WO2014020183A1 - In-vitro-assay zur diagnose von störungen der hämostase - Google Patents

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WO2014020183A1
WO2014020183A1 PCT/EP2013/066413 EP2013066413W WO2014020183A1 WO 2014020183 A1 WO2014020183 A1 WO 2014020183A1 EP 2013066413 W EP2013066413 W EP 2013066413W WO 2014020183 A1 WO2014020183 A1 WO 2014020183A1
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WO
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thrombomodulin
coagulation
aptt
plasma
soluble
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PCT/EP2013/066413
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English (en)
French (fr)
Inventor
Torsten Schulz
Karin SCHUBART
Siegmund Karasch
Original Assignee
Ici Immunochemical Intelligence Gmbh
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/7452—Thrombomodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Definitions

  • the invention relates to assays and methods for the in vitro diagnosis of disorders of hemostasis and the risk of thromboembolic events.
  • the enzyme cascade for blood clotting includes, among other things, a cleavage of prothrombin to thrombin. This converts fibrinogen to fibrin, which normally causes wound closure.
  • the formation of thrombin is feedback regulated, so that the natural wound closure does not lead to thrombosis and vascular occlusion.
  • Free thrombin is bound to the membrane protein thrombomodulin, which is located on the surface of the endothelial cells in the blood vessels, and the complex of thrombin and thrombomodulin catalyzes the formation of active protein C, which forms a complex with the cofactor protein-S, forming the factors necessary for the coagulation reaction Villa and Va inhibited.
  • factors such as von Willebrand factor and factor IXa have an influence on the anticoagulant mechanism by protecting the factor Villa from proteolytic degradation. Hemostasis may also be disturbed by lupus anticoagulants, antibodies to phospholipids, which inhibit functional binding of the protease-cofactor complexes to phospholipid surfaces.
  • mutations and defects of Factor V, Thrombomodulin, Thrombin, Prothrombin, Protein-C, or Protein-S may override the Anticoagulant Proteirt C system. Anticoagulant also antithrombin Iii and heparin sulfate.
  • Diagnosis of disorders of the protein C system DE 197 49 197 A1 teaches a coagulation sassay for determining the anticoagulant potential of a sample, thrombopiastin (tissue factor) and thrombomodulin being added to the sample. If anticoagulant activity is suspected to be low, one must determine its cause by individually testing all the factors involved in haemostasis. However, not all patients can be identified with this assay There is a high risk of venous and arterial thromboembolism in some pathologies. Several pathologies call for a combination of multiple blood clotting disorders.
  • DE 44 27 785 also teaches Unfortunately, these tests do not capture all the anticoagulant potential of a plasma sample, and patients often receive anti-thrombotic and vitamin K antagonists as a prophylaxis, or have a medication with Protein C or thromboiytic agents such as TPA (tissue plasminogen activator), urokinase, prourokinase, streptokinase, plasminogen and their analogs.
  • TPA tissue plasminogen activator
  • urokinase tissue plasminogen activator
  • prourokinase prourokinase
  • streptokinase streptokinase
  • the prior art represents a problem. There is a lack of a test that allows a global diagnosis of disorders of plasma hemostasis and thromboembolic risk.
  • the method comprises the steps of providing a plasma sample
  • Hemostasis and a high thromboembolic risk equal division of the sample into first and second vessels; Add to the first and second slopes with the plasma sample in each case equal volumes and amounts of aPTT activator reagent for initiating the coagulation cascade, wherein in a vessel or a predetermined amount of human thrombomodulin is added; Incubate the first and second samples with the aPTT activator reagent for a period of 1 to 10 minutes at a temperature from room temperature (23 ° C) to 42 ° C, preferably 37 ° C, and obtain first and second plasma samples with one set coagulation reaction; Adding to the first and second samples having formed "non-active" thrombin equal amounts of a solution of calcium ions and activating the thrombin-dependent coagulation cascades in the presence and absence of thrombomodulin; measuring the tents between the addition of the calclum solution and the thrombin Detach blood coagulation in the first and second samples and obtain the respective [activ
  • the amino acid sequence of the human thrombomodulin analogue used (hTM analogue) is thus modified so that, unlike natural hTM, it can not be oxidized and deactivated by atmospheric oxygen.
  • the hTM analog is also modified to be soluble in aqueous buffer systems.
  • the hydrophobic segment, the cytosolic segment and the transmembrane segment are removed from its amino acid sequence.
  • it contains a mutation so that it will kosiliert during production in mammalian cells nict ⁇ in the C-terminal region.
  • the thus modified hTM analog contains the thrombin binding site and the protein C-binding site and at least the domains homologous to the epidermal growth factor.
  • the modified hTM analog is added to the Thrombophilia Screening Assay (TSA) in a matrix with multilamellar phospholipid layers on the surfactant.
  • TSA Thrombophilia Screening Assay
  • the surface-bound hT -Anaiog has a specific activity in complex with thrombin even after storage in the drying at room temperature in this matrix. It can also bind human thrombin and the complex has a specific anticoagulant activity.
  • the phospholipid layer on the surfactant may also contain purified sulfatides.
  • the surfactant is preferably selected from particulate silica, kaolin, ellagic acid and poryphenol.
  • the matrix stabilized hT analog is obtained by thoroughly mixing an aqueous formulation of oxthrate-stable soluble hTM analog with an aqueous suspension of surfactant, purified phospholipids, and optionally sulfatides, and gently removing the volatiles and aqueous solvent until Dry to obtain a formulation matrix in which the hTM analogue with the phospholipids is present on the surfactant.
  • the coagulation reaction is a surface-mediated reaction and, with some limitations, this also seems to apply to anticoagulant activities.
  • One aspect relates to a dry activator mixture for plasmatic hemostasis comprising a soluble oxidation resistant hTM analog, phospholipids and surfactants. This is hydrated prior to the assay by adding an aqueous buffer and placed in suspension.
  • the dry mixture of soluble hTM analog, surfactants and phospholipids may further contain heparin neutralizers, preferably protamine and ZnCl 2 ,
  • the set of dry reagents includes a first activator reagent (aPTT reagent) for activating the coagulation cascade and for determining partial thioplasty time (PTT) comprising a dry mixture of purified phospholipids and surfactants.
  • aPTT hTM analogue reagent for the activation of the coagulation cascade and for the determination of the partial thromboplastin time (PTT), which simultaneously initiates the anticoagulant mechanism of the thrombin-thrombomodulin complex.
  • the two contain dry activator reagents same batches of surfactants and purified phospholipids.
  • the second thrombomodulin activator reagent employs a recombinant hT analogue which is soluble in aqueous buffer and resistant to atmospheric oxygen.
  • the hTM analog is formulated in the second anticoagulant activator reagent so as to be incorporated in a formulation matrix along with the phospholipids on the surfactant. This is done by thoroughly mixing an aqueous solution of a batch of isolated purified phospholipids and surfactants with a quantity of soluble, oxidation-resistant hTM analog and separating the solvent from the mixture to dryness by lyophilization.
  • First and second activator reagents are each lyophilized to dryness and hydrated prior to the clotting assay by adding an aqueous buffer. Otherwise, the two aPTT reagents are the same.
  • the storable set of dry reagents may furthermore optionally comprise stable buffer solutions for suspending and hydrating the two coagulation reagents, as well as a prepared calcium ion solution or a CaCl 2 solution for the start of the thrombin-dependent coagulation reaction.
  • the reagent kit is suitable for a comprehensive diagnosis of plasmatic hemostasis and thrombotic risk as the hydrated formulation matrix of surfactant, phospholipid, and the oxidation-resistant hTM analog is added to the plasma sample at once, in the same time as normal aPTT reagent can.
  • the two reactions can be started identically until formation of (in the absence of cofactor non-active) thrombin, only once with and once without the presence of surface-bound hTM analog. This was not the case before, because the hTM solution was always added separately. It has also been found that the hTM analog in the formulation matrix has a more diverse anticoagulant effect in the coagulation cascade.
  • the soluble hTM analog is added as soluble protein to the coagulation reaction, not all disturbances of the anticoagulant reaction are noticeable.
  • the coagulation reaction is a surface reaction wherein the surfactant is required for the simultaneous presence of multiple factors at the same site. This also appears to apply to the anticoagulant effects of thrombomodulin and thromomodulin analog, respectively. If it is bound to be added in hydrated layers of phospholipids and / or sulfatides on a surface agent, anti-coagulatory disturbances which occur outside the protein pathway or the thrombin zone are also noticeable. dependent coagulation path lie. It is preferred to add oxidation-resistant hTM analog bound to a surfactant to the TSA so as to increase its specificity for anticoagulant potential disturbances.
  • the soluble oxidation-resistant human thrombomodulin analog (variant 2) preferably has the amino acid sequence SEQ ID NO. 2:
  • a PTT activator reagents with and without thrombomodulin can be tested against a selection of plasmas from normal patients and various thrombophilia patients to recognize specific disorders of plasmatic coagulation and thromboembolic risk.
  • a PTT-Aktrvatorreagens and dissolved thrombomodulin or hTM analog however, pipetting inaccuracies are inevitable and the fluctuations in the ratio affect the diagnostic statement.
  • the pipette represents a surface on which a plasmatic coagulation can begin.
  • the ratio of aPTT and aPTT TM reagent is comparable in all reactions and it is only necessary to pipette once.
  • FIG. 1 shows a flow chart of the method steps of the assay for determining disorders of hemostasis and a thromboembolic risk
  • Figure 3A is a schematic representation of the primary structure and domains of human thrombomodulin.
  • Figure 3B is a schematic representation of the structure of soluble thrombomodulin analogue with the domains EGF1-6 (241-480), 0 (481-515), a deletion of the amino acid sequence from position 26 to 240, one inserted
  • APAEPQP sequence in the region of the N-terminus instead of amino acids 20 to 25, a Met406Leu mutation to prevent possible oxidation by Luttsauerstoff in aqueous solution and a Ser492Ala- mutations to prevent a possible O-glycosylation;
  • Fig. 5 is a diagram of the results for optimizing the TSA ratio for the
  • Thrombomodulin variants 1-4 a graphical representation of a series of experiments to investigate the influence of heparin on the assay in the absence of a heparin neutralizer;
  • 7 shows a graphic representation of the clotting times of normal plasma and heparinized plasma samples after addition of thrombomoduiin with different neutralizers; 8 is a graphical representation of the ratio of clotting times with and without
  • the coagulation ability of blood is often described by the Quick Value in laboratory medicine. He describes how well the extrinsic system of blood clotting works.
  • the Quick Value is derived from the International Normalized Ratio (INR). This is the ratio of the thromboplastin time of the patient plasma to the thromboplastin time of a reference plasma, which in turn is normalized to a WHO standard thromboplastin time.
  • Vitamin K is essential for the synthesis of coagulation factors II, VII, IX and X as well as for the anti- coagulating protein C and S system, since it is a cofactor of ⁇ -glutamyl carboxy lase.
  • the said anticoagulants also have an effect on the single-factor coagulation tests, so that they can only be interpreted quantitatively in a limited way. There are also no parameters for a significantly increased bleeding or thrombosis risk.
  • Ca 2+ -free plasma (citrate piasma) is preincubated with aPTT reagent at 37 degrees Celsius and the thrombin-dependent coagulation is started by addition of Ca 2 * .
  • the aPTT reagent anticipates the extrinsic pathway to the level of prothrombin (non-Ca-non-active) and determines only the coagulation time after addition of Ca 2 *. This value is hemophilia above the default value of about 30 seconds. Therefore, a reduced coagulation or a risk of bleeding can be detected.
  • partial thromboplastin time is also influenced by factors of the intrinsic pathway: a deficiency of the factors XII, XI, IX and VIII cause an extension of the PTT such as a deficiency of the factors X, V, II and I. Prolonged PTT values are observable at high concentrations of fibrin cleavage products or inhibitors (inhibitor hemophilia, lupus anticoagulants). Not recognized by either test is an excess (thrombophilia) or a high thromboembolic risk. Also general disorders of the plasmatic hemostasis are not recognized.
  • aPTT [activated] partial thromboplastin time and platelet count in order to detect non-drug-induced haemostatic disorders. This practice is controversial, as only about 13% of hemostatic disorders are detected; see Koscielny, J. et al., Preoperative identification of patients with (primary) haemostatic disorders, haemostaseology, 2007. 27 (3 ⁇ 177-84.
  • an extended PTT is often detected with an inconspicuous Quick value. Then it has to be clarified whether a condition with increased coagulation tendency or one of the not uncommon other causes of a PTT prolongation exists.
  • the intrinsic pathway Factors VIII, IX, XI, XII, HMWK and prekallikrein
  • the Quick test the extrinsic (Factor VII) coagulation system is detected which influences factors of the common pathway. Both worlds are flowing (X, V, II and I).
  • the activation state of the coagulation system in the whole body may also be determined by measuring the D-dimers (fibrin clot products).
  • thrombophilia thromboembolic risk
  • the aPTT reagent for the start of partial thromboplastin time consists of a surfactant and phospholipids.
  • a list of common aPTT reagents is included in the WHO Scrap WHO BS / 09.21 16, page 35.
  • the aPTT reagents differ from one another in the relative and absolute concentrations of polar phospholipids, in the surfactants (kaolin, silica, Ellag - Acid, polyphenol), in the total sensitivities to the factors IX, XI, XII, the sensitivity to factor VIII, and also in the sensitivities to heparin and lupus anticoagulants.
  • aPTT reagents include Dapttin TM (Baxter), Dapttin TM TC (Technoclone), Actin FS, Actin TM and Pathombin TM SL (Siemens Healthcare Diagnostics), Actin TM FSL (Dade Behring), APTT-SP, and SynthASil TM ( Instrumentation Laboratory) or STA TM aPTT (Roche Diagnostics).
  • Invention Contains Soluble Oxidation Resistant Thrombomodulin Analog. With the formation of the complex of thrombin and thrombomodulin, coagulation at the level of thrombin is interrupted and the anticoagulant mechanism is started. Observing the balance between coagulation and anticoagulation allows diagnosis of thromboembolic risk as well as detection of a disorder of plasma hemostasis associated with actual bleeding risk.
  • TSA thrombophilia screening assay
  • the soluble hTM analog is added in hydrated layers of phospholipids and / or sulfatides on a surfactant and then the extrinsic coagulation pathway is started.
  • disturbances of the equilibrium which lie outside the thrombin-dependent coagulation path, surprisingly also become noticeable.
  • TSA One advantage of the disclosed TSA is that its assertion of anticoagulants is hardly disturbed.
  • the TSA always forms the hemostatic balance, with coagulation inhibitors remaining visible in the coagulation system.
  • the TSA according to the invention therefore also allows postoperative statements on the necessary therapy with coagulation inhibitors and this is necessary for many reasons.
  • estrogen-containing contraceptives increase the risk of thrombosis.
  • Venous thrombosis is the third most common life-threatening disease of the cardiovascular system in women after heart attack and stroke.
  • a screening of the risk of thrombosis is also not in the prescription of hormonal contraceptives, because the benefits justify the costs only for certain pre-existing diseases.
  • the current diagnostics which consists of a series of single-factor studies, must be carried out by the patient at their own expense as part of individual health services. With the disclosed thrombophilia screening assay, a test is now available which is sensitive and a cost-effective alternative to Einzeiing investigation, because it is not defects of individual factors, but the entire physiological interaction of the coagulation factors mapped.
  • Another application is the monitoring of the risk of thrombophilic hemostasis disorders in pregnancy. Women who are carriers of acquired and / or acquired thrombophilic risk factors have an elevated incidence Risk of pregnancy-related complications such as venous thromboembolism and abortion. The relative risk of deep leg or pelvic vein thrombosis is six-fold higher in women who are pregnant than in non-pregnant women. Shortly after birth, the risk of thrombosis is even greater. During normal pregnancy, thrombosis-promoting changes occur, which bring the hemostatic system out of balance. In the face of studies linking thrombophilia and pregnancy-related complications, there is the question of the individual risk of thrombosis during pregnancy.
  • the disclosure includes formulating soluble hT analog with phospholipids on a surfactant such as silica.
  • a surfactant such as silica.
  • the resulting formulation simulates the physiological matrix state in which plasmatic coagulation and anticoagulation are surface-mediated reactions.
  • the thrombomodulin is originally a protein anchored in the cell membrane and the thrombin is bound in a complex on the cell. It turns out that the soluble hTM integrated in the artificial phospholipid layer has anticoagulatory effects in the intrinsic pathway.
  • the quantitative and relative ratios of Oberfiumbleenmrttel / - Phospholipld (aPTT reagent) and soluble hTM are to be controlled and adjusted in advance on normal plasmas. If, during the control with normal citrated plasma, the thromboplastin time is above a limit, the amounts of coagulating components and soluble hTM must be adjusted.
  • the disclosed aqueous formulation of the aPTT reagent by contrast, contains soluble hT analog and, optionally, organic solvents and mild detergents which are compatible with thrombomodulin activity for stabilization. At the same time they cause a destabilization of the phospholipid layers.
  • Suitable detergents are nonionic detergents such as Triton® X-100 (PoIyoxyethyIen (9.6) + p ⁇ octyIphenoi "Triton® X-114, T-20 een®, Octylglucoside such as octyl-beta-D-glucopyranoside, octyl?
  • -R- thioglucopyranoside decyl-ß-D- maltoside, ⁇ -dodecyl- ⁇ -D-ma itoside, phosphatalkethanolamine, dodecyldimethyl-N-amine oxide, lauroamido-N, N-dimethyl-3-n-propylamine oxide (LAPAO), N-dodecyl-N, N-dimethylammonio) butyrate (DDMAB), phosphocholines, cholates (sodium cholate) and organic solvents such as isopropanol, ethanol, butanol, isobutanol.
  • LAPAO N-dimethyl-3-n-propylamine oxide
  • DDMAB N-dodecyl-N, N-dimethylammonio) butyrate
  • cholates sodium cholate
  • organic solvents such as isopropanol, ethanol, butanol, isobutanol.
  • multilamellar phospholipid layers form on the surface agent in which proteins are incorporated.
  • lamellar proteolipid layers are formed between the interfaces or in the liquid-crystalline phospholipid phase, in which the oxidation-resistant soluble hTM analog is incorporated, although in the soluble hTM analogue the transmembrane domain and the hydrophobic domain have been deleted.
  • an antioxidant preferably selected from dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), vitamin C and ⁇ -mercaptoethanol, is preferably added to the formulation prior to lyophilization.
  • DTT dithiothreitol
  • DTE dithioerythritol
  • vitamin C vitamin C
  • ⁇ -mercaptoethanol is preferably added to the formulation prior to lyophilization.
  • DTT dithiothreitol
  • DTE dithioerythritol
  • vitamin C ⁇ -mercaptoethanol
  • aPTT reagent An aliquot of the hydrated hTM / aPTT or aPTT reagent is then added to the plasma sample in the ISA.
  • the dry aPTT reagents can be previously tested on normal plasma pools and various plasmas of thrombophilia patients. Testing can be done before lyophilization.
  • the plasma sample is preferably so-called crater plasma, in which the calcium ions are complexed and masked by the addition of citric acid.
  • Other chelating agents such as EDTA or EGTA are also suitable for the complexation of calcium ions.
  • the recombinant thrombomodulin used is a soluble oxidation-resistant human thrombomodulin fragment.
  • Natural thrombomodulin (TM) is a glycosylated type 1 transmembrane protein on the surface of blood vessel endothelial cells. Natural TM has an acidic isoelectric point around 4, a single 557 amino acid polypeptide chain, and a molecular weight of 68-78 kDa. It is thus highly N- and O-glycosylated with an additional chondroitin sulfate sugar chain.
  • TM includes a lectin-like N-terminal domain, a hydrophobic segment, six contiguous domains similar to epidermal growth factor (EGF), an O-glycosylated serine / threonine-rich region, a transmembrane domain, and C- terminal a cytoplasmic segment (see Figure 3A).
  • EGF epidermal growth factor
  • TM is a cofactor for the thrombin-catalyzed activation of protein C. It itself has no enzymatic activity.
  • Thrombin binds to the fifth and sixth EGF domains. For protein-C binding and cofactor activity, the fourth EGF domain and the serine-threonine rich region are required.
  • TM-thrombin complex with TAFI (thrombin-activatable ftbrinolysis inhibitor) requires the third EGF domain.
  • Serine ⁇ 492 is the glycosylation site for a sulfated glycosaminoglycan (chondroitin sulfate).
  • the chondroitin sulfate sugar chain (GAG chain) at the serine / threonine-rich region forms a second thrombin-binding module that supports protein C activation and promotes the formation of thrombin-antithombin HI complexes.
  • the methionines 309 and 406 are sensitive to oxidation by atmospheric oxygen, but only the oxidation of methionine (406) results in a loss of cofactor activity.
  • TM without GAG shows only cofactor activity in thrombin-mediated protein C activation.
  • TM with GAG has an increased cofactor activity and a direct anticoagulant activity (direct inhibition), it has an antithrombin HI-dependent anticoagulant activity (inactivation by antithrombin III).
  • Replacement of Ser492 by Ala prevents post-translational GAG modification.
  • the preferred thrombomodulin analog contains only the extracellular domains upon deletion of the transmembrane and cytoplasmic segments.
  • the surface layer containing soluble oxidation-resistant thrombomodulin and phosphoipid is obtained by preparing an aqueous suspension of highly purified phosphoipid, surfactant and recombinant soluble HTM, preincubated at room temperature to 37 degrees Celsius, and removing the water from the aqueous suspension, preferably by lyophilization ,
  • the soluble hTM analog is incorporated in the muttilamelar layers of polar phospholipids on the surfactant, which approximates its natural state as a membrane protein.
  • the TSA thus not only detects the absence or genetic defect of a single factor, but also integrates the complex interaction of factors involved in the reaction pathways; thus also determines potentiating and neutralizing effects, which single factor tests can not afford. Especially in sepsis patients and chemotherapy patients is often a multiple disturbed blood clotting, so that the procedure gives the doctor an overall view on the risk of thromboembolic.
  • Variant 1 JM ⁇ L H E O ) ⁇ Soluble form of hTM with the domains L (19-172), H (173-240), EGF 1-6 (241 -480), 0 (481-515 ) and a Met406Leu mutation] contained all extracellular domains.
  • Variant 4 [TM (E o) S492A] contained the EGF and serine threonine domains necessary for cofactor activity. The signal peptide was extended by the first seven N-terminal amino acids of the lectin domain (APAEPQP) C-terminal. In addition to the 406L mutation, there was an S492Autation. P " M (EO) S492A] had the amino acid sequence SEQ ID NO: 4: SEQ ID NO: 4:
  • hT analogues 1-4 (SV1, SV2, SV3, SV4) were expressed in HEK-293 cells, isolated and their anticoagulant activity determined in the standard coagulation assay; see Figure 4.
  • the variant SV1 was also expressed in insect cells (IV1), which can not carry out post-translational modifications with glycosaminoglycans.
  • the anticoagulant activities of the hTM variants were investigated by the standard method in normal plasma and in defective plasmas (protein C deficiency, protein S deficiency and heterozygous factor V Leiden); the clotting times were measured mechanically and optically.
  • Gfykosaminoglycan (Ser492 wild-type) modification produced no measurably higher activity and sensitivity than hTM variant 2 (Ser492A mutant; SEQ ID NO: 2).
  • hTM variant 2 Ser492A mutant; SEQ ID NO: 2.
  • the truncated hTM variants 3 and 4 had a higher anticoagulant activity, the higher activity masked deficiencies in clotting and thus these variants were no better suited to detect specific coagulation defects.
  • Variant IV1 had a significantly lower activity The assay development therefore took place with the soluble oxidation-resistant hTM analog variant 2 (SEQ ID NO: 2, SV2) expressed in HEK293 cells.
  • the diagnostic optimum of hTM analog variant 2 in TSA was further optimized in terms of ratio and coagulation delay (GTM); See Figure 5.
  • the amount of hTM Analog 2 was also adjusted to the requirements of clinical practice so that the induced clotting time delay did not exceed on average 130 s.
  • the diagnostic window was about 3 to 4 pg hTM analog 2 per standard measurement ⁇ Fig. 1 ; Clotting time with hTM2: 113 s / 132 s).
  • the coagulation time delay must be significantly higher for normal plasma than for deficient plasmas, because this difference is the basis of the procedure.
  • the aPPT reagent or hTM / aPTT formulation must not only cause coagulation delay, but also distinguish deficient plasmas from normal plasmas. Only then does the TSA's ratio (GTM / GTM0) point to a disruption of plasmatic hemostasis and a thromboembolic risk.
  • the human thrombomodulin is contained in conventional reagent kits as a separate solid (lyophilisate). Thrombomodulin in solution is not stable. Also, the aPTT reagent is always included as a lyophilizate in the reagent kits for durability. According to the invention, the soluble hTM analog 2 is provided as a formulation matrix with the aPTT reagent.
  • aPTT reagent (Dapttin TM TC, TECHNO-CLONE, AT) containing silica, sulfatides and highly purified phospholipids was reconstituted in ultrapure water, and then recombinant variant 2 human thrombomodulin [soluble oxidation-resistant underglucosylated hT with the domains L (FIG.
  • Ethanol (10: 1) again homogenized and aiiquotiert, so that in each of the vessels of the reagent set a defined equal amount homogeneous aPTT reagent with and without bound hTM analog 2 (silica, layers of highly purified phospholipids, Sulfatides with and without hTM analog 2).
  • the hTM analogue 2 is not only stable on storage but also participates in further antitogylatoric reactions as a result of the incorporation according to the invention into the phospholipid-sulfatide layers on the surface preparation, but it also participates more specifically in the reactions for the anticoagulant potential.
  • the coagulation reaction is a surface-transduced reaction and this also applies to the anticoagulant effect of thrombomodulin, especially since human thrombomodulin is a cell membrane protein.
  • the new TSA requires only three pipetting steps, whereas previously the soluble thrombomodulin had to be added separately.
  • the separate addition resulted in concentration differences and inherent different clotting times, without relying on a specific effect of thrombomodulin. This was tolerated and not considered important.
  • the reactions were different up to the level of thrombin, which also changed the calcium-dependent coagulation reaction.
  • For manual relief is added that the probability of errors was smaller. Manually pipetting a small amount of fluid into a larger volume into a larger number of vessels is always error prone, as double pipetting or skipping may go unnoticed. This source of error is eliminated by the new set of reagents.
  • the rd assay error has been reduced from an average of 7% to less than 4% compared to conventional manual versions.
  • the TSA according to the invention also corresponds to the standard execution of an aPTT test, but it now provides a broader diagnostic statement with regard to disorders which no longer necessarily have to lie on the protein C pathway.
  • the amount of hT analogue 2 to aPTT eagens can best be adjusted to a lack of specific clotting time delays and tested in advance.
  • the lyophilization of the aPTT reagent is not in the way of optimization. Because of the proportionally higher proportion of citrate plasma in the reaction mixture - there is no addition of other reagents - also shortens the time to coagulate the sample.
  • the standard aPTT coagulation time of Normai Kontroilplasmen in the TSA shortens from an average of 38 to 35 seconds and the HTM prolonged aPTT clotting time from an average of 160 to 135 seconds. The shorter coagulation times allow a larger amount of hTM in the assay and a higher hTM concentration in turn causes a greater difference in clotting times and a higher sensttivity for disorders of hemostasis.
  • the maximum amount of hTM in the assay is limited by the maximum allowed clotting time, and it depends on the method of measurement and the chosen limitation on the time of measurement.
  • Most clinical laboratories limit the coagulation measurement time to 240 seconds, because with longer coagulation times, the time required for the analysis becomes too long and the standard error exceeds the permissible values.
  • mechanical measuring methods increasingly lead to failures due to coagulation errors.
  • APTT coagulation time extensions of> 200 seconds lead to an unacceptable increase in the standard error, especially in the case of mechanical measuring methods.
  • the hTM-related clotting time delay is usually set to 125-135 seconds to determine the different clotting times in all patient samples. Specificity and sensitivity of h TM2 / aPTT reagents to coagulation deficiencies
  • Control plasma and pathological plasmas protein C and S deficient; factor V Leiden mutation
  • diagnostically relevant is the ratio, the ratio of partial thromboplastin times with and without hTM2 (GZTM / GZTMO) for normal control plasma and pathological deficiency plasmas.
  • the coagulation times were measured optically with the coagulation machine BCS (Siemens) in duplicate and evaluated diagnostically on the basis of the determined ratio, ie from the ratio of coagulation tents with aPTT / hTM2 matrix reagent (GZTM) and aPTT reagent without thrombomodulin (GZTM0). , The gap between the partial coagulation time between normal plasma samples and pathological samples is cautiously limited by the potential of the test procedure and the safety of the diagnosis.
  • the TSA reagents of the invention showed a high sensitivity to defects.
  • the average achieved ratio of 2.7 in pathological samples was significantly below the average ratio of normal donor samples (4.2); the ratio gap was equivalent to the ProC-Global test, but only interference in the protein C pathway recognizes.
  • the majority of the pathological samples contained defects with a FV Leiden mutation. Samples with a protein C or S mango! were under-represented.
  • the sensitivity of the reagents according to the invention for the FV Leiden mutation was 97%.
  • the average ratio in a singleton FV Leiden mutation heterozygous form (without PC, PS deficiency) was 2.3; the highest measured pathological ratio was 3.28.
  • the TSA reagents according to the invention thus allow a very high diagnostic certainty.
  • the TSA reagents according to the invention are specific beyond the protein C pathway. Thus, they detect increased plasma levels of coagulation factors FVIII, IX and XI alone or together with Lu pus anticoagulant antibodies. In addition, the rates of plasmas of sepsis patients indicate that their chance of survival depends on the state of plasmatic haemostasis, including coagulation outside of the plasma
  • the clotting time GZTMO without hTM2 is usually set to approximately 33-38 s and the delayed clotting time GZTM to 120-1 0 s (FIG. 2 B Plasma ControlN). The evaluation is done by ratio (GZTM / GZTMO) and the individual clotting times without and with hTM2.
  • Plasma sample with a ratio above limit at non-prolonged GTZMO time the pro- and anti-coagulant coagulation mechanisms are intact.
  • Plasma sample with a ratio above the limit of prolonged GTMO time there is a low concentration of pro- and anticoagulant coagulation components; the diminished plasma haemostasis does not have to mean an increased risk of thrombophilia.
  • An "extended statement” of the assay can be derived from the GZTMO time, ie from the "activated partial thromboplastin time (aPTT)". This common coagulation parameter allows further statements. So an extended GZTMO (aPTT) may indicate
  • the prolonged clotting time GZTM determined with hT 2 is dependent on the causes of the prolonged GCT O and its expression. For example, with pronounced haemophilic conditions or a high dose of heparin, GZTM can not be measured - because the sample does not clot with hTM or only when there is a high risk of thrombosis. In the case of lupus anticoagulant or therapy with oral anticoagulants from the group of vitamin K antagonists, the GZTM is measurable and results in a pathological ratio of lupus anticoagulant or in a vitamin K antagonist medication in samples with an INR below the threshold (see Figures 2A, B).
  • the anticoagulant effect of heparin is based on its binding to circulating blood antithrombin III. Free antithrombin Hl inhibits activated coagulation factors such as thrombin and factor Xa.
  • Free antithrombin Hl inhibits activated coagulation factors such as thrombin and factor Xa.
  • LMWH low molecular weight fractionated heparins
  • An International Unit (IU) Heparin prevents coagulation in 1 mL citrated plasma after addition of CaCl 2 at 37 ° C for one hour. Many patients are given heparin as a preventive measure, so that in heparinized normal plasma samples the coagulation times are prolonged or coagulation is no longer possible after the addition of hTM.
  • the surface-bound hT 2 TSA reagents of the invention were thus sensitive to combinations of risk factors outside the protein C pathway.
  • the prothrombin mutation G20210A represents a hereditary risk factor for the development of thrombosis. It is found in Germany in 2-3% of the population and leads to an approximately five-fold increased risk in heterozygous carriers, in the homozygous form the risk of thrombosis is more increased , It is the second most common hereditary thrombosis after APC resistance.
  • the test is sensitive to lupus anticoagulation and a combination of prothrombin G20210A mutation and other coagulation parameters (FVIII, FXI, CBA, FXIII, FVli, hyperhomocysteinemie).
  • the test also correlates inversely with the severity and number of defects and describes the overall risk of thrombosis.
  • Various defects of individual coagulation parameters are cumulative in the coagulation test according to the invention.
  • the test provides comprehensive information on the balance of plasmatic hemostasis, which is a major diagnostic advantage over single-factor tests in many applications.
  • the test detects both hereditary and acquired thrombosis risks.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von Störungen der Hämostase und eines thromboembolischen Risikos, wobei eine Plasmaprobe von einem Patienten mit Verdacht auf gestörter Hämostase und hohem thromboembolischen Risiko versetzt wird mit einem aPTT-Reagens mit und ohne Thrombomodulin. Das aPTT-Aktivatorreagens mit löslichem Thrombomodulin wird als wässrige Suspension zugesetzt, umfassend eine Formulierungsmatrix aus einem gemeinsamen Lyophilisat einer Suspension von Oberflächenmittel, Phospholipiden und wasserlöslichem humanen Thrombomodulin-Analog, das von Luftsauerstoff nicht desaktiviert werden kann, wobei das Thrombomodulin-Analog in einer Grenzschicht auf dem Oberflächenmittel vorliegt. Weiterhin sind verschiedene Reagenziensätze für die Bestimmung des thromboembolischen Risikos offenbart.

Description

IN-VITRO-ASSAY ZUR DIAGNOSE VON STÖRUNGEN DER HÄMOSTASE
TECHNISCHES GEBIET
[001] Die Erfindung betrifft Assays und Verfahren zur in-vitrc-Diagnose von Störungen der Hämostase und des Risikos von thromboembolischen Ereignissen. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
[002] Die Enzymkaskade für die Blutgerinnung beinhaltet unter anderem eine Spaltung von Prothrombin zu Thrombin. Dieses setzt Fibrinogen zu Fibrin um, das im Normalfall einen Wundverschluß herbeiführt. Die Bildung von Thrombin ist rückkoppelnd geregelt, damit der natürliche Wundverschluss nicht zu Thrombosen und Gefäßverschlüssen führt. Freies Thrombin wird am Membranprotein Thrombomodulin gebunden, welches sich auf der Oberfläche der Endothelzelien in den Blutgefäßen befindet, und der Komplex aus Thrombin und Thrombomodulin katalysiert die Bildung von aktivem Protein C, das mit dem Kofaktor Protein-S einen werteren Komplex eingeht, der eine Bildung der für die Gerinnungsreaktion notwendigen Faktoren Villa und Va inhibiert.
[003] Neben Protein-C und Protein-S haben Faktoren wie der Willebrand- Faktor und der Faktor IXa Einfluss auf den antikoagulatorischen Mechanismus, indem sie den Faktor Villa vor proteolytischem Abbau schützen. Die Hämostase kann weiterhin gestört werden durch Lupus-Antikoagulanzien, Antikörper gegen Phospholipide, welche eine funktionelle Bindung der Protease-Kofaktor-Komplexe an Phospholipid- Oberflächen inhibieren. Zudem können Mutationen und Defekte von Faktor V, Thrombomodulin, Thrombin, Prothrombin, Protein-C oder Protein-S das antikoagulato- rische Proteirt-C-System außer Kraft setzen. Antikoagulatorisch wirken auch Antithrombin Iii und Heparinsulfat.
[004] Die US-Patente 5,525,478 und 5,716,795 beanspruchen Assays zur
Diagnose von Störungen des Protein C-Systems. Die DE 197 49 197 A1 lehrt einen Gerinnung sassay zur Ermittlung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe, wobei der Probe Thrombopiastin (Gewebsfaktor) und Thrombomodulin zugesetzt werden. Ist die antikoagulatorische Aktivität verdächtigt niedrig, muss man deren Ur- sache durch individuelles Austesten aller der an der Hämostase beteiligten Faktoren ermitteln. Mit diesem Assay lassen sich aber nicht alle Patienten identifizieren, bei denen ein hohes Risiko für venöse und arterielle Thromboembolien besteht Manche Pathologien verlangen ein Zusammentreffen von mehreren Blutgerinnungsstörungen.
[WS] Das Risiko für venöse und arterielle Thromboembolien wird im Stand der Technik bestimmt durch das Messen der prozentualen Koaguiationsinhibterung in An- und Abwesenheit einer Serin-Protease, die man aus dem Gift der Schlange Agkistrodon contorix isolieren kann (Protac©) und die wie Thrombomodulin das Protein C-System aktiviert (siehe Tripodi et al, Hepatology 2010. 52(1):249-55; Tripodi et ai, J Thromb Thrombolysis 2010. 30(21:215-9). Auch die DE 44 27 785 lehrt Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials mit Hilfe von Proteasen aus Schiagengift. Diese Tests erfassen aber leider nicht das gesamte antikoagulatorische Potential einer Plasmaprobe. Es kommt dann noch hinzu, dass die Patienten vielfach zur Prophylaxe Thrombosehemmer und Vitamin-K-Antagonisten erhalten oder eine Medikation mit Protein-C oder thromboiytischen Mittein wie TPA (tissue Plasminogen activator), Urokinase, Prourokinase, Streptokinase, Plasminogen und deren Analoga.
[006] Die meisten Tests erfassen nur die am Gerinnungsweg beteiligten prokoagulatorischen Faktoren. Die antikoagulatorischen Faktoren werden wenig beachtet, denn die Gerinnungsreaktion verläuft in-vitro so schnell, dass die antikoagulatorischen Mechanismen nicht in Erscheinung treten. Auch die Bestimmung der en- zymatischen Aktivität oder der Plasma-Konzentrationen der verschiedenen pro- oder antikoagulatorischen Faktoren führen nicht weiter.
[007] Der Stand der Technik repräsentiert ein Problem. Es fehlt besonders an einem Test, der eine globale Diagnose von Störungen der plasmatischen Hämostase und des thromboembolischen Risikos erlaubt.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[008] Das Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose von Störungen der plasmatischen Hämostase und des thromboembolischen Risikos gemäß Anspruch 1. Weitere Aspekte der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen des
Verfahrens sind den Unteransprüchen zu entnehmen.
[009] Das Verfahren umfasst die Schritte: Bereitstellen einer Plasmaprobe
(Citrat-Piasma oder EDTA-Plasma) von einem Patienten mit Verdacht auf gestörter
Hämostase und einem hohem thromboembolischen Risiko; gleiches Aufteilen der Probe in erste und zweite Gefäße; Zusetzen zu den ersten und zweiten Gefällen mit der Plasmaprobe jeweils gleiche Volumina und Mengen aPTT-Aktivatorreagens zur Einleitung der Gerinnungskaskade, wobei in einem Gefäß noch eine vorbestimmte Menge humanes Thrombomodulin zugesetzt wird; Inkubieren der ersten und zweiten Proben mit dem aPTT-Aktivatorreagens für einen Zeitraum von 1 bis 10 Minuten bei einer Temperatur von Raumtemperatur (23°C) bis 42°C, bevorzugt 37°C, und Erhalt von ersten und zweiten Plasmaproben mit einer in Gang gesetzten Gerinnungsreaktion; Zusetzen zu den ersten und zweiten Proben mit gebildetem„nicht-aktivem" Thrombin von gleichen Mengen einer Lösung mit Calciumionen und Aktivieren der Thrombin-abhängigen Gerinnungskaskaden in An- und Abwesenheit von Thrombo- modulin; Messen der Zelten zwischen dem Zusatz der Calclumlösung und der Thrombin-ab ängigen Blutgerinnung in der ersten und zweiten Probe und Erhalt der jeweiligen ([aktivierten] partiellen Thromboplastinzeiten; und Bestimmen der Ratio zwischen der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) in der Probe mit Thrombomodulin (GZTM) und der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) in der Probe ohne Thrombomodulin (GZTM0), wobei eine Ratio unterhalb eines vorbestimmten Grenzwerts eine Störung der plasmatischen Hämostase und ein thromboembolisches Risiko aufzeigt. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass in einem Fall ein PTT- Aktivatorreagens zugesetzt wird, umfassend eine wässrige Suspension von einem gemeinsamen Lyophilisat eines Gemisches von Oberflächenmittel, Phospholipiden und löslichem Human-Thrombomodulin-Analog, das mindestens die Am i nosä u reseq uenz des humanen Thrombomodulins (hTM) von Position 241 bis 515 umfasst, wobei diese Aminosäuresequenz eine M406L-Mutation zur Erhöhung der Oxidationsbeständigkeit aufweist, so dass das lösliche hydratisierte Human-Thrombomoduiin biologisch aktiv und stabil in einer Matrix mit den Phospholipiden und dem Oberflächenmittel enthalten ist.
[010] Die Aminosäuresequenz des eingesetzten humanen Thrombomodulin- Analogs (hTM-Analog) ist also so modifiziert, dass es anders als natürliches hTM durch Luftsauerstoff nicht oxidiert und desaktiviert werden kann. Das hTM-Analog ist zudem so verändert, dass es in wässrigen Puffersystem löslich ist. Hierzu sind aus seiner Aminosäuresequenz das hydrophobe Segment, das zytosolische Segment und das Transmembransegment entfernt. Weiterhin enthält es eine Mutation im C-terminalen Bereich, so dass es bei der Produktion in Säugerzellen nict ^ kosiliert wird. Das so modifizierte hTM-Analog enthalt die Thrombin-Bindestelle und die Protein-C-Binde- stelle sowie mindestens die Domänen homolog zum Epidermal Growth Faktor. Das modifizierte hTM-Analog wird dem Thrombophilie-Screening-Assay (TSA) zugesetzt in einer Matrix mit multilamellaren Phospholipidschichten auf dem Oberflächenmittel. Die Inkorporation des hTM-Analogs in die Phospholipidschichten scheint die Struktur der Thrombin-Bindestelle und der Protein-C-Bindestelle zu stabilisieren, ohne an diese
Theorie gebunden zu sein, denn das oberflächengebundene hT -Anaiog besitzt auch nach Lagerung im Trocknen bei Raumtemperatur in dieser Matrix eine spezifische Aktivität im Komplex mit Thrombin. Es kann weiterhin humanes Thrombin binden und der Komplex besitzt eine spezifische antikoagulatorische Aktivität. Die Phospholipid- schicht auf dem Oberflächenmittel kann zudem gereinigte Sulfatide enthalten. Das Oberflächenmittel ist bevorzugt ausgewählt aus Silica-, Kaolin-, Ellageäure- und Poryphenol-Feststoffteilchen.
[011] Das in der Matrix stabilisierte hT -Analog wird erhalten durch sorgfältiges Mischen einer wässrigen Formulierung von oxtdationsbeständigem löslichem hTM- Analog mit einer wässrigen Suspension von Oberflächenmittel, gereinigten Phospholipiden und optional Sulfatiden und durch schonendes Entfernen der flüchtigen Bestandteile und des wässrigen Lösungsmittels bis zur Trockene, so dass man eine Formulierungsmatrix erhält, in der das hTM-Analog mit den Phospholipiden auf dem Oberflächenmittel vorliegt. Die Gerinnungsreaktion ist im Übrigen eine oberflächenvermittelte Reaktion und dies scheint mit Einschränkungen auch für die antikoagula- torischen Aktivitäten zu gelten.
[012] Ein Aspekt betrifft ein trockenes Aktivatorgemisch für die plasmatische Hämostase, umfassend ein lösliches oxidationsbeständiges hTM-Analog, Phospho- lipide und Oberflächenmittel. Dieses wird vor dem Assay durch Zusetzen eines wässrigen Puffers hydratisiert und in Suspension gebracht. Das trockene Gemisch aus löslichem hTM-Analog, Oberflächenmittel und Phospholipiden kann weiterhin Heparin- Neutralisatoren enthalten, bevorzugt Protamin und ZnCl2,
[0131 Ein anderer Aspekt betrifft einen lagerfähigen Satz trockener Reagenzien für die Diagnose von Störungen der plasmatischen Hämostase und eines thromboembolischen Risikos. Der Satz von Trockenreagenzien umfasst ein erstes Aktivatorreagens (aPTT-Reagens) zur Aktivierung der Gerinnungskaskade und zur Bestimmung der partiellen Th rom opla sti nzeit (PTT), umfassend ein trockenes Gemisch aus gereinigten Phospholipiden und Oberflächenmittel. Daneben ein systemgleiches zweites antikoagulatorisches Aktivatorreagens (aPTT hTM-Analog-Reagens) zur Aktivierung der Gerinnungskaskade und zur Bestimmung der partiellen Thrombo- plastinzeit (PTT), das zeitgleich der» a n tikoag u la torischen Mechanismus des Thrombin- Thrombomodulin-Komplexes startet. Damit die partiellen plasmatischen Gerinnungs- reaktionen vergleichbar sind, enthalten die beiden trockenen Aktivatorreagenzien gleiche Chargen von Oberflächenmittel und gereinigten Phospholipiden. Es wird im zweiten Thrombomodulin-Aktivatorreagens ein rekombinantes hT -Analog-Analog eingesetzt, das in wässrigem Puffer löslich und gegenüber Luftsauerstoff beständig ist. Das hTM-Analog ist im zweiten antikoagulatorischeri Aktivatorreagens so formuliert, dass es in einer Formulierungsmatrix zusammen mit den Phospholipiden auf dem Oberflächenmittel aufgenommen ist. Dies erfolgt durch sorgfältiges Mischen einer wässrigen Lösung einer Charge von isolierten gereinigten Phospholipiden und Oberflächenmittel mit einer Menge löslichem, oxidationsbeständigen hTM-Analog und Abtrennen des Lösungsmittels aus dem Gemisch bis zur Trockene durch Lyo- philisation. Erstes und zweites Aktivatorreagens (aPTT-Reagens und aPTT/hTM- Analog-Reagens) werden jeweils bis zur Trockene lyophilisiert und vor dem Gerinnungstest durch Zusetzen eines wässrigen Puffers hydratisiert. Ansonsten sind die beiden aPTT-Reagenzien gleich. Der lagerfähige Satz Trockenreagenzien kann weiterhin optional stabile Pufferlösungen zur Suspendierung und Hydratisierung der beiden Gerinnungsreagenzien umfassen sowie auch eine vorbereitete Calciumionen- Lösung bzw. eine CaCI2-Lösung für den Start der Thrombin-abhängigen Gerinnungsreaktion.
[014J Der Reagenziensatz eignet sich für eine umfassende Diagnose von Störungen der plasmatischen Hämostase und des thromboern bolischen Risikos, da die hydratisierte Formulierungsmatrix aus Oberflächenmittel, Phospholipid und dem oxida- tionsresistenten hTM-Analog auf einmal, zeitgleich wie normales aPTT-Reagens der Plasmaprobe zugesetzt werden kann. Es können die beiden Reaktionen bis zur Bildung von (mangels Cofaktor nicht-aktivem) Thrombin identisch gestartet werden, nur einmal mit und einmal ohne die Gegenwart von oberflächengebundenem hTM-Analog. Dies war früher nicht der Fall ist, denn die Lösung mit hTM wurde stets getrennt zugesetzt. Es wurde zudem gefunden, dass das hTM-Analog in der Formulierungsmatrix eine vielfältigere antikoagulatorische Wirkung in der Gerinnungskaskade besitzt. Wird das lösliche hTM-Analog als lösliches Protein der Gerinnungsreaktion zugesetzt, machen sich nicht alle Störungen der antikoagulatorischen Reaktion bemerkbar. Bekanntlich ist die Gerinnungsreaktion eine Oberflächenreaktion, wobei das Oberflächenmittel für die gleichzeitige Anwesenheit von mehreren Faktoren am selben Ort erforderlich ist. Dies scheint auch für die antikoagulatorische Wirkungen des Thrombomodulins bzw. des Thromomodulin-Analogs zu gelten. Wird es gebunden in hydratisierten Schichten von Phospholipiden und/oder Sulfatiden auf einem Oberflächenmittel zusetzt, machen sich auch antikoagulatorische Störungen spezifisch bemerkbar, welche außerhalb des Protei n-C-Weges beziehungsweise des Thrombin- abhängigen Gerinnungswegs liegen. Es wird bevorzugt oxidationsresistentes hTM- Analog gebunden an einem Oberflächenmittel dem TSA zugefügt, um so seine Spezifität für Störungen des antikoagulatorischen Potentials zu erhöhen.
[015] Das lösliche oxidationsresistente humane Thrombomodulin-Analog (Variante 2) hat bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2:
SEQ. ID NO. 2:
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICD GLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLR GFQWVTGDNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQC EVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSS AAVAPLGLQLMCTAPPGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAP RCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGY RLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPV DPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQLFCNQTACPADCDP NTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALA RHIGTDCDSGKVDGGDSGAGEPPPSPTPGSTLTPPAVGLVHS
[016] Die trockenen PTT-Aktivatorreagenzien verlangen mit Ausnahme des löslichen hT -Analogs im Wesentlichen die Verwendung von gleich beschaffenen Oberflächenmitteln und Phospholipiden bzw. Sulfatiden..
[017] Die einstufigen a PTT-Aktivatorreagenzien mit und ohne Thrombomo- dulin können gegenüber einer Auswahl von Plasmen von Normalpatienten und verschiedenen Thrombophilie-Patienten darauf geprüft werden, dass sie spezifische Stö- rungen der plasmatischen Gerinnung und das thromboembolisches Risiko erkennen. Beim zweistufigen Zusatz von a PTT-Aktrvatorreagens und gelöstem Thrombomodulin oder hTM-Analog sind hingegen Pipettierungenauigkeiten unvermeidlich und die Schwankungen im Verhältnis wirken sich auf die diagnostische Aussage aus. Zudem stellt die Pipette eine Oberfläche dar, an der eine plasmatische Gerinnung beginnen kann. Im erfindungsgemäfien einstufigen Test ist in allen Reaktionen das Verhältnis von aPTT und aPTT TM-Reagens vergleichbar vorhanden und es muss nur einmal pipettiert werden. KURZBESCHREIBUNG D BILDUNGEN
[018] Es wird nun die Erfindung und ihre Ausführungsformen an Beispielen, Vorteilen und mögliche Abwandlungen mit Bezug auf die anliegenden Abbildungen beschrieben. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele, Vorzüge und beschriebene Ausführungsformen beschränkt, sondern sie ergibt sich aus den nachstehenden Schutzansprüchen. Es zeigt: ein Flussdiagramm der Verfahrensschritte des Assays zur Bestimmung von Störungen der Hämostase und eines thromboembolischen Risikos; ein Balkendiagramm der durchschnittlichen Ratios für die plasmatische Hämostase mit und ohne hT -Analog für verschiedene Kontroll- und Patientengruppen; Fig. 3A eine schematische Darstellung der Primärstruktur und der Domänen von humanem Thrombomodulin;
Fig. 3B eine schematische Darstellung der Struktur von löslichem Thrombo- modulin-Analog mit den Domänen EGF1 -6(241 -480), 0(481-515), einer Delation der Aminosäuresequenz von Position 26 bis 240, einer inserierten
APAEPQP-Sequenz im Bereich des N-Terminus anstelle der Aminosäuren 20 bis 25, einer Met406Leu-Mutation zur Vermeidung einer möglichen Oxidation durch Luttsauerstoff in wässriger Lösung und einer Ser492Ala- Mutationen zur Vermeidung einer möglichen O-Glykosylierung;
Fig. 4 ein Balkendiagramm mit einer Evaluierung rekombinanter Thrombo- moduiin-Varianten 1 bis 4 (IV1 : Expression in Insektenzellen; SV1-4: Expression in ammaliazellen) im TSA; Fig. 5 ein Diagramm der Ergebnisse zur Optimierung des TSA-Ratio für die
Thrombomodulin-Varianten 1-4; eine graphische Darstellung einer Versuchsreihe zur Untersuchung des Einflusses von Heparin auf den Assay in Abwesenheit eines Heparin- neutraiisators;
Fig. 7 eine graphische Darstellung der Gerinnungszeiten von Normalplasma- und heparinisierten Plasmaproben nach Zusatz von Thrombomoduiin mit unterschiedlichen Neutra iisatoren; Fig. 8 eine graphische Darstellung der Ratio der Gerinnungszeiten mit und ohne
Thrombomoduiin von Normalplasma- und heparinisierten Plasmaproben mit unterschiedlichen Neutralisatoren;
Fig. 9 Darstellung der Ergebnisse von Vergleichsversuchen zur Wirkung von
Koagulationshemmern;
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[§1 i] Die Koaguiationsfähigkeit von Blut wird in der Labormedizin gerne durch den Quickwert beschrieben. Er beschreibt, wie gut das extrinsische System der Blutgerinnung funktioniert. Der Quickwert wird bestimmt, indem man einer Blutprobe Gewebsfaktor (= Prothrombinase, Gewebsthromboplastin, Gewebsthrombokinase, Faktor III) und Ca2* zugesetzt und dann die Gerinnungszeit (= Thromboplastinzeit) der Plasmaprobe mit der Gerinnungszeit eines Normalplasma-Pools vergleicht Der Quickwert ist abhängig von den Faktoren Ii, VII und X und in geringerem Umfang von den Faktoren I und V. Vom Quickwert leitet sich ab das Internationale Normalisierte Ratio (INR). Dies ist der Quotient der Thromboplastinzeit des Patientenplasmas zur Thromboplastinzeit eines Referenzplasmas, das wiederum gegenüber einer WHO- Standardthromboplastinzeit normalisiert ist.
[020] Der Quick-Wert ist vermindert bei eingeschränkter Leberproteinsynthese, hoher Konzentration von Fibrinspaltprodukten, Heparintherapie und bei Vitamin- K- angel oder einer oralen Antikoagulation mit Vitamin-K-Antagonisten wie Warfarin, Phenprocoumon, Acenocoumarol und anderen Cumarin-Derivaten. Vitamin K ist essenziell für die Synthese der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X sowie für das anti- koagulatorische Protein-C und -S-System, da es ein Kofaktor der γ-Glutamyl-carboxy- lase ist. Die genannten Gerinnungshemmer wirken sich auch auf die Einzelfaktor- Gerinnungstests aus, so dass diese nur eingeschränkt quantitativ interpretiert werden körinen. Es gibt auch keine Kennwerte für ein signifikant erhöhtes Blutungs- oder Thromboserisiko.
[021] Für die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT oder nur PTT) wird Ca2+-freies Plasma (Citratpiasma) mit aPTT- eagens bei 37 Grad Celsius vorinkubiert und die Thrombin-abhängige Gerinnung durch Zusatz von Ca2* gestartet. Im Normalfall stockt das Plasma innerhalb von 28 bis 40 Sekunden. Mit dem aPTT-Reagens wird der extrinsische Weg bis zur Stufe des (ohne Ca-lorten nichtaktiven) Prothrombins vorweg genommen und nur die Zeit für die Gerinnung nach Zusatz von Ca2* bestimmt. Dieser Wert liegt bei einer Hämophilie über dem Standardwert von ca. 30 Sekunden. Deshalb kann eine reduzierte Gerinnung beziehungsweise ein Blutungsrisiko erkannt werden. Die aPTT dient vor allem der Überwachung einer Behandlung mit gerinnungshemmenden Medikamenten. Im Unterschied zum Quick- Test wird die partielle Thromboplastinzeit (PTT) auch von Faktoren des intrinsischen Wegs beeinflusst: ein Mangel der Faktoren XII, XI, IX und VIII bewirken eine Verlängerung der PTT wie ein Mangel der Faktoren X, V, II und I. Verlängerte PTT-Werte sind beobachtbar bei hohen Konzentrationen von Fibrinspaltprodukten oder Hemm- körpern (Hemmkörperhämophilie, Lupus-Antikoagulanzien). Nicht erkannt werden von beiden Tests ein Zuviel (Thrombophilie) oder ein hohes thromboembolisches Risiko. Auch allgemeine Störungen der plasmatischen Hämostase werden nicht erkannt.
[022] Vor Operationen wird bei Patienten häufig eine grobe Einschätzung der Gerinnungssituatton anhand der Parameter Quickwert, aPTT = [aktivierte] partielle Thromboplastinzeit und Thrombozytenzahl vorgenommen, um nicht-medikamentös bedingte Hämostasestörungen festzustellen. Diese Praxis ist umstritten, da nur rund 13 % der Hämostasestörungen erkannt werden; siehe Koscielny, J. et al., Präoperative Identifikation von Patienten mit (primären) Hämostasestörungen, Haemostaseologie 2007. 27(3^177-84.
[023] Im Rahmen einer präoperativen Diagnostik wird nicht selten eine verlängerte PTT bei unauffälligem Quick-Wert festgestellt. Dann gilt es abzuklären, ob ein Zustand mit erhöhter Gerinnungsneigung oder eine der nicht seltenen anderen Ursachen einer PTT-Verlängerung vorliegt. Mit der PTT wird der intrinsische Weg (Faktor VIII, IX, XI, XII, HMWK und Präkallikrein) und mit dem Quick-Test das extrinsische (Faktor VII) Gerinnungssystem erfasst, die Faktoren des gemeinsamen Wegs beein- flussen beide Globalteste (X, V, II und I). Der Aktivierungszustand des Gerinnungssystems im gesamten Körper kann unter Umständen auch durch die Messung der D- Dimere (Fibrinspattprodukte) bestimmt werden. So können bei der Blutentnahme vorhandene Krankheitszustände, die mit einer Aktivierung der plasmatischen Gerinnung einhergehen, erkannt werden (Thrombosen, Lungenembolien, disseminierte intravasale Gerinnung und Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II). Eine Unterscheidung zwischen den möglichen Ursachen einer Gerinnungsaktivierung sowie eine zuverlässige Einschätzung eines thrornboembolischen Risikos (Thrombophilie) ist durch die Bestimmung der D-Dimere nicht möglich. Ein geeigneter Screeningtest für die Thrombophilie existiert deshalb zurzeit nicht.
[024] Das aPTT-Reagens für den Start der partiellen Thromboplastinzeit besteht aus einem Oberflächenmittel und Phospholipiden. Eine Liste üblicher aPTT- Reagenzien ist enthalten in der WHO-Schrrft WHO BS/09.21 16, Seite 35. Die aPTT- Reagenzien unterscheiden sich untereinander in den relativen und absoluten Konzen- trationen an polaren Phospholipiden, in den Oberflächenmitteln (Kaolin, Silica, Ellag- säure, Polyphenol), in den Gesamtsensitivitäten gegenüber den Faktoren IX, XI, XII, der Sensitivität gegenüber Faktor VIII, und auch in den Sensitivitäten gegenüber Heparin und Lupus-Antikoagulanzien. Für eine Übersicht, siehe Eby C, Standardi- zation ofAPTT Reagents for Heparin Therapy Monitoring: Urgent or Fading Prioriy? in Clinical Chemistry (1997) 43(7), 1105-1107. Häufig verwendete kommerzielle aPTT- Reagenzien sind Dapttin™ (Baxter), Dapttin™ TC (Technoclone), Actin FS, Actin™ und Pathombin™ SL (Siemens Healthcare Diagnostics), Actin™ FSL (Dade Behring), APTT-SP und SynthASil™ (Instrumentation Laboratory) oder STA™-aPTT (Roche Diagnostics).
[025] Das koagulatorische-antikoagulatorische aPTT-Reagens gemäß der
Erfindung enthält lösliches oxidationsresitentes Thrombomodulin-Analog. Mit Bildung des Komplexes von Thrombin und Thrombomodulin wird die Gerinnung auf der Stufe des Thrombins unterbrochen und der antikoagulatorische Mechanismus gestartet. Die Beobachtung des Gleichgewichts zwischen Koagulation und Antikoagulation erlaubt si eine Diagnose des thrornboembolischen Risikos und auch die Aufdeckung einer Störung der plasmatischen Hämostase, die mit einem tatsächlichen Blutungsrisiko verbunden ist. Es wird hier ein Thrombophilie-Screening-Assay (TSA) beschrieben, der also das Gleichgewicht von pro-koagulatorischen und antikoagulatorischen Mechanismen in einem Wert abbildet. Erfindungsgemäß wird das lösliche hTM-Analog in hydratisierten Schichten von Phospholipiden und/oder Sulfatiden auf einem Oberflächenmittel zusetzt und dann der extrinsische Gerinnungsweg gestartet. Hierdurch machen sich überraschenderweise auch Störungen des Gleichgewichts bemerkbar, welche außerhalb des Thrombin-abhängigen Gerinnungsweges liegen.
[02β] Ein Vorteil des offenbarten TSA liegt also darin, dass seine Aussage von Gerinnungshemmem kaum gestört wird. Der TSA bildet stets das hämostatische Gleichgewicht ab, wobei Koagulationshemmer im Gerinnungssystem sichtbar bleiben. Der erfindungsgemäße TSA erlaubt daher auch postoperativ eine Aussage zur notwendigen Therapie mit Koagulationshemmern und dies ist aus vielen Gründen nötig.
[027] Der größte Risikofaktor bei Operationen sind Blutungen, weshalb sich die Labormedizin zwecks Begrenzung des Operationsrisikos hauptsächlich auf den prokoag u latorischen Gerinnungsweges konzentriert. Bei anderen Risikogruppen wie älteren Patienten, Schwangeren oder Patienten mit genetischen Defekten der anti- koagulatorischen Gerinnungsfaktoren besteht jedoch ein peri- und postoperatives Thromboserisiko, vor allem während der stationären Nachbehandlung. Da die Unter- suchung auf einzelne Gerinnungsfaktoren aber das allgemeine Thromboserisiko nicht ermittelt, und die bekannten Globaltests nur die Faktoren des prokoagulatorischen Weges betrachten, erhalten Patienten zumeist postoperativ eine prophylaktische Medikation zur Verhinderung von Thrombosen. Der hier offenbarte TSA löst dieses Problem.
[028] Weiterhin erhöhen Östrogen-haltige Kontrazeptiva das Thromboserisiko.
Von diesem Thromboserisiko sind insbesondere Erstanwenderinnen der Pille im ersten Jahr betroffen. Die venöse Thrombose ist bei Frauen nach Herzinfarkt und Schlaganfall die dritthäufigste lebensbedrohende Erkrankung des Herz-Kreislaufsystems. Ein Screening des Thromboserisikos erfolgt aber auch bei Verordnung hormonaler Kontrazeptiva nicht, da der Nutzen die Kosten nur bei bestimmten Vorerkrankungen rechtfertigt. Die derzeitige Diagnostik, die aus einer Reihe von Einzelfaktor- Untersuchungen besteht, müssen die Patientinnen im Rahmen der individuellen Gesundheitsleistungen bei ihrem Arzt auf eigene Kosten vornehmen lassen. Mit dem offenbarten Thrombophilie-Screening-Assay steht nunmehr ein Test zur Verfügung, der sensitiv ist und eine kostengünstige Alternative zur Einzeifaktor-Untersuchung ist, denn es werden nicht Defekte einzelner Faktoren, sondern das gesamte physiologische Zusammenspiel der Gerinnungsfaktoren abgebildet.
[029] Eine weitere Anwendung ist die Überwachung des Risikos für thrombo- phile Hämostasestörungen in der Schwangerschaft. Frauen, die Trägerinnen ange- borener und/oder erworbener thrombophiler Risikofaktoren sind, haben ein erhöhtes Risiko für schwangerschaftsassoziierte Komplikationen wie venöse Thromboembolien und Abort. Das relative Risiko einer tiefen Bein- oder Beckenvenenthrombose ist bei Frauen mit einer Schwangerschaft sechsfach höher als bei Nichtschwangeren. Kurz nach der Geburt ist die Thrombosegefahr sogar noch größer. Während einer normalen Schwangerschaft treten thrombosebegünstigende Veränderungen ein, die das Hämo- stasesystem aus dem Gleichgewicht bringen. Angesichte der Studien, die einen Zusammenhang zwischen Thrombophilie und schwangerschaftsassoziierten Komplikationen aufzeigen, stellt sich die Frage nach der individuellen Thrombosegefahr während der Schwangerschaft. Ein primäres oder begleitendes Thrombophiiie- Screening bei Schwangeren zur Ermittlung des tatsächlichen Risikos erfolgt derzeit nicht. Es wird nur zunehmend Heparin zur Prävention schwangerschafts bedingter Komplikationen verabreicht. Mit dem offenbarten globalen TSA kann ein primäres oder schwangerschaftbedingtes akutes thromboemboftsches Risiko schnell und kostengünstig aufgedeckt werden. Die Vorteile des offenbarten TSA liegen in der einfachen, aber besseren Diagnose und Erkennung von Risikopatienten, denn der offenbarte TSA bildet das Zusammenwirken der Faktoren für den Gleichgewichtszustandes zwischen Koagulation und Antikoagulation ab.
[030] Die Offenbarung umfasst ein Formulieren von löslichem hT -Anaiog mit Phospholipiden auf einem Oberflächenmittel wie Silica. Die resultierende Formulierung bildet den physiologischen Matrixzustand nach, bei der die plasmatische Koagulation und Antikoagulation oberflächenvermittelte Reaktionen sind. Das Thrombomodulin ist ursprünglich ein Protein, das in der Zellmembran verankert ist und das Thrombin wird in einem Komplex auf der Zelle gebunden. Es zeigt sich, dass das in der künstlichen Phospholipidschicht integrierte lösliche hTM antikoagulatorische Wirkungen im intrinsischen Weg besitzt.
[031] Die quantitativen und relativen Verhältnisse von Oberfiächenmrttel/- Phospholipld (aPTT-Reagenz) und löslichem hTM sind vorab an Normalplasmen zu kontrollieren und einzustellen. Liegt bei der Kontrolle mit Normal-Citratplasma die Thromboplastinzeit über einen Grenzwert, so sind die Mengen an koagulatorische Komponenten und löslichem hTM anzupassen. Die offenbarte wässrige Formulierung des aPTT-Reagens enthält im Unterschied lösliches hT -Analog und zur Stabilisierung optional organische Lösungsmittel und milde Detergenzien, welche mit der Thrombo- modulin-Aktivität kompatibel sind. Sie sorgen zugleich für eine Destabilisierung der Phosphoüpidschichten . Geeignete Detergenzien sind nichtionische Detergenzien wie Triton® X-100 (PoIyoxyethyIen(9,6)p+octyIphenoi}» Triton® X-114, T een®-20, Octylglucoside wie Octyl-ß-D-glucopyranosid, Octy!-R-thioglucopyranosid, Decyl-ß-D- maltosid, α-Dodecyi-ß-D-ma Itosid , Phosphatki lethanolamin, Dodecyld imethyl-N- aminoxid, Lauroamido-N,N-dimethyl-3-n-propylaminoxid (LAPAO), N-Dodecyl-N.N- (dimethylammonio)butyrat (DDMAB), Phosphocholine, Cholate (Natriumcholat) und organische Lösungsmittel wie beispielsweise Isopropanol, Ethanol, Butanol, Isobutanol.
[032] Bei der Lyophilisaten der wässrigen Formulierung von hTM-Analog und aPTT-Reagens (bspw. im Rotationsverdampfer) bilden sich multilamellare Phospho- lipidschichten auf dem Oberflächenmittel, in denen sich Proteine einlagern. Bei der späteren Hydratisierung dieser Schichten oberhalb der Phasenübergangstemperatur entstehen zwischen den Grenzflächen beziehungsweise in der flüssig-kristallinen Phospholipidphase lamellare Proteolipidschichten, worin das oxidationsbeständige lösliche hTM-Analog aufgenommen ist, obzwar im löslichen hTM-Analog die Transmembran-Domäne und die hydrophobe Domäne deletiert wurden. Da auch die Phospholipide der Zusammensetzung oxidationsempfindlich sind, werden der Formu- lierung vor der Lyophilisierung bevorzugt ein Antioxidationsmittel zugesetzt, bevorzugt ausgewählt aus Dithiothreitol (DTT), Dithioerythrit (DTE), Vitamin C und ß-Mercapto- ethanoi. Gegebenenfalls kann durch mehrmaliges Einfrieren und Lyophilisieren die Inkorporation des löslichen hTM-Analogs in die Phospholipidschichten erhöht werden. Die Transport- und Lagerform von hTM/aPTT-Reagens ist trocken. Vor der Verwen- dung wird das trockene hTM aPTT-Reagens durch Zusatz einer vorbestimmten Menge Wasser oder wässrigem Puffer mit pH 7 bis 8, bevorzugt pH 7,5 suspendiert und hydratisiert. Ein Aliquot des hydratisierten hTM/aPTT- beziehungsweise des aPTT- Reagens werden dann in dem ISA der Plasmaprobe zugesetzt. Die trockenen aPTT- Reagenzien können zuvor an Normalplasma-Pools und verschiedenen Plasmen von Thrombophilie-Patienten getestet werden. Die Testung kann bereits vor der Lyophili- sation erfolgen.
[033] Die Plasmaprobe ist bevorzugt sogenanntes Crtratplasma, in der die Calciumionen durch den Zusatz von Citronensäure komplexiert und maskiert sind. Es sind auch andere Chelierungsmittel wie EDTA oder EGTA für die Komplexierung von Calciumionen geeignet.
[034] Das eingesetzte rekombinante Thrombomodulin ist ein lösliches oxidationsresistentes humanes Thrombomodulin-Fragment. Natürliches Thrombomodulin (TM) ist ein glykosiliertes Typ-1 -Transmembranprotein an der Oberfläche der Endothelzellen von Blutgefäßen. Natürliches TM besitzt einen sauren isoelektrischen Punkt um 4, eine einzelne Polypeptidkette mit 557 Aminosäuren und ein Molekular- gewicht von 68-78 kDa. Es ist somit stark N- und O-glykosiliert mit einer zusätzlichen Chondroitinsulfat-Zuckerkette. Die Primärstruktur von TM umfasst eine Lektin-ähnliche N-terminale Domäne, ein hydrophobes Segment, sechs aufeinander folgende Domänen, welche dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ähneln, eine O- glykosiiierte Serin/Threonin-reiche Region, eine Transmembran-Domäne und C- terminal ein zytoplasmatisches Segment (siehe Figur 3A). TM ist ein Kofaktor für die Thrombin-katalysierte Aktivierung von Protein C. Es besitzt selbst keine enzymatische Aktivität. Thrombin bindet an die fünfte und sechste EGF-Domäne. Für die Bindung von Protein-C und die Kofaktor-Aktivität sind die vierte EGF-Domäne und die Serin- Threonin-reiche Region erforderlich. Für die Interaktion des TM-Thrombin-Komplexes mit TAFI (Thrombin-activatable ftbrinolysis inhibitor) wird die dritte EGF-Domäne benötigt. Das Serin{492) ist die Glykosilierungsstelle für ein sulfatiertes Glykosamino- glykan (Chondroitinsulfat). Die Chondroitinsulfat-Zuckerkette (GAG-Kette) an der Serin/Threonin-reichen Region bildet ein zweites Thrombin-Bindemodul, das die Protein-C-Aktivierung unterstützt und die Bildung von Thrombin-Antith rombin HI-Komplexen fördert. Die Methionine 309 und 406 sind sensitiv gegenüber einer Oxidation durch Luftsauerstoff, jedoch führt nur die Oxidation von Methionin(406) zu einem Verlust der Kofaktor-Aktivität.
[035] Der Umfang der posttranslationale Modifikation durch eine Glykosa- minoglykan(GAG)-Kette hängt vom Zelltyp und den Kulturbedingungen ab. hTM ohne GAG zeigt nur Kofaktor-Aktivität bei der Thrombin-vermitteften Protein C-Aktivierung. TM mit GAG hat zwar eine gesteigerte Kofaktor-Aktivität und eine direkte anti- koagulatorische Aktivität (direkte Hemmung), jedoch eine Antithrombin HI-abhängige antikoagulatorische Aktivität (Inaktivierung durch Antithrombin III). Der Austausch von Ser492 durch Ala verhindert eine posttranslationale GAG-Modifikation. Das bevorzugte Thrombomodulin-Analog enthält nur die extrazellulären Domänen, bei Deletion des Transmembran- und des zytoplasrnatischen Segments.
[036] Die Oberflächenschicht mit löslichem oxidationsresistenten Thrombo- modulin und Phosphoiipid wird erhalten, indem man eine wässrige Suspension aus hochgereinigtem Phosphoiipid, Oberflächenmittel und rekombinantem löslichen HTM herstellt, bei Raumtemperatur bis 37 Grad Celsius vorinkubiert und der wässrigen Suspension das Wasser entzieht, bevorzugt durch Lyophilisieren. Es wird angenommen, ohne an diese Theorie gebunden zu sein, dass bei diesem Schritt das lösliche hTM-Analog in den muttilameliaren Schichten aus polaren Phospholipiden auf dem Oberflächenmittel inkorporiert wird, was seinem natürlichen Zustand als Membranprotein nahekommt. [037J Durch den Zusatz von HTM wird gemäß Lehrbuch nur die auf der Stufe des Thrombins folgende Gerinnuog verzögert und das Antikoagulationssystem gestartet, beginnend mit der Aktivierung von Protein C durch den Thrombin- Thrombomodulin-Komplex. Bei einer Vorformulierung des löslichen hTMs in einer Phosphoiipidschicht werden im TSA-Assay überraschend in vielen Fällen auch Mängel des intrinsischen und des extrinsischen Wegs der Gerinnung sichtbar. Die mit dem erfindungsgemäßen Assay erhobenen Daten an Patientenkollektiven bestätigen die Korrelation mit den für die Thrombophilie-Diagnostik wichtigen Markern. Der Vergleich mit Daten der großen Gruppe Normal-Patienten unterstreicht die statistische Signifikanz der pathologischen Aussagen. Der TSA erfasst somit nicht nur das Fehlen oder den genetischen Defekt eines einzelnen Faktors, sondern vereint in sich das komplexe Zusammenwirken der an den Reaktlonswegen beteiligten Faktoren; bestimmt so auch potenzierende und neutralisierende Effekte, was Einzelfaktortests nicht leisten können. Insbesondere bei Sepsis-Patienten und Chemotherapie-Patienten liegt oft eine vielfach gestörte Blutgerinnung vor, so dass das Verfahren dem Arzt eine Gesamtschau gibt auf das thromboembolische Risiko.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 - Lösliches oxidationsresistentes Thro bomodulin [038] Es wurden vier Varianten von löslichem oxidationsresistenten hTM hergestellt (siehe US 5,256,770; Weiler H. et al., J Thromb Haemost. 2003 Jul; 1(7): 1515-24. Review; Bourin MC et al., Brachem J. 1993 Jan 15; 289 Pt2: 313-30 Review; Jackson DE et al., Eur J Biochem. 1994 May 1 ; 221 (3): 1079-87; Glaser CB et al., J Clin Invest. 1992 Dec; 90(6): 2565-73; ;Edano T et al., Biol Pharm Bull. 998 Apr; 21 (4):375-81 ; ün JH et al., J Biol Chem. 1994 Oct 7; 269 (40):25021-30; Parkinson JF et al., Biochem J. 1992 Apr 1 ; 283 (Pt 1 ): 151-7; Nawa K et al., Biochem Biophys Res Commun. 1990 Sep 14; 171 (2): 729-37). Siehe Figuren 3A und 3B zur Primärstruktur und den Domänen des humanen Thrombomodulins.
[039] Variante 1 (JM<LHEO)■ Lösliche Form von hTM mit den Domänen L(19- 172), H( 173-240), EGF 1-6(241 -480), 0(481-515) und einer Met406Leu-Mutation] enthielt alle extrazellulären Domänen. [TM(LHEO)] besaß die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1: SEQ ID NO. 1 :
LGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRG HLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTG DNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPIWEEQQCEVKADGFLCEF HFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQL CTAP PGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCT ASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCP QRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAE GFAPIPHEPHRCQLFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGF CSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGSGEPPPSPTPGSTLTP PAVGLVHS
[040] Variante 2 [TM{LHEO)S492A = Lösliches HTM mit den Domänen L(19- 172), H( 173-240), EGF1 -6(241 -480), 0(481-515), Met406Leu und Ser492Ala-Mutation] enthielt gleichfalls alle extrazellulären hTM-Domänen. Der Austausch von Serin durch Alanin an Position 492 verhindert dort eine posttranslationale Modifikation mit Grykosaminoglykanen. [TI HEO)S492A] besaß die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2:
SEQ ID NO. 2:
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQICDGLRG HLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRLGPLRGFQWVTG DNNTSYSRWARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPfWEEQQCEVKADGFLCEF HFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGADFQALPVGSSAAVAPLGLQL CTAP PGAVQGHWAREAPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCT ASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCP QRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAE GFAPIPHEPHRCQLFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGF CSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGAGEPPPSPTPGSTLTP PAVGLVHS
[041] Variante 3 Π"Μ(Ε0) = Lösliches TM mit den Domänen EGF1 -6(24 -480), 0(481-515), Met406Leu] enhiett die für die Kofaktor-Aktivität notwendigen EGF- und Serin/Threonin-Domänen. Für eine korrekte Abspaltung des Signaipeptids wurde dieses um die ersten sieben N-terminalen Aminosäuren aus der Lektin-Domäne (APAEPQP) C-terminal verlängert. Variante 3 besaß die Aminosäuresequertz SEQ ID
NO. 3:
SEQ ID NO. 3:
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGAWDCSVENGGCEHACNAJPGAPRCQCPAGA ALGADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSCMCETGYRLAADQHRCEDV DDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLN QTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQLFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICT DIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGSGEPPP SPTPGSTLTPPAVGLVHS
[042] Variante 4 [TM(Eo)S492A] enthielt die für die Kofaktor-Aktivität notwendigen EGF- und Serin Threonin-Domänen. Das Signalpeptid war um die ersten sieben N-terminalen Aminosäuren der Lektin-Domäne (APAEPQP) C-Terminal verlängert. Neben der 406L-Mutation bestand eine S492A- utation. P"M(EO)S492A] hatte die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 4: SEQ ID NO. 4:
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGAWDCSVENGGCEHACNAIPGAPRCQCPAGA ALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQPGSYSC CETGYRLAADQHRCEDV DDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCYPNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLN QTSYLCVCAEGFAPIPHEPHRCQLFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICT DIDECENGGFCSGVCHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGAGEPPP SPTPGSTLTPPAVGLVHS
[043] Alle rekombinanten hT -Analoga 1-4 (SV1 , SV2, SV3, SV4) wurden in HEK-293 Zellen exprimiert, isoliert und deren antikoagulatorische Aktivität im Standard- Gerinnungsassay bestimmt; siehe Figur 4. Die Variante SV1 wurde zudem in Insektenzellen exprimiert (IV1 ), die keine posttranslationalen Modifikationen mit Glyko- saminoglykanen vornehmen können. Die antikoagulatorischen Aktivitäten der hTM- Varianten wurden mit dem Standardverfahren in Normalplasma und in defekten Plasmen (Protein C-Mangel, Protein S-Mangel und heterozygoter Faktor V-Leiden) untersucht; die Gerinnungszeiten wurden mechanisch und optisch gemessen. [144] Die Gfykosaminoglykan- odifikation (Ser492-Wildtyp) bewirkte gegenüber der hTM-Variante 2 (Ser492A Mutant; SEQ ID NO. 2) keine messbar höhere Aktivität und Sensrtivität. Allerdings ergaben sich Nachteile in Bezug auf Chargenvariabilität» Stabilität und einer Aufreinigung. Die verkürzten hTM-Varianten 3 und 4 besaßen zwar eine höhere antikoagulatorische Aktivität, jedoch überdeckte die höhere Aktivität Defekte in der Gerinnung und somit waren diese Varianten nicht besser geeignet, spezifische Gerinnungsdefekte aufzudecken. Die Variante IV1 besaß eine signifikant geringere Aktivität Die Assay-Entwicklung erfolgte daher mit dem löslichen oxidationsresistenten hTM-Analog - Variante 2 (SEQ ID NO. 2; SV2), exprimiert in HEK293-Ze!len.
[§45] Das diagnostische Optimum an hTM-Analog-Variante 2 im TSA wurde weiterhin in Bezug auf Ratio und Gerinnungsverzögerung (GTM) optimiert; siehe Figur 5. Die hTM-Analog 2-Menge wurde zudem den Erfordernissen der klinischen Praxis angepasst, so dass die hervorgerufene Gerinnungszeitverzögerung im Mittel 130 s nicht überstieg. Das diagnostische Fenster lag bei ca. 3 bis 4 pg hTM-Analog 2 pro Standard-Messung {Fig. 1 ; Gerinnungszeit mit hTM2: 113 s/132 s). Die Gerinnungszeitverzögerung muss bei Normalplasma signifikant höher sein als bei Mangelplasmen, denn dieser Unterschied ist die Basis des Verfahrens. Weiterhin muss das aPPT- Reagens bzw. die hTM/aPTT-Forrnulierung nicht nur eine Gerinnungsverzögerung bewirken, sondern auch Mangelplasmen von Normalplasmen unterscheiden können. Nur dann verweist die Ratio (GTM/GTM0) der TSA auf eine Störung der plasmatischen Hämostase und ein thromboemboiisches Risiko.
BEISPIEL 2 ~ Reagenziensatz für die Koagulationsanalyse
[046] Das humane Thrombomodulin ist in herkömmlichen Reagenziensätzen als getrennter Feststoff (Lyophilisat) enthalten. Thrombomodulin in Lösung ist nicht haltbar. Auch das aPTT-Reagens liegt aus Gründen der Haltbarkeit den Reagenziensätzen stets als Lyophilisat bei. Erfindungsgemäß wird das lösliche hTM- Analog 2 als eine Formulierungsmatrix mit dem aPTT -Reagens bereitgestellt.
[047] Hierzu wurde kommerzielles aPTT-Reagens (Dapttin™ TC, TECHNO- CLONE, AT), enthaltend Silica, Sulfatide und hochgereinigte Phosphoiipide in Reinstwasser rekonstituiert, und dann rekombinantes humanes Thrombomodulin der Variante 2 [lösliches oxidationsresistentes unterglykosiliertes hT mit den Domänen L(19-172), H(173-240), EGF1 -6(241 -480), 0(481-515) und Met406Leu, Ser492Ala] in optimierter Konzentration in einem Puffer mit OTT und einem schwachen Detergens zugesetzt Das Oberflachenmittel mit den Phospholipiden wurde mit der hTM-Lösung intensiv vermischt, bis eine homogene Suspension des Oberflächenmittels vorlag, an dessen Oberfläche neben den Phospholipiden und Suffatiden auch das zugesetzte hTM- Analog 2 gebunden war. Diese homogene Suspension wurde lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in Reinstwasser.Ethanol (10:1) aufgenommen, erneut homogenisiert und aiiquotiert, so dass in den Gefäßen des Reagenziensatzes Jeweils eine definierte gleich Menge homogenes aPTT-Reagens mit und ohne gebundenem hTM-Analog 2 (Silica, Schichten hochgereinigter Phospholipide, Sulfatide mit und ohne hTM-Analog 2) vorlag. Das hTM-Analog 2 wird durch die erfindungsgemäße Inkorporation in die Phospholipid-Sulfatid-Schichten auf dem Oberflächenmittel nicht nur lagerstabil, sondern auch weiteren antitogylatorischen Reaktionen beteiligt ist, sondern es beteiligt sich dann auch spezifischer an den Reaktionen für das antikoagulatorische Potential. Die Gerinnungsreaktion ist eine oberflächenvermrttelte Reaktion und dies trifft auch auf die antikoagulatorische Wirkung von Thrombomodulin zu, zumal humanes Thrombo- modulin ein Zeilmembranprotein ist.
Standard-Gerinnungsassay - Thrombophilie Screening Assay (TSA)
[048] Für den standardisierten Gerinnungstest (siehe Figur 1 ) wurde ein Teil Citrat-Piasma mit einem Teil rekonstituiertem hydratisiertem aPTT-Reagens (Reagens 1) oder einem Teil rekonstituiertem hydratisiertem hTM-aPTT-Reagens (Reagens 2) gemischt und 2 Minuten (120 Sekunden) bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von einem Teil CaCljrLösung wird die Thrombin-abhängige Gerinnungsreaktion gestartet und die jeweilige Zeit bis zur plasmatischen Koagulation in Sekunden bestimmt. Das antikoagulatorische Potential der Plasmaprobe ergibt sich aus der Differenz der beiden partiellen Thromboplastinzeiten. Vorteile des neuen Reagenziensatzes
[049] Der neue TSA benötigt nur drei Pipettierschritte, während früher das lösliche Thrombomodulin getrennt zugesetzt werden musste. Der separate Zusatz führte zu Konzentrationsunterschieden und inherent verschiedenen Gerinnungszeiten, ohne dass dies auf einer spezifischen Wirkung des Thrombomodulins beruhte. Dies wurde toleriert und nicht für wichtig gehalten. Damit waren die Reaktionen bis zur Stufe von Thrombin verschieden, was auch die Calcium-abhängige Gerinnungsreaktion veränderte. [050] Zur manuellen Entlastung kommt hinzu, dass die Wahrscheinlichkeit von Fehlern kleiner wurde. Das manuelle Zupipettieren einer kleinen Menge Flüssigkeit zu einem größeren Volumen in eine größere Zahl von Gefäßen ist stets fehlerträchtig, da ein doppeltes Zupipettieren oder Überspringen unbemerkt bleiben kann. Diese Fehlerquelle wird durch den neuen Reagenziensatz beseitigt Der Stande rd-Assay- Fehier verringerte sich gegenüber herkömmlichen manuellen Versionen von durchschnittlich 7% auf unter 4%. Der erfindungsgemäße TSA entspricht weiterhin der Standard-Durchführung eines aPTT-Tests, jedoch liefert er nunmehr eine breitere diagnostische Aussage in Bezug auf Störungen, welche nicht mehr zwingend auf dem Protein-C-Weg liegen müssen.
[0511 Zudem kann die Menge von hT -Analog 2 zu aPTT- eagens bestmöglich auf eine mangelspezifische Gerinnungszeitverzögerungen eingestellt und vorab ausgetestet werden. Die Lyophilisierung des aPTT-Reagens steht der Optimierung nicht im Wege. Wegen des proportional höheren Anteils von Citrat- Plasma im Reaktionsansatz - es wird kein Zusatz weiteren Reagenzien - verkürzt sich zudem die Zeit bis zur Gerinnung der Probe. Die Standard-aPTT-Gerinnungszeit von Normai-Kontroilplasmen im TSA verkürzt sich von durchschnittlich 38 auf 35 Sekunden und die HTM verlängerte aPTT-Gerinnungszeit von durchschnittlich 160 auf 135 Sekunden. Die kürzeren Gerinnung szeiten erlauben eine größere Menge hTM im Assay und eine höhere hTM-Konzentration bewirkt wiederum eine größere Differenz der Gerinnungszeiten und eine höhere Sensttivität für Störungen der Hämostase.
[052] Die maximale Menge an hTM im Assay wird jedoch begrenzt durch die maximal erlaubte Gerinnungszeit und die hängt ab von der Messmethode und der gewählten Begrenzung der Messzeit. Die meisten klinischen Labore begrenzen die Gerinnungsmesszeit auf 240 Sekunden, weil bei längeren Gerinnungszeiten der Zeitaufwand für die Analytik zu lang wird und der Standardfehler die zulässigen Werte übersteigt. Auch kommt es bei mechanischen Messverfahren vermehrt zu Ausfällen aufgrund von Gerinnungsfehlern. aPTT-Gerinnungszeitverlängerungen von >200 Sekunden führen insbesondere bei mechanischen Mess verfahren zu einer nicht akzeptablen Zunahme des Standardfehlers. Für Normal-Referenz- und Kontrollplasma wird üblich die hTM-bedingte Gerinnungszeitverzögerung auf 125 bis 135 Sekunden gelegt, um in allen Patientenproben die unterschiedlichen Gerinnungszeiten bestimmen zu können. Spezifität und Sensitivität der h TM2/aPTT-Reagenzien auf Gerinnungsmängel
[053] Oberraschend sind im erfindungsgemäßen TAS nunmehr auch Mängel im Gerinnungssystem feststellbar, welche außerhalb des Protein-C-Wegs liegen und dies zusätzlich zu den Mängeln Im Protein-C-Weg. Bisherige TSA mit Thrombomodulin erkennen nur Mängel innerhalb des Protein-C-Weges. Überraschend kommen durch die Bindung auf dem Oberflächenmittel die Wirkurtgen des hTM-2 nach Rekonstitution und Hydratisierung effektiver zur Geltung, so dass der erfindungsgemäße TSA eine signifikant gesteigerte Sensitivität gegenüber Störungen besitzt; siehe nachstehende Tabelle.
[054] Vergleich der h TM-bedingten Gerinnungszeitverzögerung von Normal-
Kontrollplasma und pathologischen Plasmen (Protein-C und -S-Defizient; Faktor V- Leiden-Mutation); diagnostisch relevant ist das Verhältnis, das Ratio der partiellen Thromboplastinzeiten mit und ohne hTM2 (GZTM/GZTMO) für Normal-Kontrollplasma und pathologische Mangel-Plasmen. Je größer die Differenz der Ratios, desto höher ist die diagnostische Sicherheit (höhere Sensitivität).
TABELLE
Ratio der aPTTmit und ohne hTM2 bei Zusatz als Lösung oder in einer Matrix mit dem Oberflächenmittel und Kontaktmittet
Figure imgf000023_0001
[055] Die Tabelle zeigt, dass fürdie aPTT/hTM2-Matrix die Differenz zwischen
Normal-Kontrollplasmen und Mangelplasmen durchgängig größer ist und damit einer höhere Sensitivität für Gerinnungsstörungen. Klinische Auswertung der Spezifität der aPTT/hTM2-Matrix im TSA
[056] Es wurden 207 Probenplasmen untersucht (55m/152 ; 38 Normal, 169 Patient). Männliche und weibliche Spenderplasmen (Normal-Kontrollplasmen) zeigten mit dem erfindungsgemißen Reagenziensatz signifikante Unterschiede in der Höhe der Ratio (Median: m 4,3; w 3,7 - Probenzahl: 38), Das Intervall der Normal-Kontrollplasmen (m/w) betrug 3,8 bis 5,2; bei Plasmaproben von Männern und bei Frauen 3,5 bis 4,6. Die Intra-Assay-Varianz über 12 Stunden betrug VK[%] 5,5 im Normalbereich und 4,3% im Abnormalbereich; siehe auch Figuren 2A, B. Von allen Patienten bestanden Anamnesen und Untersuchungsergebnisse zu Thrombinzeit, aPTT, Quick, INR, Fibrinogen, Fibrinmonomer, F1-2, D-Dimer, AT3, Faktor VIII, Faktor XI, Lupus Antikoagulanz / APS-Syndrom, Protein C-Konzentration, Protein-S-Aktivität, APCr, Faktor V-Leiden-Mutation, Fll/Prothrombinmutation G20210A. Daneben Familien- Anamnesen, vorherige und aktuelle Diagnose, bestehende Therapien, Raucherstatus, Schwangerschaft und hormonelle Verhütungsmittel. Die Koagulationsmessungen erfolgten optisch mit einem Gerinnungsautomaten (Blood Coagulation System - BCS, Firma Dade-Behring, DE). Die Ergebnisse lassen auf eine erhebliche höhere Sensi- tivität auf Mängel im antikoagulatorischen Mechanismus schließen. Auch erscheint eine allgemeine Erfassung von Thrombophilie-auffälltgen Patienten in einem Test in Reichweite. [057] Es erfolgte weiterhin ein Vergleich der Sensitiv» und Spezifität der erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien auf thrombophile Risiken im Protein-C-Weg (pathologische Veränderungen: FV-Leiden-Mutation, Protein-C/S-Mangel) zwischen Plasmen einer Kontrollgruppe (n=100) und Plasmen von Thrombophiüe-auffälligen Patienten (n=207). Die Gerinnungszeiten wurden optisch mit dem Gerinnungsauto- maten BCS (Siemens) in Doppelbestimmung gemessen und anhand der ermittelten Ratio diagnostisch ausgewertet, also aus dem Verhältnis der Gerinnungszelten mit aPTT/hTM2-Matrix-Reagens (GZTM) und aPTT-Reagens ohne Thrombomodulin (GZTM0). Der Abstand zwischen der partiellen Gerinnungszeit zwischen Normal- Plasmaproben und pathologischen Proben steht mit vorsichtigen Einschränkungen für das Potential des Testverfahrens und die Sicherheit der Diagnostik.
[058] Die erfindungsgemäße TSA-Reagenzien zeigten eine hohe Sensitivität gegenüber Defekten. Die im Durchschnitt erreichte Ratio von 2,7 in pathologischen Proben lag signifikant unter der Durchschnitts-Ratio der Proben von Normalspendern (4,2); der Ratio- Abstand war äquivalent dem ProC-Global-Test, der aber nur Störungen im Protein-C-Weg erkennt. Die Mehrzahl der pathologischen Proben enthielten Defekte mit einer FV-Leiden-Mutation. Proben mit einem Protein-C oder -S-Mange! waren unterrepräsentiert. Die Sensitivität der erfindungsgemäßen Reagenzien für die FV- Leiden-Mutation lag bei 97%. Die durchschnittliche Ratio bei einer Alleingen- Trägerschaft der FV-Leiden-Mutation in heterozygoter Form (ohne PC, PS Mangel) betrug 2,3; die höchste gemessene pathologische Ratio war 3,28. Die erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien lassen somit eine sehr hohe diagnostische Sicherheit zu.
[059] Die empirische obere Entscheidungsgrenze wurde vorläufig auf 3,3 gelegt (Mittelwert der Ratio plus 2fache Standardabweichung). Alle Ratio-Werte unter- muss man als thrombophil und pathologisch bewerten, unabhängig von Geschlecht oder der eventuellen Einnahme von Kontrazeptiva.
[060] Bei Patienten, die neben der FV-Leiden-Mutation zudem additive Mangel bei Protein C und/oder Protein S aufwiesen, betrug die durchschnittliche Ratio 2,6. Dies bestätigt erneut die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen TSA-Rea- genzien, indem sie kumulative Defekte bemerken. Kumulative Defekte potenzieren das Thromboserisiko für den Patienten. Die Testung von Einzelfaktoren übersieht in der Regel alle kumulativen Defekte.
[©81J Hinsichtlich der Protein-C- und Protein-S- angeldefekte im Protein-C- Weg besteht die Tendenz, dass alle Proben mit einer TSA-Ratio (GZT /GZT O) unter 3,3 als pathologisch anzusehen sind. Im Werteren offenbarte die Analyse der Patientengruppe mit intaktem Protein C-Weg (keine FV-Leiden-Mutation und kein Mangel an Protein-C oder -S) einen signifikanten Vorteil gegenüber beispielsweise den TSA-Reagenzien von ProC-GIobai. 53% der untersuchten Plasmen dieser Gruppe waren mit den erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien pathologisch und auffällig, wohingegen im ProC Global-Test nur 13,8% auffielen. Da eine pathologische Ratio für den Patienten stets mit einem erhöhten Thromboserisiko einhergeht, sind die erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien über den Protein-C-Weg hinaus spezifisch. Sie erkennen also erhöhte Plasmaspiegel der Gerinnungsfaktoren FVIII, IX und XI allein oder zusammen mit Lu pus-Antikoag ula nz-Antikörper. Zusätzlich deuten die Ratios der Plasmen von Sepsispatienten darauf, dass deren Überlebenschance abhängt vom Zustand der plasmatischen Hämostase, umfassend auch die Gerinnung außerhalb des
Protein-C-Weges. Im Weiteren wurde die Zuverlässigkeit der TSA-Reagenzien hinsichtlich der Anforderungen in der klinischen Praxis (hohe Robustheft, niedrige Intra- / Inter-Assay Varianz, einfache Verwendung mit Gerinnung sautomaten) belegt. BEISPIEL 3 - Auswertung bei einer Medikation mit Anti-Gerinnungsmitteln
[§62] Der Grenzwert für das Ratio (GZMT/GZ TO), unterhalb dem eine Störung des antikoagulatorischen Potentials angenommen werden muss, hängt ab von der eingesetzten Menge an hTM2. In der Regel wird bei einer Standardbestimmung (siehe Figur 1) 4 pg hTM2 als aPTT/hT 2-Aktivatorreagens eingesetzt. Üblich wird die Gerinnungszeit GZTMO ohne hTM2 auf circa 33-38s gesetzt und die verzögerte Gerinnungszeit GZTM auf 120-1 0s (Fig. 2 B Plasma ControlN). Die Auswertung erfolgt über Ratio (GZTM/GZTMO) sowie die einzelnen Gerinnungszeiten ohne und mit hTM2. Liegt das Ratio im pathologischen Abnormalbereich (Ratio < Grenzwert) liegt eine Störung des antikoagulatorischen Systems vor. Für die normale partiellen Thromoplastinzeit GZTMO (ohne hTM2 in der Formulierungsmatrix) und die verlängerte Gerinnungszeit GZTM mit hTM2 in der Formulierungsmatrix bestehen folgende vier Fallmöglichkeiten:
(1 ) Plasmaprobe mit einer Ratio über Grenzwert bei nicht verlängerter GTZMO-Zeit: die pro- und anti-koagulatorischen Gerinnungsmechanismen sind intakt.
(2) Plasmaprobe mit einer Ratio über Grenzwert bei verlängerter GTMO-Zeit: es besteht eine niedrige Konzentration an pro- und antikoagulatorischen Gerinnungskomponenten; die verminderte plasmatische Hämostase muss kein erhöhtes Thrombophilierisiko bedeuten.
(3) Plasmaprobe mit einer Ratio unter Grenzwert bei nicht verlängerter GTMO-Zeit: es liegt eine Störung im antikoagulatorischen System vor und es besteht ein erhöhtes Thromboserisiko.
(4) Plasmaprobe mit einer Ratio unter Grenzwert bei verlängerten GTMO-Zeit: es besteht eine niedrige Konzentration an pro- und/oder antikoagulatorischen Gerinnungs- komponenten; trotz defekter Hämostase besteht ein erhöhtes Thromboserisiko.
[063] Eine .Erweiterte Aussage" des Assays ist aus der GZTMO-Zeit ableitbar, also aus der .aktivierten partiellen Tromboplastin-Zeit (aPTT)". Dieser gängige Gerinnungsparameter erlaubt weitere Aussagen. So kann eine verlängerte GZTMO (aPTT) hindeuten auf
· Hämophile Zustände, die durch einen Mangel an Faktoren VIII, IX oder XI oder des von Willebrand-Faktors verursacht werden;
• Mangel an Faktor VII oder XIII;
• Dys- oder A-fibrinogemie
• Lupus Antikoagulanz (LU)
· Therapie mit oralen Antikoagulantien (AOK) • Heparin Therapie (UFH, NMH)
• Hirudin und Aprotinin Therapien
[064] Die mit hT 2 ermittelte verlängerte Gerinnungszeit GZTM ist abhängig von den Ursachen der verlängerten GZT O und deren Ausprägung. So ist zum Beispiel bei ausgeprägten hämophilen Zustanden oder einer hohen Dosis an Heparin die GZTM nicht messbar - weil die Probe mit hTM nicht gerinnt oder nur dann, wenn ein hohes Thromboserisiko besteht. Im Fall von Lupus-Antikoagulanz oder einer Therapie mit oralen Antikoagulantien aus der Gruppe der Vitamin K-Antagonisten ist die GZTM messbar und sie führt zu einer pathologischen Ratio bei Lupus- Antikoagulanz oder bei einer Medikation mit Vitamin-K-Antagonisten in Proben mit einer INR unter dem Schwellenwert (siehe Figuren 2A, B).
[065] Dies erlaubt eine Dosisfindung für die Therapie mit Vitamin K-Antagonisten. Hier besteht stets die Gefahr einer Über- oder Unterdosierung und eines erhöhten Blutungs- oder Thromboserisikos. Die Antagonisten verursachen eine Ver- ringerung der Vitamin-K-abhängigen Proteine, die aber teilweise prokoaguiatorisch (Fi!, VII, IX, X) als auch antikoagulatorisch (Protein C, Protein S) wirken. Es entstehen die sogenannten PIVKA (protein induced by Vitamin K absence), die nicht gerinnungsaktiv sind. Das Ziel der Therapie muss sein, den Patienten in einem hämostatfschen Gleichgewicht zu halten, also bei einer Ratio über den Grenzwert und zugleich therapie- bedingten erhöhten Gerinnungszeiten (GZTMO).
[068] Die antikoaguiatorische Wirkung von Heparin beruht darauf, dass es das im Blut zirkulierendes Antithrombin III bindet. Freies Antithrombin Hl hemmt aktivierte Gerinnungsfaktoren wie Thrombin und Faktor Xa. Neben den unfraktionierten Heparinen (UFH) werden auch niedermolekulare fraktionierte Heparine (NMH) verwendet, die sich in ihrer Wirkung unterscheiden. Eine Internationale Einheit (IE) Heparin verhindert über eine Stunde die Gerinnung in 1 mL Citratplasma nach Zugabe von CaCl2 bei 37°C. Viele Patienten erhalten zur Vorbeugung Heparin verabreicht, so dass in heparinisierten Normalplasmaproben die Gerinnungszeiten verlängert sind oder nach Zugabe von hTM keine Gerinnung mehr möglich ist.
[067} Es wurden unterschiedliche Heparin-Neutralisatoren mit den erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien getestet: Protamin (10 pg/mL; 1 ), ZnCI2
(2 pg/mL; 2), Protamin + ZnCl2 (3) und Polybrene (10 pg/mL; 4). Der Vergleich der vier getesteten Heparin-Neutralisatoren zeigte, dass der Zusatz von Protamin und ZnCI2 die besten Ergebnisse liefert; siehe Figuren 8 bis 9. Der Zusatz von Protamin und ZnCI2 zu Normalplasma verursachte die geringste Abweichung der Gerinnungszeiten mit und ohne hT 2, und auch das Ratio verändert sich nicht entscheidend, wenn die Probe UFH- oder NMH-Heparine enthält.
BEISPIEL 4 - - Sensitivität und Spezifität bei Defekten im Protein-C-Weg
[068] Aus einer Gesamtgruppe wurden 62 Patientenproben als unauffällig gemessen (Ratio-Grenzwert 3,5 bei 90% Konfidenzintervall). In einer Gruppe von 43 Patienten mit Protein-C-Weg-Defekten waren 39 Träger einer FV-Leiden-Mutation (38 Heterozygot; 1 Homozygot). 37 Plasmen besaßen eindeutig pathologische Ratios. Von den zwei Proben mit Ratios im Normalbereich besaß eine Probe (m) einen Faktor VIII- Wert von 50% und die andere Probe ( ) einen schwangerschaftsbedingten (9 SSW) Protein-S-Mangel von 40%. Da diese beiden Proben in zwei weiteren Faktor V-Leiden- sensitiven Tests (APC-Resistenz und ProC Global) gleichfalls nicht als pathologisch auffielen, scheint bei diesen beiden Proben die genetische Analyse fehlerhaft gewesen zu sein. Es wurden also alle Proben mit einer FV-Mutation richtig erkannt.
[§6S] Zwei weitere Patienten waren Träger einer Protein-C oder S-Mutatiort. Deren Ratios lagen im eindeutig pathologischen Bereich. Die beiden anderen Patientinnen besaßen einen Protein-C- angel, so dass die Sensitivität der erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien für Störungen des Protein-C-Weges bzw. eine Faktor V-Leiden-Mutation bei über 97% liegt. Das Verfahren und die Reagenzien waren also für Protein-C-Weg-Defekte genauso sensitiv wie der ProC-Global-Test, wie auch die Tests mit anderen Gruppen von Mangel-Patienten (PS-, PC-, FV-L) bestätigten.
BEISPIEL 5 - Sensitivität und Spezifität bei Defekten außerhalb des Protein-C-Weges
[©70] Es wurden weiterhin Proben (72 mw - negativ getestet auf FV- UPC/PS/FII/Lu) von Patienten mit intaktem Protein-C-Weg getestet. Mit den erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien wurden signifikant mehr Proben als pathologisch erkannt als beispielsweise mit dem ProC-Global-Test. Die Aussagen und Werte zur Kontrollgruppe (53 mw) waren in beiden Tests vergleichbar. In der Patientengruppe mit intaktem Protein-C-Weg war keiner der Patienten Träger einer Fll-Prothrombin- Mutation oder positiv für Lupus-Antikoagu!anzien. Die Auswertung ergab, dass die erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien mit teilweise oberflächengebundenem hTM2 nicht nur Defekte des Protein-C-Weges erkennen, sondern auch Thrombophilierisiken außerhalb des Protein-C-Systems. Somit sind noch umfassendere Aussagen zum antikoagulatorischen Potential einer Probe möglich als etwa beim ProC GIobal-Test.
BEISPIEL 6 - - Analyse auf die Faktoren VIII, IX und XI
[§71] Die Proben von der Patientengruppe (73 - mw) mit intaktem Protein-C- Weg (Faktor Il-Mutation negativ; Lupus-Koagulanzien negativ) wurde weiterhin untersucht auf die Faktoren VIII, IX und XI. Die erfindungsgemäße Ratio zeigte sich signifikant sensitiv gegenüber erhöhten Werten an Faktor VIII , IX und XI, insbesondere wenn diese in Kombination höher waren. Von 39 pathologischen Proben besaßen 21 (54%) einen erhöhten Faktor Vtil-Wert, alleine oder in Kombination mit Faktoren IX, XL 9 Proben (23%) hatten erhöhten Faktor IX und/oder XI.
[072] Die Untersuchung der Proben von 22 Patienten mit einer pathologischen Ratio und erhöhtem Faktor VIII zeigte, dass in 15 Patienten (> 66% der Fälle) die Faktoren VIII, IX und XI gemeinsam erhöht waren. Nur in drei pathologischen
Plasmaproben (14%) war allein Faktor Vlll erhöht. In zwei Proben waren sowohl Faktor Vlll als auch Faktor IX oder Faktor XI erhöht. Das mit den erfindungsgemäßen Reagenzien bestimmte Ratio erwies sich als sensitiv gegenüber der kumulativen Wirkung von mehreren Gerinnungsdefekte in der plasmatische Hämostase. Die erfindungsgemäß bestimmte Ratio ist somit der Untersuchung von Einzelfaktoren klar überlegen. Die erfindungsgemäßen TSA-Reagenzien mit oberflächengebundenem hT 2 waren somit sensitiv gegenüber Kombinationen von Risikofaktoren außerhalb des Protein-C-Wegs.
[073] Auch in der Patientengruppe mit einer FV-Lesden- utation (n = 20) besaßen Proben mit einer zusätzlichen Störung in den Werten der Faktoren FVIII, FIX und FXI eine noch niedrigere Ratio. Die Faktoren IX und XI können bei Vorliegen einer Faktor V-Leiden- utation weitere Risikofaktoren sein. Das jeweilig bestimmte Ratio korrelierte invers mit der Schwere und der Zahl der Faktor IX und Vl-Defekte. Je kleiner das Ratio, desto größer war die Gefahr einer Thrombose. Das mit den erfindungsgemäßen Reagenzien bestimmte Ratio gibt somit das thromboembolische Risiko an. Der erfindungsgemäße Reagenziensatz erlaubt somit durch eine einfache Untersuchung eine Aussage darüber, ob Störungen der plasmatischen Hämostase oder ein erhöhtes thromboembolisches Risiko zu befürchten sind. Dies ist mit anderen Tests oder durch Einzeltests nicht möglich. BEISPIEL 7 - - Analyse auf Prothrombin-Mutation und Lupus-Antikoagulanzien
[074] Die Prothrombinmutation G20210A stellt einen erblichen Risikofaktor für die Entwicklung von Thrombosen dar. Sie wird in Deutschland bei 2-3 % der Bevölkerung gefunden und führt zu einem etwa fünffach erhöhten Risiko bei heterozygoten Trägern, in der homozygoten Form ist das Thromboserisiko stärker erhöht. Sie ist nach der APC-Resistenz die zweithäufigste bekannte vererbliche Thromboseneigung. Die Mutation bewirkt keine Veränderung des Prothrombinproteins, sondern es wird mehr als notwendig Prothrombin (Faktor II) produziert, was das Thrombophilie-Risiko erhöht. Es wurden 14 Patienten mit einer Prothrombinmutation G20210A untersucht. Die Proben besaßen in sechs Fällen ein vermindertes Ratio (n=6), wenn weitere Defekte neben der Prothrombinmutation G20120A vorlagen.
BEISPIEL 8 - Protein-S-Mangel bei Schwangeren und Kontrazeptiva-Gruppe
[075] Es wurden Blutproben von 3 schwangeren Frauen mit dem erfindungsgemäßen TSA und dem ProC-Global-Test untersucht. Die jeweiligen Protein-S-Werte lagen oberhalb der für Schwangeren geltenden Referenz [bis 40%]. Verschieden zum ProC-Global-Test zeigt sich mit den erfindungsgemäßen TSA- Reagenzien eine der Proben als pathologisch. Die Störung des Gerinnungsgleichgewichts lag außerhalb des Protein-C-Weges.
[076] Es wurden weiterhin Blutproben von 5 Frauen mit dem erfindungs- gemäßen TSA und dem ProC-Global-Test untersucht. Bei drei der Proben lagen die Protein-S-Werte oberhalb der für Kontrazeptiva-geltenden Referenz [52%] und bei zwei Proben darunter. Diese beiden Proben wurden im erfindungsgemäßen TSA also pathologisch befunden (90% Konfidenzintervall) warend sie im ProC-Global-Test noch im Normalbereich lagen. Der erfindungsgemäße Reagenziensatz erkennt daher auch verbessert thromboembolische Risiken durch die Einnahme von Kontrazeptiva.
Zusammenfassung
[077] Die Auswertung der 207 Patientenproben ergab, dass die beschriebenen Gerinnungsreagenzien mit oberflächengebundenem hT 2 eine zuverlässige Entscheidungsgrenze (Cut-off) zwischen normal und pathologisch geben. Bei der Festlegung des Grenzwerts sind Geschlecht und Atter der Patienten zu berücksichtigen. Der erfindungsgemäße TSA ist sensitiv (> 95%) auf Mängel im Protein-C Weg (FV-Leiden- utation, hereditärer Protein-C und -S-Mange!) und anders als beim bekannten ProC Global Gerinnungstest werden auch Thromboserisikofaktoren (FVIII, FIX, FXI) außerhalb des Protein-C-Weges erkannt. Der Test ist sensitiv auf Lupus-Antikoag uianz sowie eine Kombination von Prothrombin G20210A- Mutation und Defekten anderer Gerinnungsparameter (FVIII, FXI, CBA, FXlll, FVli, Hyperhomocysteinemie). Der Test korreliert auch invers mit der Schwere und der Zahl der Defekte und beschreibt das Gesamtrisiko einer Thrombose. Verschiedene Defekte einzelner Gerinnungsparameter machen sich im erfindungsgemäßen Gerinnungstest kumulativ bemerkbar. Der Test erlaubt eine umfassende Auskunft zum Gleichgewicht der plasmatischen Hämostase, was in vielen Anwendungen ein großer diagnostischer Vorteil gegenüber den Einzeifaktor-Tests ist. Der Test erkennt sowohl hereditäre also auch erworbene Thromboserisiken.

Claims

37
P A T E N T A N S P R Ü C H E
Verfahren zur Diagnose von Störungen der plasmatischen Hämostase und des Risikos von throm oembolischen Ereignissen, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen einer Plasmaprobe von einem Patienten mit Verdacht auf gestörter Hämostase und hohem thromboembolischen Risiko;
(ii) Aufteilen der Probe in erste und zweite Volumina;
(iii) Zusetzen zu den ersten und zweiten Volumina der Plasmaprobe jeweils gleiche relative Mengen aPTT-Reagens aus Oberflächenmittel und Kontaktmittel für die Einleitung der Gerinnungskaskade, und im Unterschied zusätzlich eine vorbestimmten Menge lösliches Thrombomodulin;
(iv) Inkubieren der ersten und zweiten Plasmaprobe mit dem aPTT- Reagens beziehungsweise dem aPTT-Thrombomodulin-Reagens für einen Zeitraum von 1 bis 10 Minuten bei einer Temperatur von Raumtemperatur (23°C) bis 42°C, bevorzugt 37°C, und Erhalt von ersten und zweiten Proben mit einer begonnenen Gerinnungsreaktion;
(v) Zusetzen zu den ersten und zweiten Plasmaproben von Calciumiorien und Starten der Thrombin-abhängigen Gerinnung in An- und Abwesenheit von Thrombomodulin;
(vi) Inkubation der ersten und zweiten Plasmaprobe bei einer Temperatur von Raumtemperatur (23°C) bis 42°C, bevorzugt 37°C, und Messen der Zeit, bis in der ersten und der zweite Plasmaprobe eine definierte Gerinnung des Plasma besteht (aPTT oder aktivierte partielle Thromboplastinzeit); und
(vii) Bestimmen der Ratio zwischen der aPTT in der Probe mit löslichem Thrombomodulin und der aPTT in der Probe ohne Thrombomodulin; wobei eine Ratio unterhalb eines vorbestimmten Grenzwerts ein erhöhtes Risiko für ein thromboembolisches Ereignis aufzeigt;
dadurch gekennzeichnet, dass das aPTT-Aktivatorreagens mit löslichem Thrombomodulin in Schritt (iv) in Form eines dehydratisierten Lyophilisats einer gemeinsam lyophilisierten Suspension von Oberflächenmittel, Phospholipiden und löslichem Thrombomodulin, das von Luft Sauerstoff nicht desaktfviert werden kann, wobei das Thrombomodulin mit den Phospholipiden in der Grenzschicht auf dem Oberflächenmittel vorliegt. 38
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Thrombomoduiin ein unterglykosiiiertes humanes Thrombomodulin-Analog ist, das in wässriger Lösung löslich und gegenüber Luftsauerstoff oxidationsbeständig ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Thrombomodulin-Analog die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 (hT -Variante 2) enthält,
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Thrombomodulin- Analog stabilisiert in muitilamellaren Phospholipidschichten auf einem
Oberflächenmittel vorliegt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die auf dem Oberflächenmittel getragene Phospholipidschichtert zudem Sulfatide enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oberflächenmittel ausgewählt ist aus Silica-, Kaolin-, Ellagsäure- und Polyphenol- Feststoffteiichen.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Probe vor oder im Schritt (iii) ein Heparin-Neutralisator zugesetzt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Probe Protamin und ZnCI2 zugesetzt wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Probe Citratplasma ist.
10. Verwendung eines Thrombomodulin-Analogs in einer Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur quantitativen Bestimmung des thromboembolischen Risikos.
11. Rekombinantes Thrombomodulin-Analog, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2: 39
SEQ. ID NO. 2:
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGPATFLNASQI CDGLRGHLMTVRSSVAADVISLLLNGDGGVGRRRLWIGLQLPPGCGDPKRL GPLRGFQWVTGDNNTSYSR ARLDLNGAPLCGPLCVAVSAAEATVPSEPI WEEQQCEVKADGFLCEFHFPATCRPLAVEPGAAAAAVSITYGTPFAARGAD FQALPVGSSAAVAPLGLQL CTAPPGAVGGHWAREAPGAWDCSVENGGC EHACNAIPGAPRCQCPAGAALQADGRSCTASATQSCNDLCEHFCVPNPDQ PGSYSC CETGYRLAADQHRCEDVDDCILEPSPCPQRCVNTQGGFECHCY PNYDLVDGECVEPVDPCFRANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAPIPHEPHR CQLFCNQTACPADCDPNTQASCECPEGYILDDGFICTDIDECENGGFCSGV CHNLPGTFECICGPDSALARHIGTDCDSGKVDGGDSGAGEPPPSPTPGSTL TPPAVGLVHS
Satz von trockenen Reagenzien mit einem trockenen aPTT-Reagenz, umfassend ein lyophilisiertes Oberflächenmittel mit einer muftilamellansn Phospholipidschicht, die ein lösliches oxidationsbeständiges humanes Thrombomodulin-Analog gemäß einem der Ansprüche 2 bis 11 enthält.
Reagens zur Einleitung der Gerinnung in einer Plasmaprobe, umfassend eine hydratisierte homogene Suspension eines teilchenförmigen Feststoffs, ausgewählt aus Silica und Kaolin, eines Kontaktvermittlers, ausgewählt aus Phospholipide und Sulfatiden, und ein hydratisiertes wasserlösliches humanes Thrombomodulin-Analog gemäß einem der Ansprüche 2 bis 11 ,
* # * *
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