JPH05508150A - 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ８、　該第２の機能性構成要素がフィブリン溶解活性を有するものである、請求 項７に記載の多機能性分子。

９、　該第２の機能性構成要素がｔ−ＰＡである、請求項８に記載の多機能性分 子。

１０、該第２の機能性構成要素がペプチドを生体適合性ポリマーに結合する手段 である、請求項７に記載の多機能性分子。

１１、天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁 体ペプチドをコードする核酸配列。

１２、天然蛋白質配列における２９１位又は３８８位に位置するメチオニン残基 の少なくとも一方がペプチド結合により又はメチオニン以外の１またはより多く の異なるアミノ酸によって置換されており、ここに該数字が表１に提示されたア ミノ酸に言及するものである、請求項１１に記載の核酸配列。

１３、　置換コドンが、ロイシン、グルタミン及びアラニンよりなる郡より選ば れるアミノ酸をコードするものである、請求項１２に記載の核酸配列。

１４、多機能性トロンボモジュリン類縁体をコードする核酸配列であって、 １）　オキシダントに曝露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁体ペ プチド、および ２）　第２の蛋白質性の機能性構成要素よりなるものである核酸配列。

１５、該第２の機能性構成要素がＩＰＡである、請求項１４に記載の核酸配列。

１６、天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドをコードする核酸配列よりなる、組換えベクター。

１７、１）　オキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類 縁体ペプチド、及び ２）　第２の蛋白質性機能性構成要素よりなるものである、機能性分子ををコー ドする核酸配列よりなる、組換えベクター。

１８、該配列が発現調節配列に作動可能にリンクした、請求項１１に記載の核酸 配列。

１９、該配列が発現調節配列に作動可能にリンクした、請求項１４に記載の核酸 配列。

２０、　天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条 件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジ ュリン類縁体ペプチドの単位投与量の無菌的調製物よりなる、抗血栓活性を有す る薬剤組成物。

２１、該トロンボモジュリン類縁体ペプチド２９１位又は３８８位に位置するメ チオニンの一方又は双方がペプチド結合又はメチオニン以外のアミノ酸によって 置換されており、ここに該数字が表１に提示されたアミノ酸に言及するものであ る、請求項２ｏに記載の組成物。

２２、　トロンボモジュリン類縁体ペプチドの３８８位のメチオニンが置換され ているものである、請求項２１に記載の方法。

２３、天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドの有効量の無菌の水性溶液を投与することによる、哺乳類に おける血栓形成活性を制御する方法。

２４、天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドを結合させた表面を有する生体適合性ポリマーよりなる組成 物。

２５、１）　天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及 び条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボ モジュリン類縁体ペプチド、及び２）　第２の蛋白質性の機能性構成要素よりな るものである、多機能性トロンボモジュリン類縁体の単位投与量の無菌的ａｌｌ ！物よりなる、抗血栓形成活性及び第２の生物活性を育する薬剤学的組成物。

２６、第２の生物活性がフィブリン溶解活性である、請求項２３に記載の薬剤学 的組成物。

２７、１）　天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及 び条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボ モジュリン類縁体ペプチド、及び２）　第２の蛋白質性の機能性構成要素よりな るものである、多機能性トロンボモジュリン類縁体の有効投与量の無菌の水性溶 液を投与することによる、病理学的な血餅を育する哺乳類を治療する方法。

２８、　ａ）　天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度 及び条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロン ボモジュリン類縁体ペプチド、及びｂ）　多機能性分子であって、 ｌ）　オキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁体と 、及び ２）　第２の蛋白質性の機能性構成要素とからなるものである多機能性分子 よりなる群より選ばれる蛋白質をコードする核酸配列よりなる組換えベクターに よってトランスフェクトされた細胞。

２９、体重１キログラムあたり薬剤学的に許容しつる塩類溶液中の酸化抵抗性ト ロンボモジュリン類縁体ペプチドの０．００１乃至０．１ｍｇを静脈内投与する ことよりなる、ヒトにおける血栓症を防止する方法。

３０、トロンボモジュリン類縁体ペプチドの２９１位又は３８８位に位置するメ チオニンの一方又は双方がペプチド結合又はメチオニン以外のアミノ酸によって 置換されており、ここに該数字が表１に提示されたアミノ酸に言及するものであ る、請求項２９に記載の方法。

３１、トロンボモジュリン類縁体ペプチドの３８８位のメチオニンが置換されて いるものである、請求項３０に記載の方法。

明細書 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 発明の背景 発明の分野 本発明は、オキシダントに曝された後も活性を保持するトロンボモジュリンの可 溶性類縁体の生産及び使用に関する。これらの類縁体は、組換えＤＮＡ技術を用 いて製造され、例えば抗血栓療法等に有用である。新規の蛋白質、核酸遺伝子配 列、ベクター、薬剤及び血栓形成活性の阻害方法が開示される。

情報開示 安全で有効な抗凝固剤／抗血栓剤により治療すれば利益を得るであろう多くの疾 患状態が存在する。これらの状態の性質は種々である。例えば、抗凝固療法は、 心筋梗塞における又は、例えば敗血症等に関連した播種住血管内凝固（Ｄ　Ｉ　 Ｃ）の治療における、血栓溶解療法の際のような急性の状態において有用であろ う。抗凝固剤はまた、心臓弁理め込みを受けた患者における慢性的な使用又は深 部静脈血栓症（ＤＶＴ）のおそれを減少するための手術患者への予防的使用のよ うな、急性度の低い状態に対しても有用である。現在ヒトに使用することが承認 されている抗凝固剤は、一様に有効というわけではなく、より有効な化合物に対 する需要が存在する（例えば、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｅｎｏｕｓ　Ｔ ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｅｍｂｏｌｉｓｍ、　Ｃ。

ｎ５ｅｎｓｕｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｔａｔｅ ｍｅｎｔ、　Ｎ［Ｈ，１９８６，６（２）：１−２３．を参照）。

トロンボモジュリンは、実証された抗凝固作用を有する膜蛋白質である。ヒトに おいては、それは中枢神経系を除き血管系及びリンパ管の内皮上に広く分布して いる。それは、凝固カスケードにおける中心的酵素であるトロンビンの受容体と して機能する。遊離のときは、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに 変換しそして血小板を活性化することにより直接的にも、そして凝固カスケード 中の他の蛋白質（例えば、第Ｖ、第Ｖ［［Ｉ　、第Ｘ　ＩＩＩ因子）の活性化を 通じて間接的にも、凝固を促進する。トロンボモジュリンに結合したときは、し かしながら、トロンビンの凝固促進活性は阻害され、その主たる機能はプロティ ンＣの活性化へと切り換えられる。活性化されたプロティンＣは、今度は数カ所 において凝固過程を−１２２５１，を参照）。

天然のトロンボモジュリンをコードしている遺伝子は、数個の種より単離され、 いずれもゲノムの形態で且っｃＤＮＡとして配列が定められている（Ｒ，Ｊａｃ ｋｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　ＰＮＡＳ　８３：　８８３４−８８ ３８及び（＋９８７）　８４：　６４２５−６４２９．　これらのいずれも参照 によりここに導入する。）。ＬＤＬ受容体のような既知の蛋白質との比較は、機 能的ドメインを示唆している（Ｄ、　Ｗｅｎ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９８７）　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：　４３５０−４３５７）。ある研究は、５番目 及び６番目の表皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインがトロンビンに結合する能力を 有することを示唆しくＳ、　Ｋｕｒｏｓａｗａ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ：　Ｃｈｅｍ、　２６３：　５９９３−５９９６）　、別の研究 は、ＥＧ、Ｆ様ドメイン第４．５及び６が、トロンビン媒介プロティンＣ活性化 活性のための補因子として働くに十分であることを示唆している（Ｚｕｓｈｉ、 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６４：　１０ ３５１−１０３５３）。

天然形態におけるトロンボモジュリンは、固有のアミノ酸配列のためそれが膜結 合性であり、界面活性剤処理なしては不溶性であることから、抗凝固療法には適 さない。それは、剖検又は生検サンプルからの精製が実際的でないような僅かな 量（約３００ｍｇトロンボモジュリン／人）だけ存在している。

本発明者はまた、天然のトロンボモジュリンが酸化に弱く、酸化されるとプロテ ィンＣの活性化を促進する能力を失うことも発見した。抗凝固を必要としている 疾患状態の多くはまた、毒性酸素ラジカルの高いレベルとも関係しており、それ は生体分子を不活性化し且つ有意な組織障害を引き起こし得る。これらの状態の 例は、心筋梗塞に関連した再潅流傷害、敗血症に関連したＤＩＣ，及び成人呼吸 窮迫症候群に関連した肺胞繊維症である（Ｏｔａｎｉ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　（ １９ようないかなる外傷も、活性化された単球、多形核白血球等の流入を伴い、 それらはエラスターゼのような多数の蛋白分解酵素を遊離するとともに、毒性酸 素種を作り出し得る。内皮細胞障害、炎症及び血栓症の間の関連は久しく認識さ れてきた（例えば、Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕＪａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｏｕｎｄ　Ｒｅｐａｉｒ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｒ，Ａ、 Ｆ、及びＰ、Ｍ、　Ｈｅｎ５ｏｎ　！ｉ！、１９８８．を参照）。しかしながら 、本発明者は、トロンボモジュリンが毒性酸素種に曝されることによって不活性 化されること及びこのことが多くの病原的状態において重要な役割を演じている らしいということを認識した最初の者である。

可溶性のトロンボモジュリン様分子が、ヒト血漿及び尿中に非常に少量検出され た。これらの分子は、プロティンＣの活性化を促進する能力が低下しており、少 なくとも部分的な酸化のため、少なくとも部分的に不活性化されている可能性が ある。これらの分子が膜結合分子の分解産物であることが示唆されている（Ｈ， ［５ｈｉｉ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｍａｊｅｒｕｓ、　（１９８５）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｉｎｖ、　７６：　２１７８−２１８１）か、それらは特徴付けが困難な程 に非常に少量（〜ｏ、８ｍｇ／成人男子）にしか存在しない。精製された天然分 子の蛋白分解フラグメントが、トリプシンまたはエラスターゼを用いて製造され た（　ｌ５ｈｉｉ、上記、Ｋｕｒ。

分店性化を促進する能力を保持している。

天然蛋白質の活性の全てではないとしても大部分を保持しているトロンボモジュ リンの可溶性類縁体が製造され、係属中の、共に譲渡された１９８９年２月１７ 日に出願した米国特許出願第３１２．１４１号　、１９８９年４月２８日に出願 した米国特許出願第３４５．３７２号、１９８９年９月１３日に出願した米国特 許出願第４０６．９４１及び１９９０年２月１６日に出願したＷｏ　９０１００ ９５５に記述されており、ここに参照して導入する。更なる参照文献は、ＢＰ　 ２９０．４１９及びＷｏ　８８１０５０５３を含み、これらはヒトのトロンボモ ジュリン蛋白質をコードしたｃＤＮＡを開示している。トロンボモジュリンの類 縁体はまた、ＷＯ８８１０５０５３にも記述されており、これは種々の数のＥＧ Ｆ様ドノドメインする類縁体を開示している。

トロンボモジュリンの抗凝固作用を示し、血漿に可溶性であり、オキシダントへ の曝露による不活性化に対して抵抗性であり、そして容易に大量に製造される、 新しい組成物への需要が存在する。本発明は、これらの及び他の需要を満たして いる。

発明の概要 本発明は、トロンボモジュリンの特徴的な抗血栓活性を有するが、水性溶液に可 溶性であり、オキシダントに曝露された後も不活性化されないペプチドを提供す る。これらのペプチドは、類縁体と呼ぶが、少なくとも天然トロンボモジュリン の膜架橋ドメイン及び細胞質ドメインを欠いており（表１を参照）、加えて、天 然配列の特異的アミノ酸が除去され又は１若しくはより多くの異なるアミノ酸に 置換されている。特に、除去又は置換されたアミノ酸は、天然蛋白質配列の２９ １番目又は３８８番目の位置のメチオニン残基のいずれか又は双方である（表１ を参照）。好ましいｌの具体例においては、これらのメチオニンのいずれか又は 双方が、アミノ酸であるアラニン、ロイシン又はグルタミンに置換されている。

これらのメチオニンの置換は、オキシダントに曝露された後も活性を保持するペ プチドを作り出すのみならず、該新規ペプチドは、アミノ酸を置換していない等 価なペプチドに比較して増大した特異的活性を示し得る。更に提供されるのは、 酸化抵抗性トロンボモジュリン（ＴＭ）類縁体ペプチドをコードしたヌクレオチ ド配列、及び、これらの新規ヌクレオチド配列を含有する組換えベクターである 。これらのペプチドを原核細胞及び真核細胞中において製造するための方法が開 示される。

特に、本発明は、天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去してし まう濃度及び条件下にてオキシダントに曝露した後にも生物学的活性を保持する 、トロンボモジュリン類縁体ペプチドを提供する。トロンボモジュリン類縁体ペ プチドは、天然ペプチド配列のアミノ酸の少なくとも１つが１つ又はより多くの 異なるアミン酸によって置換されているペプチドよりなることが好ましい。好ま しいアミノ酸置換は、上述のメチオニン残基の置換である。最も好ましいのは、 ペプチド結合による（除去）又は１つ若しくはより多くのオキシダントに影響さ れないアミノ酸による、３８８番目のメチオニンの置換である。メチオニン残基 のための好ましい置換基は、ロイシン、グルタミン及びアラニンよりなる群より 選ばれるアミノ酸である。上述の類縁体が天然トロンボモジュリンと同じ又はよ り高い特異的活性を存していることもまた好ましい。特異的活性は、トロンビン に結合しプロティンＣのトロンビン媒介活性化を促進するペプチドの能力によっ て典型的に測定される。

本発明はまた、上述のような及び第２の機能的構成要素を含んでなる、多機能性 トロンボモジュリン（ＴＭ）類縁体をも提供する。

第２の機能的構成要素はｔ−ＰＡ様蛋白質のようなフィブリン溶解活性を有する ことが好ましい。第２の機能的構成要素は、ペプチドを生体適合性ポリマーに結 合する手段であってよい。

本発明は、更に、オキシダントへの曝露の後に活性を保持するトロンボモジュリ ン類縁体をコードする核酸の配列を提供する。該ペプチドは上述の通りであり、 プラスミノーゲン活性化因子様の蛋白質のような、タンパク質性の第２の機能的 構成要素をコードする配列を含むことができる。該配列は、当該組替えベクター を宿す細胞のゲノム中に導入される能力を有する、染色体外プラスミド又はトラ ンスフェクションベクターのような組替えベクターに組み込まれることができる 。該配列は、ホスト細胞に所望の類縁体ペプチドを表現させるようプロモーター に作動可能にリンクさせるさせることかできる。原核細胞及び真核細胞の双方が 、これらの組替えベクターに適したホスト細胞として開示される。

本発明は更に、上述のトロンボモジュリン類縁体ペプチドの単位投与量の無菌的 調製物よりなる、抗血栓活性を有する薬剤学的組成物を提供する。更に、該組成 物の有効量を投与することによる、唾乳類における血栓形成活性を制御するため の該薬剤学的組成物の使用方法も提供される。該薬剤学的組成物はまた、上記の 多機能構成要素をも含有する。加えて、これらの組成物はまた、天然トロンボモ ジュリンの生物学的活性を実質的に除去してしまう濃度及び条件下にてオキシダ ントに暴露した後にも生物学的活性を保持する、トロンボモジュリン類縁体ペプ チドを結合させた表面を有する生体適合性ポリマーをも含有する。

人の血栓症を防止するための更なる方法がここに開示される。該方法は、酸化抵 抗性トロンボモジュリン類縁体ペプチドを薬剤学的に許容し得る塩溶液中におい て体重１ｋｇ当たりｏ、ｏｏｔ乃至０．１ｍｇの投与量で静脈内投与することよ りなる。該類縁体は上記の通りである。

図面の簡単な説明 図ＩＡ及びＩＢは、天然トロンボモジュリンのドメイン、本発明の可溶性の酸化 抵抗性トロンボモジュリン（ＴＭ）類縁体に含まれる天然分子の各領域、各類縁 体ペプチド中の蒼然的突然変異部位、及び多機能性突然変異類縁体ペプチドを概 念的に示す。

図２は、ここに記載のトロンボモジュリン（ＴＭ）類縁体のだめの野性型（非突 然変異）遺伝子配列とクローニングプラスミドｐＵＣ，）ｃｒＴＭ７とを作り出 すためにＰＣＲ反応において使用するプライマーの２つを示す。

図３は、本発明にて記述される酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を作り出す ために使用される、部位指向性突然変異生成の方法を概念的に示す。

図４は、バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）伝達ベクターｐＴＭＨＹ １０１、及び、部位指向性突然変異生成反応において使用するための単鎖ＤＮＡ を作るためのベクターｐＴＨＲ１４を示す。

図５は、可溶性トロンボモジュリン類縁体ＤＮＦＬ（ｗｔ）及びＤＮＦＬ　（Ｍ ｓ、、Ｌ）のクロラミンＴによる酸化を示す。

図６は、Ｃｏｓ　７細胞上におけるクロラミンＴによる全長トロンボモジュリン 、ＦＴ−ＴＭの酸化を示す。

図７は、ｌｉｌｅｔｓｓｍが他の全てのアミノ酸に置換されているＳＴＭ−６Ｅ ＧＦ突然変異体のＡＰＣアッセイにおける活性を示す。

詳細な説明 本発明は、天然トロンボモジュリンの性質の実質的に全てを示すか、しかし血漿 に可溶性でありオキシダントに曝露後も活性を保持する新規の組成物を提供する 。また、これらの組成物を製造する方法も提供する。以下の詳細な説明は、本発 明のこれらのそして他の面を提示する。

トロンボモジュリンすなわちＴＭは、トロンビンの受容体として働く内皮細胞膜 蛋白質である。それは、十分な界面活性剤の存在下において細胞膜から遊離され ることができ、溶液中においてトロンビンに結合する能力を保持する。トロンボ モジュリンに結合すると、トロンビンは凝固促進性酵素から抗凝固酵素へと変換 される。特に、プロティンＣのトロンビン媒介活性化は、トロンビンがトロンボ モジュリンに結合すると大きく高められる、すなわちプロティンＣの活性化速度 はトロンビンがトロンボモジュリンに結合すると少なくとも１０００倍増大する 。

本発明者は、トロンボモジュリンの活性が、オキシダントに暴露された後は実質 的に除去されることを発見した。生理学的オキシダントの例は、スーパーオキシ ド及びヒドロキシルラジカル並びに過酸化水素及び次亜ハロゲン酸塩のような関 連種である。スーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルのような酸素フリーラ ジカル中間体は、正常の及び病理的な代謝過程により産生される。他の重要な毒 性オキシダントは、クロラミン類であり、次亜塩素酸塩のアンモニア又はアミン 類との反応によって形成される。Ｄｖｏｒａｋ、　）１．Ｆ、、　ｅｔａｌ、　 Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｏｕｎｄ　Ｒｅｐａｉ ｒ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｒ，Ａ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｍ、　Ｈｅｎ５ｏｎ編、　（ １９８８）の１６５−１７２頁を参照のこと。トロンボモジュリンの様な生物学 的巨大分子は、これらのオキシダントの傷害作用の標的として働き得る。

「実質的に除去され」は、トロンボモジュリン活性が約５０％、より好ましくは 約６０％、そして最も好ましくは７０％またはより多く減少することを意味する 。

組織への酸化傷害は、急性呼吸窮迫症候群、再潅流傷害、肺及び腎臓への免疫傷 害、脳外傷又は虚血、動脈硬化、及び慢性関節リウマチを含む、多くのヒト疾患 の病態生理学に関与することが知られている。種々の可溶性蛋白質並びに膜脂質 の酸化的不活性化は、正常の過程及び疾患状態の双方の制御に関連づけられてき た。例えば、愛煙家の肺のα−１−プロテアーゼインヒビターの酸化的不活性化 は、肺気腫に特徴的な肺の蛋白分解への重要な寄与因子である（Ｃａｒｐ、　Ｈ ，、ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　ＰＮＡＳ　７９：　２０４１−２０４５．） 。血栓溶解療法に続いて再潅流を受けた心筋組織は、障害組織中における酵素反 応によって生成されたスーパーオキシドラジカルによる、重大な傷害を被る。虚 血後組織の炎症は、好中球及び単球を含む責食細胞の浸潤をもたらし、これらは それ自身多量のスーパーオキシドラジカル、並びにヒドロキシルラジカル、過酸 化水素、次亜ハロゲン酸及び長２２２：　６２３−６２８）。

発明者は、トロンボモジュリンがオキシダントとの反応に弱く、そのような反応 はトロンボモジュリンの抗血栓作用を破壊することを発見した。例えば、培養ヒ ト細胞（Ａ５４９）は、活性化された単球又はクロラミンＴのような化学的オキ シダントに曝された後、トロンビンを介してプロティンＣの活性化を促進する能 力を急速に失う。Ａ３４９細胞（ＣＣＬ　１８５．　Ｇｉａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ 、　（１９７２）　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、　５１：　１ ４１７−１４２３）は、細胞当たり約１０，０００分子の膜結合トロンボモジュ リンを有する。発明者はまた、可溶化された、精製された天然トロンボモジュリ ンは、クロラミンＴと共にインキュベートすると活性を失うことも実証した。６ 個のＥＧＦ様ドメインを含む天然トロンボモジュリンのフラグメントを用いた実 験は、トロンビンへの結合はトロンボモジュリンを酸化から保護しないことを示 した。２個の特異的アミノ酸、２９１番目及び３８８番目のメチオニン（表１を 参照）が酸化され、これらのアミノ酸が酸化されるとトロンボモジュリンフラグ メントは活性を失う。本発明のペプチドは、２９１番目及び／又は３８８番目の メチオニンの代わりに置換された他のアミノ酸を有する。

活性酸素ラジカル発生に関連する多くの病理学的状態は、可溶性トロンボモジュ リン類縁体のような抗血栓剤が有用な治療薬となるであろう状態である。従って 、例えばプロティンＣ活性化補因子としてのような活性を、オキシダントに暴露 された後も保持する、安全で効果的な抗血栓剤を有することが非常に望ましい。

本発明においては、これは、天然トロンボモジュリン配列中の酸化に対して弱い １つまたより多くのアミノ酸を、該ペプチドの生物学的活性を変化させることな （酸化に対して抵抗性であるアミノ酸で置換すること（又は完全に除去すること ）によって達成される。当業者は、蛋白質中の単一のアミノ酸を置き換えるため に使用できるアミノ酸の全数（こ限界がありそしてこの限界は、活性の保持によ って定められることを理解することができよう。これらのペプチドは、高められ たｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｗ剛性と安定性並びに貯蔵寿命を有するであろう。特異的活 性は、野性型（非突然変異）トロンボモジュリン類縁体ペプチドに比して高めら れているであろう。

ヒトのトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列は単離されている。それは、 ５７５個のアミノ酸よりなる蛋白質（〜６０．３ｋＤａ）をコードし、１８個の アミノ酸のシグナル配列を含む。種々の種（ウシ、マウス、ヒト）より単離され たトロンボモジュリン遺伝子配列は、高度の配列相同性を示す。ヒトのトロンボ モジュリンの全ＤＮＡ及びアミノ酸配列を表１に示す。ここに用いるトロンボモ ジュリンの定義は、個体間に存在するであろう天然の対立遺伝子的変種を包含す る。

他の既知の蛋白質の配列との比較及び類推により、トロンボモジュリンは６個の 機能的ドメインに分けることができる。各ドメインは３次元の、蛋白質分子の自 己組立式アミノ酸列であり、その蛋白質の特異的な生物学的活性に必要な構造的 要素を含む。

凡そのアミノ酸部位　ドメイン −１８−１シグナルペプチド １−２２６　Ｎ−末端ドメイン：　いくつかのレクチンに相同 ２２７−４６２　ＥＧＦ様ドメインの反復４６３−４９７　作動可能にリンクし たグリコシレージョンドメイン ４９８−５２１　伝達停止ドメイン：　膜架橋５２２−５５７　細胞質ドメイン ０−４３５７を参照のこと。

オキシダントは、一般的に、高度に反応性の化学種である。電子をめて、オキシ ダントは、生物学的及び非生物学的いずれもの種々の分子と反応する。蛋白質を 構成するアミノ酸のうちで、ヒスチジン、メチオニン、システィン、トリプトフ ァン及びアルギニンは、最も酸化されやすい。トロンボモジュリンの場合、２９ １位及び３８８位にあるメチオニンのメチオニンスルホキシドを形成する反応は 、トロンボモジュリンの抗血栓活性の喪失をもたらす特別の問題である。この活 性の喪失は凝固過程を抑制なしに進行させるのみならず、酸化された蛋白質はプ ロテアーゼによって一層急速に消化ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２７５：　５ ５９−５６７及びＤａｖｉｅｓ、　Ｋ、Ｊ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７） Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２　（２０）：　９９１４−９９２０　） 　、膜結合トロンボモジュリンが、例えば、活性化好中球に分泌されるエラスタ ーゼ等によって切断除去されることを許容することもあり得よう。

本発明の蛋白質はトロンボモジュリン（ＴＭ）の類縁体である。

この語は、それらが下記の天然トロンボモジュリンと実質的に同じ特徴的な生物 学的活性を有する蛋白質であって、更に、それらが水性溶液に可溶性であること により及びそれらのアミノ酸配列中の特異的な人工的に誘導された突然変異の存 在によって特徴づけられることを意味する。

アミノ酸、特にメチオニンを酸化に抵抗性にする方法は、技術的に周知である。

チオール基を例えばヨード酢酸で化学的に蓚飾して、酸化に抵抗性のスルホニウ ムを形成することが可能である（　Ｇｕｎｄｌａｃｈ、　Ｈ，Ｇ、、　ｅｔ　ａ ｌ、　（１９５９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２３４：　１７５４）　 、好ましい方法は、該不安定なアミノ酸を除去し又はそれをオキシダントとは反 応しない１つ若しくはより多くの異なるアミノ酸に置換することである。アミノ 酸ロイシン、アラニン及びグルタミンは、それらのサイズ及び中性の性質のため 、特に好ましいアミノ酸である。

蛋白質配列中のアミノ酸を除去し又は置換できる方法は周知である。変更された アミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子は、例えば合成的に、作るこ とができる。好ましい方法の１つは、部位指向性ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異生成 の使用である。部位指向性突然変異生成は、単鎖標的ＤＮＡの核酸配列を特異的 に変更するよう設計された、所望の核酸の置換、挿入又は除去を含む合成的オリ ゴデオキシリポ核酸の使用を伴う。単鎖の鋳型へのこのオリゴヌクレオチド（プ ライマーともよばれる）のハイブリダイゼーション及びこれに続くプライマー・ エクステンションは、ヘテロデュプレックスＤＮＡを生成し、これは形質転換細 胞中で複製させたとき、所望の突然変異を有する蛋白質配列をコードする。この 方法は、下記の実施例３に詳しく概説され、図３に描かれている。

勿論、除去又は置換が突然変異ペプチドの生物学的活性を保持することを許容す べきことは決定重要性を有する。トロンボモジュリン活性は、トロンビンの作用 の変化に基づく種々のアッセイにて測定することができる。特に好ましい活性は 、トロンビンに触媒されるプロティンＣの活性化をトロンボモジュリン又はその 可溶性類縁体が促進する能力であり、これは、この能力がトロンボモジュリンに 特異的だからである。プロティンＣ補因子活性は、Ｓａｌｅｍ、　ｅｔ　ａｌれ たアッセイにて測定することかできる。簡単にいえば、このアッセイは２つの段 階よりなる。第１は、試験する酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をトロンビ ン及びプロティンＣと所定の条件下にインキュベーションすることである（下記 の実施例を参照）。第２の段階ににおいては、トロンビンはヒルジン（ｈｉｒｕ ｄｉｎ）又は抗トロンビンＩ１１及びヘパリンによって不活性化され、新たに活 性化されたプロティンＣの活性が、色素原性基質の使用により定量されるが、そ れにより、活性化されたプロティンＣの蛋白分解活性によって発色団か遊離され る。このアッセイは、精製された試薬を用いて行われる。

代わりに、酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、血漿を用い、活性化部分ト ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）及び／又は プロトロンビン時間（ＰＴ）のような、凝固時間アッセイにて測定することがで きる。これらのアッセイは、凝固阻害の異なったメカニズム間を識別し、そして 、プロティンＣの活性化を伴う。これらのいずれのアッセイにおける凝固時間の 長期化も、該分子が血漿中で凝固を阻害できることを実証するものである。

酸化によるトロンボモジュリン活性の喪失に対する抵抗性を定量するために、試 験材料（１００−２５０μｇ／ｍＩりが先ず、例えばクロラミンＴ、５−１０ｍ ＭのクロラミンＴ下での過酸化水素、又は２００−１０００ｍＭの過酸化水素の ようなオキシダントと共に、０．２％のＮ−エチルモルフすリン及びｏ、ｏｏｓ ％のＴｗｅｅｎ８０を含むｐＨ７，０の緩衝液中で室温にて２０分間インキュベ ートされる。そのようなオキシダント曝露の後、試験材料は、上記のアッセイの いずれかを用いて評価される。オキシダントに曝露前に有していた活性の少なく とも６０％、及び好ましくは９０％の活性を保持しているそれらの突然変異トロ ンボモジュリン類縁体は、野性型（非突然変異）トロンボモジュリン類縁体又は 天然トロンボモジュリンに比して酸化抵抗性であると考えられる。突然変異トロ ンボモジュリン類縁体のい（つかは、オキシダントに暴露しない野生型ペプチド に比してさえ特異的活性の増大を示すであろう。これは、野生型ペプチド中の低 レベルの固有の酸化の結果、又は、アミノ酸の変化によるトロンビンと突然変異 類縁体との間の相互作用が実際に変化した結果てあろう。これらのアッセイの詳 細は下記の実施例に提示されている。

上記のアッセイは、精製システムと血漿培地中の双方においてトロンビンに結合 でき且つプロティンＣを活性化できる、可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン 類縁体を同定するのに使用される。更なるアッセイは、次いで、トロンビンに触 媒されるフィブリノーゲンからのフィブリン生成の阻害（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ 、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｂ性化の阻害（Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７：　７９４４− ７９４７）、抗トロンビンＩＩＩ及びヘパリン補因子ＩＩによるトロンビンの抑 制の促進（Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２５８：　１２２３８−１２２４２）、第ＸＩ［［因子のトロンビン による活性化の阻害（Ｐｏｌｇａｒ、　ｅｔａｌ、　（１９８３）　Ｔｈｒｏｍ ｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　５４：　１４０）　、プロティンＳのトロンビン 媒介不活性化の阻害（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓａｌｅｍ、　（１９８６） 　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖ、　７８　（１）＋１３−１７）及びトロンビン媒介血小板活性化及び凝 集の阻害（Ｅｓｍｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２５８：　１２２３８−１２２４２）のような、トロンボモジュリンの 他の活性の喪失に対する抵抗性を評価するために用いられる。

抗凝固剤／抗血栓剤としての酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体２豊里 血栓性疾患の基礎にある病理は、例えば傷害血管壁のような刺激に応答して血餅 が形成されることである。この刺激がトロンビンを産生ずる凝固カスケードを始 動するが、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリン、すなわち血餅のマトリ クスに変換する能力を有する。

全身投与された可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、血栓形成に対 して防禦するであろう。なぜならそれらは活性化されたプロティンＣ系を介して トロンビンの産生を阻害し、及び／又は、他の凝固パラメーターを乱すことなく フィブリノーゲンに対するトロンビンの作用を阻害するからである。こうして、 可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、望まない血栓形成を防止する のに安全且つ有効であろう。トロンボモジュリンの効果は、血管の重大な傷害に よって産生された大量のトロンビンによって凌駕され、止血栓の形成を許容する ことができる。

血栓形成が重要な病因学的役割を演じている疾患には、心筋梗塞、播種性血管向 凝固、深部静脈血栓症、肺気腫、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、不安 定狭心症並びに他の動脈及び静脈の閉塞状態が含まれる。これらの全てにおいて 、並びに血栓形成が病理学的である他の疾患においても、可溶性の酸化抵抗性ト ロンボモジュリン類縁体はそれのみで又は血栓溶解剤との組合せで、疾患の治療 に又はより重症の状態へ進行することの防止において、治療上有用である。可溶 性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体はまた、例えば心臓弁のような人工器 官を取りつけられる患者又は体外循環を必要とする患者において、安全且つ有効 な抗凝固剤を提供する。

これらの化合物は、例えば肺気腫又は急性心筋梗塞等において、ヘパリンやワー ファリンに代わるであろう。

アンジオプラスティーは、閉塞した動脈中の開存を回復するためにしばしば用い られる手順である。開存は回復できるものの、この手順はしばしば動脈の内皮性 の内張りを傷つけ、その結果、血餅が形成し始める。内皮に加えられた傷害は、 活性化された白血球か該部位に集められる過程を開始させる。これらの活性化さ れた白血球は、取り分は過酸化物のようなすギシダントを遊離し、これは、障害 された領域にある膜結合天然トロンボモジュリンの活性を破壊し５、こうして局 所的な凝固促進性状態に寄与する。アンジオプラスティーと共に投与された可溶 性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、この有害な副作用を防止するであ ろう。

多くの急性の血栓性及び塞栓性疾患は、現在、血栓を除去する目的でフィブリン 溶解療法により治療されている。最も広く検討されてきた状態は、急性心筋梗塞 （心臓発作）である。急性心筋梗塞の治療のために現在使用されている薬剤は、 ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター及び及びウロキナー ゼを含む。

これらの薬剤の使用は、重篤な出血性合併症をもたらし得る。フィブリン溶解療 法によって血栓を除去されて血流が回復した患者は、しばしば該障害血管が再閉 塞する、すなわち、血餅か再形成される。血栓溶解剤の投与量及び治療期間を増 加することによって再閉塞を防止することが試みられてきたが、そうすると出血 症例は増加する。

複合的心筋梗塞は、再潅流に関連した組織傷害である。血栓が溶解されると、酸 素ラジカルが血餅部位において産生され、周囲組織を破壊し、好中球依存性の炎 症性応答を開始させる（Ｓｉｍｐｓｏｎ、　Ｐ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎ　 Ｕｐｊｏｈｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｒａｄｉｃａｌｓ、 　Ａｐｒｉｌ　１９８７中第６３−６９頁）。これらの酸素ラジカルによって不 活性化されない可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の使用は、その抗 トロンビン活性により再閉塞に対する防禦を与える。その特異的作用は、全身的 というより局所的、すなわち、トロンビンが産生され又は血餅から遊離されてい る部位に働く。従って、血栓溶解剤と組み合わせて使用されると、その投与量は 減らすことができ、出血の危険を実質的に減少することかできる。

抗凝固剤、抗血栓剤及び／又はフィブリン溶解性薬剤の使用を必要とする、殆と ではないとしても多くの状態がまた、活性酸素ラジカルの産生に関連した状態で あることに注意することが重要である。特定の蛋白質か酸化に弱いが否かを確実 性をもって予測することは不可能であり、またもし酸化されても、当業者は酸化 が該蛋白質の不活性化をもたらすと期待することはないであろう。トロンボモジ ュリンは完全に不活性化される。活性の喪失は、起こりつる副作用の増大を伴う 投与量の増加を必要とする。酸化による活性の喪失の生じない蛋白質薬剤は、従 って、これらの状態において使用するのに非常に望ましいであろう。

可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の投与は、ポーラス静脈注射によ り、持続的静脈内注入により、又はこれら双方の経路の組合せにより行われよう 。また、適当な賦形剤と混合した可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 もまた、筋肉内部位より循環中に取り込まれよう。ここで用いるように、治療上 有効な投与量は、病理学的血餅の形成を阻止するのに必要な酸化抵抗性トロンボ モジュリン類縁体のレベルとして定義される。

酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体による全身的治療は、患者から採取した一 連の血液サンプルについての活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＴＰＰ）の ような止血パラメーターを定量することによりモニターすることができる。この アッセイで観察される凝固時間は、十分なレベルの酸化抵抗性トロンボモジュリ ン類縁体が循環中に達成されると延長される。しかしながら、これは効果の全身 的測定であり、おそらく血餅の部位において有効な投与量でもＡＰＴＴを延長す る効果はないであろう。投与量レベルと養生法は、例えばＡＰＴＴアッセイ又は プロティンＣ活性化アッセイ等によって測定したとき活性蛋白質の十分な濃度が 維持されるよう、調整することができる。

本発明の一面において、上述の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、それら がその中で産生される真核細胞から分泌される。薬理学的投与のためには、該酸 化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、所望により、薬理学的処方化の当業者に 周知のリン脂質小胞、界面活性剤又は他の類似の化合物と組み合わせることがて きる。本発明の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、血流中において可溶性 であり、このことは該類縁体を種々の抗凝固その他の治療において宵月なものと している。

完全長のトロンボモジュリンとは対照的に、本発明の類縁体は、それらの可溶性 、安定性及び一層優れた活性によって、改良された下剤を提供するであろう。こ れらの類縁体は製造的見地、薬剤学的見地のいずれか又は双方において、一層優 れた特徴を提供するであろうと期待される。

一般的方法 一般に、本出願において用いる術語の定義及び一般的実験室手順Ｈａｒｂｏｒ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、に見出すことができる。該マニュアルは、以下ｒＭａｎｉ ａｔｉｓＪ　といい、ここに参照により導入する。

全ての酵素は、メーカーの指示通りに使用した。

商業的に入手できないオリゴヌクレオチドは、Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａ ｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔｓ、、　２２　（２０）：　１８５９−１８６２によって最初に記述 された固相ホスホラミダイト・トリエステル法に従って、Ｄ、Ｒ，Ｎｅｅｄｈａ ｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　ＮｕｃｌｅｉｃＡ ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：　６１５９−６１６８．に記述された自動化され た合成装置を使用して化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は 、本来のアクリルアミドゲル電気泳動によるか又は、Ｊ、Ｄ、　Ｐｅａｒｓｏｎ 　ａｎｄ　Ｆ、Ｅ、　Ｒｅｇｎｉｅｒ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、、 　２５５：　１３７−１４９．に記述された陰イオン交換ＨＰＬＣによった。ヌ クレオチドのサイズは、キロ塩基（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）与えられた。これ らは、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動から、又は報告されているＤ ＮＡ配列から導かれる推定である。

クローン化した遺伝子及び合成的オリゴヌクレオチドの配列は、Ａ、Ｍ、　Ｍａ ｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ、　６５：　４９９−５６０の化学的分解法をもちいて検証することがで きる。配列は、オリゴヌクレオチドフラグメントの二重鎖ＤＮＡ配列への組立の 後に、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　（上記）の方法により又はＲ， Ｂ、　Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａｔ。

（１９８１）　Ｇｅｎｅ、　１６：　２１−２６の二重鎖鋳型の配列を決めるた めの鎖停止法により確認することができる。サザンプロット・ハイブリダイゼよ る産生に関する。標的遺伝子は、中間ベクターにおいて単離され、Ｅ、　ｃｏｌ ｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような原核細胞中におい て増幅のためにクローン化される。最も好ましいのは、Ｅ、　Ｃｏ１１である。

なぜなら、この微生物は培養が容易であり、他の原核細胞に比べ、より完全に理 解されているからである。Ｍａｎｉａｔｉｓマニュアルは、下記に記述されたＥ 、　ｅｏｌｉ　クローニングの全てを実施するに十分な方法論を含む。ＭＨ−１ 株は、別に述べない限り好ましい。全てのε、　Ｃｏ１１株を、ブドウ糖を含む ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨンに、又は、ブドウ糖及び酸加水分解カゼインアミ ノ酸強化Ｍ９培地に増殖させる。抗生物質に抵抗性の株は、Ｍａｎｉａｔｉｓに 記述された薬物濃度に維持した。形質転換は、Ｄ、Ａ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　 （１９７７）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１３２：　３４９−３５１により又はＪ、Ｅ 、　Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃｕｒｔｉｓｓ、　（１９８３ ）　Ｍｅｔｈａｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ’／、　１０１：　３４７−３ ６２．　Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、纒、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋにより記述された方法に従って実施した。代表的ベクターは、商業的 に入手できるｐＢＲ３２２及びｐＵＣシリーズを含む。

定義 本発明の目的のため、次の術語を以下の通りに定義する。

術語「ベクター」は、ウィルス発現システム、自律的自己複製性環状ＤＮＡ　（ プラスミド）をいい、発現及び非発現プラスミドを含む。組替え微生物又は細胞 培養が、「発現ベクターｊを宿していると記述される場合には、これは、染色体 外環状ＤＮＡ及びホストの染色体中に導入されたＤＮＡの双方を含む。「伝達ベ クター」なる語は、昆虫細胞中に野生型バキュロウィルスと共にコトランスフエ クトされたベクターをいう。伝達ベクターは、バキュロウィルスゲノムと伝達ベ クターとの間の組替えを促進し、バキュロウィルスのポリヘトリン遺伝子を異型 の標的遺伝子で置き換えるような方法で構成される。ベクターがホスト細胞によ って維持されている場合には、ベクターは、自律的構造として有糸分裂に際して 細胞によ〕で安定に複製されるか、又はホストのゲノム内に導入されるであろう 「プロモーター」の語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合させ るのに関与するＤＮＡの領域である。

「作動可能にリンクした」の語は、各要素がそれらの通常の機能を営むような形 態を取っている並んだ位置をいう。こうして１．コード配列に作動可能にリンク した調節配列又はプロモーターは、コード配列の発現を行わせることができる。

「調節配列Ｊの語は、所望のコード配列に適切に繋げられたとき、そのような配 列と適合性のあるホスト内においてその発現に影響することのできる、１つ又は より多くのＤＮＡ配列をいう。そのような調節配列は、少なくとも原核ホストと 真核ホスト双方のプロモーターを含み、所望により、転写終止シグナルを含む。

発現を行わせるのに必要な又は役立つ追加の要素もまた同定されよう。ここに用 いるように、「調節配列」は、単に、使用した特定のホスト中において発現をも たらすのに有用であろうようないかなるＤＮＡ配列をもいう。

「オキシダントＪの語は、分子（又は原子）から電子を除去する化学的試薬をい う。生理学的オキシダントの例は、取り分け、ヒドロキシルラジカル及び過酸化 水素である。

「天然ノ　トロンボモジュリンの語は、自然の該蛋白質、及び、膜結合又は界面 活性剤可溶化（自然）トロンボモジュリンと同じ特徴的な生物学的活性を有する 可溶性ペプチドをいう。これらの可溶性ペプチドはまた、「野生型」又は「非突 然変異」類縁体ペプチドともいう。「生物学的活性」は、トロンビンの受容体と して働き、プロティンＣの活性を高める能力、又は、天然トロンボモジュリンに 関連した他の生物学的活性である。酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、可 溶性であることに加えてそれらのアミノ酸配列に特定の人工的に誘導された突然 変異を含む、これらの可溶性ペプチドである。

「特定の人工的に誘導した突然変異」の語は、アミノ酸配列における除去、挿入 及び置換を含み、クローン化したＤＮＡ配列の操作により導入し得る。突然変異 トロンボモジュリン類縁体をコードするＤＮＡ配列は、「突然変異ＤＮＡ配列」 という。

遺伝子合成 ヒトのトロンボモジュリンをコードする完全長のＤＮＡ配列の公表は、遺伝子の 調製を促進し、可溶性の突然変異トロンボモジュリン類縁体をコードするＤＮＡ 配列を構成する出発点として用いられた。本発明の類縁体は、内部のアミノ酸置 換を有することに加えて、伝達停止配列を欠く可溶性の誘導体である。更に、こ れらの類縁体は、これらのポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドで トランスフェクトされた又は形質転換された真核細胞から分泌される。アミノ酸 の置換、除去又はクローン化された遺伝子へのシグナル配列の追加のような修飾 のための方法は既知である。ここに用いる個々の方法は以下に記述される。

トロンボモジュリンの完全長の遺伝子は、数種の方法によって調製できる。ヒト ゲノムライブラリーは商業的に入手できる。トロンボモジュリン遺伝子に特異的 なオリゴヌクレオチドプローブは、公表されている遺伝子配列を用いて合成でき る。オリゴヌクレオチドプローブによってゲノムライブラリーをスクリーニング する方法は既知である。トロンボモジュリンの遺伝子配列の公表は、コード領域 内にイントロンが存在しないことを実証している。従ってゲノムクローンは、既 知の方法を用いてトロンボモジュリンのための発現プラスミドを構成するために 必要な出発材料を提供する。

トロンボモジュリンをコードするＤＮＡフラグメントは、遺伝子に並んで又は中 に存在する領域中に同定されている制限酵素部位を利用することによって回収す ることができる（Ｒ，Ｗ、　Ｊａｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８４：　６４２５ −６４２９　）。

代わりに、完全長の遺伝子はｃＤＮＡバンクから得られる。内皮細胞から調製さ れたメツセンジャーＲＮＡは、ｃＤＮＡの調製の適切な出発材料である。トロン ボモジュリンをコードする遺伝子を含むｃＤＮＡ分子は、上記のようにして同定 される。ｃＤＮＡバンクを作る方法は既知である（ＭａｎｉａｔｉＳを参照）。

可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をコードする遺伝子は、全長トロ ンボモジュリンをコードする遺伝子を用いて、最初に構成された野生型トロンボ モジュリン類縁体遺伝子から作ることができる。続く突然変異形成のための野生 型トロンボモジュリン類縁体遺伝子を製造するための好ましい方法は、合成的オ リゴヌクレオチドブライマーの使用とｍＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型上におけるポリメ ラーゼエクステンションとを組合せる。このポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法は 、所望の核酸配列を増幅する。米国特許第４．６８３．１９５号及び４．６８３ ．２０２号はこの方法を記述している。制限酵素部位をプライマーに導入するこ とができる。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルより精製 でき、そして適当なベクター中にクローン化することができる。天然遺伝子配列 中における変更は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異生成の技術によって又は適当な突 然変異を導入するように設計されたプライマーとのポリメラーゼ鎖反応の使用に よって導入することができる。

ここに記述した可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、培養真核細胞 中で発現されると分泌される。分泌は、トロンボモジュリン遺伝子の天然のシグ ナル配列の使用により達成され得る。

代わりに、本発明の可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をフードする 遺伝子は、適当な読み取りフレーム中において天然トロンボモジュリン遺伝子に 対応するもの以外のシグナル配列に繋げられることができる。例えば、ｔ−ＰＡ のシグナル配列（ここに参照して導入する、共に譲受された１９８７年７月１６ 日出願の継続中の米国特許出願第０７４．０８３号を見よ。）又はヒボデルミン Ａ若しくはＢ（ここに参照して導入する、共に譲受された１９８９年１月２７日 出願の継続中の米国特許出願第１４８．７４９号を見よ。）を、ポリペプチドと リンクさせることができる（表２を参照）。本発明の好ましい具体例においては 、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子の第２のイントロンを含んだ、ｔ−ＰＡのシグナル配列の 使用がなされる。イントロンを含めることは、隣接する構造遺伝子の生産性を高 める（ここに参照して導入する、共に譲受された１９８７年１月１４日出願の継 続中の米国特許出願第００３．６１１号を見よ。）。

本発明の類縁体については、天然トロンボモジュリン遺伝子のカルボキシル末端 領域の、伝達停止及び細胞質ドメインをコードする遺伝子部分は、除去されてい る。従って、翻訳が所望の位置において終止するよう、停止コドンを加える必要 がある。代わりに、停止コドンは、所望の発現プラスミドによって提供すること ができる。

加えて、真核細胞中において酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をコードした ｍＲＮＡの適当なプロセシングを保証するよう、ポリアデニル化配列が必要であ る。更に、可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の発現のために、開始 コドンを、もしなければ、与えることが必要であろう。そのような配列は、天然 の遺伝子から又は発現プラスミドによって与えられるであろう。

本発明のトロンボモジュリン類縁体はそのアミノ酸配列によって及びＤＮＡ配列 によって記述されているが、本発明が該類縁体の生物学的性質に実質的に殆と影 響を与えないアミノ酸の多少の又は意図しない置換及び除去を含むよう、該類縁 体はそれらの生物学的均等物を含むものであることは理解される。種々のホスト 細胞中において可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を発現させるため には、代わりの配列を使用できることもまた理解されねばならない。更に、遺伝 子コードの縮重のため、同じポリペプチド配列をコードするために等価なコドン は置換できよう。

クローニングベクター 複製及び原核細胞又は真核細胞中への組み込みに適し、そして可溶性の酸化抵抗 性トロンボモジュリン類縁体の発現を調節するのに有用な転写及び翻訳ターミネ ータ−１開始配列及びプロモーターを含んだクローニングベクターがここに記述 される。該ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネータ−配列、真核細 胞及び原核細胞の双方においてプラスミドの複製を許容する配列すなわちシャト ルベクター、及び原核細胞システム及び真核細胞システム双方のだめの選択マー カーを含む発現カセットよりなる。

原核細胞中における可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の発現 クローン化された配列の増幅のためのＥ、　ｃｏｌｉ中におけるクローニング法 の使用に加えて、原核細胞中において酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を発 現させることが望ましい。本発明者は、成熟蛋白質の炭水化物部分は補因子とし ての活性には必須ではなく、循環中における該分子の半減期に対する効果を有す ることを発見した。Ｅ、　ｃｏｌｉ中におけるトロンボモジュリン類縁体の発現 は、この問題の解析のための有用な道具を提供した。可溶性の酸化抵抗性トロン ボモジュリン類縁体をコードした発現プラスミドで形質転換したＥ、　ｃｏｌｉ から、治療上機能的な蛋白質を回収することが可能であるクローン化された遺伝 子の細菌中における発現の方法は周知である。原核細胞システムにおいてクロー ン化された遺伝子の高いレベルの発現を得るためには、最小限ｍＲＮＡ転写終止 を導く強いプロモーターを含む発現ベクターを構成することが必須である。この 目的に適した調節領域の例は、ε、ｃｏＨβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ ーター及びオペレーター領域、Ｅ、　ｅｏｌｉ　）リブトファン生合成経路、又 は、λファージからの左方のプロモーターである。Ｅ。

ｃｏｌｉ中の形質転換されたＤＮＡベクター中に選択マーカーを含めることが有 用である。そのようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン 又はクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子が含まれる。

−に関する詳細はＭａｎｉａｔｉＳを参照のこと。本発明の記述した具体例にお いては、ｐＵｃＩ９が、所望の遺伝子配列のサブクローニング及び増幅のための ベクターとして使用される。

真核細胞中における酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の発現当業者は所望の 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の発現のために選択される発現システムに ついて知識があると期待されるから、真核細胞中における蛋白質の発現のだめの 既知の種々な方法を詳細に記述することはしない。

可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をコードするＤＮＡ配列は、ホス ト細胞培養を形質転換する際に使用するための種々の発現ベクターに繋げること ができる。該ベクターは典型的には、マーカー遺伝子及び、異型遺伝子の転写及 び翻訳を開始させるための遺伝子配列を有する。

該ベクターは好ましくは、形質転換されたホスト細胞の選択のための、ジヒドロ 葉酸還元酵素、メタロチオネイン、ヒグロマイシン、又はネオマイシンホスホト ランスフェラーゼのような表現型特性ｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及びＢｏ ｍｂｙｘ　ｍｏｒｉから形質転換された昆虫細胞株をスクリーニングする上で有 用である。酵母に関しては、Ｌｅｕ−２、Ｕｒａ−３、Ｔｒｐ−１及びＩ（ｉｓ −３が、選択できるマーカーとして知られている（Ｇｅｎｅ　（１９７９）　８ ：　１７−２４）　、上記の科学的原理を具現化する既知及び未知の多くの他の マーカーがあり、それらの全てが、本発明に包含されるベクターでトランスフェ クトされたそれらの真核細胞を検出するためのマーカーとして有用であろう。

可溶性の酸化抵抗性トロンポモジュリシ類縁体の発現に有用な高等の真核細胞シ ステムのうちには、選択できる非常に多くの細胞システムがある。哺乳類細胞株 の具体例には、ＲＰＭ［７９３２、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハ ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ［３８、ＢＨＫ、ＣＯ５−７、Ｃｌ２７又は ＭＤＣＫｍ胞株が含まれる。好ましい哺乳類細胞株はＣＨＬ−１である。ＨＣＬ −１を使用するときは、真核細胞選択マーカーとしてヒグロマイシンが含まれる 。ＣＨＬ−１細胞は、直ちに入手できるヒト細胞株であるＲＰＭＩ　７９３２メ ラノーマ細胞から誘導される。ＣＨＬ−１細胞株は、ブタペスト条約の条件に従 って、１９８７年６月１８日にＡＴＣＣに寄託されており、＃ＣＲＬ　９４４６ の受託番号を付されている。本発明において使用するに適する細胞は、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎから商業的に入手できる。昆虫細胞株の例には、５ｐｏｄｏｐ ｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（ｆａｌｌ　Ａｒｍｙｗｏｒｍ）及びＢｏｍ ｂｙｘ　ｍｏｒｉ　（カイコ）が含まれる。

上に示したように、ホスト細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター例え ばプラスミドは、可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体蛋白質遺伝配列 の転写を開始させ翻訳を調節する遺伝子配列を含む。これらの配列は、発現調節 配列という。ホスト細胞が昆虫又は哺乳類起源の場合には、発現調節配列の例に は次のものが含まれるがこれに限定はされないニレトロウィルスＬＴＲ（ｌｏｎ ｇｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）プロモーター（（１９８２）　Ｎａｔｕｒ ｅ、　２９７：　４７９−４８３）０８）又はβ−グロビンプロモーター（Ｐ、 Ａ、　Ｌｕｃｉｗ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ酸は、必要に応じて又は 所望により制限酵素を用いて切断されぞしてサイズ調整される。このセグメント は、技術的に既知の手段を用いて可溶性の酸化抵抗性ｌ−ロンボモジュリン類縁 体をコードするＤＮＡ配列に繋げられる。

高等動物ホスト細胞を用いた場合には、ポリアデニル化または転写停止配列がベ クターに導入されねばならない。ポリアデニル化配列の例にはＳＶ４０からのポ リアデニル化配列が含まれ、これはまた転写ターミネータ−としても機能する。

適当なベクターに導入された遺伝子は、過渡的発現システム又は安定クローンの いずれかにおいて、直接に蛋白質を合成するのに使用することができる。前者の 場合には、収率は低いが、実験は速い。後者の場合には、高産生性クローンを単 離するのに一層時間がかかる。種々のベクターを、これら２つ異なるタイプの実 験のために使用することができる。特に、過渡的発現の場合においては、配列は 、プラスミドを細胞内において高いコピー数に複製することを許容する配列をプ ラスミド内に含めることができる。これらの配列は、ＳＶ４０（例えばＣ，Ｄｏ ｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１００ ：　７０４〜７１４）のようなウィルスから又はネズミ自立的複製配列のような 染色体複製配列（Ｗｅｊｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｇｅｎｅ、　７ ３：　４２７−４３７）から誘導することができる。過渡的発現において使用す るためのベクターはまた、関係遺伝子の転写を調節するためにＳＶ４０初期プロ モーター（ればならない。過渡的発現は遺伝子産物のアッセイのための迅速な方 法を提供する一方、そのプラスミドＤＮＡはホスト細胞の染色体には導入されて いない。従って、過渡的発現ベクターの使用は、安定なトランスフェクトされた 細胞株を与えない。過渡的発現に適したプラスミドの記述は、Ａ、　Ａｒｕｆｆ ｏ　＆　Ｂ、　５ｅｅｄ、　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８４：　８５７３−８５７７によって与えられてい る。

可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、代わりに、バキュロウィルス システムを用いて上述の昆虫細胞株中においても製造することができる。このシ ステムは、Ｖ、Ａ、　Ｌｕｃｋｏｗ　ａｎｄ　Ｍ、Ｄ、　Ｓｕｍｍｅｒｓ　（１ ９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：　４７−５５．によって記述 されている。一般的に、この発現システムは、殆との哺乳類システムによって提 供されるより高い発現レベルを提供する。バキュロウィルスはホストの昆虫細胞 に感染し、非常に多くのサイクルを通してそのゲノムを複製し、そして次いで大 量の多面体結晶を産生ずる。この多面体遺伝子は酸化抵抗性トロンボモジュリン 類縁体遺伝子で置換することができる。多面体プロモーターは、次いで培養ホス ト細胞の感染及びバキュロウィルスゲノムの複製に続いて、大量の類縁体蛋白質 を作る。該分泌されない遺伝子産物は、感染３乃至７日後にホストより回収され る。代わりに、もし適当なシグナル配列が蛋白質上に存在すれば、酸化抵抗性ト ロンボモジュリン類縁体蛋白質は分泌され得る。

ホスト細胞はトランスフェクションでき又は種々の手段によってトランスフェク ションできるようにされる。動物細胞にＤＮＡを導入する数種の周知の方法があ る。これらは次のものを含む：　リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキスト ラン法、ＤＮＡ含有細菌性プロトプラストとレシピエンド細胞との融合、ＤＮＡ 含有リポソームによるレシピエンド細胞の処理、電気泳動及び細胞中へのＤＮへ の直接のマイクロインジェクション。Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　”Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ｇｕｋ及びＷｉｇｌｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９８７）　Ｃｅ１１．１ ６：　７７７−７８５を参照のこと。

細胞の培養 ホスト細胞は迅速に細胞培養でき且つ発現した遺伝子産物を適切にグリコジル化 できることか好ましい。組織培養における高密度増殖のために適していることが 知られている細胞は特に望ましく、種々の無を推動物又はを推動物の細胞が、正 常の又は形質転換した細胞株のいずれの形でも、技術的に用いられてきた。

トランスフェクトされた細胞は、技術的に周知の方法により増殖される。例えば 、Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｋｕｃｈｌｅｒ、 　Ｒ，Ｊ、、　Ｄ。

ｗｄｅｎ、　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ、　Ｉｎｃ、　（１９７ ７）、中のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈａｄｓを参照のこと。発現産物は 、蛋白質がホスト細胞から分泌される場合にはそれらのシステム中の細胞培地か ら、又は、例えば技術的に周知の機械的又は酵素的手段等によりホスト細胞シス テムを破裂させた後に細胞懸濁液から、回収される。

可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の精製本発明は、培養組換え真核 細胞により分泌される可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を提供する 。該類縁体は、無血漿又は血漿補強培地中で産生され、無傷で分泌される。原核 細胞を用いた場合には、酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は細胞内に貯留さ れるであろう。該類縁体はグリコジル化されていてもグリコジル化されていなく てもよい。組換え細胞の増殖及びこれに伴う培養培地中への酸化抵抗性トロンボ モジュリン類縁体の分泌に続いて、この［条件付けられた培地」が回収される。

該条件付けられた培地は、次いて遠心又は濾過によりにより透明化されて細胞及 び細胞残滓を除去される。澄明化された培地中に含有される蛋白質は、例えばＱ セファロース若しくは金属キレート化剤のような任意の適当な樹脂に吸着させる ことによって、又は、硫酸アンモニウム分画、ポリエチレングリコール沈殿、又 は限外濾過を用いて濃縮される。技術的に既知の他の手段も等しく適当であろう 。可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の更なる精製は、ＧａＬｖｉｎ 、　Ｊ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　（にここに開示する具体例において記述された 仕方で、達成することができる。培養細胞により分泌された酸化抵抗性トロンボ モジュリン類縁体の精製は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオ ン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は他の蛋白質精製 技術等の追加の使用を必要とするであろう。

組換え型の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、非還元性クロマトグラフィ ー条件下において検出し得る多くのコンフォメーション形にて産生され得る。低 い特異的活性を有する種の除去が望ましく、陰イオン交換樹脂又はサイズ排除ク ロマトグラフィーを含む種々のクロマトグラフィー技術によって達成される。

組換え型の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、加圧透析及び揮発性緩衝液 （例えば、Ｎ−エチルモルフイン（ＮＥＭ）　、炭酸水素アンモニウム、酢酸ア ンモニウム、及び酢酸ピリジン）へと直接交換された緩衝液によって濃縮するこ とができる。加えて、サンプルは、そのような既発性緩衝液から直接凍結乾燥す ることかてき、塩類及び界面活性剤を含まない安定な蛋白質粉末を与える。加え て、組換え型類縁体の凍結乾燥したサンプルは、使用前に注入に適合性の緩衝液 （例えば、リン酸緩衝化食塩水）に効率的に再溶解することができる。他の適当 な緩衝剤には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン 酸塩、クエン酸塩、グリシン、グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩が含まれる 。

トロンボモジュリン類縁体の処方化及び使用ここに記述した可溶性の酸化抵抗性 トロンボモジュリン類縁体は、凍結乾燥した又は液体処方の形態に調製すること ができる。該材料は、注射用又は静脈内調製物のとしての薬剤学的使用に適した 濃度で提供される。

これらの化合物は、単独で又は、一本望ｔ−ＰＡのような他の生理学的に許容し 得る活性材料と若しくは不活性な材料、若しくは、例えば水又は生理食塩水のよ うな適当な担体との混合物として、投与することができる。これらの化合物は、 非経口的に、例えば注射によって投与することができる。注射は、皮下的、静脈 内又は筋肉内であることができる。これらの化合物は、薬剤学的に有効な量で及 び、しばしば、酸付加塩のような薬剤学的に許容しつる塩として投与される。そ のような塩としては例えば、取り分け、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸 塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、グリシン、グルタミン酸 塩及びアスパラギン酸塩が含まれる。ここに記述した類縁体は、ミセル中への導 入によって、高められたｉｎ　ｖｉｖｏ活性を示す。イオン性界面活性剤ミセル 又はリン脂質ミセル中に導入するための方法は既知である。

ここに記述した該可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を用いて抗血栓 症剤か製造でき、これは完全に精製された類縁体のみ又は上述の血栓溶解剤と組 み合わせよりなることができる。上述の生理学的効果を有することの示された本 発明の化合物は、例えば血餅形成の阻害のような多数の治療的応用に用途を見出 すことができる。従って、これらの化合物は、種々の循環性傷害、例えば心臓又 は呼吸器塞栓症、脳卒中、及び血栓溶解療法後の再閉塞の防止等の治療において 治療剤としての用途を見出すことができ、これらの化合物は、梗塞発生に際して 血餅の更なる拡大を止めるのに使用される。更に、開示した化合物は、しばしば 敗血症、ある種の癌及び妊娠中毒症と関連する播種住血管内凝固（ＤＩＣ）のよ うな全身的凝固疾患の治療に有用でありうる。

これらの化合物は、獣医学的用途のために家畜のような哩乳類に、及びヒトの臨 床的用途のために他の治療剤と同様の仕方で、すなわち生理学的に許容し得る担 体申入れて投与することができる。一般に、投与量はホストの体重当たり約ｏ、 ｏｏｏｉ乃至１００ｍｇ／ｋｇの範Ｊ、そしてより通常は０００１乃至０．１ｍ ｇ／ｋｇてあろう。これらの投与量は、所望の循環レベルが達成されるまで長時 間かけた持続的に注入によるか、又は好ましくはポーラス（ｂ。

１ｕｓ）注射として投与する。

多機能性蛋白質 突然変異性の酸化抵抗性ｌ・ロンポモジュリン類縁体蛋白質は、それらのＮ−末 端又はＣ−末端のいずれかに、天然トロンボモジュリン配列からのアミノ酸に対 応しないアミノ酸を有していてもよい。

これらの末端アミノ酸は翻訳後プロセシングの結果であり異型のシグナルペプチ ドに起源をもつものであろう。代わりに、該非Ｉ・ロンボモジュリンアミノ酸は 、該突然変異トロンボモジュリン類縁体に天然のトロンボモジュリンとは通常関 連のない生物学的特徴を与える異型の蛋白質配列に対応しているものであってよ い。これらの多機能蛋白質は、天然トロンボモジュリンの活性すなわち例えばト ロンビン結合又はプロティンＣ活性化補図子活性等に関連する第１の機能性構成 要素と、異型であるすなわち何か他の蛋白質と関連のある生物学的活性を有する 第２の機能性構成要素とから構成される。

第２の機能性構成要素は、多機能性酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の局在 化をもたらし、細胞表面またはフィブリン血餅のようなｉｎ　ｖｉｖｏて起こる 特定の組織構造に対する親和性を修飾するものであってよい。第２の機能性構成 要素は、多機能性蛋白質の循環半減期を変更してもよい。好ましいｌの具体例に おいては、第２の機能性構成要素は、蛋白分解活性のような追加の生物学的活性 を与える。好ましい蛋白分解活性は、プラスミノーゲンのプラスミンへの酵素的 切断である。多機能性トロンボモジュリン類縁体に蛋白分解活性を与える異型の 蛋白質配列は、好ましくは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ） 又はブローウロキナーゼより誘導される。特に好ましい具体例は、ヒトｔ−ＰＡ のアミノ酸４−５３０を含む。第２の機能性構成要素は、Ｃ−末端又はＮ−末端 のいずれにおいて酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体に結合させてもよい（図 ＩＢを参照）。

追加の１の具体例においては、多機能性蛋白質は、融合蛋白質としてでなく化学 的な結合によって作り出すことがてきる。Ｒｕｇｅｒ、　ｅ他の分子との化学的 な結合を記述している。化学的な結合をさせるために使用する方法は、しばしば オキシダントの使用を伴う。従って、酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体はこ の具体例において特に好ましい。これらの分子は、細胞表面に対する変化した親 和性またはフィブリンに対する高められた親和性を有する。

抗血栓活性と共にフィブリン分解活性を与える追加のドメインを含む多機能性酸 化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、現行の入手。フィブリン溶解活性（フィ ブリン血餅を溶解する能力）は、Ｈａｖｅｒｋｅｔｅｔ　ａｎｄ　Ｂｒａｋｍａ ｎ、　（１９７５）　Ｐｒｏｇ、　ｉｎ　Ｃｈｅｍ、　Ｆｉｂｒｉｎ、　Ｔｒｈ ｏｍｂ、　ｌ：１５−１５９に記述されているように、プラスミノーゲンに富ん だフィブリンプレート上の帯状の透明化を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価するこ とができる。これらの多機能性蛋白質は、多機能性の酸化抵抗性トロンボモジュ リン類縁体をフィブリン血餅の部位に導く。異型のドメインによって本化合物に 与えられたフィブリン分解活性は、より優れた血栓溶解剤を提供する。例えばｔ −ＰＡドメインのフィブリン分解作用により血餅が溶解されると、トロンボモジ ュリンドメインが、トロンビンに結合し血餅マトリクスのいかなるそれ以上の増 大をも阻害するために正しく必要な位置に配置される。このトロンビンは凝固経 路によって新たに産生されたか又は溶解する血餅から遊離されたものであろう。

多機能性ペプチドの抗血栓活性は、再潅流に際しては一般的であるような活性酸 素中間体の存在によっては減弱されないであろう。多機能性蛋白質の治療上有効 量は、単独で投与される各々の分子の投与量より低く、トロンボモジュリン類縁 体又はｔ−ＰＡのいずれかの一層広汎な全身的作用についての懸念を減らし、結 果として生ずるいかなる望ましくない副作用をも減らすであろう。

ｔ−ＰＡ遺伝子の好ましい源は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍ ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ） に寄託され、受託番号第６７、４４３を有するＥ、　ｃｏｌｉ培養（株ＭＨ−１ ）からｔ−ＰＡ遺伝子を単離することによって得ることかできる。標準的クロー ニング技術が、ｔ−ＰＡプラスミドを得、そして上述のように、トロンボモジュ リン類縁体をコードする遺伝子中に異型のドメインを挿入するのに十分循環系の いずれの部位においても、変更された人工器官としての血管内又は心血管系装置 の使用は、変動する流れ状態下における止血メカニズムの活性化の病理学的結果 としての血液から誘導された塊である、血栓形成をもたらす。典型的には、人工 器官としての血管内又は心血管系装置に関連する血栓形成は、次の連鎖を含む。

（ａ）　循環血液への表面の曝露、 （ｂ）　血小板の吸着、凝集及び血小板成分の遊離（ｃ）　トロンビン産生及び フィブリン形成（ｄ）　プラスミン産生と繊維素溶解とを要するトロンビンの分 解。一般的に、血液が人工的表面に接触すると、該表面は素早く吸収された血漿 蛋白質の層を獲得し、これが、最終的には血栓形成をもたらす活性酸素種の産生 を同時に伴った炎症性応答を媒介する。この一連の出来事はまた、血液が人工心 肺のような体外装置を通って循環するときにも起こる。

血栓抵抗性を高めるために、そのような血液接触装置のポリマー性表面には種々 の被覆を導入することが望まれてきた。酸化抵抗性トロンボモジュリンは、血栓 抵抗性表面をつくり出すのに適した新規の一群の分子を代表する。それは、それ にはインヒビターが知られていないこと及びこの能力を長時間機能させることが できることから、そのような表面として特に適している。

ここに記載の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、それらが炎症面において 活性を失わないからこの目的に特に有利であり、いくつかの類縁体は、完全長ト ロンボモジュリン類縁体を豚膵臓エラスターゼで消化するときに誘導される蛋白 質フラグメントに密接に関係づけられる。この固定化された蛋白質の長時間の安 定性は、最も重要である。従って、より小さい、蛋白分解及びオキシダントに抵 抗性のトロンボモジュリン類縁体は、血液中の酵素によって蛋白分解されて生物 材料表面からの活性部分の消失並びにオキシダントによって不活性化の可能性を もたらし得る完全長分子よりも有利である。固定化した蛋白質の安定性はまた、 抗血栓性宵月性をなくしてしまう酸化に対して抵抗性を与える突然変異によって 、有意に高められる。酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、取り分け、白血 球エラスターゼを含む強力な白血球プロテアーゼ及び活性酸素中間体が生体材料 表面にアクセスする生理学的ストレス、例えば炎症等の期間においては、完全長 分子の使用より特に好ましい。

酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、動静脈シャント、静脈内シャント（例 えば、庚、血管造影の）、血管移植組織、心臓弁、人工ｒＭｉ節、ペースメーカ ー、π心室補助装置その他を含む（しかしこれらに限定されない）広汎な生物学 的応用において使用されるポリマーの表面を被覆するのに使用することができる 。

酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、生体適合性ポリマーに結合される。生 体適合性ポリマーは、ポリウレタン類、シリコンエラストマー類、ヒドロゲル類 （例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート等）、ポリエステル類、ポリ エーテル類、ポリビニルアルコールその他のような、生物学的応用の技術におい て既知で使用されているいかなる適当なポリマー性生体材料でも又はそれらの組 合せでもよい。

酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、生体ポリマーの活性化の後、該ポリマ ー材料を被覆するために結合されることができる。

活性化方法は技術的に知られており、被覆すべき化合物上のアミノ、カルボキシ ル、ヒドロキシル又はスルフヒドリル基を利用しつる。活性化は、グルタルアル デヒド、カルボジイミド活性化Ｃ０ＯＨ、イソシアナート、シアヌール酸又はヒ ドロコハク酸イミドエステル類を含む（ただしこれらに限定されない）種々の既 知の単−及び／又は二官能性試薬によって達成できる。ポリマーに結合された技 術的に既知のスペーサアームを、所望により、使用することができる。本発明の ペプチドの主要な配列に対して又はアミノ酸の化学構造に対してなした修正は、 該ペプチドを生体適合性ポリマーに結合するための手段と呼ぶ。そのような手段 は、ポリリジン部分、抗体／抗原及びビオチン／アビジン等のリガンド／アンチ リガンド結合ペアのようなスペーサーアームを含む。

生体適合性ポリマーが一旦被覆されると、それは必要に応じて手元の手順のため の技術の教えるところに従って哺乳類に埋め込まれるか、又は血液か抗凝固的に 維持されなければならない場合において血液と接触するいかなる装置においても 使用され得る。

以下の実施例は、説明として提示するものであり、限定としてのものではない。

実施例 実施例１−　酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の遺伝子の構成 １、　ｌ−ロンボモジュリン類縁体配列の単離組換えトロンボモジュリン類縁体 ペプチドを産生ずるための遺伝子は、それぞれユニに参照して導入する、１９８ ９年２月１７日に出願した米国特許出願第３１２．１４１号、１９８９年４月２ ８日に出願した米国特許出願第３４５．３７２号、１９８９年９月１３日に出願 した米国特許出願第４０６゜９４１号及び１９９０年２月１６日に出願したＰＣ Ｔ　ＳＮ　９０１００９５５なる係属中の各出願に記述されたところに従って単 離された。要するに、トロンボモジュリンのアミノ酸２２７−４６２に対応する ６個のＥＧＦ様ドメイン並びにトロンボモジュリンペプチドの他の部分をコード する遺伝子を単離するためにヒトＤＮＡが使用された（表１を参照）。このＤＮ Ａは、Ｂ１１ｎ、　Ｎ　ａｎｄ　ＤＷ　５ｔａｆｆｏｒｄ、　（１９７６）　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　３：　２３０２．に従って、胎児肝臓より 単離された。該ＤＮＡは、次いで所望の領域を抱えるように選択された合成的に 誘導されたプライマーとのポリメラーゼ鎖反応において鋳型として使用された（ 表３及び４、図ＩＡ及び２を参照）。

ａ　アミノ酸２２７−４６２をコードする遺伝子の単離法の各段階は、アミノ酸 （ａａ）　２２７−４６２をコードする挿入ＤＮＡ及び使用したプライマー＃１ ０３３及び＃１０３４を得るための手段を提供する（図２を参照）。代わりのプ ライマーを使用することによって以下に提示した手順を修正することにより、他 の可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体を得ることができることが理解 される。

＃１０３３及び＃１０３４プライマーの配列は、所望のドメインの５゛及び３゛ 末端に対応する。しかしながら、それらはＢａｍＨＩ部位を含むよう修正されて いる。終止コドン（ＴＧＡ）は、塩基１５８６に続いて導入した。ポリメラーゼ 鎖反応は、アニーリングの初期温度を３７°Ｃとした以外は５ａｉｋｉ、　ｅｔ 　ａｔ、　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　３２０：　１３５０−１３５４によ り記述された条件下において行わせた。１０サイクル後、残りの３０サイクルに ついてはアニーリングの温度を４５℃まで高め　′た。反応生成物の小部分を５ ％ポリアクリルアミドゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化し た。予想したサイズ（７００塩基対）が鮮やかに見られた。代わりに、このバン ドの配列を決定し又はその同一性を確証するために内部プローブにハイブリダイ ゼーションさせることもできる。

ｂ、　トロンボモジュリンの他の領域をコードする遺伝子の単離ここに記述した ポリメラーゼ鎖反応が、同じ仕方で、表３に掲げた領域に対応するトロンボモジ ュリンの追加のフラグメント（これらのい（つかは概念的に図ＩＡに示した）を 単離するために用いられた。特に、これらの領域は、１個又はより多くのＥＧＦ 様ドメイン及び作動可能にリンクしたグリコシレージョンドメインを抱える。所 望の領域を産生するよう選択されたプライマーの配列は、表４に示す。

Ｃ，）ロンボモジュリン類縁体遺伝子を含有するクローニングプラスミド ｉ、ｐＵｃ１９ｐｃｒＴＭ７ 上記ａ、）の部に記述したポリメラーゼ鎖反応混合物の残りをＢａｍＨＩで制限 的に切断し、５％ポリアクリルアミドゲルで分離して、７００塩基対のバンドが 切り出され溶出された。それは、ＢａｒｎＨＩで制限的に切断されたｐＵｃ１９ に繋げられ、新しいプラスミドはＥ、　ｃｏｌｉ株ＤＨ５−α中に導入された。

組換えコロニーは、アンピシリン及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル −β−Ｄ−ガラクトシドを含有する培地で選別した。白のコロニーをグリッド上 にとり、ランダムブライミングにより３２Ｐで標識する前にＥｃｏＲＩ及びＨｉ ｎｄ［Ｉ［てクローニングプラスミド（ｐＴＭ２．１）から切り取られた、トロ ンボモジュリンのアミノ酸２８３−３５２に対応する合成的に誘導した遺伝子と 、Ｇｒυ口ｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法により、ハイブリダイゼーションした （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。

フィルターをＸ線フィルムに曝した後、ｐＴＭ２．　ｌプローブ（ｐＵｃ１９ｐ ｃｒＴＭ７　、図２を参照）とハイブリダイゼーションしたコロニーを選択し、 培養物を増殖させた。ＤＮＡを抽出し、正しい制限地図を有する挿入片の存在を 確認するため、ＢａｍＨ［又はＢｇｌｌＩのいずれかの制限酵素で切断により解 析した。切り取られた挿入片はまた、ニトロセルロースに移され、標識したｐＴ Ｍ２．１とハイブリダイゼーションすることにより解析も行った。いずれの方法 も、この７００塩基対の挿入片がトロンボモジュリンの６個のＥＧＦ様ドメイン についてのコード配列を含むことを確認した。該挿入片は、ＰＣＲの間に偶発的 に突然変異が導入されていないことを確証するため、配列決定した。

ｉｉ、他のトロンボモジュリン類縁体遺伝子を含むクローニングプラスミド （１，）に記述したのと同様の方法を用いて、ｐＴＭ３０９及びｐＴＭ３２３の ような他のクローニングプラスミドが構成された。プラスミドｐＴＭ３０９は、 天然トロンボモジュリンの３５０−４６２位のアミノ酸を含有しくＥＧＦ様ドメ イン４．５及び６　）　、ｐＴＭ３２３は、２２７−４９７位のアミノ酸（ＥＧ Ｆ様ドメイン１−６及び作動可能にリンクしたグリコシレージョンドメイン）を 含む。

他のトロンボモジュリン類縁体遺伝子配列を含む追加のプラスミドが構成された （表３を参照）。

ｄ、ＡｃＮＰＶ伝達ベクターの構成 下記の伝達ベクターはまた、ここに参照して導入する１９８９年４月２８日に出 願した係属中の米国特許出願第３４５．７３２号にも記述されている。

ｉ、ヒボデルミンＡシグナル配列：　ｐＨＹｌ及びｐｓｃ７１６２つのオリゴマ ー、ＣＯＤ＃１１９８及びＣＯＤ＃１１９９を合成した（表４を参照）。これら のすりゴマ−はヒボデルミンＡシグナル配列、翻訳開始コドン、Ｂｇｌｌｌ　ク ローニング部位、ＢａｍＨＩ　５’オーバーハレド（ｏｖｅｒｈａｎｄ）および Ｋｐｎｌ　３’　オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含む。ＣＯＤ＃１１９ ８及びＣＯＤ＃１１９９をアニーリングし、ｐＵｃ１９誘導体であるｐＳＣ６５ ４中にクローニングし、ｐＨＹｌを作り出した。ヒポデルミンＡのシグナルペプ チドは表２に示す。

プラスミドｐＨＹ１はＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより制限的に切断し、ヒボデ ルミンＡシグナル配列を遊離した。この配列を、次いでｐｓｃ７１４と繋げてベ クターｐｓｃ７１６を作り出した。プラスミドｐｓｃ７１４はｐＶＬ１３９３の 誘導体であり、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、より得られた。両者間の唯一の 相違は、ｐｓｃ７１４においてはＢｇｌｒｒ部位の１つが破壊されていることで ある。

ｉｉ、ｐＨＹｌｏｌの構成 ｐＵｃ１９ｐｅｒＴＭ７からのＢａｍＨＩフラグメントをｐＨＹｌのＢｇｌＩ＋ 部位中にクローン化し、オリエンテーションはヒボデルミンＡシグナル配列がア ミノ酸２２７に隣接するように選択した。このプラスミドはｐＨＹＩＯＩである 。

ｉｉ、ＡｃＮＰＶ伝達ベクターｐＴＭＨＹ１０１の構成プラスミドｐＨＹ１０１ をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理し、これはトロンボモジュリン類縁体コード配 列に連結したヒボデルミンＡシグナル配列を遊離した。シャトルベクターｐＶＬ １３９３は、部分的に除去されたＡｃＮＰ■ポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉ ｎ）遺伝子及び独特のＢａｍＨ［及びＥｃｏＲ［クローニング部位を含む。ｐＨ Ｙｌ　０１からの５二のＢａｍＨ［／ＥｃｏＲ［フラグメントを多面体プロモー ターの下流に挿入し、こうしてプラスミドｐＴＭＨＹＩＯＩを作り出したが、そ の中ではハイブリッド遺伝子はポリへドリンプロモーターの調節下にある。この プラスミドを図４に示す。

ｌν、　他のＡＣＮＰＶ伝達ベクターの構成他のトロンボモジュリン類縁体遺伝 子配列を含む伝達プラスミドを、上に概説したのと同様の戦略を用いて構成した 。トロンボモジュリン類縁体遺伝子配列がヒポデルミンＡシグナル配列に融合す るように上述のクローニングプラスミドからのフラグメントを、フレーム中ｐｓ ｃ７１６中にクローニングした。トロンボモジュリン遺伝子配列を表３に掲げ、 図ＩＡに概念的に示す。

２、　部位指向性突然変異生成 天然トロンボモジュリンの６個のＥＧＦ様ドノドメイン領域ＥＧＦ）は、２９１ 位に１個そして３８８位に１個の、２個のメチオニン残基を有する（表１を参照 ）。部位指向性ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異生成を、これらのメチオニンのいずれ か又は双方を他のアミノ酸に変換するために使用した。部位指向性突然変異生成 は、単鎖鋳型ＤＮＡの核酸配列を特異的に変更するために、所望の核酸の置換、 挿入又は除去を含む合成的ＤＮＡ配列を使用する。この合成的ＤＮＡの鋳型ＤＮ Ａへのハイブリダイゼーション及びこれに続くプライマー・エクステンションは 、所望の突然変異を生み出すために細胞の形質転換をすることができるヘテロデ ュプレックスＤＮＡを産生ずる。

この過程を描くダイアグラムを図３に示す。

ａ、プラスミドｐＴＨＲ１４ Ａｓｅｌ−３ｃａＩフラグメント上に含まれた複製のＦ１起点を、あらかじめＮ ｄｅ　ｒ及びＳｃａ　［で消化した昆虫細胞伝達ベクター、ｐＴＭＨＹ１０１中 に繋げることによって、単鎖ＤＮＡコピーを作るためのプラスミドを構成した。

プラスミドｐＴＭＨＹ１０１は、トロンボモジュリンの６個のＥＧＦ様ドメイン に対応するペプチド（アミノ酸２２７−４６２）を産生ずる遺伝子配列を含む。

数２２７−４６２は、天然トロンボモジュリン配列に対応するアミノ酸を指す（ 表１）。アミノ酸２２７−４６２は、６個のＥＧＦ様ドメインよりなる。ｐＴＭ ＨＹｌｏｌは、継続中の米国特許出願第３４５．３７２号に完全に記述され、図 ４にダイアグラムとして示す。

ｂ、　部位指向性突然変異生成 別に述べる場合を除き第２鎖の合成を開始させそしてメチオニンの一方又は双方 が非酸化性アミノ酸に変更されたトロンボモジュリン類縁体遺伝子を作り出すた めに、特異的な突然変異生成オリゴヌクレオチドブライマーを合成し、ＭＵＴＡ ＴＯＲＴＭ−Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ１１部位指向性突然変異生成キット（カ タログ＃２００５００　、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）と共に使用した。好ましいアミノ酸であるロイシン、グルタミン又はアラニン への変換を導くプライマーを、表５に示す。これらのプライマーには、突然変異 生成が成功したか否かを判定するため有用な独特の制限酵素部位を加えるか必ず しも対応するアミノ酸配列に変更を生じないものである、遺伝子配列の置換も含 まれる。表５に示したプライマー中において核酸の置換部には下線を付した。例 えば、プラスミドｐＴＨＲ２８においては、天然トロンボモジュリン蛋白質の３ ８８位のメチオニンはロイシンに置換され、その過程で独特なＰｖｕ　［［部位 が導入されている。他の代わりの非酸化性アミノ酸が本発明において等しく有用 であることは理解される。

他の既知の手順も等しく適するであろうが、精製された単鎖ＤＮＡ鋳覆をＢｉｏ −Ｒａｄ　（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ　Ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕ ｔａｇｎｅｓｉｓ、［ｎ５ｔｒｕｅｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃａｔ、　ｎｏ 、　１７０−３５７６、　ｐ、３３−３４）により記述された手順を用いて調製 した。

各突然変異生成プライマーの５゛末端は、２ｍＭのｒＡＴＰ、０．４Ｕ／μｌの ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液中の０．　５ｎｇ／μｌのプライマーを、 アニーリング緩衝液（２０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ７，５，８ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１！ 及び４０ｍＭのＮａＣ１）中にて３７°Ｃで３０分間インキュベートすることに よって、リン酸化した。反応混合物を６５°Ｃで１５分間インキュベートするこ とにより、反応を熱不活性化した。リン酸化は突然変異生成の成功率を高めた。

１１００ｎの鋳型と２．５ｎｇのプライマーとを２５μｌのアニーリング緩衝液 中で６５°Ｃにて５分間加熱し、次いて混合物を冷却し室温にて１０分間アニー リングすることにより、リン酸化されたプライマーを単鎖鋳型にアニーリングし た。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔ、　Ｎ、、　ｅｔ様に、二重！１ｉＤＮＡをプライマー ・エクステンション法により作成した。要するに、鋳梨／プライマー混合物を、 ８０μｇ　／　ｍ　ｌの牛血清アルブミン、２．５ｍＭのジチオスレイトール、 ０．２５ｍＭの混合ｄＮＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ及び１％のグリセリン並びにｌ μｇの単鎖ＤＮＡ結合蛋白質を添加した１０％のアニーリング緩衝液で希釈（１ ・１）した。結合蛋白質が単鎖ＤＮＡ鋳型を覆うことを許容するよう、反応物は 室温にて５分間インキュベートした。ＤＮＡポリメラーゼ［Ｉ［ホロ酵素（Ｅ、 　ｃｏｌｉ　、５０単位溶液の１．　７μｌ）を添加し、反応物を３０″Ｃにて １０分間インキュベートした、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加しくＱ、５μＪ、　２ Ｗｅｉｓｓ単位）そして、反応物を３０″Ｃにて更に５分間インキュベートした 。この混合物をＥ、　ｅｏｌｉを形質転換するために使用し、適正に突然変異し たクローンを制限消化パターンによ選別した。表３は、ｐＴＭＨＹｌｏｌから作 り出された新規プラスミドを、各々の中のアミノ酸置換部と共に掲げる。

３、　他の遺伝子配列の部位指向性突然変異生成上に概説した方法を用いて、表 ３に掲げたトロンボモジュリン類縁体遺伝子配列中において類似のアミノ酸置換 を行う。

実施例２−　酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体蛋白質の製造ｏｒｎｉａ核多 面性ウィルスつウィルス（ＡｅＮＰＶ）システムを用いて、酸化抵抗性蛋白質を 製造した。このシステムにおいて、相同的組換えによって、野生型のＡｃＮＰＶ ポリヘトリン遺伝子を外来遺伝子配列に置換した。

１、　純粋なファージのストックの製造細胞のトランスフェクションは、Ｓｕｍ ｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈに従って昆虫用に修正したリン酸カルシウム沈殿 法を用いて行った。要するに、Ｔ２５フラスコに２ＸＩＯ’のＳｆ９細胞を播種 し、そして細胞を室温にて１時間接着させた。２μｇの伝達ベクター、例えばｐ ＴＨＲ２８、及びｌμｇのＡｃＮＰＶ　ＤＮＡをリン酸カルシウム中に共沈させ 、細胞と共に４時間インキュベートした。細胞を濯ぎ、再び増殖培地を与え、次 いで２８°Ｃにてインキュベーター中に３．４日置いた。このインキュベーショ ンの間、細胞は組換え及び非組換えウィルスを産生じ、これらは増殖培地中に蓄 積した。混合ウィルスのストックを含有するこの培地を、プロティンＣ補因子活 性の存在につきアッセイした（下を参照）。

組換えウィルスはプラークアッセイによって検出された。トランスフェクション の４乃至７日後にトランスフェクションストックを希釈（１０−’、ｌｏ弓及び ｌｏ−６）し、プレートに播いた。プレートに播いて７日後に、閉塞陰性（組換 え型）プラークを採取し、再度プレートに播いた（１０−’、１Ｏ−２及び１０ −３希釈）。７日後、プレートは１００％純粋な閉塞陰性組換えプラークを示し た。産生用に各々からの単一のｐｆｕを選別した。単一のｐｆｕで５ｍｊ７のＳ ｆ９細胞（Ｅｘｃｅｌｌ　４００培地（ＪＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中ｌＸｌ０ ’／ｍｊ７）を感染させ４．５日増殖させることにより、高いタイターのウィル スストックを増殖させた。このストックの一部を次いで中間対数相まて増殖した Ｓｆ９細胞中に１＝５０乃至１：１００に希釈し、蛋白質ストックを製造させた 。

２、　組換え蛋白質の製造 Ｔ２５７ラスコに、１０％ＦＢＳを加えたＴＨＮ−ＦＨ培地又はＥＸＣｅｌｌ　 ４００の５ｍｌ中２Ｘ１０＠個の密度にＳｒ１　ｍ胞を播種し、次いで単離した 組換えプラークを感染させた。３日後、ウィルスストックを回収した。フラスコ （３０乃至１００ｍｌシェーカーフラスコ又は１００乃至３００ｍｌのスピンナ ーフラスコ）に細胞を播種しく１−１、　８　Ｘ　１０’　／ｍｌ）、最終液量 の１１５０乃至！／ｌ　ＯＯに等しいウィルスストックの部分液で感染させた。

組換え型酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体蛋白質を含有する条件付けられた 培地の回収前に、感染した細胞培養物を４日間増殖させた。

実施例３−　トロンボモジュリン活性のアッセイ突然変異型酸化抵抗性トロンボ モジュリン類縁体によるトロンボモジュリン活性の保持は、該新規ペプチドの、 プロティンＣのトロンビン媒介活性化のための補因子として働く能力を評価する ことにより、最初にアッセイした。

１、　材料 家兎のトロンビン、ヒルジン及びヒトのプロティンＣはＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａ ｇｎｏｓｔｉｃａにより提供された。ヒトのトロンビンは、種々の非商業的及び 商業的ソースから入手可能である。牛トロンビンはＭｉｌｅ　Ｌａｂｓ、　Ｄａ ｌｌａｓ、　Ｔｅｘａｓ、から入手した。Ｄ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−１ｅｕｃｙｌ− Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６）及びＤ−Ｐｈｅ− Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）はＫａｂｉ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃａより入手した。牛血清アルブミン（第５分画）及びクエン酸添加ヒ ト血漿は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ミクロタイタープレ ートは、Ｃｏｒｎｉｎｇより提供された（＃２５８６１−９６）。他の全ての試 薬は入手しつる最高グレードのものであった。

２、　アッセイ方法 プロティンＣ活性アッセイ（色素原性）は、ミクロタイタープレート中、次の蛋 白質の各２０μｌを混合することにより行ったニトロンホモシュリンサンプル（ 未知又は標準）、トロンビン（３ｎＭ）、及びプロティンＣ（０，１５乃至１． ５μＭ）。各蛋白質用のアッセイ希釈液は、２０ｍＭトリス塩酸、０．１ＭのＮ ａＣ１，２，５ｍＭのＣａ　Ｃ１ｔ　、５ｍｇ／ｍｉ７のＢＳＡ、ｐＨ７，４で あった。ウェルは０．５乃至２時間の間３７℃にてインキュベートし、その後、 アッセイ希釈液への２０μ！のヒルジン（０，１６単位／μｌ、３７０ｎＭ）の 添加によりプロティンＣの活性化を停止し、そして更に１０分間インキュベート した。

形成された活性化プロティンＣの量は、１００μｌの１．０ｍＭＳ−２２６６（ アッセイ希釈液中）を添加し、プレートを３７°Ｃにてインキュベートし続ける ことによって検出した。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ製プレートリーダ ーを用いて、各ウェルの４０５ｎｍの吸収を３０分の間１０秒毎に読みとった。

吸光度データを貯蔵し、そして各ウェルの１秒当たりの吸光度変化（勾配）を計 算した。１秒当たりの吸光度の変化は、活性化プロティンＣのｐｍｏｌｅ／ｍｌ に比例する。この比率は、総活性化プロティンＣの変化する濃度を用いて実験的 に決定した。１００％活性化プロティンＣを含有するサンプルは、Ｏ乃至１．　 ５μＭのプロティンＣを６０ｎＭの天然の家兎トロンボモジュリン及び３０ｎＭ のトロンビンと混合し、０乃至４時間インキュベートし、ヒルジンを加えＳ−２ ２６６の変換を上記のように測定することによって産生した。１００％のプロテ ィンＣが活性化される条件を、Ｓ−２２６６変換（Ａ４０５／秒）がプラトーに 達する条件と定義した活性の単位は、上に定義した試薬条件下において、１ｍｌ 当たり１分当たりｌ　ｐｍｏｌｅの活性化プロティンＣの産生として定義される 。代わりに、報告した活性値は、家兎のトロンボモジュリン又は野生型（非突然 変異）のトロンボモジュリン類縁体６ｈ／２２７−４６２を標準として用いて計 算された。蛋白質分子量を導くのにアミノ酸分析を用いることにより、ｌ　ｎｍ ｏｌｅの野生型トロンボモジュリン類縁体（６ｈ／２２７−４６２）が１　ｍｍ ｏｌｅの家兎天然トロンボモジュリンに等しい苛性を有することが決定された。

３、　オキシダントに暴露した後の活性オキシダントに対する突然変異トロンボ モジュリン類縁体ペプチドの抵抗性を特に試験するために、クロラミンＴ　（Ｎ −クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミドナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ）を使用した 。突然変異トロンボモジュリン遺伝子配列又はｐＴＭＨＹｌｏｌ　（野生型、ａ ａ２２７−４６２）によりコードされたペプチドを含むトランスフェクション培 養上澄（１ｍ！りを、ＮＡＰ−１０カラム（ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）上 で脱塩してｐＨ７，０でｏ、ｏｏｓ％のＴｗｅｅｎ　８０を含む１゜５ｍ！！の ０．　２％Ｎ−二チルセチルリン（ＮＥＭ）中に溶液とし、次いで凍結乾燥しそ して１００μｌの上記緩衝液に再懸濁した。サンプルを均等に分割し、５μｌの 水（対照）か又は５μｌの０．　１ＭクロラミンＴ（最終濃度９．１ｎＭ）を加 えた。サンプルを室温にて２０分間インキ、ベートシ１、次いてＮＡＰ−５カラ ムに移し、オキシダントを全て除去した。使用Ｉ５、た脱塩緩衝液をプロティン Ｃアッセイ希釈液とした。丁に示した結果は、クロラミ二／Ｔに曝露した後も突 然変異ペプチドはその全ての活性を保持し、一方野生型ペプチドは実質的に不活 性化されたことを実証した。活性は天然トロンボモジュリンに対するｎＭ等量で 報告されている。

蛋白質量の損失は、いずれのサンプルにおいても検出されなかった。他の突然変 異トロンボモジュリン類縁体は、類似の結果を示した酸化抵抗性トロンボモジュ リン類縁体は、条件付けられた培地から細胞残滓を除去し、５つのクロマトグラ フィ一段階によって精製された。すなわち、１）Ｑセファロース、２）トロンビ ン親和性、３）ゲル濾過、４）陰イオン交換、及び５）第２のゲル濾過段階であ る。各ゲル濾過段階は、緩衝液の交換をもたらす。全てのクロマトグラフィ一段 階は４℃にて行った。

１、クロマトグラフィー樹脂のいくつかは、市販のものを入手した。Ｑセファロ ース及びセファデックスＧ２５はＳｉｇｍａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）よ り入手し、ＭｏｎｏＱ　５１５ＴＭはＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　（Ｐｉｓｃ ａｔａｗａｙ、　ＮＪ）より入手した。

ＤＦＰ−トロンビンアガロースは、凡そ次のようにして調製した。１００ｍｆの ２０ｍＭリン酸すトリウム、ｐＨ７，５中の３６０ｍｇの牛トロンビン・を約１ ００ｍｌの５０％Ａｆｆｉｇｅｌ　ｔｏ樹脂懸濁液に加え、４°Ｃにて終夜混合 した。Ａｆｆｉｇｅｌ　１０は、メーカーによる記載の通りにして使用のために 準備しそしてサンプル装填用緩衝液と平衡化させた。残存活性エステルは、１０ ０ｍｆの０．１Ｍグリシン（ｐＨ５，６）の４°Ｃ１時間の添加によりブロック した。ゲルは次いで３０ｍＭのトリス塩酸、２ＭのＮａＣ１、ｐＨ７，５で平衡 化し、そしてＤＦＰの最終濃度約１ｍＭを得るよう、２０μ！のＤＦＰを加えた 。４°Ｃにて１６時間の混合の後、追加の６μｌのＤＦＰを加え、そして混合を 更に４時間続けた。次いで樹脂を２０ｍＭのトリス塩酸、２ＭのＮａＣ１，ｐＨ ７，５で洗浄し、４°Ｃに貯蔵した。

トロンビン活性は、Ｋａｂｉ　Ｓ−２２３８基質を用いて測定したところ、８６ ％を超えるトロンビンが溶液から除去され、そしておそらく樹脂に結合したこと が示され、樹脂１ｍ４７当たり約６ｍｇのトロンビンの最終濃度を与えた。ＤＦ Ｐ処理樹脂の酵素活性は、当初活性の１％未満であった。

２　純粋なＭｅｔ３８８−＞ＬｅＬＩペプチドの製造条件付けられた培地を回収 し、１４００Ｘｇで１０分間遠心することにより澄明化した。氷酢酸でｐＨを約 ６．　０から約５．２に調整した。調整した培地を次いでＱセファロース樹脂の カラムに載せた。カラムは、約４カラム体積分の洗浄緩衝液１（１１７ｍＭの酢 酸ナトリウム、０．０２％のＮａＮ５　、ｐＨ５，０）で予め平衡化させておい た。載せた後、カラムを洗浄緩衝液２（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、Ｏ，ＬＭの ＮａＣ１、ｐＨ５，０）で洗浄し、次いで酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 を０．３ＭのＮａＣ１を含有するｐ）Ｉｓ、０の洗浄緩衝液２で溶出させた。

プロティンＣ活性化アッセイ（上を参照）において測定したとき活性を含有する カラム分画をプールし、次いで０．３ＭのＮａＣ１，２０ｍＭのトリス塩酸、０ ．５ｍＭのＣａＣ１ｚ、０．０２％のＮａＮｘ　、ｐＨ７，５、で希釈した。希 釈した液のｐＨを測定し、ＮａＯＨで約７．５に調整した。プールした液のイオ ン強度は、凡そ約０．３ＭのＮａＣ１のイオン強度であった。この調整したプー ルを、条件付けられた培地を希釈するのに用いたのと同じ緩衝液で予め平衡化し たトロンビンアガロースカラムに、終夜、重力により載せた。カラムを希釈緩衝 液で洗浄し、そしてトロンボモジュリン類縁体を１．５ＭのＧｕＨＣＩ、２．０ ＭのＮａＣ１，２０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡナトリウム、０．０２ ％のＮａ　Ｎ　３、ｐＨ７，５、でマトリクスから除去した。

実質的に純粋の、活性な酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体をセファデックス Ｇ２５カラムにかけ、０．２％の酢酸Ｎ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）　、ｐＨ ７，０で回収した。この段階はＧｕＨＣｌ及びＮａＣ１を除去する。

セファデックス０２５カラムから回収した酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 を、次いで、０．２％のＮ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）、ｐＨ７，０、で予め 平衡化させたＭｏｎｏＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ、１０μｍ粒子、第４級 アミン）にかけた。この緩衝液で洗浄した後、種々の形態をＯ乃至０．４ＭのＮ ａＣ１勾配を用いて分離した。各分画のサンプルを、非還元性条件下に５ＤＳ− ＰＡＧＥゲル上で評価した。積み上げゲルに３．３％のアクリルアミド、分離ゲ ルに１２．５％のアクリルアミドを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法でＳＤＳポリア クリルアミドゲル電気泳動を実施した。還元されていないサンプルをＬａｅｍｍ ｌｉサンプル可溶化緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ６，８，２５％のグリ セリン、２％のＳＤＳ及び０．０１％のブロムフェノールブルー）で希釈し、ゲ ル上に直接載せた。Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　ＬＭＷ　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉｏｎ　 Ｋｉｔ蛋白質標準を分子量マーカーとして使用し、ゲルを銀染色した。これらの 条件下に、単一のバンドのみが銀染色によって見られた。

近似の可動性を有するペプチド含有分画をプールし、次いで総蛋白質量及びプロ ティンＣ活性化アッセイにおける活性をアッセイした。最高の特異的活性を含有 するピークを、同じ手順を用いて精製しておいた野生型トロンボモジュリン類縁 体ペプチド（突然変異のない天然配列）を含有するペプチド分画と比較した。Ｍ ｅｊｓｓｓ−＞Ｌｅｕトロンボモジュリン類縁体の特異的活性は、野生型トロン ボモジュリン類縁体の１．９３倍（３つのタイプの蛋白質定量の平均）であった （８０３，０００　＋　／　−７９，０００単位／ｍｇ対４１６，０００　＋／ −１９，０００単位／　ｍ　ｇ　）。

４、　オキシダントに暴露した後の活性の保持精製蛋白質（Ｍｅｓｓｓ−＞Ｌｅ ｕ）を、クロラミンＴ及び過酸化水素に暴露した後に活性を保持する能力につき 評価した。ｐＨ７，０の０゜２％ＮＥＭ中に各精製サンプル蛋白質（５μｌ、突 然変異又は野生型）を含有する３つの部分液を、５０μ！のプロティンＣアッセ イ希釈液で希釈した。サンプルに、５μｌの水、５μ！の０．１クロラミンＴ（ ＣＲＴ）（最終濃度８．３３ｍＭ）又は５μｆの３０％過酸化水素（最終濃度０ ．７４Ｍ）のいずれかを加えた。サンプルを室温にて２０分間インキュベートし 、プロティンＣアッセイ希釈液で２００倍に希釈しプロティンＣ補因子活性につ きアッセイした。表に示した結果は、突然変異トロンボモジュリン類縁体はオキ シダントに！露した後も活性を保持することを確認している。

化抵抗性及び特異的活性に関する追加データ上に論じたように、クロラミンＴは 、１ｎνｉｖｏで遭遇し得るＮ−クロロアミン類及び他の強いオキシダント類の モデルである。酸化的不活性化に対する抵抗性に関するＭｅｊｚ＊＊−＞ｌＪｕ 突然変異の利点についての我々の最初の観察は、更に２つの形態のトロンボモジ ュリンを試験することによって拡張され且つ確認された。第１の形態はＮ−末端 ドメイン、６個のＥＧＦ様ドメイン、及び作動可能にリンクしたグリコシレージ ョンドメイン〔アラニン１　（ＡＰＡＥＰＱ、、、）からセリン４９７　（、、 、ＧＬＶＨ３）まで、すなわちトロンボモジュリンの残基１−４９７）よりなる 、可溶性の類縁体、ＤＮＦＬであった。この可溶性トロンボモジュリン類縁体は 、従って、トロンボモジュリンの全ての細胞外ドメインを有する。第２の形態は 、Ｃｏｓ　７細胞の表面に発現された完全長トロンボモジュリン（ＰＬ−ＴＭ） であった。

１、　可溶性トロンボモジュリン類縁体、ＤＮＦＬの酸化的不活性化 ＤＮＦＬ　（Ａｌａｌ乃至５ｅｒ４９７）可溶性トロンボモジュリン類縁体をコ ードするＤＮＡを、複製のＳＶ４０起点及びＣＭＶプロモーターを有する哺乳類 細胞発現ベクター中に挿入した。ベクターｐＴＨＲ３２４は、天然ヒトトロンボ モジュリン配列を含み、ｐＴＨＲ３２９はＭ３８８Ｌ突然変異を含む。

Ｃｏｓ　７細胞（ＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎臓細胞）を、Ｏｐｔｉ −Ｍｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。

プラスミドＰＴＨＲ３２４及びｐＴＨＲ３２９を、リボフエクションによりＣ。

Ｓ７細胞中にトランスフェクションさせた。トランスフェクション後４８乃至７ ２時間の間に細胞培地を回収した。可溶性のトロンボモジュリン含有培地を、１ ０ｍＭのクロラミンＴで３０分間酸化し、１５ｍＭのＮ−アセチルメチオニンを 添加することにより酸化反応を停止させた。酸化された培地を、トロンボモジュ リン依存性プロティンＣ活性化についてアッセイした（Ｈ，Ｓａｌｅｍ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５９：　１２２４６　（１９８ ４）、ここに参照して導入する。）。

活性化されたプロティンＣ（ＡＰＣ）アッセイには、ヒトのα−トロンビン（Ｓ ｉｇｍａ）、組換えプロティンＣ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ヒルジン及び色素原基質 Ｓ−２２６６（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ）を使用した。全ての試薬を、９６ウエル プレート中の６０μｌのアッセイ希釈液（２０ｍＭのトリス塩酸、０．１ＭのＮ ａＣ１，２，５ｍＭの（：：ａＣｌｚ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７゜４）に希釈 した（３７°Ｃ）。プロティンＣの最終濃度は０．　５μＭ、トロンビンのそれ は１ｎＭとした。希釈されたサンプルを、６０分間インキュベートし、ヒルジン で停止させ、そしてＳ−２２６６加水分解物を４０５ｎｍ（体積１８０μｊ７） で２回読んだ。

結果を図５に示す。

２、Ｃｏ５７細胞上の完全長トロンボモジコリンであるＦＴ−ＴＭの酸化 完全長トロンボモジュリンをコードするＤＮＡ　（Ａｌａｌ乃至ＬｅＵｓｓｔ） を、複製のＳＶ４０起点及びＣＭＶプロモーターを含む唾乳顕細胞発現ベクター 中に挿入した。ベクターｐＴＨＲ４０２は天然のヒトトロンボモジュリン配列を 含み、ＰＴＨＲ４０３はＭ３８８Ｌ突然変異を含む。

Ｃｏｓ　７細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。

プラスミドｐＴＨＲ４０２及びｐＴＨＲ４０３を、Ｃｏｓ　７細胞中にリボフエ クションでトランスフェクトした。トランスフェクション後４８乃至７２時間の 間に、細胞を回収した。培養Ａ３４９細胞による並列的アッセイｃ［、Ｍａｒｕ ｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　６９：　１４８４　（１９８７）、 ここに参照して導入する。）に基づき、細胞当たりのＰＬ−ＴＭコピー数は１０ ０．０００と２００．０００の間にあると評価した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を遠心により洗浄し、そして２．５ＸＩＯ’細胞／ｍ ｌに再懸濁させた。細胞を、クロラミンＴにより２５°Ｃにて図６に示した時間 及び濃度にて酸化した。酸化の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞結合性トロンボ モジュリンについてアッセイした（１゜Ｍａｒｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８７）、ここに参照により導入する。）。細胞を３７°Ｃで１０分間、３ｎＭ のヒトのトロンビンと共にインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでプロティ ンＣ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）と共に３７°Ｃにて１時間インキュベートした。プロテ ィンＣ活性化をヒルジンの添加により停止させた。遠心により細胞を除去し、Ｓ −２２６６加水分解物を４０５ｎｍ（体積１８０μＩりにて２回読んだ。図６に おいて、ｐＰＡ０４５をの記号を付した棒は、１）ＰＡＯ４５すなわち、複製の ＳＶ４０起点、ＣＭＶプロモーター及びヒトｔ−ＰＡをコードしたＤＮＡを含む 対照プラスミドで同じ手順によりトランスフェクトした、酸化しなかった対照Ｃ ｏｓ　７細胞を示す。

３、ＳＴ＋１ｌ−６ＥＧＦにおけるＭｅｔｚ３ｇの他の全てのアミノ酸による置 換及びＡＰＣ活性の測定 ＳＴＭ−６ＥＧＦの名称は、６個のＥＧＦ様ドメイン（すなわちトロンボモジュ リンアミノ酸２２７−４６２）を含有するトロンボモジュリン類縁体をいう。Ｓ ＴＭ−６ＥＧＦの突然変異体は、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて次のようにして調製し た。

単鎖ＤＮＡを調製し、前記のようにＰｒｏｍｅｇａからのプラスミド及び方法を 用いて突然変異生成を行った。Ｍｅｔｚ＊ａは、複製のＦｌファージ起点を含む ｐＧＥＭ３ｚｆからの５ｅａｌ−Ｓａｃ！フラグメントと共に、ＰＳｅｌｅｃｔ ｌ（ｐｓｉ）のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨ１部位中に挿入された６個のＥＧＦ様ドメ インを含む、ε、　ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴＨＲ２１１中において他のアミノ 酸に変換された。　ＭｅＴｘａｘの、グルタミン、ロイシン又はアラニンへの変 更を有するＳＴＭ−６６ＧＦ突然変異体は、バキュロウィルスベクターからＭｌ ｕｌ−Ｎｏｔｌフラグメントとして採られ、Ｉｌ：、　ｃｏｌｉベクター中に挿 入された。

バキュロウィルスベクターは次のようにして調製した。前記したように特異的に アミノ酸を変化させ且つ突然変異体の選別のための制限部位を作り出すために、 突然変異オリゴマー（２７−５５塩基対）を、６ＥＧＦドメインを含む単鎖ＤＮ Ａベクターにハイブリッド化した。バキュロウィルスベクターｐＴＨＲ１４は、 ｐＥＭＢＬ８＋からの複製のＦ１起点をＮｄｅｌ及び５ｃａｌで切断したｐＴＭ ＨＹ１０１中に挿入することにより作られた。突然変異試薬は、Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅより入手した。形質転楔体を、突然変異オリゴマー中に作られた制限部位 についてスクリーニングした。突然変異蛋白質を発現すＥ、　ｅｏｌｉ　ＤＨ５ α培養物のマツチさせたサンプルをぺＩノット化し、洗浄し、そして細胞ペレッ トを、２０％ショ糖、３００ｒｎＭト’Ｊス、ｐＨ８，０，１ｍＭのＥＤＴＡ、 ０．５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２中にて培養（１０分間、４”Ｃ）ｌ、た。細胞ベレ ットを遠沈し続いて０．５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２で処理（１０分間、４°Ｃ）す ることによりショッケ−１□　（Ｓｈｏｅｋａｔｅ）上澄を調製し、そしてＡＰ Ｃアッセイ（上述）にてアッセイした。ウェスタンプロット分析は、突然変異蛋 白質が全ての例において発現されていることを実証した。図７に示したデータは 、各突然変異体又は対照プラスミド、ｐＳｌについてアセンブルした、３つの独 立した構成からの３つのショッケートのデータの平均である。

図５（部分的に精製した可溶性ＤＮＦＬについて）及び図６（細胞全体について のＦＬ−ＴＭについて）における結果が示すように、Ｍｚｓｓ−＞ＬｅＬＩ突然 変異（Ｍ２Ｂ５いは、クロラミンＴによる酸化に対し、より高いレベル及びより 長時間の曝露に対するトロンボモジュリンの抵抗性をもたらす。

ＤＮＦＬ及びＰＬ−ＴＭの双方とも、６ＥＧＦ構造中のＭｅｔ２９１に加えて追 加のアミノ酸として、メチオニン（Ｍｅｔ４２：　Ｍｅｔ　２０５；　Ｍ５３２ 　（ＰＬ−ＴＭのみり及びトリプトファン（Ｔｒｐ６９：　Ｔｒｐ９２；　Ｔｒ ｐ１０４；　Ｔｒｐ１３５：　Ｔｒｐ２１７：Ｔｒｐ２２５）を有し、これらは 酸化され得るということに注意しなければならない。これらの酸化可能残基の存 在にもかかわらず、単一のＭｅｔ３＊ｓ−＞Ｌｅｕ部位突然変異は、不活性化的 酸化に対するトロンボモジュリンの抵抗性を大きく改善する。

の、トロンビ〉に関する解離定数（Ｎ６）及び動力学的パラメーター（プロティ ンＣに関してはに２、複合体に関してはに、、、、）の測定 昆虫細胞からのＳＴＭ−６６ＧＦのトロンボモジュリン精製サンプルの、ｌ・ロ ンビンに関する解離定数（Ｎ６）及び、動力学的パラメーター（プロティンＣに 関してはｒ＜、、四合体に関してはｋｃ、、　）を測定するため、同じミクロタ イタープレートにおいて並列的にアッセイし、またアミノ酸分析にも付した。

測定は、修正アッセイ希釈液（２０ｍＭのトリス塩酸、０．１ＭのＮａＣＬ　Ｏ ，２５ｍＭのＣａＣＩｚ、０．１％のＮ　ａ　Ｎ３．０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７ ，５）中９６ウエルのプレート中で行った。Ｋ、！１１定については、トロンビ ン（１ｎＭ）をトロンボモジュリン類縁体（１乃至２００ｍＭ）に加えた。反応 はプロティンＣの添加（３μＭ）により開始した。いずれも最終濃度である。各 トロンボモジュリン濃度は３検体調製した。混合物を１０乃至１５分間（７５μ ！、２０°Ｃ）インキュベートし、そしてヒルジン（８００ｎＭ）により停止さ せた。修正アッセイ希釈液中の１００μｌ／ウエルのＳ−２２６６基質を次いで 添加した（２ｍＭ、ｆｃ）。

Ｋ、及びｋ　ｃ　ａ　＋の測定には、トロンビン（１ｎＭ、ｆｃ）、トロンボモ ジュリン類縁体（１００ｎＭ、ｆｃ）及び８濃度のプロティンＣ（２−１２μＭ 、ｆｃ）を使用した。プロティンＣの各濃度について、各時間点は、１分と９分 との間１分間隔で停止しＡ　Ｐ　Ｃｊｍつきアッセイした。ＡＰＣ濃度は、３７ °Ｃにて、３８ｍＭのトリス塩酸、０．１ＭのＮａＣ１，１ｍＭのＣａＣ１１， ０，２％のＢＳＡ、０．０６％のＰＥＣ；−６０００，０，０５％のｌ’Ｊ　ａ 　Ｎｚ　、ｐＨ７，８中において、３．９ｍＭのＳ−２２６６て、発生するｐ− ニトロアニリン（Ｅ　＝９９２０Ｍ−’　ｃ　ｍ−’）により、そして完全活性 化組換えプロティンＣについて測定された７６２分−１のｋ　ｃ　ａ　＋を用い て測定した。背景ＡＰＣについて補正した後、速度を決定するために、ＡＰＣ濃 度は時間に対してプロットされた。各動力学的ノくラメ−ターの測定は少なくと も２回行った。

表６に結果を示す。ＳＴＭ−６ＥＧＦ　（ｗｔ）については、特異的活性か２３ ２、０００±７２．０００単位／ｍｇ　（ｎ＝３）であり、ＳＴＭ−６ＥＧＦ− Ｍ３８８Ｌについては特異的活性は４６５．０００±１９．０００単位／ｍｇ（ ｎ＝２）であった。この実験における特異的活性の比率は２．０である。

実施例７−　治療的応用 可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、特に人工股関節のような整形 外科的手術を受ける患者における深部静脈血栓症の発生を防止するために使用さ れるであろう。酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体の投与は、予防剤として意 図する場合には手術前にするのが好ましいが、しかし手術中又は術後にも患者に 投与してよい。既に患者が種々の他の物質を投与されているときは、静脈内投与 は便利な投与経路であるが、皮下又は筋肉内投与は等しく効果的であろう。酸化 抵抗性トロンボモジュリン類縁体は、例えば酸付加塩、グルタミン酸塩又はアス パラギン酸塩のような薬剤学的に許容し得る担体中にて投与されるであろう。投 与量範囲は、患者体重当たり約０．０００１乃至１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより 通常は０゜００１乃至０．１ｍｇ／ｋｇであろう。適切な投与量は、ＡＰＴＴア ッセイにおいて患者の血清のサンプルを評価することによりモニターされる。治 療上有効な投与量は、所望のレベルの抗凝固が達成されるまで、ある時間にわた る一定の注入によりこれらの患者に与えられる。

表２ ＋４ ＧＧ ヒボデルミンＡシグナル配列　−ｐＨＹ１表３ 表４ ＣＯＤ　＃１４０Ｂ ＣＯＤ　１１１４０９ ＣＯＤ　＄１４１０ 表４−　（続き） ＣＯＤ　１１４４１１ ＣＯＤ　＄１４１２ ＣＯＤ　＃１４］３ ＣＯＤ　９４３４ ＣＯＤ　＄：Ｌ４８０ 表４−　（続き） 表５ ａａ２９１におけるメチオニンの置換のためのプライマーａａ３８８におけるメ チオニンの置換のためのプライマー表６ 江ヒｆｆｌ　８−−６ＥＧＦ ヒトａ−トａンビンのＫｍ　（ｎＭ）　３，７　３．５プロテインＣのに、４　 （μＭ）　３，２　□、６複合体のｋ。、、（分−’　）　２８　ｘ。

ｋ、、、／に、（Ｍ−’秒−’）　１．４６ｘｌｏ’　ｌ−９２ｘｌＯ’八 ＣＯＤ　＃１０ＢＢ ＣＧＣＣＡＣＡＴＩ″ＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧ　天 然配グｊＣＯＤ　Ｊ！１’１０３４ ＦＩＧ、２゜ ＦＩＧ、　３゜ ＦＩＧ、４゜ Ｅ＋１　← ：Ｘ　八 １）１へ Ｄ　口 へへ 区口 日ト 要約書 血栓及び血管疾患の治療のような種々の治療上及びその他の用途のための、新規 の可溶性の酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体が製造される。これらの類縁体 は、天然のトロンボモジュリンに特徴的な治療的性質を示し、しかも可溶性であ り且つオキシダントに暴露された後に不活性化されない。開示された類縁体のい くつかは、抗血栓症活性及び何らか追加の生物活性の双方を有する多機能性の融 合蛋白質である。

国際調査報告 ■−・−町ローー・１−一−Ｉ　ベコ／１ｌｓ９１１０２４４２

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件下 においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュリ ン類縁体ペプチド。
2. ２．天然ペプチド配列の少なくとも１のアミノ酸が１又はより多くの他のアミノ 酸により置換されているものである、請求項１に記載のトロンボモジュリン類縁 体ペプチド。
3. ３．２９１位又は３８８位に位値するメチオニンの一方又は双方がペプチド結合 又はメチオニン以外のアミノ酸によって置換されており、ここに該数字が表１に 提示されたアミノ酸に言及するものである、請求項２に記載のトロンボモジュリ ン類縁体ペプチド。
4. ４．３８８位のメチオニンが置換されているものである、請求項３に記載のトロ ンボモジュリン類縁体ペプチド。
5. ５．３８８位のメチオニンか置換されていないトロンボモジュリン類縁体ペプチ ドより高い特異的活性を有し、ここに測定される活性がトロンビンに結合しトロ ンビン媒介プロテインＣ活性化を高める能力である、請求項４に記載のトロンボ モジュリン類線体ペプチド。
6. ６．メチオニン残基の少なくとも１つがロイシン、グルタミン及びアラニンより なる郡より選ばれるアミノ酸残基によって置換されているものである、請求項３ に記載のトロンボモジュリン類縁体ペプチド。
7. ７．１）請求項１に記載のトロンボモジュリン類縁体ペプチドと、そして ２）第２の機能性構成要素とからなる、多機能性トロンボモジュリン類縁体。
8. ８．該第２の機能性構成要素がフィブリン溶解活性を有するものである、請求項 ７に記載の多機能性分子。
9. ９．該第２の機能性構成要素がｔ−ＰＡである、請求項８に記載の多機能性分子 。
10. １０．該第２の機能性構成要素がペプチドを生体適合性ポリマーに結合する手段 である、請求項７に記載の多機能性分子。
11. １１．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁 体ペプチドをコードする核酸配列。
12. １２．天然蛋白質配列における２９１位又は３８８位に位置するメチオニン残基 の少なくとも一方がペプチド結合により又はメチオニン以外の１またはより多く の異なるアミノ酸によって置換されており、ここに該数字が表１に提示されたア ミノ酸に言及するものである、請求項１１に記載の核酸配列。
13. １３．置換コドンが、ロイシン、グルタミン及びアラニンよりなる郡より選ばれ るアミノ酸をコードするものである、請求項１２に記載の核酸配列。
14. １４．多機能性トロンボモジュリン類縁体をコードする核酸配列であって、 １）オキシダントに曝露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁体ペプ チド、および ２）第２の蛋白質性の機能性構成要素よりなるものである核酸配列。
15. １５．該第２の機能性構成要素がｔ−ＰＡである、請求項１４に記載の核酸配列 。
16. １６．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジユ リン類縁体ペプチドをコードする核酸配列よりなる、組換えベクター。
17. １７．１）オキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁 体ペプチド、及び ２）第２の蛋白質性機能性構成要素よりなるものである、機能性分子ををコード する核酸配列よりなる、組換えベクター。
18. １８．該配列が発現調節配列に作動可能にリンクした、請求項１１に記載の核酸 配列。
19. １９．該配列が発現調節配列に作動可能にリンクした、請求項１４に記載の核酸 配列。
20. ２０．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドの単位投与量の無菌的調製物よりなる、抗血栓活性を有する 薬剤組成物。
21. ２１．該トロンボモジュリン類縁体ペプチド２９１位又は３８８位に位置するメ チオニンの一方又は双方がペプチド結合又はメチオニン以外のアミノ酸によって 置換されており、ここに該数字が表１に提示されたアミノ酸に言及するものであ る、請求項２０に記載の組成物。
22. ２２．トロンボモジュリン類縁体ペプチドの３８８位のメチオニンが置換されて いるものである、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドの有効量の無菌の水性溶液を投与することによる、哺乳類に おける血栓形成活性を制御する方法。
24. ２４．天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び条件 下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモジュ リン類縁体ペプチドを結合させた表面を有する生体適合性ポリマーよりなる組成 物。
25. ２５．１）天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び 条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモ ジュリン類縁体ペプチド、及び２）第２の蛋白質性の機能性構成要素よりなるも のである、多機能性トロンボモジュリン類縁体の単位投与量の無菌的調製物より なる、抗血栓形成活性及び第２の生物活性を有する薬剤学的組成物。
26. ２６．第２の生物活性がフィブリン溶解活性である、請求項２３に記載の薬剤学 的組成物。
27. ２７．１）天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び 条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモ ジュリン類縁体ペプチド、及び２）第２の蛋白質性の機能性構成要素よりなるも のである、多機能性トロンボモジュリン類縁体の有効投与量の無菌の水性溶液を 投与することによる、病理学的な血餅を有する哺乳類を治療する方法。
28. ２８．ａ）天然トロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に除去する濃度及び 条件下においてオキシダントに暴露した後に生物学的活性を保持するトロンボモ ジュリン類縁体ペプチド、及びｂ）多機能性分子であって、 １）オキシダントに暴露した後に活性を保持するトロンボモジュリン類縁体と、 及び ２）第２の蛋白質性の機能性構成要素とからなるものである多機能性分子 よりなる群より選ばれる蛋白質をコードする核酸配列よりなる組換えベクターに よってトランスフェクトされた細胞。
29. ２９．体重１キログラムあたり薬剤学的に許容しうる塩類溶液中の酸化抵抗性ト ロンボモジユリン類縁体ペプチドの０．００１乃至０．１ｍｇを静脈内投与する ことよりなる、ヒトにおける血栓症を防止する方法。
30. ３０．トロンボモジュリン類縁体ペプチドの２９１位又は３８８位に位置するメ チオニンの一方又は双方がペプチド結合又はメチオニン以外のアミノ酸によって 置換されており、ここに該数字が表１に提示されたアミノ酸に言及するものであ る、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．トロンボモジュリン類縁体ペプチドの３８８位のメチオニンが置換されて いるものである、請求項３０に記載の方法。