DK176140B1 - Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer - Google Patents

Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer Download PDF

Info

Publication number
DK176140B1
DK176140B1 DK198903575A DK357589A DK176140B1 DK 176140 B1 DK176140 B1 DK 176140B1 DK 198903575 A DK198903575 A DK 198903575A DK 357589 A DK357589 A DK 357589A DK 176140 B1 DK176140 B1 DK 176140B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
gly
ser
leu
thr
cys
Prior art date
Application number
DK198903575A
Other languages
English (en)
Other versions
DK357589D0 (da
DK357589A (da
Inventor
Paul A Friedman
George E Mark
Le Thi Duong
Stephen J Gardell
John W Jacobs
Richard A F Dixon
Bruce L Daugherty
Original Assignee
Schering Ag Patentabteilung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Ag Patentabteilung filed Critical Schering Ag Patentabteilung
Publication of DK357589D0 publication Critical patent/DK357589D0/da
Publication of DK357589A publication Critical patent/DK357589A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK176140B1 publication Critical patent/DK176140B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

DK 176140 B1 I 2 3 4 FI6.1 4 DK 176140 B1
Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer
Vampyr-flagermus er absolut afhængige af en føde af frisk blod, som de opnår ved at tilføje deres offer et sår. Om end disse sår 5 er overfladiske, fortsætter de med at sive med blod i en periode på adskillige timer.
Komponenter i vampyr-flagermusespyt fra Desmodus rotundus blev undersøgt og viste sig at interferere med den hæmostatiske meka-10 nisrae i pattedyrblod på tre forskellige niveauer. De viste sig at hæmme blodpladeaggregation og aktivere plasminogen (Hawkey, C.Μ., Mature, 211:434 (1966) og Hawkey, C.M., Br. J. Haematol., 13:1014 (1967)). Hver af disse funktioner var forbundet med en særskilt proteinfraktion. Den fraktion, som aktiverede plasminogen, blev 15 kaldt "desmokinase" (Hawkey, C.M. Nature). Cartwright, T., Blood, beskriver oprensningen af desmokinase fra Desmodus-spyt og foreslog, at den var mere effektiv end urokinase (UK) og streptokinase ved lysering af på forhånd dannede klumper af størknet blod.
20 Materialet forårsager hurtig lysering af såvel plasminogenrige klumper af størknet blod som fibrinplader. Materialet er inaktivt, når det anvendes på fibrinplader uden aktiv plasminogen.
Materialet er i stand til at forårsage hurtig lysering af klumper 25 af helblod. Forfatteren antog, at der ikke er andre proteolytiske proteiner til stede. Casein-testen med to trin er ubrugelig til r karakterisering. Der er forskelle mellem den måde, hvorpå materi alet reagerer, og den mekanisme, ved hvilken urokinase er i stand til at aktivere plasminogen.
30
Der er ingen teknisk lære for isolering, rensning og karakterisering af et trombolytisk middel i T. CARTWRIGHTS publikation. Den af T. CARTWRIGHT anvendte teknik omfatter en gelfiltrering, der 2 DK 176140 B1 giver urent materiale. De fundne midler er beskrevet i en negativliste, der viser, hvilke funktioner materialet ikke har, og hvilke træk, materialet mangler.
5 Anvendelsen af vævstype-plasminogenaktivator (tPA) som et throm-bolytisk middel er forbundet med en række ulemper, herunder alvorlige blødningskomplikationer, en forholdsvis hyppig forekomst af gentilstopning, en manglende evne til ensartet effektivitet og følsomhed over for inaktivering af plasminogen-aktivatorhæmmere, 10 såsom type 1 plasminogen-aktivatorhæmmer (PAI-1) (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, bind 14, nr. 1 (1988)).
Blødningskomplikationer, som er resultatet af thrombolytisk terapi, formodes at skyldes eller i det mindste forværres ved aktive-15 ringen af cirkulerende plasminogen. tPA's evne til at bindes til fibrin formodes at være ansvarlig for dets udprægede substratpræference for fibrin-bundet plasminogen. Ikke desto mindre har teoretiske overvejelser og resultater af kliniske undersøgelser vist, at de hævede niveauer af tPA, som er nødvendige for hurtig 20 opløsning af klumper af størknet blod, også fremkalder aktivering af væsentlige mængder af cirkulerende plasminogen.
Endvidere formodes det, at tPA's vekselvirkning med plasma-hæmmere svækker tPA's funktionelle aktivitet under og efter infu-25 sion, hvilket potentielt kan bidrage til gentilstopning.
En yderligere ulempe, der er forbundet med at anvende tPA som et thrombolytisk middel, er at den krævede dosis af tPA er meget stor, mellem 100 og 150 mg, hvilket gør denne terapeutiske be-30 handling meget dyr.
Vi har fundet plasminogen-aktivatorer i spyt og spytkirtler fra . Desmodus rotundus, hvilke plasminogenaktivatorer udviser en mar- 3 DK 176140 B1 kant større selektivitet over for fibrin-bundet plasminogen og derfor kan være forbundet med et nedsat omfang og en nedsat frekvens af blødningsdiatese, når de anvendes til thrombolytisk terapi. Endvidere inaktiveres aktivatorerne ikke let med plasma-5 hæmmere, såsom PAI-1, og de kan derfor være forbundet med en lavere frekvens af gentilstopning.
Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe fibrinolytiske midler, der er bedre end tPA med hensyn til både 10 sikkerhed og virkningsfuldhed.
Det er også et formål med den foreliggende opfindelse at identificere DNA-sekvenser, der koder for proteiner ifølge den foreliggende opfindelse, tilpasse sekvenserne fra vævsafledt cDNA og 15 indsætte sekvenserne på funktionsdygtig måde i ekspressionsvektorer .
Det er også et formål med den foreliggende opfindelse at fremstille proteiner ifølge den foreliggende opfindelse ud fra værts-20 mikroorganismer eller eukaryote celler, som med ekspressionsvektorer er blevet transformeret til at producere proteinet.
Det er også et formål med den foreliggende opfindelse at fremstille antistoffer, der reagerer med proteiner ifølge den fore-25 liggende opfindelse.
Opfindelsen angår et glycosyleret eller uglycosyleret plasmino-gen-aktiverende protein, der har mindst 90% homologi med følgende aminosyresekvens: 30 L - ----------- 4 DK 176140 B1
Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin
Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser 5 Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr
Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr
Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp
Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser
Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser
Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin 10 Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser
His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg
Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile
Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin
Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly
Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr ^ Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp
Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu
Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser
Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu
Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 2q His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys
Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr
Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met
Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro
Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro
Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly 25 Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile
Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp
Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro hvori proteinet kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasminogen. Denne sekvens står for Bat-PA(L).
30
Endvidere angår opfindelsen et glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90S homologi med følgende aminosyresekvens: 5 DK 176140 B1
Met val Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu
Thr Tyr Arg Gin Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly
Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin
Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys
Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin
Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg
Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe
Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly
Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys
Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser
Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu
Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala
Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn
Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr val Ile Lys
Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val
Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu
Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile
Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn
Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile
Leu.Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val
Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu
Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu
Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu
Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser
Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu
Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr
Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin
Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg
Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys
Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile
His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly
Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu
Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys
Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 6 DK 176140 B1 hvori proteinet kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasminogen. Denne sekvens står for Bat-PA(H) plus signalsekvensen.
Endnu en udførelsesforn» for opfindelsen er et glycosyleret eller 5 uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90% homolog! med følgende aminosyresekvens:
Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met
Ile Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val
Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly
Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser
Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala
Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly
Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr
Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp
Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn
Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg
Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr
Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr
Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser
Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys
Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe
Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala ile Phe
Ala Gin Asn Arg. Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys
Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala
Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu
Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly
Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val
His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile
Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala
Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu
Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu
Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr
Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro 7 DK 176140 B1
Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr
Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser
Gly Glu Ile His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His
Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys 5 Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro hvori proteinet kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasminogen. Denne sekvens står for Bat-PA(H).
10 Endnu en udførelsesform for opfindelsen er et glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90% homologi med følgende aminosvresekvens:
Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly 15
Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val
Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu
Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val
Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala
Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg
Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly
Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn
Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe
Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala
Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His
Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro
Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser
Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg
Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr
Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu
Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp
Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser
Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg
Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp
Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys
Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly 8 DK 176140 B1
His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys
Phe Lea Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys
Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Val
His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile ® Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg
Asp Asn Met Arg Pro hvori proteinet kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasmi-10 nogen. Denne sekvens står for Bat-PA(I).
De plasrainogen-aktivatorproteiner, som isoleres fra vampyr-flagermus-spyt og -spytkirtler, adskiller sig fra både tPA og urokinase med hensyn til adskillige strukturelle og funktionelle 15 kriterier. I modsætning til tPA indeholder plasminogen- aktivatorer ifølge opfindelsen ikke "kringle 2"-domænet og det plasminfølsomme processeringssted. Ækvimolære mængder af disse aktivatorer og tPA er lige effektive, når de måles for deres evne til at katalysere lysering af på forhånd dannede plasma-20 blodpropper. Deres aktivitet over for plasminogen stimuleres mindst 27.000 gange i nærværelse af en fibrin-cofaktor. Den tilsvarende værdi for tPA er kun 205 gange. Tre forskellige former svarende til formen i fuld længde, finger-minus- og finger-minus-EGF-minus-former af tPA er blevet isoleret fra vampyr-25 flagermusspyt. De kaldes Bat-PA(H), Bat-PA(l) henholdsvis Bat- PA(L) . Henvisninger herefter til "Bat-PA" svarer til den ikke-fraktionerede præparation, som indeholder de tre molekyleformer Η, I og L. Formen i fuld længde binder sig i modsætning til de to andre tæt til fibrin. Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L) udviser 30 tilsyneladende molekylevægte på 49, 42 henholdsvis 40 kD bestemt ved SDS-PAGE i nærværelse af dithiothreitol (figur 1, bane 1). De tilsyneladende molekylevægte for de deglycosylerede former af Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L) (opnået ved at fjerne de N- DK 176140 B1 g koblede kulhydratkæder med endeglycosidase F) bestemt ved SDS-PAGE er 44, 40 henholdsvis 38 kD (figur 1, bane 2). Disse proteiner udviser et stringent krav for tilstedeværelse af en fibrin-cofaktor og en bemærkelsesværdig evne til at katalysere lyserin-5 gen af plasma-blodpropper. Mekanismen bag disse proteiners selektivitet over for fibrin-bundet plasminogen skyldes en række faktorer, herunder direkte fibrin-binding og kraftig hæmning af NaCl, der frigøres i nærværelse af fibrinblodklumpen. Endvidere er vampyr-flagermus-plasminogenaktivatorerne mindre følsomme end 10 tPA over for inaktivering med.hæmmere, som er til stede i plasma.
Bat-PA(H) indeholder aminosyresekvensen 1-441. Bat-PA(I) indeholder sekvensen af aminosyrerne 1-3 og 50-441 og BAT-PA(L) indeholder sekvensen af aminosyrerne 1-3 og 37-441. Endvidere er amino-15 syren i position 88 ændret fra threonin til prolin i protein "L".
Et antistof, der er specifikt reaktivt med proteinet ifølge opfindelsen, udgør endnu en udførelsesform for opfindelsen.
20 Derudover angår opfindelsen et glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende fusionsprotein, der omfatter en sekvens af aminosyrer svarende til aminosyrer 190 - 441 som vist på Fig.
8a og en tung kæde sekvens fra vævstype plasminogen-aktivator, hvilket protein har større plasminogen-aktiverende aktivitet i 25 nærværelse af type-1 plasminogen-aktivator hæmmer end vævsplasmi-nogen-aktivator i nærværelse af type-1 plasminogen-aktivator hæmmer .
Proteinerne ifølge opfindelsen kan anvendes som et medikament.
30 Opfindelsen angår derfor et farmaceutisk præparat til aktivering af fibrin-bundet plasminogen omfattende en effektiv mængde af proteinet ifølge opfindelsen.
10 DK 176140 B1
En yderligere udførelsesform for opfindelsen er en DNA sekvens, der koder for et protein af Bat-PA(L); Bat-PA(H) plus signalsekvens ; Bat-PA(H) og Bat-PA(I) ifølge opfindelsen.
5 Et replikerbart kloningshjælpemiddel omfattende en indsat DNA-sekvens, der koder for et protein af Bat-PA(L); Bat-PA(H) plus signalsekvens ; Bat-PA(H) og Bat-PA(I) ifølge opfindelsen, er også omfattet af opfindelsen.
10 En pattedyrcelle eller en bakteriecelle transfektet med et kloningshjælpemiddel ifølge opfindelsen kodende for Bat-PA(H) er også en del af opfindelsen.
Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til rensning af et 15 plasminogen-aktiveringsprotein med en molekylvægt på mindre end 50.000 Dalton omfattende følgende trin: (a) homogenisering af underkæbespytkirtler fra Desmodus rotundus vampyrflagermus til dannelse af en blanding og centrifugering af 20 blandingen til frembringelse af en supernatantfraktion; (b) klaring og koncentration af supernatantfraktionen; (c) påføring af retentatet på en phosphocellulose-25 kationbyttersøjle og absorbering af plasminogen-aktivatoren på søjlen; (d) eluering af søjlen til opnåelse af fraktioner indeholdende plasminogen-aktiverende proteiner; 30 (e) samling af fraktionerne og påføring af de samlede fraktioner på en affinitetssøjle med immobiliseret Erythrina-trypsin-inhibitor (ETI); 11 DK 176140 B1 (f) fraktionering af plasminogen-aktivatorerne ved højtryksvæskekromatografi; og 5 (g) separering af plasminogen-aktivatorerne ved SDS-polyacryl- amid-gelelektroforese.
Hver af de plasminogen-aktiverende former aktiveres af fibrin.
Den eneste erkendelige egenskab, som differentierer formerne, er 10 Bat-PA(H)'s eksklusive evne til at bindes tæt til fibrin, en egenskab, der er korreleret med tilstedeværelsen af "Finger"-domænet. 3at-PA(I)'s og Bat-PA(L)'s specificitet over for fibrin-bundet plasminogen synes at være uafhængig af en evne til at bindes tæt til fibrin.
15
Bat-PA-aktivitetens kraftige fibrin-afhængighed er en egenskab, som er ønskelig i forbindelse med fibrinolytisk terapi. Blød ningskomplikationer, som ledsager anvendelsen af thrombolytiske midler, kan blive forværret ved aktiveringen af cirkulerende 20 plasminogen til frembringelse af plasmin. Omfanget og hyppigheden af blødningskomplikationer kan formindskes ved at anvende en plasminogen-aktivator ifølge den forliggende opfindelse, hvis virkning er lokaliseret til fibrin-blodpropstedet.
25 293-Bat-PA-l-pattedyrceller (betegnet ATCC nr. CRL 10180), BPA-CN-pSZ88-104-20 bakterielle celler (betegnet ATCC nr. 68050), BPA-CK-pSZ89-lll-17 bakterielle celler (betegnet ATCC nr. 68052), BPA-FK-p89WO-l bakterielle celler (betegnet ATCC nr. 68051), BPA-FN-p89WO-2C bakterielle celler (betegnet ATCC nr. 68053) og BPA-30 DK-p89WO-20A bakterielle celler (betegnet ATCC nr. 68049) er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Bethesda, MD, USA, i overensstemmelse med kravene ifølge Budapest Traktaten. De er uigenkaldeligt tilgængelige ved udstedelse af dette patent.
12 DK 176140 B1
Deponeringen er også tilgængelig ifølge de krav, som patentlovene i udlandet kræver, i hvilke lande tilsvarende ansøgninger er indleveret. Det skal imidlertid forstås, at tilgængeligheden af deponeringerne ikke udgør en licens til at udøve den foreliggende 5 opfindelse til forringelse af patentrettigheder udstedt af myndighederne.
10 Beskrivelse af tegningens figurer
Figur 1 viser SDS-polyacrylamidgel-elektroforese af oprensede vampyr-flagermus-plasminogen-aktivatorer. Prøverne fra vampyr-flagermus-spytkirtler (banerne 1 og 3) og spyt (banerne 2 og 4).
15 Hver prøve blev behandlet med endoglycosidase F forud for SDS-PAGE. Banerne 1 og 2: Western blotting og immunofarvning. Banerne 3 og 4: Fibrin-autografi.
Figur 2 viser procent lysering af blodpladefattige plasmablod-20 propper katalyseret med tPA og det 40 kd store flagermus-plasminogen-aktivatorprotein.
Figur 3 viser procent lysering af blodpladerige plasmablodpropper katalyseret med tPA og det 40 kd store flagermus-plasminogen-25 aktivatorprotein.
Figur 4 viser inaktivering af plasminogen-aktivatorer med plasmakomponenter .
30 Figur 5 viser molekylevægten på SDS-PAGE af 40 kd og 45 kd store proteiner, identificeret ved sølvfarvning og fibrin-autografi.
Figur 6 viser blodprop-lysering katalyseret med Bat-PA og tPA.
13 DK 176140 B1
Figur 7 viser bindingen af plasminogen-aktivatorer til fibrin.
Figur 8a viser nukleotid-sekvensen for vampyr-flagermus-5 plasminogen-aktivator-cDNA og aminosyresekvenserne for plasmino-gen-aktivatorerne.
Figur 8b viser en skematisk gengivelse af aminosyresekvensen for vampyr-flagermus-plasminogen-aktivator og sammenligning med human 10 tPA.
Figur 9 viser i skematisk form syntesen af plasmid p88SZ-100-20, der er afledt fra det kendte plasmid pS?73, og som indeholder Bat-PA(H)-gensekvensen, og den endelige syntese af plasmid pSZ83-15 104-20, der er afledt fra det kendte plasmid pD5, og som indehol der Bat-PA(H)-gensekvensen.
Figur 10 viser i skematisk form syntesen af plasmiderne pSZ89-109, pSC89-1010, p89WO-10 og p89WO-8, der er afledt fra det kend-20 te plasmid pSP73, og som indeholder Bat-PA(H)-gensekvensen, samt plasmiderne pSZ89-lll, pSZ89-112 og pSZ89-113, som er afledt fra det kendte plasmid pD5, og som indeholder Bat-PA(H)-gensekvensen.
Figur 11 viser i skematisk form syntesen af plasmiderne p89WO-14, 25 p89WO-5,6, p89WO-9 og p89WO-12, der er afledt fra det kendte plasmid pSP73, og som indeholder Bat-PA(I)-gensekvensen, samt plasmiderne p89WO-l, p89WO-2A,B,C, p89WO-3 og p89WO-4, der er afledt fra det kendte plasmid pD5, og som indeholder Bat-PA(I)-gensekvensen.
Figur 12 viser i skematisk form syntesen af plasmiderne p89WP-20A&B og p89WO-19A&B ud fra det kendte plasmid pD5 og P89WP-17 30 14 DK 176140 B1 henholdsvis p39WO-l8. p89WP-17 blev opnået fra p89WO-ll, og p89WP-18 blev opnået fra p8SWO-9.
. Opfindelsen angår native og ved rekombination afledte, oprensede 5 plasminogen-aktivatorproteiner som beskrevet ved sekvenserne vedrørende Bat-PA(L); Bat-PA(H) plus signalsekvens; Bat-PA(H) og Bat-PA(I).
Udtrykkene protein og polypeptid anvendes her på skift og refere-10 rer til den lineære polymer af aminosyrer bundet sammen med amidbindinger. Sekvensen af aminosyrer i kæden er kritisk vigtig i forbindelse med proteinets eller polypeptidets biologiske funktion. De her anvendte plasminogen-aktivatorer refererer til proteiner, som katalyserer dannelsen af plasmin, et enzym, der hydroly-15 serer peptider og estere af arginin og lysin og omdanner fibrin til opløselige produkter.
Monoklonale og polyklonale antistoffer mod proteinerne kan bruges ved isolering og identificering af proteiner ifølge den forelig-20 gende opfindelse. De kan fremstilles ved en hvilken som helst af de normale, kendte metoder. For eksempel kan polyklonale antistoffer syntetiseres af et dyr, såsom en kanin, der har modtaget injektion med plasminogen-aktivatorproteiner fra Desmodus rotun-dus. Efter injektion stiger antistofniveauet i dyret. Antistof-25 holdigt blod, kaldet antiserum, tappes derefter fra dyret. Plasminogen-aktivatorspecifikt antistof isoleres derefter fra andre antistoffer i antiserumet ved en hvilken som helst af en række separationsmetoder, f.eks. affinitetskromatografi. Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved at ‘anvende metoden ifølge 30 Kohier og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975).
Det her anvendte udtryk native proteiner refererer til proteiner, som har fuld længde, og som produceres af de tilsvarende gener.
15 DK 176140 B1
Ved rekombination-afledt refereres der til isoleringen af et gen eller cDNA for et ønsket protein og anvendelsen af dette oprense-de gen eller cDNA til konstruktioner af en celle, som vil overproducere det ønskede protein.
5
Mikroheterogene former refererer her til et enkelt gen-produkt, der er et produkt, som produceres fra en enkele gen-enhed af DNA, hvilket protein modificeres strukturelt efter translation. Disse strukeurmodifikationer resulterer imidlertid ikke i nogen væsent-10 lige ændringer af proteinets aktivitet. Modifikationerne kan finde sted enten in vivo eller under isoleringen eller oprensningen.
In vivo modifikation kan resultere i, men er ikke begrænset til, acetylering ved den N-terminale ende, proteolyse, glycosylering eller ohosphorylering. Proteolyse kan omfatte exoproteolyse, .hvor 15 én eller flere terminale aminosyrer sekventielt, enzymatisk spaltes til frembringelse af mikroheterogene former, der har færre aminosyrer end det oprindelige gen-produkt. Proteolyse kan også omfatte endoproteolytisk modifikation, som hidrører fra indvirkningen af endoproteaser, der spalter peptidet på specifikke ste-20 der i aminosyresekvensen. Lignende modifikationer kan finde sted under oprensningsprocessen, hvilken kan resultere i frembringelsen af mikroheterogene former. Den mest almindelige modifikation, der finder sted under oprensning, er proteolyse.
25 En anden udførelsesform for opfindelsen er et plasminogen- aktiverende protein med en polypeptidsekvens, der mindst er 95% homolog med polypeptidsekvensen af aminosyrerne 1-441 vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-aktiverende aktivitet, som stimuleres i nærværelse af en fibrin-eofaktor, og hvilket 30 protein er i stand til at bindes tæt til fibrin.
En anden udførelsesform for opfindelsen er et plasminogen- aktiverende protein med en polypeptidsekvens, som mindst er 90%
J
i • i 16 DK 176140 B1 homolog med den polypeptidsekvens af aminosyrer 1-441, som er vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-aktiverende ak-i tivitet, som stimuleres i nærværelse af en fibrin-cofaktor, og hvilket protein er i stand til at bindes tæt til fibrin.
5
En anden udførelsesform for opfindelsen er et plasminogen- aktiverende protein med en polypeptidsekvens, der mindst er 95% homolog med den polypeptidsekvens af aminosyrer 1-3 og 50-441, som er vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-10 aktiverende aktivitet, som stimuleres i nærværelse af en fibrin-cofaktor .
Sn anden udførelses form for opfindelsen er et plasminogen- aktiverende protein med en polypeptidsekvens, der er mindst 90% 15 homolog med polypeptidsekvensen af aminosyrer 1-3 og 50-441, som er vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-aktiverende aktivitet, som' stimuleres i nærværelse af en fibrin-cofaktor.
En anden udførelsesform for opfindelsen er et plasminogen- 20 aktiverende protein med en polypeptidsekvens, som er mindst 95% homolog med polypeptidsekvensen af aminosyrer 1-3 og 87-441 (med aminosyren ved position 88 udskiftet fra threonin til prolin) vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-aktiverende aktivitet, som stimuleres i nærværelse af en fibrin-cofaktor.
25
Endnu en udførelsesform for opfindelsen er et plasminogen- aktiverende protein med en polypeptidsekvens, der er mindst 90% homolog med polypeptidsekvensen af aminosyrer 1-3 og 87-441 (med aminosyren ved position 88 17 DK 176140 B1 udskiftet fra threonin til prolin) vist i figur 8a, hvilket protein har plasminogen-aktiverende aktivitet, som stimuleres i nærværelse af en fibrin-cofaktor.
5 Opfindelsen angår endvidere isolering og oprensning af genetisk information, der koder for de individuelle proteiner, samt fremgangsmåder til udtrykkelse af de tilsvarende proteiner.
10 Figur 1 viser SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) af oprenset flagermus-plasminogen-aktivator.
Prøver blev forbehandlet med 25 mM dithiothreitol forud for elektroforese på en 11% stacking SDS-polyacryl-amidgel. Bane 1 viser aktivator (3,6 ug) oprenset fra 15 vampyr-flagermus-spytkirtler; bane 2 viser aktivator (3,6 ug) behandlet med endoglycosidase F (Boehringer Mannheim) (0,1 enhed i 24 timer ved 37°C); og bane 3, 0,1 enhed endoglycosidase F. Protein-molekylevægtsmar-køre'r er som angivet. Flagermus-plasminogen-aktivator 20 (100 ng) fra spytkirtler (bane 1) og spyt (bane 2) blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af kanin-antistoffer mod flagermus-plasminogen-aktivator og alkalisk phosphatase konjugeret med gede-anti-stof mod kanin-IgG. Fibrin-autografi af aktivator (15 25 IU) fra spytkirtler (bane 3) og spyt (bane 4) blev udført som beskrevet i Laemmli, U.K., Nature, 227, 680-685 (1970) .
Til opnåelse af de resultater, som er vist i figur 1, 30 blev frosne, primære og underordnede underkæbespytkirtler (6 g) fra Desmodus rotundus-flagermus anbragt i 40 ml 10 mM Tris-HCl, 0,5 M JTaCl, pH 7,5, og straks homogeniseret under anvendelse af en Brinkmann-homoge-nisator. Homogenatet blev centrifugeret ved 27.000 x g 35 i 20 minutter. Supernatantfraktionen blev klaret ved centrifugering ved 100.000 x g i 30 minutter, blev 18 DK 176140 B1 fortyndet til 50 mM NaCl med 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,01% Tween 80 og blev sat på en kationbytter-phospho-cellulosesøjle (Whatmann Pil) ækvilibreret i 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM NaCl og 0,01% Tween 80. Efter 5 påsætning af prøven blev phosphocellulosesøjlen vasket udtømmende med den ovenfor nævnte ækvilibreringspuffer. Flagermus-plasminogen-aktivator blev elueret fra phos-phocellulosesøjlen med 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5 M NaCl og 0,01% Tween 80 og blev sat på en affinitets-10 søjle bestående af Erythrina-trypsininhibitor (ETI) (American Diagnostica) koblet til CNBr-aktiveret Sepha-rose 4B (Pharmacia). Affinitetssøjlen blev vasket med 20 mM NaH2P0< ,0,5 M NaCl, pH 7,0, 0,1% Tween 80, og aktivator blev derefter elueret med'50 mM Na-acetat, 15 0,2 M NaCl, pH 4,0, 0,1% Tween 80. Fraktioner indehol dende aktivator blev hældt sammen, og der blev tilsat 1 M Tris-base til frembringelse af en slutkoncentration af Tris på 25 mM. Den oprensede prøve blev opbevaret ved -70°C. Proteinkoncentrationen blev bestemt med 20 Biorad-farvebindingsanalysen under anvendelse af bovin serumalbumin som standard.
Figur 6 viser lysering af klumper af størknet blod katalyseret af flagermus-plasminogen-aktivator og tPA.
25 Plasma-blodpropper blev frembragt ved at tilsætte 0,2 IU human thrombin (Sigma) og 7,5 mM CaCl2 til 195 μΐ human plasma indeholdende (* 8 9 I)-fibrinogen (100.000 cpm/blodprop). Det endelige volumen af hver prøve var 200 μΐ. Blodpropperne blev dannet i nærværelse af og 30 blev hæftet til små træstykkeir, blev ældet i 30 minutter ved 37°C, blev mast for at presse væske ud og blev overført til 250 μΐ plasma, hvortil der tilsattes 25 U/ml Hirudin (Sigma). Femogtyve μΐ 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01% Tween 80 indeholdende plasminogen-aktivator 35 blev tilsat til denne opløsning, som badede blodpropperne, prøverne blev inkuberet ved 37°C, og delprøver 19 DK 176140 B1 blev fjernet og talt for opløselige fibrin-nedbryd-ningsprodukter. Flagermus-plasminogen-aktivator oprenset fra spytkirtler og to-kaedeholdigt tPA blev anvendt til denne undersøgelse. ▼, 3 nM Bat-PA; a, 3 nM 5 t-PA; «, 10 nM Bat-PA; A , 10 nM t-PA. Flagermus-plasmi-nogen-aktivator og t-PA udviste lignende effektiviteter, når de blev målt for deres evne til at katalysere frigørelsen af radioaktivt mærkede fibrin-nedbrydnings-produkter fra på forhånd dannede plasma-blodpropper.
10
Figur 7 viser binding af plasminogen-aktivatorer til fibrin. Bane 1, Bat-PA, 1,8 picomol; banerne 2 og 3, 10 volumenprocent af pellet- henholdsvis supernatant-fraktionen fra fibrin-prøven, som flagermus-plasmino-15 gen-aktivator; bane 4, en-kæde-tPA, 1,8 picomol; banerne 5 og 6, 10 volumenprocent af pellet- henholdsvis supernatantfraktionen fra den tPA-holdige fibrin-prøve; bane 7, urokinase, 0,5 picomol; banerne 8 og 9, 10 volumenprocent af pellet- henholdsvis supernatant-20 fraktionen fra urokinase-holdige fibrin-prøver.* De tre flagermus-plasminogen-aktivator-former (bane 1) er uens fordelt mellem supernatant- og pelletfraktionerne. Hovedparten af Bat-PA(H) skilles fra inden i fibrin-pelleten (bane 2), medens Bat—PA(I) og Bat(PA(L) ikke 25 har nogen skelnelig affinitet for fibrin og hovedsageligt er lokaliseret i supernatantfraktionen (bane 3).
Delprøver af tPA (bane 4) og urokinase (bane 7) blev også undersøgt for deres evne til at bindes til fibrin.
Som forventet bindes tPA kraftigt til fibrin og for-30 deler sig i pelletfraktionen (bane 5), men urokinase er udelukkende lokaliseret i supernatantfraktionen (bane 9).
Fibrin-klumper blev dannet ved at tilsætte 0,2 IU 35 thrombin til 200 μΐ 10 mM NaHzPO«, 140 mM NaCl, pH 7,4, 0,01% Tween 80 indeholdende human fibrinogen 20 DK 176140 B1 (1 mg/ml), EDTA (5 mM) og flagermus-plasminogen-aktivator (18 picomol) eller en-kæde-tPA (18 picomol) eller urokinase (5,5 picomol). En-kæde-tPA blev oprenset fra en blanding af en-kæde-tPA og to-kæde-tPA 5 ved kromatografi med en søjle med monoklonalt antistof, som fortrinsvis binder en-kæde-tPA (PAM-1, American Diagnostica). Fibrin-klumper blev ældet i 1 time ved 37°C og blev centrifugeret ved 100.000 x g i 10 minutter. Pelletfraktionerne blev vasket med 400 μΐ 10 NaH2PO4, NaCl, Tween 80-puffer, blev resuspenderet med 150 μΐ 0,5% SDS og blev inkuberet ved 37°C i 1,5 timer med konstant omblanding. Pellet- og supernatantfrak-tioner indeholdende flagermus-plasminogen-aktivator blev behandlet med Endo F. Prøver blev udsat for SDS-15 PAGE og blev analyseret ved FA-analyse.
Plasminogen-aktivatoranalyser
Fibrin-plademetode; Fibrin-plader blev fremstillet ved 20 at opløse bovint eller humant fibrinogen (2 mg/ml) og humant Glu-plasminogen (6 ug/ml) i 1% agaroseopløsning (holdt ved 55°C). Humant thrombin (1,5 enheder) blev derefter tilsat forud for, at den blandede opløsning blev støbt i kalibrerede immunodiffusionsplader. Der 25 blev frembragt brønde i en stivnet fibrin-plade, og søjlefraktioner blev tilsat. Der blev oberveret lyseringsområder, hvor der var aktivitet til stede. Lyseringsarealet (mm2) pr. inkuberingstime ved 37°C kan korreleres til enzymets aktivitetsenheder.
30
Fibrin-autografi: Prøver blev udsat for SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser, og acrylamidgelen blev grundigt vasket i Triton X-100 (2,5%) og blev derefter anbragt på en plasminogen-holdig fibrin-agarosegel.
35 Plasminogen-aktivatorerne renaturerer på grund af Triton-behandlingen og diffunderer ind i agarosegelen, 21 DK 176140 B1 hvor de aktiverer plasminogen til frembringelse af plasmin. Frembringelsen af plasmin nedbryder fibrinet, hvilket resulterer i fremkomsten af en fibrinolyse-zone, der let kan ses på baggrund af ikke-nedbrudt 5 fibrin.
Koblet amidolytisk analyse: Aktiveringen af plasminogen til frembringelse af plasmin blev undersøgt i nærværelse af Desafib, og produktionen af plasmin blev 10 overvåget med et kolometrisk plasminsubstrat, Spectro- zyme PL. Flagermus-plasminogen-aktivatorerne blev inkuberet med humant Glu-plasminogen {20 pg/ml), Spectro-zyme PL (0,4 mM) og Desafib (80 ug/ml). Blandingen blev inkuberet ved 37°C i 60 minutter. Reaktionen blev 15 afsluttet ved tilsætning af 50 μΐ 10% SDS- Absorption af spaltet substrat blev målt ved 405 nm. En aktivitetsenhed af f lagermus-plasxninogen-aktivator svarer til den mængde enzym, som katalyserer omsætningen af 1 pmol Spectrozyme PL i 1 minut ved 37°C.
20
Titrering af aktivitetssted: Vampyrflagermus-plasmino-gen-aktivatorer blev titreret ved to forskellige metoder for at bestemme den funktionelle molaritet. Den første metode var baseret på princippet med tilbage-25 titrering af en kalibreret trypsin-standard med en kalibreret standardopløsning af en chlormethylketonhæm-mer af både trypsin og plasminogen-aktivatorer. En opløsning af trypsin (500 nM) blev titreret direkte under anvendelse af 4-methylumbelliferyl-p-guanidin-30 benzoat (MUGB). Chlormethylketonen (Dansyl-glutamyl-glycyl-argininchlormethylketon, DNS-EGRCK) blev titreret mod den MUGB-kalibrerede trypsin. Omsætning af en sådan kalibreret trypsinopløsning med en kalibreret chlormethylketonopløsning muliggør måling af redukti-35 onen af hæmningen af trypsinstandarden, når CK-standar-den blev præinkuberet med aktivatorerne. Tilstedeværel- 22 DK 176140 B1 sen af flagermus-plasminogen-aktivatorer resulterer i en forøget aktivitet i forhold til trypsin-CK-kontrol-len, hvilket er proportionalt med mængden af plasmino-gen-aktivator.
5
Den anden metode involverer observationen af "burst kinetics" efter tilsætning af MUGBE til flagermus-plasminogen-aktivatoren, når reaktionen blev udført ved lav temperatur (5°C).
10 SDS-polyacrvlamidqelelektroforese: Vi anvendte en modificeret protokol af Laemmli-systemet (Nature, 227, 680-635 (1970)). Stacking-gelen og separationsgelen (0,75 mm) indeholdt 4% henholdsvis 10% polyacrylamid.
15 Gelerne blev kørt ved 75 Volt i 20 timer. Protein blev påvist ved sølvfarvning.
Oprensning af flaqermus-plasminoqen-aktivatorproteiner 20 Materialer; Spyt og spytkirtler fra Desmodus rotundus blev købt fra Antibodi Associates, Bedford, TX og fra Dr. C. Rupprecht, Rabies Unit, Wistar Institute, Philadelphia, PA. Fibrinogen, plasminogen, thrombin og substrater for amidolytisk analyse var fra American 25 Diagnostica, New York, NY. Materialer til elektroforese var fra BioRad, Inc., og materialer anvendt til søjlekromatografi var fra Pharmacia. HPLC-søjler var produkter fra Vydac. Immunodiffusionsplader var fra ICN.
30 Procedure: Oprensning af aktivatorerne fra vampyr- flagermus-spyt involverer kromatografiske trin med phosphocellulose, phenyl-Sepharose og HPLC-C4 med omvendt fase.
35 23 DK 176140 B1
Spyttet fra vampyr-flagermusen Desmodus rotundus blev fortyndet til et 3 gange så stort volumen med 10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Tween-20-opløsning. Det fortyndede spyt blev centrifugeret i 5 minutter ved 5 12.000 omdrejninger pr. minut ved 4°C i en Eppendorf- centrifuge. Supernatanten blev sat direkte på en phos-phocellulosesøjle (2,5 x 10 cm) og blev vasket med den samme puffer anvendt til fortynding af spyttet. Søjlen blev kørt ved et strømhastighed på 6 ml/time. Aktivi- i 10 teten blev bestemt ved lyseringsarealet under anvendelse af fibrin-plademetoden, og protein blev målt ved OD 280.
Flagermus-plasminogen-aktivatorer bandtes kraftigt til 15 phosphocsllulosesøjlen. Genfinding af aktivitet efter eluering med 1 M NaCl var 94% (tabel I).
Fraktioner fra phosphocellulosesøjlen indeholdende plasminogen-aktivatoraktivitet blev hældt sammen og 20 sat direkte på en phenyl-Sepharose-søjle (1,5 x 5,0 cm) i nærværelse af 2,5 M NaCl. Søjlen blev vasket med en gradient af 2 M NaCl til 0 M NaCl og 10% glycerol i 10 mM Tris-puffer. Vask med 10% glycerol-opløsning blev fortsat, indtil al aktivitet var elueret.
25
Kromatografi med phenyl-Sepharose-søjlen resulterede i genfinding af 82% aktivitet (tabel I). Men aktiviteten blev opdelt i to toppe, 1 og 2, der blev hældt sammen separat. De to toppe udviste forskellige molekylevægte 30 bestemt ved sølvfarvning efter SDS-PAGE og fibrin-auto-tografi (figur 5) . Top 1, som vi formoder er Bat-PA(L) , eluerede mod enden af saltgradienten (2 M-0 M NaCl.). Vi formoder, at top 2 repræsenterer Bat-PA(I).
35 24 DK 176140 B1
Efter phenyl-Sepharose-kromatografi blev der opnået en ca. 660 ganges oprensning af Bat-PA(L). Den totale aktivitet af Bat-PA(I)-enzymet blev ikke bestemt optimalt ved amidolytisk analyse under anvendelse af 5 plasminogen/Spectrozyme PL-koblingssystemet, eftersom Desafib ikke er en effektiv cofaktor for denne flager-mus-plasminogen-aktivator.
TABEL I
10 Oprensningstabel
Aktivitet Udbytte Protein Trin enheder %_ OD 280 15 Flagermus-spyt (4 ml) 206 100 76,230
Phosphocellulose 194 94 7,000
Phenyl-Sepharose: 20 Top 1 142 69 0,079
Top 2 27* 13* 0,083 C4 omvendt fase HPLC:
Top 1 119 57 N.D.
25 _ *: Desafib er ikke en passende cofaktor for denne form af flagermus-PA.
N.D.: Ikke bestemt.
30
Det endelige oprensningstrin for proteinerne var en C4 omvendt fast HPLC-søjle, der var blevet ækvilibreret med 0,1% (v/v) trifluoreddikesyre (TFA) i vand. Sammenhældninger af fraktioner af proteinerne blev koncentre-35 ret ved frysetørring og blev sat direkte på HPLC-søjlen. Enzymet blev elueret med en gradient på fra 25 DK 176140 B1 25% til 55% acetonitril i nærværelse af 0,1% TFA. Proteintoppe blev målt ved OD 214 og blev opsamlet separat. Flygtige materialer blev fjernet ved vacuum-centrifugering efterfulgt af frysetørring. Proteinerne 5 blev genopløst i 10 roM eddikesyre. Aktivitet blev analyseret under anvendelse af fibrin-plademetoden, efter at eddikesyre var neutraliseret med Tris-Tween-puffer.
Oprensning af flagermus-plasminogen-aktivator fra 10 vampyr-flagermus-spytkirtler blev udført på følgende måde.
De primære og underordnede underkæbekirtler fra vampyrflagermus blev anbragt i puffer indeholdende 10 mM 15 Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5, og blev straks homogeniseret under anvendelse af en polytron.
Efter centrifugering blev den klarede SN-fraktion både koncentreret og ækvilibreret i 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,2, ved anvendelse af en Amicon-celle med om-20 røring (YM 10-membran). Det tilbageholdte materiale blev direkte sat på en phosphocellulosesøjle (Whatmann) ækvilibreret med 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,01%
Tween 80, pH 7,2. Plasminogen-aktivatorproteinet blev kvantitativt absorberet på phosphocellulosesøjlen og 25 blev trinvis elueret med påsætningspuffer tilsat 0,5 M NaCl. Genfinding af aktivitet var typisk større end 80%.
Fraktioner, som indeholdt aktivatoraktivitet, blev 30 hældt sammen og sat på en affinitetssøjle omfattende Erythrina trypsin-inhibitor {ETI) koblet til Sepharose 4B. Hovedparten af aktiviteten blev absorberet til denne søjle og blev effektivt elueret ved vask af søjlen med 50 mM Na-acetat, pH 4,0, 0,2 M NaCl og 0,1% Tween 35 80. Den endelige genfinding af flagermus-plasminogen- aktivatoraktivitet fra kirtelekstraktet under anven- 26 DK 176140 B1 delse af denne protokol var 91%, hvilket gav ca. 5,4 mg flagermus-plasminogen-aktivator ud fra 6 g kirtler. Homogeniteten af flagermus-plasminogen-aktivatorpræpa-ratet blev indikeret ved en korrespondance mellem den 5 beregnede proteinkoncentration og beregnet funktionel molaritet bestemt ved titrering af det aktive sted under anvendelse af 4-methylumbelliferyl-p-guanidino-benzoat (Urano et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 150, 45-51 (1988)).
10
Proteinfarvning efter SDS-PAGE af de sammenhældte aktive fraktioner viste et komplekst mønster af bånd, der havde en række tilsyneladende molekylevægte. Vandringen af disse former svarede til aktivitetszonerne 15 defineret ved FA-analyse. Denne korrelation udover overensstemmelsen mellem aminosyreanalyse, N-terminal analyse og resultater for titrering af aktivt sted gav evidens for, at aktivatoren var blevet vellykket oprenset til homogenitet.
20
Proteinkarakteriserinq og -aktivitet
Plasminogen-aktivatorer ifølge den foreliggende opfindelse viste ingen aktivitet med plasminogen-frie 25 fibrin-plader. Inkubering af aktivatorerne med plasmi nogen i nærværelse af Fibrin I (Desafib) resulterer i frembringelsen af plasmin vurderet ved Western blotting og immunofarvning med et anti-plasmin(ogen)-antistof .
De udviser aktivitet over for humant plasminogen bundet 30 til humant fibrin såvel som bovint plasminogen bundet til bovint fibrin.
Ved Sepharose G-200-gelfiltreringskromatografi blev flagermus-plasminogen-aktivatoraktivitet til stede i 35 råspyt elueret som en bred top med en omtrentlig molekylevægt på 130 K. Denne molekylevægt var sandsynligvis 27 DK 176140 B1 molekylevægten for et aggregat af flagermus-plasmino-gen-aktivator. Den synes at være ca. 32 K ved FPLC-3epharose-søjlekromatografi i nærværelse af 0,01%
Tween 20.
5
Under oprensningsstudier vekselvirkede flagermus-plasminogen-aktivator ikke med lysin-Sepharose, hvilket tidligere var vist at være et effektivt trin til at oprense proteiner, som bindes til fibrin via "kringle"-10 domænet. Aktivatorernes bindingsroekanisme til fibrin er således forskellig fra tPA.
Behandling af aktivatorerne med endoglycosidase H og F frembringer aktive proteiner med en lavere molekyle-15 vægt, hvilket indikerer, at aktivatorerne er glycopro-teiner. Disse proteiners vekselvirkning med hvedespire-og concanavalin A-agarose giver yderligere understøttelse for denne konklusion.
20 Bat-PA(H)’s evne til at aktivere Glu-plasminogen blev vurderet med en koblet analyse, som målte omsætningen af et plasminspecifikt amidolytisk substrat (tabel II). Bat-PA(H)*s specifikke aktivitet (IU/nmol) over for Glu-plasminogen var ca. 260 gange mindre end tPA, 25 når den blev analyseret i fravær af en fibrin-efter-ligning. Men Bat-PA(H)’s specifikke aktivitet over for Glu-plasminogen i nærværelse af Desafib var ca. 85% af den aktivitet, som blev udvist af tPA. Desafib stimulerede således tPA- og Bat-PA(H)-aktivitet med 205 hen-30 holdsvis 45.000 gange. Den specifikke aktivitet, som udvises af Bat-PA, den præparation, som indeholder de tre molekyleformer, var sammenlignelig med Bat-PA(H) i fravær af Desafib, men ca. 30% mindre end Bat-PA(H) i nærværelse af denne fibrin-cofaktor (tabel II). Vi 35 slutter, at aktiviteterne af Bat-PA(I) og Bat-PA(L) ikke stimuleres i samme udstrækning som Bat-PA(H) med 28 DK 176140 B1 80 pg/ml Desafib.
TABEL II
Aktivering af plasminogen med Bat-PA(H), Bat-PA og tPA
5
Plasminogen- Desafib-koneentration Gange aktivator 0 pg/ml 80 ug/ml stimulering
Bat-PA(H) 1,05+0,04 47.700+4.500 45.000 (220)
Bat-PA 1,24+0,08 33.500+ 970 27.000 (130) 10 tPA 270 + 20 55.400+1.500 205 (1)
Disse resultater angiver specifikke aktiviteter (IU/ nmol) under anvendelse af den ovenfor beskrevne koblede 15 amidolytiske analyse. To-kæde-tPA blev anvendt til disse analyser; den katalytiske aktivitet af en-kæde-tPA er ikke angivet, eftersom resultaterne tilsløres af den uundgåelige frembringelse af to-kæde-tPA under analysen. Desafib blev tilsat i analysen, hvor angivet.
20 Angivelserne under overskriften "Gange stimule ring" er forholdet mellem specifik aktivitet i nærværelse af Desafib i forhold til specifik aktivitet i fravær af Desafib. Tallene i parentes er stimulering af plasminogen-aktivatoraktivitet af Desafib i forhold 25 til den, der er udvist af tPA.
tPA's og Bat-PA(H)'s evne til at katalysere lysaring af plasminogen-holdige fibrin-blodpropper blev også sammenlignet. Lidt højere koncentrationer af Bat-PA(H) 30 er nødvendige for at opnå blodproplyseringshastigheder, som er identiske med de hastigheder, der fremkommer med koncentrationer af tPA i området fra 0,25 til 10 nM. De koncentrationer af tPA og Bat-PA(H) (afledt fra deres dosis-respons-kurver), som forårsager udvalgte 35 blodproplyseringshastigheder, er angivet i tabel III.
Den specifikke aktivitet af Bat-PA(H) i forhold til 29 DK 176140 B1 tPA lå fra 59 til 72% og var korreleret med koncentrationen af aktiveret plasminogen. Den stigende specifikke aktivitet af Bat-PA(H) i forhold til tPA ved højere koncentrationer kan afspejle forskelle mellem disse 5 plasminogen-aktivatorer med hensyn til deres måder at vekselvirke med fibrin og/eller plasminogen på,
TABEL III
Fibrin-blodproplysering medieret af tPA og Bat-PA(H) 10
Hastig- Relativ hed_ tPA (nM) Bat-PA(H) (nM) virkning (%) 0,850 9,33 + 1,11 12,9 + 1,05 72,3 15 0,825 7,52 + 0,88 10,53 + 0,83 71,4 0,800 6,05 + 0,69 8,60 + 0,66 70,4 0,775 4,88 + 0,54 7,02 + 0,52 69,5 0,725 3,16 + 0,34 4,68 + 0,32 67,5 0,675 2,05 + 0,21 3,12 + 0,20 65,7 20 0,625 1,33 + 0,13 2,08 + 0,12 63,9 0,575 0,86 + 0,08 1,39 + 0,07 61,9 0,525 0,56 + 0,05 0,92 + 0,05 60,9 0,475 0,36 + 0,03 0,61 + 0,03 59,0 0,425 0,24 + 0,02 0,41 + 0,02 58,5 25 _
Forsøg med lysering af blodpropper under anvendelse af den turbidimetriske analyse blev udført i firedobbelte prøver med følgende koncentrationer af 2-kæde-tPA el-30 ler Bat-PA(H): 0,25, 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 og 10,0 nM. En blodproplyseringshastighed blev angivet som den maksimale hastighed af faldende turbiditet (-mOD/minut) bestemt ved at analysere hver blodproplyseringsprofil med Softmax kinetisk software. Fire og seks uafhængige, 35 lineære dosis-respons-kurver (hastighed vs. log (plas-minogen-aktivator)) blev frembragt for tPA henholdsvis 30 DK 176140 B1
Bat-PA(H). I tabellen er der angivet de plasminogen-aktivatorkoncentrationerr som resulterer i de angivne blodproplyseringshastigheder. Disse værdier blev afledt fra ligninger, som beskriver de linier, som pas-5 ser bedst, konstrueret ud fra analyse af alle dosis-respons-kurver for tPA og Bat-PA(H). Værdierne for den relative virkning er forholdet mellem de koncentrationer af tPA i forhold til Bat-PA(H), som resulterer i den angivne blodproplyserings-hastighed.
10
Flagermus-plasminogen-aktivatorerne ifølge den foreliggende opfindelse er mindre følsomme end tPA over for inaktivering af den hurtigt virkende type 1-plas-minogen-aktivatorinhibitor (PAI-1) .
15
Det formodes, at koncentrationen af PAI-1 i området af et tilstoppet kar kan være meget større end de koncentrationer, som er beregnet ud fra plasma-undersøgelser. Eksistensen af latent PAI-1 i plasma, og blodpla-20 der, som indeholder PAI-1, der kan frigøres af thrombin, adenosindiphosphat og andre blodpladeagonister, bidrager til de forholdsvis høje lokale koncentrationer i tilstoppede områder. PAI-1 fungerer som en anti-aktivator, der specifikt blokerer aktiviteten af tPA.
25
Figur 4 viser, at tPA hurtigere inaktiveres af plas-minogen-aktivatorinhibitorer end plasminogen-aktiva-torer fra vampyr-flagermus-spyt. tPA og plasminogen-aktivatorer fra vampyr-flagermus-spyt blev hver 30 inkuberet i plasma, og deres respektive aktiviteter blev målt som en funktion af tiden.
En NaCl-medieret hæmning af plasminogen-aktivering med både tPA og det 40 kd store protein blev ikke observe-35 ret, da lysering af fibrin-blodpropper blev målt. I dette tilfælde blev blodpropper fremstillet ud fra op- 31 DK 176140 B1 rensede komponenter, som inkluderede fibrinogen (både mærket og ikke-mærket), plasminogen, α-2-antiplasmin,
Faktor XHIa og puffer med eller uden 0,1 M NaCl.
5 SDS-polvacrylamidgelelektroforese af Bat-PA og blotting af proteiner på immobilon (PVDF-membraner)
Der blev opnået sammenhældte aktive fraktioner fra en trypsin-inhibitoraffinitetssøjle, og de blev yderligere 10 fraktioneret under anvendelse af en Vydac C4 HPLC-søjle, fra hvilken plasminogen-aktivatorproteinet blev elueret ved ca. 40% acetonitril/0,1% trifluoreddike-syre. To hovedaktivitetstoppe (bestemt ved fibrin-pladeautolyse) kunne påvises, og de blev elueret fra 15 HPLC-søjlen. De to aktivitetstoppe blev hældt sammen i separate puljer og blev betegnet Bat-PA(I) og Bat-PA (II) .
Med SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SD3-PAGE) 20 efterfulgt af fibrin-autograf i udviste både Bat-PA(I) og (II) et lignende mønster for lyseringszoner, hvilke lå i molekylevægtsområdet fra 42.000 til 46.000 Dalton.
Både Bat-PA(I) og (II) kunne mærkes med 3H-DFP (diiso-propylfluorphosphat), et mærkningsreagens for aktive 25 steder i serine proteinaser.
Polyacrylamidgelelektroforese af flagermus-plasminogen-aktivatorer betegnet I og II blev udført under anvendelse af en modificeret protokol af Laemmli-systemet 30 (Nature, 227,.680-685 (1970)). Stacking-gelen og separationsgelen (0,75 mM) indeholdt 4% henholdsvis 10% polyacrylamid. Gelerne blev kørt ved 75 Volt i 20 timer.
35 32 DK 176140 B1
Proteiner, der var separeret ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese, blev ved elelektroforese overført på Immobilon (PVDF-membraner) , som var købt hos Millipore, katalognummer IPVH304FO. Elektroblotting af proteiner 5 blev udført stort set som beskrevet af Matsudaira (J.
Biol. Chem., 261, 10035-10038, 1987). I korthed blev proteiner elektroelueret fra SPS-polyacrylamidgelen ved 30 Volt i en periode på 15 timer. Immobilon-blottet blev derefter farvet med Coomassie-blåt til afsløring 10 af proteinbånd på blottet. Proteinbåndene blev direkte skåret ud fra blottet og anbragt i en gasfasesekven-teringsmaskine model 477A med et polybren-prækondi-tioneringsfilter under den afsatte prøve. Sekvente-ringsprogrammerne og reagenserne er dem, der leveres 15 af producenten (Applied Biosystens). Frigjorte amino-syrederivater blev identificeret på et on-line HPLC-system.
N-terminale aminosyresekvenser af plasminoqen-aktiva-20 torer fra vampyr-flaqermus-spyt N-terminal sekventering af SDS-PAGE-fraktioneret plas-minogen-aktivator blev udført med en polyvinylidendi-fluorid-membran (Immobilon, Millipore) og en sekvente-25 ringsmaskine model 470 fra Applied Biosystems med online PTH-analyse (Matsudaira, P., J. Biol. Chem., 262, 10035-10038 (1987)). V8-fragmenter af plasminogen-aktivator blev frembragt ved reduktion/alkylering af aktivatoren med dithiothreitol/iodacetamid, inkubering 30 af det modificerede protein med Staphylococcus aureus V8-protease (Boehringer Mannheim) og isolering af pro-teolytiske fragmenter med en Vydac C-18 HPLC-søjle. Peptidfragmentet med det aktive sted, TI, blev identificeret på følgende måde: plasminogen-aktivator blev 35 inkuberet med (1,3-3H)-diisopropylfluorphosphat (New England Nuclear) i nærværelse af Desafib (American 33 DK 176140 B1
Diagnostica), blev behandlet med dithiothreitol og iodacetamid, blev fordøjet med trypsin, og det radioaktivt mærkede fragment blev isoleret ved HPLC og blev underkastet sekvensanalyse.
5
Otte proteinbånd, som udviste plasminogen-aktivatorak-tivitet, blev identificeret, på Immobilon-blottet og blev udsat for sekvensanalyse. De opnåede sekvenser er angivet nedenfor: -{ )- angiver, at ingen aminosyre 10 kunne identificeres på denne bestemte position, hvilket højst sandsynligt skyldes visse aminosyrers ustabilitet eller dårlige indvinding fra proteinsekvensmaskinen.
Bånd 1 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-{ )-Arg-Tyr-?he 15 Bånd 2 - Ala-Tyr-Gly-Glv-Pro-Ser-Ala-( )-( )-Tyr-( )~ Asp-Gln-Gly-Val Bånd 3 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thr-20 Gln-Met-(Thr)-Tyr Bånd 4 - Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr-Lys 25 Bånd 5 - Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-Phe-Ile-Gly-Gly Bånd 6 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val 30 Bånd 7 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly Bånd 8 - Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-35 Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr.
34 DK 176140 B1
Molekylær kloning af flaqermus-plasminogen-aktivator-cDNA
Rekombinant-DNA-teknologi defineres her som en teknolo-5 gi, som muliggør at segmenter af genetisk information, DNA, fra forskellige celler, sædvanligvis fra forskellige organismer, sættes sammen ende-mod-ende uden for de organismer, hvorfra DNA*et blev opnået, og at dette hybrid-DNA inkorporeres i en celle, som vil tillade 10 produktionen af det protein, for hvilket det oprindelige DNA koder. Genetisk information, DNA eller mRNA, isoleres og inkorporeres i en passende kloningsvektor og overføres ved transfektion til en passende værtscelle -15
Som anvendt her betyder udtrykket kloningsvektor en DNA-sekvens, som tillader inkorporeringen af specifik, eksperimentel, fremmed DNA, hvor det kombinderede DNA indføres i en værtscelle, der kan eksistere på en .sta-20 bil måde og udtrykke det protein, der dikteres' af det eksperimentelle DNA. Det fremmede DNA kombineret med vektor-DNA udgør et rekombinant-DNA-molekyle, som fremkommer ved rekombinant-teknologi. Kloningsvektorer kan omfatte plasmider, bakteriofager, vira og cosmider.
25 Det skal forstås, at en hvilken som helst kloningsvektor kan anvendes til at klone de nye DNA-sekvenser, der koder for Desmodus-protein. Ekspressionsvektorer defineres her som DNA-sekvenser, der er nødvendige for transkriptionen af klonede kopier af gener og transla-30 tionen af deres mRNA*er i en passende vært. Sådanne vektorer kan anvendes til at udtrykke enten procaryote eller eucaryote gener i en række celler, såsom bakterie-, gær-, insekt- og pattedyrceller. Proteinerne kan også udtrykkes i en række virus-systemer. En pas-35 sende konstrueret ekspressionsvektor bør indeholde: et replikationsstartsted for autonom replikation i 35 DK 176140 B1 værtsceller, selektive markører, et begrænset antal nyttig® restriktionsenzymsteder, et højt kopiantal og stærke promotorer. En promotor defineres som en DNA-sekvens, der styrer RNA-polymerase til at bindes til 5 DNA og til at initiere RNA-syntese. En stærk promotor er en promotor, som forårsager, at mRNA'er initieres ved høj frekvens. Ekspressionsvektorer kan være, men er ikke begrænset til, kloningsvektorer, modificerede kloningsvektorer, specifikt udformede plasmider eller 10 vira.
Proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse kan eksistere som, men er ikke begrænset til, de komplette proteiner, der specificeres af de definerede gener i 15 det native Desmodus-protein eller et hvilket som helst fragment eller underenhed deraf, eller som hybrider af det komplette protein eller dets fragmenter eller underenheder, forudsat at proteinerne udviser egenskaber hos en plasminogen-aktivator afledt fra Desmodus 20 rotundus-spyt med et stringent krav for tilstedeværelse af fibrin. De komplette proteiner refererer her til det post-transkriptionelt modificerede polypeptid i fuld længde produceret af de hensigtsmæssige Desmodusgener. De komplette proteiner kan opnås ved oprensning 25 fra Desmodus rotundus-spyt eller ved ekspression i en passende ekspressionsvektor for det tilsvarende ved rekombination afledte gen-produkt. Proteinfragmenter eller underenheder refererer til en hvilken som helst del af det protein, som indeholder færre aminosyrer 30 end det komplette protein og bevarer evnen til at aktivere plasminogen under de samme betingelser som det native protein. Hybridproteiner omfatter, men er ikke begrænset til fusionsproteiner eller proteiner, der fremkommer ved ekspression af multiple gener i 35 ekspressionsvektoren. Et fusionsprotein defineres som et protein, i hvilket et begrænset antal aminosyrer, 36 DK 176140 B1 som kodes af ekspressionsvektoren, udtrykkes, og ekspressionen resulterer i, at de fastgøres til det specifikke plasminogen-aktivatorpolypeptid. Proteiner, der fremkommer ud fra multiple gener, kan omfatte det; 5 specifikke aktivatorpolypeptid koblet til et andet polypeptid eller peptider ved hjælp af peptidbindinger, hvilket forøger plasminogen-aktivering.
Spytkirtler blev opnået fra 10 for nyligt aflivede 10 vampyr-flagermus og blev anvendt til isolering af poly A+ RNA. Dette RNA blev anvendt til at konstruere et lambda-gt 22 unidirektionelt cDNA-bibliotek bestående af mere end 2 x 106 rekombinerede bakteriofager. En yderligere RNA-præparation anvendt til Northern blot-15 ting-analyse blev isoleret fr3 kirtler, der hurtigt blev frosset på tøris. Kvaliteten af dette RNA var sammenlignelig med kvaliteten af det, der blev isoleret fra frisk væv.
20 Totalt RNA blev isoleret fra de primære og underordnede underkæbekirtler hos vampyr-flagermus (Desmodus rotun-dus) ved lavtemperatur-guanidiniumtriocyanat-metoden (Han, J. et al., Biochem., 26, 1617-1625 (1987)).
Poly(A)+ RNA blev isoleret ved oligo(dT)-cellulose-25 kromatografi. Dobbeltstrenget cDNA blev fremstillet ved en modifikation af metoden ifølge Gubier og Hoffman (Gene, 25, 263-269 (1983)) som tidligere beskrevet (Dixon, R.A.F. et al., Nature, 321, 75-79 (1986)).
cDNA’et blev størrelsesfraktioneret ved agarosegelelek-30 troforese i puljer med længder på 1-2 kb og 2-7 kb, hvilke stykker blev ligeret i EcoRI-stedet i lambda-ZAP-arme (Stratagene). Bibliotekerne blev amplificeret i E. coli stamme LE392 og blev screenet ved plaque-hybridisering som beskrevet (Maniatis, T. et al., Mo-35 lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Par af 37 DK 176140 B1 delvis overlappende, komplementære oligonukleotider svarende til peptider N-l, N-3, V-2 og T-l, blev anneleret (eng.: annealed), blev mærket med Klenow- fragment og fire (32P)α-dNTP’er og blev anvendt til at 5 undersøge nitrocellulosefilteraftryk af bibliotekerne.
Hybridisering og vaskebetingelser var, som beskrevet (Maniatis et al., se ovenfor). Positive kloner blev ! plaque-oprenset, og cDNA-indføjelserne blev frigjort ved coinfektion med en hjælperfag ifølge leverandørens j 10 instruktioner. Sekventering af enkeltstrenget og dob- j beltstrenget DMA blev udført ved dideoxynukleotid- metoden. Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. bind 74, 5463-5467 (1977).
15 Pigur 8a viser nukleotidsekvensen for plasminogen-aktivator-cDNA og aminosyresekvensen for aktivatoren (aktivatorerne). Nukleotidsekvensen strækker sig fra 5'-enden af den længste klon og gennem den åbne læseramme. En yderligere 800 nukleotid lang ikke-transla-20 teret 31-sekvens, som ender i en poly(A)-hale, er ikke vist. Nukleotidsekvensen er nummereret til venstre for hver linie, hvor den foreslåede begyndelseskodon er den første base. Den forudsagte aminosyresekvens er vist i enkeltbogstavkode og nummereret til højre for 25 hver linie. Aminosyresekvenserne bestemt for Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L) er understreget og betegnet som N-l, N-2 henholdsvis N-3. Bat-PA(H) svarer til en form i fuld længde, hvor signalpeptidet spaltes ved en position, som er analog med signalspaltningsste-30 det i tPA. Bat-PA(I) begynder med de samme tre aminosyrer som Bat-PA(H) efterfulgt af sekvenser begyndende med N-2 svarende til EGF-domænet. Bat-PA(I) svarer således til en finger-minus-form af Bat-PA(H). Bat-PA(L)’s unikke aminosyresekvens begynder med de samme 35 tre aminosyrer efterfulgt af den del af polypeptidet, som begynder ved N-3, med undtagelse af at den anden 38 DK 176140 B1 aminosyre af N-3 er udskiftet fra threonin til prolin efter EGF-domænet og forårsager en finger-minus- og EGF-minus-form af proteinet. Aminosyresekvenserne for to proteolytiske fragmenter fra Staphylococcus V8 (V-5 1, V-2) og et tryptisk fragment (T-l) er også under streget. En stiplet understregning indicerer aminosyre-rester, som ikke kunne bestemmes eller som ikke stemmer overens med de aminosyrer, der er forudsagt fra cDNA. Lokaliseringen af det aktive sted. Ser, som blev 10 mærket med (3H) DIFP, er mærket (*). De forudsagte N-koblede glycosyleringssteder er angivet med indrammede aminosyrer.
Oligonukleotid-primere blev syntetiseret baseret på 15 tre fagkloner indeholdende BatPA-cDNA. BatPA-cDNA-klonerne blev udsat for amplifikation ved polymerase-kædereaktionen (PCR) (se U.S. patent nr. 4.800.159, spalte 2, linierne 36-68, spalte 3-4 og spalte 5, linierne 1-20, hvilket er medtaget her ved henvisning).
20 cDNA-strengene blev opvarmet, indtil de adskilte sig, på hvilket tidspunkt de primere, som bindes til hver streng, blev tilsat. Primerne instruerede DNA-polyme-rasen, der udfører dans replikationsfunktion, til at kopiere en bestemt del af strengen. Processen blev 25 fortsat med en serie af opvarmnings- og afkølings-cycluser, opvarmning til at separere strengene og afkøling, medens kopierne blev fremstillet. Cycluserne blev gentaget for at frembringe flere kopier af de specielle strenge. Ved ampifikation blev det kodende 30 domæne, hvortil terminale restriktionssteder er knyttet, opnået.
Ekspressionsvektorer for de tre flagermus-plasminogen-aktivatorformer (Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L)) 35 blev fremstillet som nedenfor beskrevet og blev derefter ved transfektion overført i celler i overensstem- i 39 DK 176140 B1 melse med en protokol med kortvaring transfektion (anvendt til kvalitativt at bestemme, om der er opnået en vellykket ekspression) eller en protokol med stabil transfektion (fortrinsvis anvendt til at etablere 5 levedygtige kloner).
I protokollen med kortvarig transfektion'blev 2,5 x 106 celler/100 mm plade udpladet i 10 ml medium 24 timer før transfektion. To til fire timer før transfek-10 tion blev mediet skiftet. Et DNA/CaPO^-præcipitat blev fremstillet ved at fremstille filtersteriliseret rekom-binant-BatPA-pD5 plasmid-DNA i en koncentration på 5 ug/250 μΐ ddH2O for hver 100 mm plade. Dette blev blandet med 500 μΐ 0,5 M CaCl2 og ddH? O til et slut-15 volumen på 1 ml. En ml 2 x HBS blev dråbevis tilsat under let omblanding. Præparationen henstod ved stuetemperatur i 10 til 30 minutter, og præcipitatet blev jævnt dryppet på pladen med forsigtig omhvirvling.
Efter dette trin adskiller protokollen sig lidt af-20 hængigt af de celler, som skal transficeres. CV1- celler blev inkuberet i 4 timer ved 37°C i 10% COa, medens COS7- og 293-celler blev inkuberet 4 timer ved 37°C og 6% CO2· Fire timer efter transfektion blev mediet fjernet fra 293-celler. Fire timer efter transfek-25 tion blev CV1- og COS7-celler udsat for et glycerolchok i 2 minutter (15% glycerol i mediet) og blev skyllet to gange med PBS. Der blev tilsat frisk medium.
Cellerne blev inkuberet ved 37°C og analyseret 24, 48 og 72 timer efter transfektion.
30 I protokollen med stabil transfektion blev protokollen fra kortvarig transfektion fulgt med følgende modifikationer: 5 x 103 celler pr. 100 mm plade blev udpladet i stedet for 2,5 x 106 pr. 10O mm plade: 0,5 ug Neo- 35 ekspressionsplasmid blev tilsat til DNA/CaPOi-præcipitatet for G418-selektion. Cellerne blev udsat for 40 DK 176140 B1 selektion i 48 timer med mediumskift med 2 til 3 dages interval, indtil der fremkom G418-resistente kolonier.
Intermediære vektorer og ekspressionsvektorer blev 5 fremstillet på følgende måde for de forskellige flagermus-plasminogen-aktivatorformer.
I. Bat-PA(H) 10 1. Naturlig 5'NTL: Bat-PA(H)-cDNA'er blev afledt fra cDNA-biblioteket ved PCR-amplifikation af cDNA under anvendelse af oligodeoxynukleotidparrene 141 og 142 samt 27 og 19, vist nedenfor som p.rimere:
Bgl II
15 141 5’ > ATA TAT AGA TCT AGG GAC ACC GCA CAA ATG
GTG > 3‘
Spe I Bgl II
14 2 5' > ATA TAT GAG CTC AGA TCT CAG GGA GTT GCG
TAT TCT TGG > 3’
20 Hind III spe I
27 5 * > ΑΤΑ TAA GCT T AC TAG TAG GGA CAC CGC
ACA AAT GGT G > 3' met
Xbal Sac I
25 19 5 > TAT ATC TAG A GA GCT CCA GGG AGT TGC GTG
TTC TTG G > 3‘
PCR blev udført i et reaktionsvolumen på 100 μΐ omfattende 10 mM Tris-Cl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM
30 MgCl2, 200 μΜ af hver af dNTP, 100 picomol af hver PCR-primer, 10-100 ng cDNA eller DNA fra biblioteket og 2,5 enheder Taq-polymerase. Reaktionen blev programmeret i en DNA-termocycler for 30 cycluser. Hver cy-clus omfattede 2 minutters denaturering ved 94°C, 2 35 minutters annelering ved 60°C og 2 minutters polymeri-sering ved 72°C. Amplificerede cDNA’er blev gel- 41 DK 176140 B1 oprenset og blev derefter restriktionsbehandlet med Bglll og ligeret i pSP73-BglII-stedet. Efter sekvensbekræftelse blev de åbne læserammer fra Bat-PA(H) subklonet i den eukaryote ekspressionsvektor pD5, som 5 indeholdt den vigtige sene adenoviruspromotor, til frembringelse af pSZ88-104-20 (se figur 9). 293-Cellar blev transficeret med pSZ88-104-20 til frembringelse af 293-Bat-PA-l-pattedyrceller (ATCC nr. CRL 10180).
E. coli-celler blev transficeret med pSZ88-104-20 til 10 frembringelse af BPA-CN-pSZ88-104-20 bakterieceller (ATCC nr. 68050).
2. 51-Kozak-NTL: Bat-PA(H)-cDNA'er blev PCR-amplifice-ret som ovenfor beskrevet under anvendelse af oligo-15 deoxynukleotidparrene 18 og 19 som primers:
Hind III Spe I Nco I
18 5’ > ΑΤΑ TAA GCT TAC TAG TCC ACC.ATG GTG
met on AAT ACA ATG AAG AC > 3'
Amplificerede cDNA'er blev gel-oprenset og blev derefter spaltet med Xbal og Hindlll efterfulgt af 25 ligering i den intermediære vektor pSP73 mellem dens Xbal- og Hindlll-restriktionssteder til frembringelse I af PSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 og p89WO-8. De åbne
Bat-PA(H)-læserammer blev yderligere subklonet i SacI/
Spel-stedet i pD5-mcs-vektoren, der indeholdt et 30 multikloningssted i stedet for det oprindelige BamHI-kloningssted til frembringelse af pSZ89-lll-17, pSZ89-112 og pSZ89-113 (se figur 10) . E. coli-celler blev transficeret med pSZ89-lll-l7 til frembringelse af BPA-CK-pSZ89-lll-17-bakterieceller (ATCC nr. 68052).
35 42 DK 176140 B1 II. Bat-PA(I) Åbne Bat-PA{I)-læserammer blev afledt fra cDNA-biblio-teket ved den samme PCR-procedure, der er beskrevet 5 ovenfor, og blev genkendt ved deres mindre størrelse i forhold til den komplette isoform. Bat-PA(I), som indeholdt den naturlige NTL, blev afledt fra oligo-deoxynukleotidparret 27 og 19, hvorimod det Bat-PA(I), som indeholdt Kozak-NTL, blev afledt fra oligodeoxy-10 nukleotidparret 18 og 19. Amplificerede, åbne Bat-PA (I)-læserammer blev spaltet med Hind'III og Xbal til kloning i pSP73 til frembringelse af p89WO-14, p89WO-5,6, p89WO-9 og p89FWO-12 eller blev spaltet med Spel og SacI til kloning i pD5-mcs-vektoren til frembrin-15 gelse af p89WO-l, p89WO-2, A, B, C , p89WO-3 og p89WO--4 {se figur 11). E. coli-celler blev transficeret mad p89WO-l til frembringelse af BPA-FK-p89WO~l-bakterie-celler (ATCC nr. 68051). E. coli-celler blev transficeret med p89WO-2C til frembringelse af BPA-FN-20 p89WO-2C-baktei-ieceller (ATCC nr. 68053).
III. Bat-PA(L) Åbne Bat-PA(L)-læserammer blev afledt fra cDNA-biblio-25 teket ved den samme PCR-amplifikation af DNA fra biblioteket med oligodeoxynukleotidparret 18 og 11,4 som primåre.
11.4 5 > CCT TTC TCC TGA TGA CCT TC > 3'
Amplificeret DNA blev gel-oprenset og derefter skåret 30 med Ncol, og det mindste af de tre Ncol-fragmenter, som koder for 5’-delen af Bat-PA(L), blev igen gel-oprenset og ligeret til Ncol-spaltet p89WO-ll (en åben Bat-PA(H)-læseramme i pSP73) til frembringelse af p89WP-17 henholdsvis p89WP-18. De åbne Bat-PA(L·)-35 læserammer blev derefter frigjort fra de intermediære vektorer ved spaltning med SacI og Spel og blev DK 176140 B1 43 subklonet i pD5-mcs-vektoren, hvilket gav p89W-20A&B og p89WP-19A&B (se figur 12). E. coli-celler blev transficeret med p89WP20A til frembringelse af BPA-DK-p89WP20A-bakterieceller {ATCC nr. 68049).
; 5
Fibrin-agarplade-analyser af konditioneret medium fjernet 48 timer efter transfektion af COS-7 viste 50 ng/ml BatPA.
10 Klon pSZ88-104-20 fandtes at være den bedste ekspres-sor. Denne klon blev etableret i 293-celler og udtrykte mere end 0,5 pg pr. ml pr. dag BatPA-aktivitet/sammen-flydende monolag. Konstant eksponering for butyrat og mediumoptimering .boostede ekspressionsniveauet til 15 mere end 10 ug pr. ml pr. dag. Andre egnede ekspressionsvektorer er pSZ89-111-17 (et derivat af pSZ38-104-20 med en Kozak 5'-NTL i stedet for en naturlig 5'-NTL), EBV/EBNA/D5BatPA-C og CMVIE-AKl-BatPA-C og HIV LTR/BatPA-C.
20
Sammenligning med human vavsplasminogen-aktivator
Nedenfor er vist en sammenligning af den primære aminosyresekvens-struktur af human vævsplasminogen-25 aktivator og BatPA(H) ifølge opfindelsen.
30 35 44 DK 176140 B1 1 10 human t-PA GARSYQVICRDE 5 Bat-PA(H) GSRAYGVACRDE -3 7 20 ktqmiyqqhqsw •ktqmiyqqqesw 10 17 30
LRPVLRSNRVEY
lrpevrskrveh 27 15 40 CWCNSGRAQCHS CRCDR GLAQCHT 37 50 60
20 VPVKS CSEPRCF
VPVKS CSELRCF
47 57 70 nggtcqnalyfs
25 NGGTRWNAASFS
67 80 dfvcncpegfag
DFVCNCPKGYTG
30 77 90
KCCEIDTRATCY
KQCEVDTHATCY
87 Λ
.J
45 DK 176140 B1 100
- human t-PA EDQGI S Y R G T W S
Bat-PA(H) KDQGVTYRGTWS
97 110 120 TAESGAECTNWN TSESGAQCINWN 10 117 107 117 130
SSALANKPYSGR
snlltrrtyngr 127 15 14 0 rpda i rlglgnh rsda itlglgnh 137 150 20 nycrnpdrdskp nycrnpdnnskp 147 160 wcyvfkagkyss
25 WCYV IKASKFIL
157 170 180 efcstpacsegn efcsvpvcska i 30 167 176 190 human t-PA SDCYFGNGSAYR 35 DK 176140 B1 46 200
5 human t-PA GTHSL TESGASC
210
LPWNSMILIGKV
10 220 YTAQN PSAQALG 15 230 240
LGKHNYCRNPDG
20 250 dak pw chvlknr 260 RLTWE YCDVPSC 25 270
human t-PA STCGL RQYSQPQ
Bat-PA(H) TCGLRKYKEPO 30 177 180 280
FRIKG GLFADIA
LHSTG GLFTDIT
190 35 DK 176140 B1 47 290 300
5 human t-PA SHPWQAA I FAKH
Bat-PA(H) SHPWQAAI FAQN 200 210 310
.RRSPGERFLCGG 10 RRSSGERFLCGG
220 320 ilisscwilsaa IL I SSC WVLTAA i5 230 330 hcfqerfpphhl hcfqeryppqhl 240 20 340
TVI LGRTYRVVP
RVVLGRTYRVKP
250 350 360
,5 GEEEQKFEVEKY
gkeeqtfevekc 260 270 370
IVHKEFDDDTYD
^ IVHEE FDDDTYN
280 380 ndiallqlksds ndiallqlksgs 290 35 390 DK 176140 B1 48
human t-PA SRCAQESSVVRT 5 Bat-PA(H) PQCAQESDSVRA
300 400 VCLPPADLQLPD ICLPEANLQLPD 10 310 410 420
WTECELSGYGKH WTECELSGYGKH
320 330 15 430
EALSPFYSERLK KS SSPFYSEQLK
340 440 20 eahvrlypssrc
EGHVRLYPSSRC
350 450
TSQHLLNRTVTD 25 TSKFLFNKTVTK
360 460
NMLCAGDTRSGG
NMLCAGDTRSGE
30 370 470 480
PQANLHDACQGD
ihpnvhdacqgd 380 390 35 490 49 DK 176140 B1
human t-PA SGGPLVCLNDGR Bat-PA(H) SGGPLVCMNDNH
400 5 500
MTLVGI ISWGLG MTLLGIISWGVG
410 510
10 CGQKDVPGVYTK
CGEKDI PGVYTK 420 520
VTNYLDWIRDNM 15 VTNYLG WIRDNM
430
530 R P R P
20 440
Fibronectin-finger-domænet i human tPA (sekvens 9-46) har 78% homologi med Bat-PA(H) sekvens 6-43. Domænet for epidermal vækstfaktor i human tPA (sekvens 46-95) 25 har 75% homologi med Bat-PA(H) sekvens 43-92. Det første "kringle"-domæne i human tPA (sekvens 95-177) har 67% homologi med Bat-PA(H) sekvens 92-174.
Det andet "kringle"-domæne i human tPA (sekvens 178-30 265) har ingen modpart i Bat-PA(H). Bat-PA(H)-amino- syrerne 175 og 176 er lysin og alanin. Aminosyrerne 190-441 i Bat-PA(H), den "lette kæde", har 74% homologi med human tPA sekvens 280-531 for den lette kæde.
35 Figur 8b er en skematisk gengivelse af aminosyresekven-sen for Bat-PA(H) og sammenligning med human t-PA
50 DK 176140 B1 (Pennica et al., Nature, bind 301, 214-221 (1983)). De individuelle aminosyrer i Bat-PA er angivet med en enkeltbogstavkode. De udfyldte cirkler viser aminosyre-identitet mellem Bat-PA(H) og human t-PA. Åbne cirkler 5 repræsenterer divergerende aminosyrerester. Det foreslåede disulfid-mønster er tegnet analogt med t-PA. De postulerede N-koblede glycosyleringssteder er angivet ved en tilføjet klamme.
10 Ud over de naturlige derivater Bat-PA(I) og Bat-PA(L) af denne plasminogen-aktivafcor er andre derivater ifølge den foreliggende opfindelse plasminogen-akti-vatorer, som udelukker enten finger-domæne-området (aminosyrerne (-3)-43) eller området for den epidermale 15 vækstfaktor (aminosyrerne 43-84) . Et andet derivat er Bat-PA(H) med muterede kulhvdratholdige aminosyrerester. Alle udviste ønskelige plasminogen-aktiverende egenskaber, herunder længere halveringstid.
20 Inden for opfindelsens rækkevidde er også fusionsproteiner mellam den lette kæde af Bat-PA'er (sekvens 190-441) og den tunge kæde af human tPA (sekvens 1-278) samt derivater deraf med plasminogen-aktiverende egenskaber. Eftersom de proteolytiske domæner af Bat-25 PA'er ikke væsentlig inaktiveres af type 1-plasminogen-aktivatorinhibitor, formoder vi, at fusionsproteinerne vil have forbedrede farmakologiske egenskaber i forhold til human vævsplasminogen-aktivator.
30 Som tidligere nævnt stimuleres aktiviteten af flager-mus-plasminogen-aktivatorer dramatisk i nærværelse af en fibrin-cofaktor. Den synes at være mindst 90 gange mere selektiv end tPA over for fibrin-bundet plasminogen. Det andet ’'kringle'*—domæne af tPA rummer et 35 lysin-bindingssted, hvilket formodes at spille en afgørende rolle ved mediering af fibrin-induceret 51 DK 176140 B1 stimulering af aktivitet. I modsætning hertil viser aminosyresekvensen af aktivatoren ifølge den foreliggende opfindelse, at dens markante fibrin-selektivitet ikke skyldes tilstedeværelsen af et område, som ligner 5 det andet "kringle"-domæne i tPA. Flagermus-plas-minogen-aktivatorers manglende evne til at bindes til Lys-Sepharose viser endvidere, at tilstedeværelsen af et lysin-bindingssted ikke er ansvarlig for den fibrin-specifikke aktivering af plasminogen.
10 "Kringle”-domænet i aktivatorerne ifølge opfindelsen medierer fibrin-induceret stimulering af aktivitet på trods af dets forskelle fra det andet "kringle"-område i tPA.
15
Aktivatorerne adskiller sig også strukturelt fra tPA ved fravær af et plasmin-følsomt processeringssted i flagermus-enzymet.
20 De ovenfor beskrevne Bat-PA-proteiner er blevet defineret ved hjælp af den fastlagte DNA-sekvens og den udledte aminosyresekvens. Det skal forstås, at naturlige alleliske variationer eksisterer. Disse variationer kan demonstreres ved (en) aminosyre-forskel(le) i 25 den samlede sekvens eller ved deletioner, substitutioner, indføjelser, inversioner eller tilføjelser af (en) aminosyre(r) i sekvensen. Endvidere vil glycosy-leringsstedet og glycosyleringsgraden afhænge af naturen af værtscellemiljøet.
30
Ved at anvende rekombinant-DNA-teknologi er der et potentiale for at fremstille forskellige flagermus-plasminogen-aktivatorderivater, der er modificeret forskelligt ved enkle eller multiple aminosyresubstitu- 35 tioner, deletioner, tilføjelser eller udskiftninger, f.eks. ved hjælp af stedstyret mutagenisering af det 52 DK 176140 B1 grundliggende DNA. Alle sådanne alleliske variationer og modifikationer, der resulterer i derivater af flagermus-plasminogen-aktivator, ligger inden for den foreliggende opfindelses rækkevidde, så længe den 5 essentielle egenskab for flagarmus-plasminogen-akti-vatoraktivitet forbliver upåvirket. Flagermus-plas-minogen-aktivatoren fremstilles (1) med methionin som dens første aminosyre (til stede på baggrund af ATG-startsignalkodonindføjeisen foran det strukturelle 10 gen) eller (2) hvor methioninen spaltes intracellulært eller ekstracellulært, idet den har dens normale første aminosyre eller (3) sammen med enten dens signalpolypeptid eller et andet konjugeret protein end det traditionelle signalpolypeptid, hvor signalpolypep-15 tidet eller konjugatet specifikt kan spaltes i efc intra- eller ekstracellulært miljø (se britisk patentansøgning publikation nr. 2.007.676A) eller (4) ved direkte ekspression i moden form uden at det er nødvendigt at fraspalte noget fremmed, overflødigt 20 popypeptid. Sidstnævnte er specielt vigtig, når en bestemt vært ikke kan aller ikke effektivt kan fjerne st signalpeptid, hvor ekspressionshjælpemidlet er udformet til at udtrykke plasminogen-aktivatoren sammen med dens signalpeptid. Den således frembragte 25 plasminogen-aktivator i dens forskellige former indvindes og oprenses i alle tilfælde til et niveau, der passer til dens brug ved behandlingen af forskellige vasculære tilstande eller sygdomme.
30 Terapeutisk behandling
Disse proteiner kan indgives ved hjælp af en hvilken som helst passende fremgangsmåde, der vil resultere i, at de går ind i blodstrømmen i en væsentlig mængde.
35 Intravenøs indgivelse antages for tiden at være den foretrukne indgivelsesvej. Proteinerne er opløselige i 53 DK 176140 B1 vand, og de kan derfor indgives effektivt i opløsning.
I et eksempel på anvendelse indgives en passende mængde af proteiner ifølge den foreliggende opfindelse 5 intravenøst i en person, der har haft et hjerteanfald.
Passende doser fil opnåelse af thrombolyse er op til 200 mg, fortrinsvis mellem 25 mg og 150 mg, og mere fortrinsvis mellem ca. 25 mg og 50 mg.
10 Proteinerne kan også indgives i de ovenfor nævnte doser ved successive bolus-injektioner over en periode på adskillige timer.
Proteinerne kan indgives sammen med blodpladeaggrega-15 tionshæmmere til frembringelse af en kombineret effekt af thrombolyse og blodpladeaggregationshæmning. En samtidig indgivelse omfatter intravenøs indgivelse af blodpladeaggregationshæmroerne i en mængde til hæmning af blodpladeaggregation, f.eks. en mængde, hvormed der 20 opnås en ligevægtsplasmakoncentration på mellem 0,05 og 2 μΜ.
25 30 t 35

Claims (18)

54 DK 176140 B1 Pa tentkrav
1. Glycosyleret eller uglycosyleret plastminogen-aktiverende protein, der har mindst 90% homologi med følgende aminosyrese-5 kvens: Ala Tyr Gly Asp Pro His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Giy Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly 10 Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser
20 Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr·Lys Asn H ^ Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn 25 val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 30 hvilket protein kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasminogen. -------- -----------------— " 55 DK 176140 B1
2. Glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90% homologi med følgende aminosyresekvens: Met Val Asn Thr Met Lys Thr Lys Leu Leu Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala val Phe Ser Leu Pro Arg Gin Glu Thr Tyr Arg Gin
3. Glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90¾ homologi med følgende aminosyresekvens. Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys T’nr Gin Met Ile Tyr
4. Glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende protein, der har mindst 90% homologi med følgende aminosyresekvens: Ala Tyr Gly Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
5. Antistof, der specifikt reagerer med glycoproteinet ifølge krav 1-4. DK 176140 B1 58
5 Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser
5 Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser ^0 Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn. Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe ^ Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys 2q Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu
25 Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro hvilket protein kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plastni nogen 30 57 DK 176140 B1
5 Leu Ala Arg Gly Ser Arg Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin Gin Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gin Cys His Thr Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gin Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gin Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gin Cys ^ Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gin Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gin Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys ^ Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val
20 Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser
25 Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Val •His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro hvilket protein kræver en fibrin-cofaktor ror at aktivere plasminogen . 56 i DK 176140 B1
6. Glycosyleret eller uglycosyleret plasminogen-aktiverende fusionsprotein, der omfatter en sekvens af aminosyrer svarende til aminosyrerne 190-441, som vist i figur 8a, og en sekvens for tung kæde fra vævstype-plasminogen-aktivator, hvilket protein har 5 større plasminogen-aktiverende aktivitet i nærværelse af type-1-plasminogen-akcivatorinhibitor end vævsplasminogen-aktivator i nærværelse af type-l-plasminogen-aktivatorinhibitor har.
7. Farmaceutisk præparat til aktivering af fibrin-bundet plasmi-10 nogen, der indeholder en effektiv mængde af glycoproteinet ifølge krav 1-4.
8. DNA-sekvens, der koder for et glycoprotein ifølge krav 1.
9. DNA-sekvens, der koder for et glycoprotein ifølge krav 2.
10. DNA-sekvens, der koder for et glycoprotein ifølge krav 3.
10 Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gin Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Gin Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg ^ Tyr Pro Pro Gin His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gin Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gin Cys Ala Gin Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gin 2Q Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gin Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Lys Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile His Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu
25 Leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro hvilket protein kræver en fibrin-cofaktor for at aktivere plasmi-30 nogen.
11. DNA-sekvens, der koder for et glycoprotein ifølge krav 4. 20
12. Replikerbart kloningshjælpemiddel, der omfatter en indføjet DNA-sekvens ifølge krav 8.
13. Replikerbart kloningshjælpemiddel, der omfatter en indføjet 25 DNA-sekvens ifølge krav 9.
14. Replikerbart kloningshjælpemiddel, der omfatter en indføjet DNA-sekvens ifølge krav 10.
15. Pattedyrcelle transficeret med et kloningshjælpemiddel iføl ge krav 14. _____ ___V______ • DK 176140 B1 59
16. Bakteriecelle transficeret med et kloningshjælpemiddel ifølge krav 14.
17. Replicerbart kloningshjælpemiddel omfattende en indsat DNA-5 sekvens ifølge krav 11.
18. Fremgangsmåde til oprensning af et plasminogen-aktiverings-protein med en molekylvægt på mindre end 50.000 Dalton omfattende følgende trin: 10 (a) homogenisering af underkæbespytkirtler fra Desmodus rotundus vampyrflagermus til dannelse af en blanding og centrifugering af blandingen til frembringelse af en supernatantfrakcion; 15 (b) klaring og koncentration af supernatantfraktionen; (c) påføring af retentatet på en phosphocellulose-kation-byttersøjle og absorbering af plasminogen-aktivatoren på søjlen; 20 (d) eluering af søjlen til opnåelse af fraktioner indeholdende plasminogen-aktiverende proteiner; (e) samling af fraktionerne og påføring af de samlede fraktioner på en affinitetssøjle med immobiliseret Erythrina-trypsin- 25 inhibitor (ETI); (f) fraktionering af plasminogen-aktivatorerne ved højtryksvæskekromatografi; og 30 (g) separering af plasminogen-aktivatorerne ved SDS- polyacrylamid-gelelektroforese.
DK198903575A 1988-07-20 1989-07-19 Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer DK176140B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22169788A 1988-07-20 1988-07-20
US22169788 1988-07-20
US37722189A 1989-07-13 1989-07-13
US37722189 1989-07-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK357589D0 DK357589D0 (da) 1989-07-19
DK357589A DK357589A (da) 1990-01-23
DK176140B1 true DK176140B1 (da) 2006-09-25

Family

ID=26916041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198903575A DK176140B1 (da) 1988-07-20 1989-07-19 Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5830849A (da)
EP (1) EP0352119B1 (da)
JP (1) JP2713467B2 (da)
KR (1) KR0138997B1 (da)
AT (1) ATE126269T1 (da)
AU (1) AU621389B2 (da)
CA (1) CA1341090C (da)
DE (1) DE68923741T2 (da)
DK (1) DK176140B1 (da)
ES (1) ES2076965T3 (da)
FI (1) FI100403B (da)
GR (1) GR3017587T3 (da)
IE (1) IE69054B1 (da)
IL (1) IL91059A (da)
NO (2) NO302954B1 (da)
NZ (1) NZ230017A (da)
PT (1) PT91236B (da)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01500322A (ja) * 1986-03-28 1989-02-09 クリエイティブ　バイオモレクレス，インコーポレーテッド 組織プラスミノーゲンアクテイベーター類縁蛋白質
US6008019A (en) * 1989-02-13 1999-12-28 Schering Aktiengesellschaft Plasminogen activator from saliva of the vampire bat
AU642404B2 (en) * 1989-02-13 1993-10-21 Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen Novel thrombolytic
DE3943241A1 (de) * 1989-12-22 1991-06-27 Schering Ag Thrombolytisch wirkendes kombinationspraeparat
EP0455424A3 (en) 1990-05-02 1992-04-29 Merck & Co. Inc. Mammalian inducible promoter cascade system
ES2082465T3 (es) * 1991-04-16 1996-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Unidad farmaceutica de envasado que contiene activadores de plasminogeno para la administracion multiple de bolos.
US5910481A (en) * 1995-11-13 1999-06-08 Immuno Ag Hybrid proteins with modified activity
US5945432A (en) * 1995-12-22 1999-08-31 The University Of Vermont And State Agricultural College Thrombolytic agents and thienopyridine derivatives in acute stroke
US5731186A (en) * 1996-02-05 1998-03-24 Schering Aktiengesellschaft Method for the production of rDSPA α1
DE10153601A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
PL1622639T3 (pl) * 2003-05-02 2013-06-28 Lundbeck H As Dożylne wstrzyknięcie nieneurotoksycznych aktywatorów plazminogenu do leczenia udaru mózgu
US20060135425A1 (en) * 2003-05-02 2006-06-22 Paion Deutschland Gmbh Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke
WO2004096267A1 (de) * 2003-05-02 2004-11-11 Paion Gmbh Intravenöse injektion nicht-neurotoxischer plasminogen-aktivatoren zur behandlung von schlaganfall
DE10342518A1 (de) * 2003-09-12 2005-05-12 Paion Gmbh Plasminogen-Aktivatoren mit verringerter Lysin-Bindungskapazität
TWI482628B (zh) * 2007-10-18 2015-05-01 Lundbeck & Co As H 新穎之血栓溶解病患次群
EP2289541A1 (en) 2009-08-31 2011-03-02 PAION Deutschland GmbH Treatment of neurological or neurodegenerative disorders
EP2289542A1 (en) 2009-08-31 2011-03-02 PAION Deutschland GmbH Treatment of neurological or neurodegenerative disorders
WO2018141909A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Acticor Biotech Inhibition of platelet aggregation using anti-human gpvi antibodies
CN110913890A (zh) 2017-05-16 2020-03-24 国家医疗保健研究所 用于治疗急性缺血性中风的方法和药物组合物
EP3806833A1 (en) 2018-06-15 2021-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3kc2b inhibitors for the preservation of vascular endothelial cell barrier integrity
WO2021148439A1 (en) 2020-01-21 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for stimulating cerebrovascular function
WO2021249974A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fucoidan-functionalized polysaccharide particles with t-pa for targeted thrombolytic therapy
WO2023156683A1 (en) 2022-02-21 2023-08-24 Acticor Biotech Treatment of cardiovascular diseases using anti-human gpvi antibodies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US5010002A (en) * 1983-01-19 1991-04-23 Genentech, Inc. Human t-PA production using vectors coding DHFR protein
WO1987005934A1 (en) * 1986-03-28 1987-10-08 Roberto Crea Protein analogues of tissue plasminogen activator
ZA887556B (en) * 1987-10-09 1989-07-26 Monsanto Co Modified tissue plasminogen activator
AU642404B2 (en) * 1989-02-13 1993-10-21 Schering Aktiengesellschaft Berlin Und Bergkamen Novel thrombolytic

Also Published As

Publication number Publication date
KR910003094A (ko) 1991-02-26
NO892976L (no) 1990-01-22
CA1341090C (en) 2000-08-29
GR3017587T3 (en) 1995-12-31
IL91059A0 (en) 1990-02-09
ATE126269T1 (de) 1995-08-15
US5830849A (en) 1998-11-03
NO970603L (no) 1990-01-22
NO970603D0 (no) 1997-02-10
FI893500A0 (fi) 1989-07-19
EP0352119B1 (en) 1995-08-09
KR0138997B1 (ko) 1998-04-30
AU621389B2 (en) 1992-03-12
NZ230017A (en) 1992-05-26
DE68923741T2 (de) 1996-02-15
NO314548B1 (no) 2003-04-07
DK357589D0 (da) 1989-07-19
IE892354L (en) 1990-01-20
EP0352119A3 (en) 1990-07-04
IE69054B1 (en) 1996-08-07
AU3891589A (en) 1990-01-25
FI893500A (fi) 1990-01-21
ES2076965T3 (es) 1995-11-16
DE68923741D1 (de) 1995-09-14
NO302954B1 (no) 1998-05-11
DK357589A (da) 1990-01-23
JP2713467B2 (ja) 1998-02-16
NO892976D0 (no) 1989-07-20
EP0352119A2 (en) 1990-01-24
PT91236A (pt) 1990-02-08
PT91236B (pt) 1995-03-01
FI100403B (fi) 1997-11-28
IL91059A (en) 1995-06-29
JPH02167075A (ja) 1990-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK176140B1 (da) Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer
US5278144A (en) Antithrombosis agents
JP4163517B2 (ja) フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）切断酵素
IE81046B1 (en) Activatable fibrinolytic and anti-thrombotic proteins
JPH05508150A (ja) 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体
JPH10513062A (ja) 細胞質アンチプロテイナーゼ−２及び細胞質アンチプロテイナーゼ−３並びにコーディング配列
US5795863A (en) Recombinant agents affecting thrombosis
RU2143490C1 (ru) Бифункциональный вариант урокиназы, плазмида, содержащая синтетический структурный ген, кодирующий бифункциональную урокиназу, плазмида (варианты), способ получения плазмиды, способ получения бифункционального варианта урокиназы, тромболитическое средство
NO308708B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et trombolytisk protein, samt isolert DNA, mikroorganisme og fremgangsmÕte for fremstilling av et farmasøytisk preparat
NO314848B1 (no) Protein for inhibering av kollagenfremkalt blodplateaggregering, DNA som koder for proteinet, vektor som omfatter et slikt DNA, vertscelletransformert medvektoren, fremgangsmåter for fremstilling og rensing avproteinet, farmasöytiskpreparat
NZ229691A (en) A t-pa analogue with at least one amino acid of native t-pa substituted for another between position 67 and 72
DK175369B1 (da) Anvendelse af tPA-varianter til fremstilling af et terapeutisk præparat til behandling af vaskulæresygdomme
EP0395375B1 (en) Novel DNA sequences which encode ancrod-like polypeptides and compositions comprising the expression products thereof
CA1341318C (en) Dna clones of human placental plasminogen activator inhibitor
JPH08231595A (ja) 繊維素溶解性のトロンビン阻害性質を有するキメラたん白質
JPH08511157A (ja) Ｘａファクター阻害活性を有する新規ポリペプチド
US5801017A (en) Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis
CA2083286C (en) Recombinant fibrinogenases, preparation and use thereof
EP0712934A2 (de) Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
FI100406B (fi) Menetelmä vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattoreiden valmist amiseksi
JPH04505252A (ja) Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的ヒトプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ―１）の高水準発現

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired