそのためにリリースfibrinopeptid AのA.alpha。鎖の中のArg.sup.16−Gly.sup.17結合を切断して、線維素ペプチドAを放出する。その結果得られる、フィブリンIモノマーを代表するdes−AA−フィブリノーゲンは、ペプチドGly−Pro−Arg−Proがなければ可溶性である。Lys−プラスミノーゲンの濃度は、DESAFIB存在下では、0.0125から0.2μMまで変化させ、補助因子の非存在下では、0.9から16μMまで変化させた。
上記引用した刊行物に従って、間接的色原体試験を行った。0.25〜1ngの酵素、0.2μMのLys−プラスミノーゲン、および0.62mMのスペクトロザイムPLを含む全量で100μlのプローブを用いた。試験は、バッファー、25μg/mlのDESAFIB、100μg/mlのフィブリノーゲンの臭化シアンフラグメント(American Diagnostica)、または100μg/mlの刺激性13アミノ酸ペプチドP368のいずれかの存在下で行った。解析は、マイクロタイタープレートの中で行い、光学密度を、「Molecular Devices Thermomax」において、405nmの波長で30秒ごと、1時間測定した。反応温度は37℃であった。
マウスの線条体では、NMDAを注射してから、6時間または24時間後にt−PAまたはDSPAを静脈内適用しても、組織損傷は誘導されなかった。陰性対照と比較して、NMDAを注射してから24時間後にt−PAを静脈内注入液として投与すると、実験動物は、NMDA注射によって、約30%の損傷組織面積の増加を示したが、これは、組織損傷をそのようには増加させなかったDSPAとは対照的であった(図18参照)。抗DSPA抗体を用いた冠状断面の染色により、NMDAを注射してから24時間後にt−PAを静脈内注入液として投与すると、損傷組織の面積内へ浸透したことを検出することは、可能であった(図19参照)。同じように、NMDAを注射してから6時間後にt−PAまたはDSPAを静脈内適用した場合には、損傷組織の面積の増加は今のところ検出されていない。これは、t−PAまたはDSPAを適用した時点では、血液脳関門が、まだ十分な障壁機能を提供していたというのが理由かもしれない。このように、静脈内適用する場合には、DSPAも神経毒副作用を示さない。
Claims (43)
- プラスミノーゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノーゲン活性化因子の活性が、脳梗塞を治療するための静脈内適用可能な薬物を製造するためにフィブリン存在下で少なくとも650倍増強される、プラスミノーゲン活性化因子の使用。
- Desmodus rotundusのプラスミノーゲン活性化因子(DSPA)またはその薬学的に受容可能な塩の使用を特徴とする、請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、アスパラギン酸残基とともに、シモゲントライアドの少なくとも一部を形成する、少なくともヒスチジン残基またはセリン残基を含む、請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記セリン残基が、t−PAの292位と少なくとも部分的に相同な位置に位置し、前記ヒスチジン残基が、t−PAの305位と少なくとも部分的に相同な位置に位置し、そして前記アスパラギン酸残基が、t−PAの447位と少なくとも部分的に相同な位置に位置している、請求項3に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、以下のt−PA変異体:t−PA/R275E;t−PA/R275E、F305H;t−PA/R275E、F305H、A292Sの群から選択される、請求項4に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、Asp194または相同な位置にあるアスパラギン酸の点変異を有し、該点変異が、フィブリンの非存在下でプラスミノーゲン活性化因子の触媒活性立体構造の安定性を低下させる、請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- Asp194が、グルタミン酸またはアスパラギンによって置換されている、請求項6に記載の使用。
- ASP194の、Glu194またはAsn194による置換を含む、請求項7に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、その自己分解ループの中に少なくとも1つの変異を含み、該変異が、フィブリンの非存在下でプラスミノーゲンとプラスミノーゲン活性化因子との間の機能的な相互作用を低下させる、請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記自己分解ループにおける少なくとも1つの変異が、野生型t−PAのアミノ酸位置420〜423または相同な位置に影響を与える、請求項8に記載の使用。
- 前記変異が、以下の変異体:L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423AおよびF423Eからなる群から選択される、請求項9に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、プラスミンによる触媒を防げる少なくとも1つの点変異を含むシモゲンである、請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記点変異が、t−PAの15位もしくは275位、またはそれと相同な位置に位置する、請求項11に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- グルタミン酸が、前記15位または275位に位置する、請求項12に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化が、His420、Asn421、Ala422およびCys423を含む自己分解ループを含む、請求項1に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、フィブリンの非存在下で該プラスミノーゲン活性化因子の触媒活性立体構造の安定性を低下させる194位における点変異を特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、Phe194を特徴とする、請求項15に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、プラスミンによる触媒を防げる少なくとも1つの点変異を特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子がGlu275を含む、請求項17に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性化因子が、Val420,Thr421,Asp422およびSer423を含む自己分解ループを有するウロキナーゼである、請求項20に記載の使用。
- 前記ウロキナーゼが、フィブリンの非存在下でウロキナーゼの触媒活性立体構造の安定性を低下させる194位における点変異を特徴とする、請求項20に記載の使用。
- 前記ウロキナーゼが、Glu194を含む、請求項21に記載の使用。
- 前記ウロキナーゼが、プラスミンによる触媒を防げる少なくとも1つの点変異を特徴とする、請求項20〜22のいずれか一項に記載の使用。
- 前記プラスミノーゲン活性剤が、配列番号2に記載の配列を含む、請求項1に記載の使用。
- 点滴を特徴とする、請求項1〜25のいずれか一項に記載の使用。
- ボーラス注射を特徴とする、請求項1〜26のいずれか一項に記載の使用。
- 単回ボーラス注射を特徴とする、請求項26に記載の使用。
- 脳梗塞を治療するための薬物を製造するためにILE275を含むウロキナーゼの使用であって、該ウロキナーゼが静脈内注射される、使用。
- 脳梗塞発症の少なくとも3時間後に、ヒトにおいて脳梗塞を治療的処置するための、請求項1〜29のいずれか一項に記載の使用。
- 脳梗塞発症の少なくとも6時間後に、ヒトにおいて脳梗塞を治療的処置するための、請求項1〜30の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 脳梗塞発症の少なくとも9時間後に、ヒトにおいて脳梗塞を治療的処置するための、請求項1〜31の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 前記脳梗塞の発症が時間的には正確に決められない脳梗塞患者を治療的処置するための、請求項1〜32の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 野生型t−PAの神経毒性を回避しつつ脳梗塞を治療するための、請求項1〜33の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
- 請求項1〜34の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子、および少なくとも1つのさらなる薬学的活性成分またはその薬学的に受容可能な塩を含有する薬学的組成物。
- 神経保護剤を特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
- グルタミン酸レセプターアンタゴニストを特徴とする、請求項35に記載の薬学的組成物。
- 競合的アンタゴニストまたは非競合的アンタゴニストを特徴とする、請求項36に記載の薬学的組成物。
- 以下の物質:トロンボモジュリン、トロンボモジュリンアナログ、トリアビン、パリジピン、またはソルリンの群から優先的に選択される、少なくとも1つのトロンビンインヒビターを特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
- 以下の抗凝血剤:ヒルジン、ヘパリン、アセチルサリチル酸またはアンクロドの群から優先的に選択される、少なくとも1つの抗凝血剤を特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
- 抗炎症物質を特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
- 抗生剤を特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
- シチコリンを特徴とする、請求項34に記載の薬学的組成物。
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