DE3904580A1

DE3904580A1 - Neues thrombolytikum

Info

Publication number: DE3904580A1
Application number: DE3904580A
Authority: DE
Inventors: Berthold Dipl Biol Baldus; Peter Donner; Wolf-Dieter Dr Schleuning; Alejandro Prof Alagon
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1989-02-13
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1990-08-16
Also published as: NZ232500A; ZA901091B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Thrombolytikum, Verfahren für seine Isolierung und seine pharmazeutische Verwendung.

Thrombosen entstehen durch die Bildung eines Blutgerinnsels in Blutgefäßen. Man unterscheidet venöse Thrombosen einschließlich der Lungenembolien und arterielle Thrombosen einschließlich des akuten Herzinfarkts.

Lungenembolie und Herzinfarkt sind lebensbedrohliche Ereignisse, die einer me dizinischen Sofortintervention bedürfen.

Neben verschiedenen invasiven Methoden hat sich in den letzten Jahren die en zymatische Thrombolyse mit Plasminogenaktivatoren als Therapieform für arterielle und venöse Thrombosen durchgesetzt. Diese als Thrombolytika bezeichneten Stoffe wandeln Plasminogen, das inaktive Proenzym des Fibrinolysesystem im Blut, in das aktive proteolytische Enzym Plasmin um. Plasmin wiederum löst den Faserstoff Fibrin, ein wesentlicher Bestandteil eines Blutgerinnsels, auf, was zur Wiedereröffnung der verschlossenen Gefäße und zur Rekonstruktion des Blut flusses führt. Plasmin jedoch ist eine relativ unspezifische Protease, das heißt, einmal im Blut gebildet, zerstört sie proteolytisch Komponenten im Blut, die für eine intakte Hämostase unerläßlich sind (z. B. Fibrinogen), und induziert dadurch unter Umständen gefährliche Blutungsrisiken.

Die Thrombolytika der ersten Generation, Streptokinase und Urokinase sind Stoffe, die, einmal in die Zirkulation injiziert, systemisch Plasminogen in Plasmin umwandeln und eine systemische Proteolyse induzieren. Thrombolyse therapien mit diesen Stoffen sind daher häufig von Blutungskomplikationen begleitet. Die daraufhin entwickelte fibrinspezifische Thrombolyse, bei der rekombinierte Plasminogenaktivatoren vom Gewebetyp, kurz t-PA genannt, eingesetzt werden, sollte aus diesem Dilemma herausführen. t-PA hat im Blutkreislauf eine nur geringe Affinität zu Plasminogen. In Gegenwart des Faserstoffs Fibrin jedoch, mit dem es über spezifische Bindungsstellen reagiert, erhöht sich diese Affinität um ein Vielfaches, was in einer Plasminbildung an der Thrombusoberfläche resultiert. Dieses Konzept konnte in vitro und in tierexperimentellen Untersuchungen verifiziert werden; die klinischen Studien jedoch, daß große Mengen t-PA nötig sind, um die rasche Auflösung einer Koronarthrombose zu bewirken.

Infundiert man aber derart hohe Dosen t-PA, führt das ähnlich wie in den Fällen von Streptokinase und Urokinase zu einer systemischen Proteolyse verbunden mit einem relativen Blutungsrisiko. Man spricht daher heute von einer relativen Fibrinspezifität des t-PA. Die Ursache dafür liegt in einer wesentlichen Eigenschaft des t-PA begründet: Dieses Molekül ist eine aktive Protease, die unter günstigen Bedingungen (hohe Enzymkonzentration, lange Expositionszeit, hohe Substratkonzentration, optimaler pH und Ionenmilieu) Plasminogen auch in Abwesenheit von Fibrin zu Plasmin umwandelt. Alle diese Bedingungen sind bei der derzeitigen klinischen Standardtherapie mit t-PA erfüllt.

Bei der Suche nach spezifischeren Plasminogenaktivatoren, die das Kriterium der Fibrinspezifität erfüllen, wurde ein neuer, natürlicher, fibrinolytisch wirksamer Stoff mit der Bezeichnung v-PA gefunden.

Die Erfindung betrifft den thrombolytischen Wirkstoff v-PA aus dem Speichel von Fledermäusen der Gattung Desmodus spec., der durch die folgenden charakteristischen Eigenschaften gekennzeichnet ist:

- Die Haupt-Protein-Bande des Wirkstoffs zeigt in der Sodiumdodecylsulfat polyacrylamid-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von 40 000±3000.
- Die Aktivität des Wirkstoffs eluiert von einer Gelfiltrationssäule (Superose 12) unter einem Molekulargewicht von 40 000±3000 (Abb. 3).
- Die isoeketrischen Punkte (pI) des Wirkstoffs liegen zwischen 6,8 und 8,5.
- Der Wirkstoff reagiert mit 3H-Diisopropylfluorophosphat und ist daher eine Serinprotease.
- Der Wirkstoff reagiert nicht mit einem polyvalenten Anti-t-PA-Antiserum und ist demzufolge immunologisch nicht identisch mit t-PA.
- Der Wirkstoff wird nicht durch den Plasminogenaktivator-Inhibitor 2 (PAI-2) gehemmt.
- Der Wirkstoff hydrolysiert die chromogenen Peptide H-D-Ile-Pro-Arg-pNA, H-D-Val-Leu-Lys-pNA und <Glu-Gly-Arg-pNA, jedoch nicht das chromogene Peptid H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.
- Der Wirkstoff bindet in einem pH-Bereich von 4-10.5 nicht an Lysin-Sepharose (Abb. 8).
- Der Wirkstoff erzeugt Lysehöfe auf Fibrinplatten, dagegen nicht auf Casein platten.
- Der Wirkstoff bindet bei pH 7.5 an Zn⁺⁺-Chelat-Sepharose (Abb. 1).
- Der Wirkstoff bindet bei pH 4.0 an Kationenaustauscher (MonoS; Abb. 2).
- Der Wirkstoff aktiviert Plasminogen nur in Gegenwart von Stimulatoren wie Fibrin, nicht aber in Gegenwart von Fibrinogen (Abb. 4).
- Der Wirkstoff lysiert konzentrationsabhängig humane Vollblut-Thromben in vitro (Abb. 5 und 6).
- In einem rekonstituierten, gerinnbaren in vitro System führt der Wirkstoff im Gegensatz zu t-PA zu keinem meßbaren Fibrinogenabbau (Tab. 1).
- In einem in-vitro-Fibrinolysetest (International Clot-Lysis-Assay) erzeugt der Wirkstoff ein konzentrationsabhängige Fibrinolyse (Abb. 7).

Der thrombolytische Wirkstoff v-PA stellt einen neuen, natürliche vorkommenden Plasminogenaktivator dar, der Blutgerinnsel im menschlichen Körper auflöst und somit zur Behandlung z. B. des Herzinfarktes geeignet ist.

Er findet sich im Speichel aller Species von Fledermäusen der Gattung Desmodus spec. in geringen Konzentrationen und wird wahrscheinlich von den Zellen der Speicheldrüsen dieser Tiergattung exprimiert. Die Fledermäuse der Gattung Desmodus spec. umfassen alle Fledermaus-Arten des amerikanischen Kontinents. Besonders gut wurde die Gattung Desmodus Mittelamerikas und Mexikos untersucht.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung des Thrombolytikums v-PA, wie es im Anspruch 2 beschrieben wird. Die genauen Verfahrensparameter sind im Beispiel 1 wiedergegeben.

Die Erfindung beinhaltet ferner Arzneimittel auf Basis der Verbindung v-PA sowie üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Die Überlegenheit des neuen Thrombolytikums v-PA gegenüber t-PA geht aus den nachfolgenden Beispielen 2, 3, 5 und 6 hervor.

Beispiel 1 Isolierung und Reinigung des Wirkstoffs v-PA

8 ml Speichel von Desmodus spec. werden bei 10 000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Der Überstand wird auf 10 mM Tris pH 7,5/100 mM NaCl/0,01% Pluronic F68 eingestellt und über eine entsprechende äquilibrierte Zn⁺⁺-Chelat-Sepharose- Chromatographiesäule (Bettvolumen 25 ml) gegeben. Die Säule wird anschließend mit 10 mM Tris pH 7,5/100 mM NaCl/0,01% Pluronic F68 gewaschen, bis die optische Dichte bei 280 nm die Grundlinie erreicht. Dann wird mit diesem Puffer, dem danach 150 mM EDTA zugesetzt werden, eluiert (Abb. 1).

Abb. 1

Chromatographie von Speichelüberstand über Zn⁺⁺chelat-Sepharose 6B. Flußrate: 25 ml/h, Gelbedvolumen: 25 ml, Fraktionsgröße: 1 ml, Messung der amidolytischen Aktivität: 10 µl/Fraktion, Messung der fibrinolytischen Aktivität: 2 µ/Fraktion. Beide Aktivitäten sind in willkürlichen Einheiten angege ben.

Die Aktivität des Wirkstoffs v-PA eluiert unter diesen Bedingungen quantitativ und kann in Fraktionen à 1 ml gesammelt werden. Der Anreicherungsfaktor beträgt 3,6. Die gepoolten Fraktionen werden gegen 50 mM Na-Acetat pH 4,0/0,01% Pluronic F68 dialysiert. Das Dialysat wird mit Hilfe einer FPLC-Anlage (Pharmacia) einer Kationenaustauschchromatographie (Mono S) unterzogen. Die Aktivität des Wirkstoffs v-PA eluiert im linearen Kochsalzgradienten bei etwa 0,4 M (Abb. 2).

Abb. 2

Chromatographie des Zn⁺⁺chelat-Sepharosepools über den Kationenaustauscher Mono S.
50 mM Na-acetat pH 4,0/0,01% Pluronic F68, Gradient: 0-1 M NaCl in Puffer, Flußrate: 1 ml/min, Gelbed: 0,5 cm ⌀×5 cm, Messung der amidolytischen Aktivität: 10 µl/Fraktion, Messung der fibrinolytischen Aktivität im Fibrinplattentest: 2 µl/Fraktion. Beide Aktivitäten sind in willkürlichen Einheiten angege ben.

Die gepoolten aktivitätshaltigen Fraktionen werden durch Lyophilisation auf 2 ml eingeengt. Dieses Volumen wird mit der FPLC-Anlage über Superose 12 gel filtriert. Die Aktivität des Wirkstoffs v-PA eluiert in Gegenwart von Molekular gewichtsmarkern mit einem apparenten Molekulargewicht von 40 000+3000 (Abb. 3).

Abb. 3

Gelfiltration des Pools aus der Kationenaustauschchromatographie (Mono S) über Superose 12 (FPLC).
Flußrate: 0,5 ml/min, Gelbed: 1,6 cm ⌀ × 50 cm, Fraktionsgröße 1 ml, Puffer: 50 mM Tris pH 8,0/160 mM NaCl, Messung der amidolytischen Aktivität: 20 µl/Fraktion, Aktivität in willkürlichen Einheiten angegeben, Messung der fibrinolytischen Aktivität im Fibrinplattentest mit internationalem t-PA Standard als Vergleich: 10 µl/Fraktion, Aktivität in IU/ml angegeben. In einem nachfolgenden Lauf werden Carboanhydrase (30 000) und Ovalbumin (43 000) als Molekulargewichts marker (siehe Pfeile) chromatographiert.

Konzentrate der angereicherten Aktivität werden einer SDS-Gelektrophorese in einem 8-25%igen Gradientengel unterzogen. Einige der Gele werden zur Darstellung der Proteine silbergefärbt, andere werden zur Entfernung des SDS in Triton X-100 (1%) gewaschen und auf ein plasminogenhaltiges Fibrin-Indikatorgel gelegt (Fibrin-Zymographie; Granelli-Piperno A. und Reich E., J. Exp. Med. 148 : 223-234, 1978).

Die Aktivität des Wirkstoffs v-PA, kenntlich durch einen Lysehof im Indikatorgel, korrespondiert mit einer Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht von 40 000±3000. Der Lysehof läßt sich ausschließlich auf plasminogenhaltigen Fibrin-Indikatorgelen nachweisen, nicht aber auf plasminogenfreien Fibrin-Indikatorgelen oder auf plasminogenhaltigen Casein-Indikatorgelen. t-PA, welches man einem identischen Prozeß unterzieht, erzeugt auch auf plasminogen haltigen Casein-Indikatorgelen Lysehöfe.

Die Aktivität des gereinigten Wirkstoffs v-PA ist also identisch mit einem Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 40 000±3000, welches Plasminogen in Gegenwart von Fibrin in Plasmin umwandelt, welches zur Auflösung des Faserstoffs Fibrin führt. Im Gegensatz zu t-PA, welches auch in Gegenwart von Casein Plasminogen aktivieren kann, ist v-PA nicht in der Lage, Plasminogen in Gegenwart von Casein in Plasmin umzuwandeln.

Die vorliegende Erfindung läßt sich weiterhin anhand der folgenden Beispiele charakterisieren:

Beispiel 2 Vergleich der Plasminogenaktivierung des nach Beispiel 1 gereinigten Wirkstoffs v-PA mit t-PA

Inkubiert man einen spezifischen Plasminogenaktivator (PA) mit genügend hoher Konzentration an Plasminogen (PLG) in einem Puffermilieu, z. B. 50 mM Tris pH 7,4, 20 mM NaCl bei 37°C, dann entsteht Plasmin nach folgendem Prinzip:

1. PA+PLG (±Stimulator) [PA/PLG (±Stimulator)] PA+Plasminogen (±Stimulator).

Das gebildete Plasmin läßt sich nachweisen mit einem für diese Protease weitgehend spezifischen chromogen Tripeptid H-D-Val-Leu-Lys-pNA. Diese Reaktion verläuft nach folgendem Prinzip:

2. Plasmin+H-D-Val-Leu-Lys-pNA [Plasmin/H-d-Val-Leu-Lys-pNA] Plasmin+pNA.

Die Entstehungsrate von pNA läßt sich photometrisch bei 405 nm bestimmen und ist der Konzentration des Enzyms Plasmin proportional. Koppelt man die beiden Prinzipien 1 und 2, läßt sich also auch die Entstehungsrate von Plasmin messen, was ein Ausdruck der Aktivität des Plasminogenaktivators ist. Abbildung 4 zeigt die Plasminentstehungsraten von t-PA und von v-PA in Abwesenheit und in Gegenwart der Stimulatoren Fibrinogen (dem Gerinnungssubstrat) und Fibrin (dem aufzulösenden Faserstoff in Blutgerinnseln).

Abb. 4

t-PA aktiviert demzufolge Plasminogen auch in Abwesenheit eines Stimulators und mit sehr hoher Aktivierungsrate auch in Anwesenheit von Fibrinogen. v-PA aktiviert Plasminogen im beschriebenen Testansatz ausschließlich in Anwesenheit des Faserstoffs Fibrin. (Der Test wird auf 96-Loch-Mikrotiter-Platten durchgeführt. Jedes Loch enthält ein Gesamtvolumen von 220 µl. Die Konzentration von Plasminogen beträgt 0,5 µM; von H-D-Val-Leu-Lys-pNA 0,68 mM; von t-PA 0,05 IU; die eingesetzte Aktivität von v-PA, ermittelt im International Clot-Lysis-Assay (Gaffney P. J., Curtis A. D. Thrombos. Haemostas. 53 : 134-136, 1985) ist 10mal höher, also etwa 0,5 U. die Konzentration der Stimulatoren beträgt etwa 20 µg/ Loch.)

Beispiel 3 Vergleich der thrombolytischen Wirkung von v-PA mit der von t-PA

Die thrombolytische Wirkung des neuen Wirkstoffs wird im Vergleich zu t-PA in einem neu entwickelten "Micro-clot-Lysis-Assay" (MCLA) untersucht. In die Löcher von Mikrotiterplatten werden je 100 µl frisches humanes Vollblut pipettiert, mit je 10 µl eines Gerinnung auslösenden Agens (Thromborel(R), Behring- Werke) versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die entstandenen Blutgerinnsel werden zweimal mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor sie mit 100 µl autologem Plasma, welches zuvor durch Zentrifugation gewonnen worden ist, versetzt werden. Das Plasma wird anschließend mit t-PA bzw. v-PA in Konzentrationen von 1,56-12,5 U/ml versetzt. Die so behandelten Mikrotiter- Platten werden 18 h bei 37°C in einer feuchten Kammer aufbewahrt. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Platten auf einem Schütteltisch (Red Rotor) ge schüttelt, bevor aus jedem Loch eine Plasmaprobe entnommen, 1 : 6 mit Aqua bi destillata verdünnt (führt zum Zerplatzen der durch die Lyse freigesetzten roten Blutzellen) und der freigesetzte rote Blutfarbstoff photometrisch bei 492 nm in einem Mikrotiter-Platten-Photometer bestimmt wird.

Abb. 5

Das Ergebnis des Versuchs ist der Abbildung 5 zu entnehmen: Im Vergleich zu einem Standard-t-PA lysieren equieffektive Konzentrationen des neuen Wirkstoffs (ermittelt im International Clot-Lysis-Assay) humane Vollblutthromben etwa 4fach besser als t-PA. Bereits etwa 3 U/ml des neuen Wirkstoffs zeigen im be schriebenen Versuchsmodell eine signifikante thrombolytische Wirkung, während 3 U t-PA keine von der Kontrolle abweichenden Resultate ergeben.

In einem ähnlichen Experiment wird die Zeitabhängigkeit der humanen Vollblut thrombolyse durch t-PA und durch v-PA untersucht.

Je 6,25 und 12,5 U t-PA und v-PA werden in dem beschriebenen Ansatz 23 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach 15 Stunden wird alle 2 Stunden eine Probe entnommen und wie beschrieben für den photometrischen Test vorbereitet. Das Ergebnis ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abb. 6

Der Eintritt der Thrombolyse, gemessen an der Freisetzung von roten Blutzellen aus dem Gerinnsel, ist unter Einsetzung des neuen Wirkstoffs deutlich schneller als unter t-PA. 6,25 U des neuen Wirkstoffs erzielen nach 23 Stunden eine stärkere Thrombolyse als die doppelte Aktivität von t-PA (12,5 U).

Beispiel 4 Serinproteasen reagieren spezifisch mit dem "active site titrant" Diisopropyl fluorophosphat (DIFP)

Der gereinigte Wirkstoff wird dazu auf pH 8,0 gepuffert und im Verhältnis 1 : 20 mit 3H-DIFP in Propylenglykol versetzt. Der Ansatz wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Aliquot des Ansatzes wird auf einem 12,5%igen SDS-Gel elektrophoresiert. Das Gel wird dann in Amplify(R) (Amersham) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend getrocknet. Dann wird das Gel für 4 Tage exponiert und anschließend der Röntgenfilm entwickelt. Serinproteasen, die das radioaktiv markierte DIFP inkorporiert haben, werden auf dem Film als geschwärzte Banden sichtbar. t-PA ergibt eine leicht geschwärzte Hauptbande mit dem apparenten Molekulargewicht von 68 000±5000, der neue Wirkstoff hat eine stark geschwärzte Hauptbande von 40 000±3000 MW. Ein unter gleichen elektrophoretischen Bedingungen erhaltenes Kontrollgel wird mit 1% Triton X-100 gewaschen und anschließend auf ein fibrin- und plasminogenhaltiges Indikatorgel gelegt. Die Position der Aktivität des elektrophoresierten Wirkstoffs ist kongruent mit der geschwärzten Bande der 3H-DIFP-markierten Serinprotease, die das aktive Prinzip des Wirkstoffs darstellt.

Beispiel 5

Wenn man t-PA in humanem Plasma bei 37°C inkubiert, nimmt die Konzentration von gerinnbarem Fibrinogen zeitabhängig ab. Dieses liegt in der relativen Fi brinspezifität von t-PA begründet und ist eine charakteristische Eigenschaft dieses Thrombolytikums. 3 mg gerinnbares humanes Fibrinogen werden in je 1 ml 50 mM Tris pH 7,4 40 mM NaCl gelöst und mit 1 µM humanem Plasminogen versetzt. Ein Teil des aliquotierten Ansatzes wird mit 3,1, 6,25 und 12,5 U t-PA bzw. mit den gleichen Aktivitäten von v-PA versetzt. Ein dritter Ansatz ohne Plasmino genaktivator dient als Kontrolle. Es werden jeweils 6 Ansätze pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Sofort nach Zugabe der Plasminogenaktivatoren werden aus allen Ansätzen je ein Aliquot entnommen und mit der Methode nach Clauss (Clauss V. A., Acta Haematol. 17 : 237-246, 1957) das gerinnbare Fibrinogen bestimmt. Ein Teil des Aliquots wird außerdem gelelektrophoretisch analysiert. Weitere Aliquotentnahmen aus den bei 37°C inkubierten Ansätzen werden nach 2, 4 und 6 Stunden durchgeführt. Die Resultate der Fibrinogenmessungen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Aufgeführt sind die Gerinnungszeiten nach Clauss in Sekunden. Bereits nach zweistündiger Inkubation kann in keinem t-PA-haltigen Ansätze gerinnbares Fibrinogen festgestellt werden, die Gerinnungszeiten lagen <300 s. Hingegen gibt es weder in den Kontrollansätzen noch in den Ansätzen, die mit dem neuen Wirkstoff versetzt sind. Zeichen eines Fibrinogenabbaus. Dieses Experiment ver deutlicht die wesentlich höhere, wenn nicht gar absolute Fibrinspezifität des neuen Wirkstoffs v-PA im Vergleich zu t-PA.

In der gelektrophoretischen Analyse der Aliquots läßt sich weiterhin nachweisen, daß das Fibrinogen in den Ansätzen mit dem neuen Wirkstoff auch nach 6stündiger Inkubation nicht vom Fibrinogen in den Kontrollansätzen unterscheidbar ist, wohingegen in den Ansätzen mit t-PA bereits nach 2 Stunden nur degradiertes Fibrinogen nachweisbar ist.

Beispiel 6 Einfluß von v-PA auf ein rekonstruiertes Clot-Lyse-System (International Clot- Lysis-Assay)

Gereinigtes humanes Fibrinogen wird in Gegenwart einer konstanten Menge humanem Plasminogen und verschiedenen Konzentrationen an Plasminogenaktivator mit Thrombin zur Gerinnung gebracht. In dem entstehenden Gerinnsel wird nun das Plasminogen durch die Plasminogenaktivatoren in Plasmin umgewandelt, welches wiederum den Faserstoff Fibrin im Gerinnsel auflöst. Gemessen wird die Zeit zwischen Zugabe des Thrombins und der vollständigen Auflösung des Gerinnsels und doppelt logarithmisch gegen die Plasminogenaktivatorkonzentration aufgetragen. 12,5-100 µl einer gepufferten Lösung des gereinigten Wirkstoffs werden nach oben angeführtem Prinzip getestet und gegen 12,5-100 IU t-PA verglichen.

Abb. 7

International Clot-Lysis-Assay

Der neue Wirkstoff ergibt im Vergleich zu t-PA eine parallele Konzentrations- Wirkungs-Kurve (Abb. 7). 100 µl einer Lösung des aufgereinigten Wirkstoffs enthalten entsprechend der Versuchsdaten etwa 40 U an t-PA-vergleichbarer Ak tivität.

Der Test im einzelnen:

Lyophilisiertes Test-Thrombin (Behring, Marburg) wird in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Dieses ergibt eine Aktivität von 30 IU/ml. Humanes Plasminogen (Kabi, München) wird in 2 mM HCl+50% Glycerin+5 g/l PEG 6000 gelöst. Dieses ergibt eine Aktivität von 10 IU/ml. Humanes Fibrinogen (Kabi, München) wird in einem Phosphatpuffer der folgenden Zusammensetzung auf eine Konzentration von 2 mg/ml gerinnbares Protein gebracht: 1,605 g/l KH₂PO₄; 8,58 g/l Na₂HPO₄ · 2 H₂O; 100 1/1 Tween 80; 500 mg/l HSA. Das Standard-t-PA wird auf eine Aktivität von 1000 IU/ml verdünnt.

20 µl Plasminogen+100 µl Thrombin werden in ein Teströhrchen pipettiert und bei 37°C inkubiert. 1 ml Fibrinogen und 12,5-100 µl Plasminogenaktivator werden gleichzeitig zugesetzt und die Stoppuhr gestartet. Nach 2 min wird eine Glaskugel (Durchmesser 6 mm) auf das Gerinnsel gelegt. Wenn die Glaskugel den Boden des Teströhrchens erreicht hat, wird die Uhr gestoppt und die Zeit re gistriert.

Abb. 8

Bindung von v-PA und t-PA an Lysinsepharose 4B.

Die Plasminaktivatoren wurden auf den entsprechenden pH gebracht und bei diesem Wert mit der Lysinsepharose behandelt. Die Lysinsepharose wurde intensiv gewaschen und in den vereinigten Überständen die Aktivität bestimmt. Elutionsversuche konnten mit den geringen Mengen an v-PA nicht durchgeführt werden.

Claims

1. Thrombolytikum v-PA mit einer in Gegenwart von Fibrin fibrinolytischen Wirksamkeit aus dem Speichel von Fledermäusen der Gattung Desmodus spec., gekennzeichnet durch

a) ein gelelektrophoretisch ermitteltes Molekulargewicht von 40 000±3000;
b) eine Elution der Aktivität des Wirkstoffes von einer Gelfiltrationssäule bei einem Molekulargewicht 40 000±3000;
c) isoelektrische Punkte (pI) zwischen 6,8 und 8,5;
d) Einbau von ³H-Diisopropylfluorophosphat (Serinprotease);
e) eine fehlende immunologische Identität mit t-PA;
f) eine fehlende Hemmung durch den Plasminogenaktivator-Inhibitor PAI-2;
g) seine Hydrolysefähigkeit der chromogenen Peptide H-D-Ile-Pro-Arg-pNA H-D-Val-Leu-Lys-pNA und Glu-Gly-Arg-pNA;
h) seine fehlende Hydrolysefähigkeit des chromogenen Peptids H-D-Phe-Pip- Arg-pNA;
i) seine fehlende Fähigkeit, Lysehöfe auf Caseinplatten zu erzeugen;
j) seine Bindungsfähigkeit bei pH 7,5 an Zn⁺⁺-Chelat-Sepharose;
k) seinen in einem rekonstituierten, gerinnbaren in-vitro-System in Gegensatz zu t-PA fehlenden Fibrinogenabbau.

2. Verfahren zur Isolierung des Thrombolytikums v-PA aus dem Speichel von Desmodus spec. gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den zentrifugierten Speichel in einem Puffer aufnimmt, über Zn⁺⁺-Chelat-Sepharosesäulen chromatographiert, nach Waschen der Säule den Wirkstoff v-PA quantitativ eluiert, die gesammelten Fraktionen dialysiert, das Dialysat einer Kationen austauschchromatographie unterzieht, durch Lyophilisation einengt und über Superose 12 gelfiltriert.

3. Arzneimittel auf Basis der Verbindungen gemäß Anspruch 1 mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.