DE10016139A1 - Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin

Info

Publication number
DE10016139A1
DE10016139A1 DE2000116139 DE10016139A DE10016139A1 DE 10016139 A1 DE10016139 A1 DE 10016139A1 DE 2000116139 DE2000116139 DE 2000116139 DE 10016139 A DE10016139 A DE 10016139A DE 10016139 A1 DE10016139 A1 DE 10016139A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
plasminogen
pna
hydrochloride
arg
dspa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE2000116139
Other languages
English (en)
Inventor
Wolf-Dieter Schleuning
Roland Hansen
Michael Praus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE2000116139 priority Critical patent/DE10016139A1/de
Priority to AU73819/01A priority patent/AU7381901A/en
Priority to PCT/DE2001/001207 priority patent/WO2001073445A2/de
Publication of DE10016139A1 publication Critical patent/DE10016139A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das auf der selektiven, spezifischen Stimulation der katalytischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA selbst oder durch Plasmin beruht. Die Erfindung dient der Diagnose präthrombotischer oder thrombotischer Zustände und ermöglicht auf Grund ihrer schnellen automatisierbaren Durchführung die zeitnahe Einleitung therapeutischer Maßnahmen. Ferner kann sie auch zur sensitiven Überwachung antikoagulatorischer Therapien genutzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin. Insbesondere betrifft das Verfahren die spezifische und hochsensitive Messung von löslichem Fi­ brin mittels Desmodus rotundus Speichel Plasminogenakti­ vatoren (DSPA).
Venöse Thrombosen und die damit einher gehenden Folgeer­ krankungen wie das Postthrombotische-Syndrom oder die Lungenembolien, welche akut lebensbedrohend sein können, stellen eine häufige Ursache für Morbidität dar. In der Bundesrepublik wird die Thrombose-Inzidenz auf 1 : 1000 pro Jahr geschätzt mit einer hohen Mortalitätsrate (Witt I. APC-Resistenz (Faktor V Mutation): Klinische Bedeu­ tung, Pathophysiologie und Diagnostik. Dt Ärzteblatt 1998; 95: A 2316-2323). Die rechtzeitige Diagnose des präthrombotischen Zustandes würde krankheitsverhütende antithrombotische Maßnahmen erlauben.
Es ist aber immer noch eine ungelöste Aufgabe in der kli­ nischen und laboratoriumsmedizinischen Diagnostik, den Aktivierungszustand der Gerinnungskaskade vor der Gerinn­ selpräzipitation zu quantifizieren. Bei den im Augenblick verfügbaren Testverfahren für Aktivierungsparameter der Blutgerinnung wie zum Beispiel der Nachweis der Prothrom­ binfragmente 1 + 2 oder von Thrombin-Antithrombin Komplexen handelt es sich um zeitaufwendige ELISA-Methoden, deren Durchführung mehrere Stunden in Anspruch nimmt.
Ein weiterer möglicher Parameter zur Detektion einer ak­ tivierten Gerinnung ist lösliches Fibrin. Alle bisher verfügbaren Nachweisverfahren für lösliches Fibrin sind mit gravierenden Mängeln behaftet, die ihren Einsatz in der Routine Diagnostik schwierig oder sehr aufwendig gestalten. Verfahren, die lösliches Fibrin anhand seiner physikalischen Stoffeigenschaften nachweisen, zum Bei­ spiel durch Präzipitation oder Chromatographie sind unge­ nau und für die Routinediagnostik nur schlecht automati­ sierbar.
Die turbidimetrische Messung von löslichem Fibrin durch Agglutination von Latex Partikeln (EP-A1 0 139 885) ist zwar sensitiv und automatisierbar, basiert jedoch auf un­ spezifischer Absorption, die durch andere Plasmaproteine gestört werden kann. Ein weiteres Verfahren beruht auf der Steigerung der katalytischen Aktivität von tissue- type Plasminogenaktivator (t-PA) in Anwesenheit von Fi­ brin. Der wesentliche Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch in seiner Unspezifität, da die enzymatische Akti­ vität von t-PA auch durch Fibrinogen stimuliert wird. Dies stellt vor allem deshalb ein Problem dar, weil viele Krankheitsbilder, bei denen die Bestimmung von löslichem Fibrin von diagnostischer Bedeutung ist, im Rahmen einer Akut-Phase-Reaktion mit einem Anstieg der Plasma Fibrino­ gen Konzentration einher gehen, wie zum Beispiel Venen­ entzündungen, Sepsis, instabile Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt oder der Schlaganfall.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue zu­ verlässige und automatisierbare Methode zur Messung von löslichem Fibrin als frühem diagnostischen Parameter zur Diagnose von präthrombotischen Zuständen, bereitzustel­ len, die auf einer spezifischen biochemischen Reaktion beruht, die aber nicht durch Anwesenheit von Fibrinogen gestört wird.
Die Aufgabe wird durch Verfahren zur Bestimmung von lös­ lichem Fibrin gelöst, wobei man die zu untersuchende Plasmaprobe mit einem Plasminogenaktivator der Desmodus- Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie (DSPA) inku­ biert.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu untersu­ chende Plasmaprobe weiterhin in der Gegenwart eines für Plasminogenaktivatoren spezifischen chromogenen Substrats inkubiert und man die Menge an löslichem Fibrin mittels Messung des abgespaltenen Chromophors bestimmt.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist es, daß das für Plasmino­ genaktivatoren spezifische chromogene Substrat CH3SO2-D- HHT-Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu-(γ-OR)- Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist.
Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, daß der Plas­ minogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen- Aktivatoren-Familie aus DSPA alpha 1, alpha 2, beta, gam­ ma oder bat-PA ausgewählt ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasmino­ gen, einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 An­ tiplasmin sowie eines für Plasmin spezifischen chromoge­ nen Substrats inkubiert.
Vorteilhaft ist es, daß das Plasminogen Glu-Plasminogen ist.
Vorteilhaft ist ferner, daß man einen neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin Verwendet.
Vorteilhaft ist gleichermaßen, daß das für Plasmin spezi­ fische chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl- L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder H-D-Val-Leu-Lys- pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro- Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-val-Phe-Lys-pNA- Hydrochlorid oder H-D-Ala-HHT-Lys-pNA ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhaft zur Be­ stimmung von löslichem Fibrin zum Nachweis präthromboti­ scher und thrombotischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei prothetischen Herzklappen und funktionel­ len cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoa­ gulatorischer Therapien.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testbesteck zur erfindungsgemäßen Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von löslichem Fibrin bestehend aus:
  • a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA an­ tikoaguliert ist,
  • b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus-Speichel- Plasminogen-Aktivator-Familie,
  • c) Plasminogen als Substrat für DSPA,
  • d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti­ plasmin und
  • e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
Erfindungsgemäß ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Testbestecks zum Nachweis präthrombotischer und thrombo­ tischer Zustände, zur Risikovorhersage bei disseminierter intravasaler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti­ schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist Syste­ men und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
Die Aufgabe wird also dadurch gelöst, daß ein Plasmino­ genaktivator aus der Familie der Desmodus Speichel Plasminogenaktivatoren (Krätzschmar J, Haendler B, Langer G, Boidol W, Bringmann P, Alagon A, Donner P Schleuning WD. The plasminogen activator family from the salivary gland of the vampir bat Desmodus rotundus: cloning and expres­ sion. Gene, 1991; 105: 229-237) verwandt wird, um in ei­ ner zu untersuchenden Blut- oder Plasmaprobe die Menge an löslichem Fibrin zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit ein neues Verfahren zur quantitativen Messung von löslichem Fibrin in Plasma, das auf der selektiven, spezifischen Stimulation der kataly­ tischen Aktivität des Plasminogenaktivators DSPA durch Fibrin auch in Anwesenheit von Fibrinogen und dem damit verbundenen Umsatz eines chromogenen Substrats durch DSPA selbst oder durch Plasmin beruht. Der Plasminogenaktiva­ tor aus dem Speichel der Vampir Fledermaus (Desmodus ro­ tundus) Desmodus salivary plasminogen activator ist nur in Anwesenheit von Fibrin aktiv. Die Aktivierung des Plasminogenaktivators und der Umsatz des chromogenen Substrates sind direkt der Menge an löslichem Fibrin pro­ portional.
Erfindungsgemäß wurde das Messverfahren so optimiert, daß es auf einem modernen Analyse-Automaten etabliert werden kann. Die Plasmaprobe wird 1 : 10 mit einem Tris-HCL Puffer verdünnt und mit einem Desmodus Speichel Plasminogenakti­ vator versetzt.
Gemessen wird der fibrinstimulierte Umsatz eines chromo­ genen Substrates für den Plasminogenaktivator direkt oder zur Signalverstärkung für Plasmin, das Fibrin-abhängig aus Plasminogen entsteht. Im zweiten Verfahren muß der im Plasma enthaltene Plasmin Inhibitor *2-Antiplasmin in­ aktiviert werden, zum Beispiel durch Zugabe eines neutra­ lisierenden Antikörper. Die Quantifizierung des löslichen Fibrins erfolgt dann auch durch Spaltung eines chromogenen Substrates wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L- Phenylalanyl-L-Lysine-p-Nitroanilinhydrochlorid.
Messungen von löslichem Fibrin mit diesem neuen Testver­ fahren in humanem mit Hemokomplettan substituierten Plas­ ma haben gezeigt, daß DSPA wie erwartet eine größere Spe­ zifität für Stimulation seiner katalytischen Aktivität durch Fibrin in Anwesenheit von Fibrinogen besitzt als Tissue-type Plasminogenaktivator. Darüber hinaus hat sich überraschenderweise auch gezeigt, daß das neue Testver­ fahren weniger störanfällig gegenüber Plasminogenaktiva­ tor Inhibitor 1 ist.
Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus:
  • a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, die entweder mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert wurden,
  • b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus Speichel Plasmino­ genaktivator Familie, wie zum Beispiel DSPA alpha 1, al­ pha 2, beta, gamma, oder bat-PA (Gardell SJ et al. Iso­ lation, characterization and cDNA cloning of a Vampire bat salivary plasminogen activator. (1989) J Biol Chem 264: 17947-17952),
  • c) Plasminogen als Substrat für DSPA, zum Beispiel Glu- Plasminogen,
  • d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Anti­ plasmin, zum Beispiel Rabbit anti-human Alpha 2 antiplas­ min #A0303,
  • e) Chromogene Substrate, welche entweder spezifisch durch den Plasminogenaktivator, wie zum Beispiel CH3SO2- HHT.Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder durch Plasmin, wie zum Beispiel L-Pyroglutamyl-L-Phenylalanyl-L-Lysine-p- Nitroanilinhydrochlorid gespalten werden.
Das Wesen der Erfindung liegt in einer Kombination be­ kannter Elemente und neuer Lösungswege, die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung ei­ nen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, daß nunmehr eine neue zuverlässige Me­ thode zur Messung von löslichem Fibrin und damit ein Ver­ fahren zur frühen Diagnose präthrombotischer Zustände, bereitgestellt wird.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen er­ läutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiele Beispiel 1 Kalibrationskurve für lösliches Fibrin
Lösliches Fibrin (DesaFib) wird in einer Konzentration von 4 mg/ml in Aqua ad injectionem gelöst. Humanes Zi­ tratplasma wird zur Erstellung einer Kalibrationskurve mit ansteigenden Mengen DesaFib-X von 1,25 µg/ml, 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml ge­ mischt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis 1 : 10 verdünnt. 25 µl verdünnte Probe werden mit 50 µl Rea­ genzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 µl polyklonalem Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (0,067 g/l) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Re­ aktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Zur Bestimmung der Reaktionsrate [mOD/min] wird die Absorpti­ on bei 405 nm nach 5 und 10 min gemessen (Fig. 1).
Beispiel 2 Vergleich der Fibrin Spezifität von t-PA und DSPA im lös­ lichen Fibrin Test
Pool Plasma (Preciclot) wird mit Haemocomplettan (gereinigtes humanes Fibrinogen, daß einen geringen An­ teil an löslichem Fibrin enhält) in aufsteigenden Mengen (0 mg/dl, 62,5 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl) versetzt. Diese Proben werden nochmals mit Puffer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) im Verhältnis 1 : 10 verdünnt. 25 µl verdünnte Probe werden mit 50 µl Rea­ genzienlösung (Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) und 25 µl polyklonalem Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antiserum gemischt. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (5 µg/ml) oder 50 µl t-PA (5 µg/ml) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Zur Bestimmung der Reaktionsrate [mOD/min] wird die Absorption bei 405 nm nach 5 und 10 min gemessen (Fig. 2). Der deutlich höhere OD-Anstieg der mit t-PA gemessenen Proben zeigt, daß auch in diesem Assay DSPA eine größere Fibrinspezifität besitzt als t- PA. Dies erlaubt in den folgenden Anwendungsbeispielen den Einsatz höherer Konzentrationen von DSPA zum Nachweis von löslichem Fibrin.
Beispiel 3 Untersuchung über den Einfluß von Heparin und Polybren auf den Nachweis von löslichem Fibrin mit Hilfe von DSPA
Effekte von Heparin und Polybren auf den Fibrin-Nachweis mit DSPA: Haemocomplettan (Centeon) ist eine lyophilisierte Präpa­ ration von Fibrinogen. Es enthält zu circa 1% Gewichts­ prozent lösliches Fibrin. Haemocomplettan wird in einer Konzentration von 100 mg/ml in Aqua ad injectionem gelöst. Um vergleichbare Proben mit einem reproduzierbaren Anteil an löslichem Fibrin zu erhalten, wird humanes Zi­ trat-Plasma, in diesem Beispiel Fresh-Frozen-Plasma, mit aufsteigenden Konzentrationen (0 mg/dl, 125 mg/dl, 250 mg/dl, 500 mg/dl Haemocomplettan) dieser Stammlösung sub­ stituiert. Der Einfluß von Heparin auf das neue Verfahren zur Messung von löslichem Fibrin wird untersucht, indem das Plasma zusätzlich noch mit unterschiedlichen Heparin­ konzentration von 0 bis 3 internationalen Einheiten pro ml versetzt wird. Auf einem Analysenautomaten, zum Bei­ spiel ein Cobas Fara, wird das folgende Messprotokoll programmiert: 2,5 µl Plasmaprobe werden mit 22,5 µl Puf­ fer (0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) verdünnt. Es werden dann 75 µl Reagenzienlösung (2 Volu­ men Anteile Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 1 volumen Anteil Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antikörper, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v)) hinzu pipet­ tiert. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (0,067 g/l) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) ge­ startet. Es werden insgesamt 15 Messungen im Abstand von 20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung der Konzentrati­ on erfolgt an Hand einer Kalibrationskurve. Es wird, wie in Fig. 3 dargestellt, deutlich, daß es in Anwesenheit von Heparin zu einer starken Abnahme des Meßsignals kommt, die bei hohen Konzentrationen von löslichem Fibrin dosis-abhängig zu sein scheint.
Antagonisierung der Heparineffekte durch Polybren: Um die Möglichkeit zu untersuchen, die durch Heparin her­ vorgerufene Abnahme des Meßsignals durch Zugabe von Poly­ bren zu antagonisieren, wurden die Plasmaproben wie oben beschrieben mit löslichem Fibrin in der Form des Haemo­ complettans und Heparin versehen.
Im automatisierten Messprotokoll wurde der Verdünnungs­ puffer für die Proben durch einen Polybren-(0,13%) halti­ gen Trispuffer ersetzt. Das restliche Protokoll wurde wie oben bereits beschrieben durchgeführt.
2,5 µl Plasmaprobe werden mit 22,5 µl Puffer (0,1 M Tris- HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13% (w/v)) verdünnt. Es werden dann 75 µl Reagenzienlösung (2 Volumemanteile Glu-Plasminogen 0,075 g/l, 1 Volumenanteil Rabbit anti-human Alpha 2 antiplasmin Antikörper, 0,1 M Tris-HCL pH 8,0, 0,02% Triton X 100 (v/v), Polybren 0,13% (w/v)) hinzu pipettiert. Es erfolgt dann die Zugabe von 50 µl DSPA Lösung (0,067 g/l) und eine Inkubation bei 37°C für 10 Minuten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl Substratlösung (S2403, Chromogenix, 0,6 M Arginin 2 M KCl pH 8,2) gestartet. Es werden insgesamt 15 Messungen im Abstand von 20 Sekunden durchgeführt. Die Berechnung der Konzentration erfolgt an Hand einer Kalibrationskur­ ve.
Die Heparin vermittelte Signalabnahme konnte durch die in diesem Assay benutzte Polybrenkonzentration von (0,13%) aufgehoben werden (Fig. 4).

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin, wobei man die zu untersuchende Plasmaprobe mit einem Plas­ minogenaktivator der Desmodus-Speichel-Plasminogen- Aktivatoren-Familie (DSPA) inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe weiterhin in der Gegenwart eines für Plasminogenaktivatoren spezi­ fischen chromogenen Substrats inkubiert und man die Menge an löslichem Fibrin mittels Messung des abge­ spaltenen Chromophors bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Plasminogenaktivator der Desmodus- Speichel-Plasminogen-Aktivatoren-Familie aus DSPA al­ pha 1, alpha 2, beta, gamma oder bat-PA ausgewählt ist.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Plasmaprobe in der Gegenwart von Plasminogen, einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplas­ min sowie eines für Plasmin spezifischen chromogenen Substrats inkubiert.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasminogen Glu- Plasminogen ist.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen neutralisieren­ den Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin verwendet.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für Plasminogenakti­ vatoren spezifische chromogene Substrat CH3SO2-D-HHT- Gly-Arg-p-Nitroanilinacetat oder Bz-Ile-Glu-(γ-OR)- Gly-Arg-pNA oder H-D-Ile-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder pyroGlu-Gly-Arg-pNA-Hydrochlorid ist.
6. Verfahren nach gemäß einem der voranstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß für Plasmin spezifi­ sche chromogene Substrat L-Pyroglutamyl-L- Phenylalanyl-L-Lysin-p-Nitroanilinhydrochlorid oder H-D-Val-Leu-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ile-Pro- Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Pro-Phe-Arg-pNA- Hydrochlorid oder pyroGlu-Pro-Arg-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Val-Phe-Lys-pNA-Hydrochlorid oder H-D-Ala- HHT-Lys-pNA ist.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche zum Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustän­ de, zur Risikovorhersage bei disseminierter intrava­ saler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti­ schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
10. Testbesteck zur Bestimmung von löslichem Fibrin be­ stehend aus:
  • a) dem Untersuchungsmaterial bestehend aus Vollblut oder Plättchen freiem Plasma, welches mit Zitrat oder EDTA antikoaguliert ist,
  • b) Plasminogenaktivatoren der Desmodus-Speichel- Plasminogen-Aktivator-Familie,
  • c) Plasminogen als Substrat für DSPA,
  • d) einem neutralisierenden Antikörper gegen alpha 2 Antiplasmin und
  • e) Chromogenen Substraten, welche spezifisch durch den Plasminogenaktivator oder durch Plasmin spaltbar sind.
11. Verwendung des Testbestecks nach Anspruch 10 zum Nachweis präthrombotischer und thrombotischer Zustän­ de, zur Risikovorhersage bei disseminierter intrava­ saler Koagulopathie sowie Thrombosen bei protheti­ schen Herzklappen und funktionellen cardiac assist Systemen und zur Überwachung antikoagulatorischer Therapien.
DE2000116139 2000-03-27 2000-03-27 Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin Withdrawn DE10016139A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2000116139 DE10016139A1 (de) 2000-03-27 2000-03-27 Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin
AU73819/01A AU7381901A (en) 2000-03-27 2001-03-27 Method for analyzing soluble fibrin
PCT/DE2001/001207 WO2001073445A2 (de) 2000-03-27 2001-03-27 Verfahren zur bestimmung von löslichem fibrin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2000116139 DE10016139A1 (de) 2000-03-27 2000-03-27 Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10016139A1 true DE10016139A1 (de) 2001-10-18

Family

ID=7637178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2000116139 Withdrawn DE10016139A1 (de) 2000-03-27 2000-03-27 Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU7381901A (de)
DE (1) DE10016139A1 (de)
WO (1) WO2001073445A2 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3012985A1 (en) 2015-01-27 2016-08-04 Kardiatonos, Inc. Biomarkers of vascular disease

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3904580A1 (de) * 1989-02-13 1990-08-16 Schering Ag Neues thrombolytikum
DE3879406T2 (de) * 1987-06-18 1993-06-24 Chromogenix Ab Bestimmung aktiver bestandteile der proteolyse.
EP0383417B1 (de) * 1989-02-13 1995-12-27 Schering Aktiengesellschaft Fledermausspeichel-Plasminogenaktivator vPA-alpha 1
US6008019A (en) * 1989-02-13 1999-12-28 Schering Aktiengesellschaft Plasminogen activator from saliva of the vampire bat

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3430906A1 (de) * 1984-08-22 1986-02-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von fibrinmonomer in plasma
US5114845A (en) * 1987-07-06 1992-05-19 Biopool International, Inc. Assays for plasminogen activator inhibitor and soluble fibrin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3879406T2 (de) * 1987-06-18 1993-06-24 Chromogenix Ab Bestimmung aktiver bestandteile der proteolyse.
DE3904580A1 (de) * 1989-02-13 1990-08-16 Schering Ag Neues thrombolytikum
EP0383417B1 (de) * 1989-02-13 1995-12-27 Schering Aktiengesellschaft Fledermausspeichel-Plasminogenaktivator vPA-alpha 1
US6008019A (en) * 1989-02-13 1999-12-28 Schering Aktiengesellschaft Plasminogen activator from saliva of the vampire bat

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbank MEDLINE bei STN: AN 86236190 zu: Deter- mination of soluble fibrin in plasma by a rapid and quantitative spectrophotometric assay. Wiman, B. & Ranby, M., THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, (1986 Apr 30) 55(2) 189-93 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001073445A3 (de) 2002-05-10
AU7381901A (en) 2001-10-08
WO2001073445A2 (de) 2001-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0915340B1 (de) Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe und Verfahren zur Bestimmung der Glykosilierung von Thrombomodulin
EP1734369B1 (de) Verfahren zur Standardisierung von Gerinnungstesten
DE60315151T2 (de) Diagnostischer test zur bestimmung der konzentration einer transienten proteolytischen aktivität in zusammengesetzten biologischen medien
DE69207607T3 (de) Verfahren zur diagnose von störungen der blutgerinnung
EP0537490B1 (de) Funktioneller Test und Reagenz zur Bestimmung von Fibrinogen
DD222043A5 (de) Verfahren und reagens zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma
EP1059359B1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen
DE2812943A1 (de) Verfahren und reagens zur bestimmung des biologisch aktiven heparins im plasma
EP0696642B1 (de) Verfahren zum Nachweis von Störungen des Protein C/Protein S-Systems
EP1752772B1 (de) Faktor Xa basiertes Heparin-Testverfahren unter Verwendung einer Heparin-modifizierenden Komponente
DE112006003476T5 (de) Verfahren und Systeme zum Nachweisen und Quantifizieren indirekter Thrombininhibitoren
EP0173916B1 (de) Verfahren zur Bestimmung von Fibrinmonomer in Plasma
DE2601372C3 (de) Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III
AT402824B (de) Test zur bestimmung der empfindlichkeit einer testprobe gegenüber aktiviertem protein c
EP0062310A1 (de) Reagens zur optischen Bestimmung des Blutgerinnungsverhaltens
AT405692B (de) Reagens zur bestimmung der aptt
AT398004B (de) Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers
DE10016139A1 (de) Verfahren zur Bestimmung von löslichem Fibrin
DE4439756C2 (de) Kalibrator zur Verwendung in Testverfahren zum Nachweis eines defekten Gerinnungsfaktors V
EP0445626B1 (de) Funktioneller Test zur Bestimmung der Protein S-Aktivität
DE69916816T2 (de) Verbesserter blutgerinnungstest
DE10238429A1 (de) Marburg I Mutante der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) als Risikofaktor für Atherosklerose
DE69520725T3 (de) Verfahren zur Diagnose von Blutgerinnungsstörungen
DE3635191A1 (de) Verfahren zur bestimmung von plasminogen
DE19506263A1 (de) Verfahren zum spezifischen Nachweis eines Gerinnungsfaktors V mit einer erhöhten Stabilität gegenüber aktiviertem Protein C im aktivierten Zustand

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8143 Withdrawn due to claiming internal priority