DE112006003476T5 - Verfahren und Systeme zum Nachweisen und Quantifizieren indirekter Thrombininhibitoren - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins und/oder Quantifizieren mindestens eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, umfassend:
– Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und
– Messen mindestens eines Parameters, der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probenmischung anzeigt.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Systeme zum Nachweisen und/oder Quantifizieren indirekter Thrombininhibitoren, wie Heparin, in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, z. B. in einer Blut- oder Plasmaprobe. Die Verfahren und Systeme verwenden Prothrombinaktivatoren, welche die Herstellung von Thrombin verursachen, das gegenüber der Einwirkung durch derartige indirekte Thrombininhibitoren anfällig ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Prozess der Blutgerinnung beinhaltet eine komplexe Serie von Wechselwirkungen, die als Gerinnungskaskade bekannt ist, in der eine Abfolge proteolytischer Aktionen zur Gerinnung führt. Die Proteolyse wird durch Wirkungen, welche die Gerinnung inhibieren, im Gleichgewicht gehalten. Gerinnungsfaktoren, die der Proteolyse unterliegen, liegen generell anfänglich als inaktive Zymogene vor, welche sich nach der Proteolyse in aktive Proteasen verwandeln, die das nächste Zymogen in der Kaskade aktivieren. Aktivierte Gerinnungsfaktoren werden im Allgemeinen mit einem tiefgestellten "a" gekennzeichnet.
  • Von der Aktivierung der Gerinnung wird oft beschrieben, einem von zwei Wegen zu folgen: (a) dem extrinsischen Weg und (b) dem intrinsischen Weg. Diese zwei Wege laufen an einem Punkt unter Bildung eines gemeinsamen Wegs zusammen, der zur Gerinnselbildung führt. Im extrinsischen Weg setzt beschädigtes Gewebe Tissue-Faktor frei, der Faktor VII (FVII) zu seiner aktivierten Form FVIIa aktiviert. Tissue-Faktor und FVIIa bilden einen Komplex, der FX aktiviert, welcher den gemeinsamen Weg der extrinsischen und intrinsischen Wege initiiert. Der intrinsische Weg wird durch Kontaktaktivierung auf einer künstlichen Oberfläche initiiert, z. B., wenn Blut an Oberflächen ausgesetzt ist oder während extrakorporalem Blutkreislauf, wie etwa während einer Herzoperation oder Hämodialyse, oder wenn Biomaterialien, wie Katheter, in den Blutkreislauf eingesetzt werden. Im intrinsischen Weg wird FXII zu FXIIa aktiviert, der den Faktor FXI zu FXIa aktiviert, der seinerseits FIX zu FIXa aktiviert, was schließlich zum gemeinsamen Weg führt. Im gemeinsamen Weg wird Prothrombin durch aktivierten Faktor FXa gespalten, was schließlich zu aktivem Thrombin führt. Thrombin spaltet seinerseits Fibrinogen, was zu Fibrin führt, das unter Bildung eines Blutgerinnsels polymerisiert.
  • Die Gerinnung wird, wie oben erwähnt, durch eine Reihe inhibitorischer Wirkungen im Gleichgewicht gehalten. Zum Beispiel inaktiviert Antithrombin, in Verbindung mit Heparin-Cofactor II, Thrombin. Falls durch Thrombin zur Bildung seiner aktivierten Form, APC, aktiviert, wirkt Protein C in Verbindung mit einem Cofactor, Protein S, um die Faktoren FVIIIa und FVa zu inaktivieren. Tissue-Faktor-Pathway-Inhibitor (TFPI) inhibiert FXa und den Tissue-Faktor-FVIIa-Komplex in einer FXa-abhängigen Weise.
  • Zusammengefasst ist eine große Vielzahl an Faktoren im Blutstrom erforderlich, um eine ausgeglichene Gerinnung zu erzielen, die zu Gerinnselbildung zur rechten Zeit, Stelle und in der richtigen Menge führt. Bei bestimmten Leiden, wie z. B. Hämophilie oder Lupus, fehlen essentielle Faktoren oder es sind Antikoagulantien vorhanden, welche derartige essentiellen Faktoren inaktivieren. Einige Schlangen produzieren Gifte, die bestimmte Gerinnungsfaktoren simulieren können, was zur Gerinnung und Gerinnselbildung des Bluts ihrer Beute führt. Insbesondere simulieren einige Schlangengifte Faktor FXa und/oder Faktor FVa, wodurch Prothrombin aktiviert wird. Diese Schlangengifte können in In-vitro-Antigerinnungs-Assays verwendet werden.
  • Die Veröffentlichungen und anderen Materialien, einschließlich Patenten und Patentanmeldungen, die hier verwendet werden, um die Erfindung zu veranschaulichen und, insbesondere, zusätzliche Details bezüglich der Praxis anzugeben, sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
  • Es ist häufig notwendig, Blut mit Substanzen, die eine koagulierende Wirkung haben, z. B., wenn dem Blut bestimmte Faktoren fehlen, oder, noch häufiger, mit Substanzen, die eine antikoagulierende Wirkung haben, z. B., im Verlauf eines chirurgischen Eingriffs, zu behandeln. Als Folge zählen Blut-Antikoagulantien zu den meistverwendten Arzneistoffen in der modernen Medizin, wobei sie prophylaktisch als auch zur Behandlung von thromboembolischen Krankheiten verwendet werden. Eine langfristige Blut-Antikoagulation kann mit Vitamin-K-Antagonisten, wie Warfarin, und anderen von Cumarin abgeleiteten oralen Antikoagulantien erzielt werden. Diese Substanzen benötigen mehrere Tage, bis eine stabile Antikoagulation erreicht ist. Jedoch ist in vielen Situationen eine rasche Gerinnung erforderlich. In diesen Situationen wird häufig direkte oder indirekte Inhibition von aktivierten Gerinnungsfaktoren angewandt. Der meistverwendete Gerinnungsfaktorinhibitor ist Heparin, ein Gemisch aus polysulfatierten Glycoaminoglycanen, das die Bindung von Antithrombin an die Faktoren FXIIa, FXIa, FXa und Thrombin fördert und das im Wesentlichen unverzüglich wirkt.
  • Im Verlauf einer Anzahl von invasiven Prozeduren wird Blut mit Fremdoberflächen in Kontakt gebracht. Zum Beispiel wird, während eines kardiopulmonären Bypass (CPB) für eine Operation am offenen Herzen, das Blut des Patienten in einen extrakorporalen Kreislauf kanalisiert. Fremdoberflächen zeigen im Allgemeinen eine starke prokoagulierende Wirkung auf das zirkulierende Blut, wodurch die Bildung von Blutgerinnseln gefördert wird. Blutgerinnsel können Thrombose oder Embolie herbeiführen, was zu schweren Schäden im Patienten führt. Um die Blutgerinnselbildung auszugleichen, werden routinemäßig Antikoagulantien, insbesondere Heparin, ein indirekter Thrombininhibitor, verabreicht. Direkte Thrombininhibitoren, wie Hirudin, können ebenfalls verwendet werden.
  • Es ist wichtig, die Konzentration eines Antikoagulans im Blut eines Patienten sowie dessen Aktivität genau zu überwachen, da nicht nur seine Wirkung von Patient zu Patient abweicht, sondern weil es häufig während einer Operation metabolisiert wird.
  • Ein Verfahren, das auf die Bestimmung der Konzentration und Aktivität von direkten Thrombininhibitoren wie Hirudin abzielt, wird in der Internationalen Patentveröffentlichung WO00004662 beschrieben. In diesem Verfahren wird Schlangengift, wie Ecarin, zu einer Körperflüssigkeit gegeben und wandelt Prothrombin in atypische Intermediate, wie Meizothrombin, um. Diese Intermediate werden selektiv durch direkte Thrombininhibitoren inaktiviert. Bestimmte chromogene oder fluorogene Substanzen, die bekanntermaßen durch Thrombin gespalten werden, werden ebenfalls durch diese atypischen Intermediate gespalten. Die Konzentration sowie die Aktivität des direkten Thrombininhibitors kann durch Verfolgen der Reduktion von Lichtabsorption oder -emission, die aus der Spaltung der chromogenen oder fluorogenen Substanzen resultiert, bestimmt werden.
  • Der indirekte Thrombininhibitor Heparin bindet an den endogenen Gerinnungsinhibitor Antithrombin und verstärkt die Fähigkeit von Antithrombin signifikant, aktivierte Gerinnungsfaktoren zu binden und zu inaktivieren. Die biologische Wirkung von Heparin wird angenommenermaßen hauptsächlich durch die Inhibition von Thrombin vermittelt.
  • Heparin wird während einer Operation metabolisiert und der Antikoagulationseffekt von Heparin variiert von Patient zu Patient. Um einen geeigneten Pegel an Antikoagulation während, z. B., CPB-Operation, aufrecht zu erhalten, wird daher Heparin im Allgemeinen sowohl vor als auch während der Operation in Mengen verabreicht, die für den speziellen Patient angepasst sind. Am Ende des invasiven Vorgehens hört das Ausgesetztsein an die Fremdoberfläche und somit das Erfordernis für Antikoagulation auf. Daher werden Mittel wie Protamin verabreicht, welche die Aktivität von Heparin durch Bilden eines Komplexes damit blockieren.
  • Eine Anzahl von Assays ist derzeit verfügbar, um die Heparinaktivität zu quantifizieren. Die Populäreren schließen den sogenannten "aktivierte partielle Thromboplasmin-Zeit"(aPTT)-Assay und die "aktivierte Gerinnungszeit" (ACT) ein. Der aPTT-Assay ist in der Lage, Heparinkonzentrationen bis zu 0,75 U Heparin/ml zu quantifizieren. Nur ACT ist in der Lage, hohe Spiegel von Antikoagulantien/Antikoagulation zu quantifizieren.
  • Der ACT-Assay ( U.S.-Patent 3 492 096 ) beinhaltet das Zusetzen z. B. einer Patienten-Blutprobe zu einer definierten Menge von Aktivatoren der Gerinnung, welche eine Fremdoberfläche simulieren, wie Celite (Diatomeen-Erde), Kaolin oder Glasteilchen. Diese aktivieren den intrinsischen Weg der Gerinnung, der, nach Durchlaufen der Gerinnungskaskade, das Blut gerinnen lässt (1). Eine Messung des Zeitintervalls zwischen dem Zugeben eines Aktivators zu einer Blutprobe und dem Nachweis der Gerinnung wird erfasst. Diese Messung stellt die ACT dar. Das Verfahren ist durch ein hohes Ausmaß an Automatisierung vereinfacht worden. Die ACT beträgt in Abwesenheit von Heparin typischerweise etwa 120 Sekunden. Eine ACT von mehr als 480 Sekunden, und die jeweilige Heparinkonzentration, wird von vielen Klinikern als die minimale ACT/Heparinkonzentration angesehen, die z. B. für CPB-Chirurgie erforderlich ist. Der ACT-Test zielt auf die Bestimmung, ob angemessene Mengen an Heparin verabreicht worden sind, um die Bildung von Blutgerinnseln während einer chirurgischen Prozedur zu vermeiden. Der Hauptvorteil des ACT-Tests gegenüber anderen verfügbaren Gerinnungstests besteht darin, dass er Heparin bei relativ hohen Konzentrationen quantifizieren kann. Jedoch gibt es gegenwärtig eine Reihe von Beschränkungen für den ACT-Test, wie eine schlechte Korrelation der ACT mit der Heparinkonzentration in der Probe (Leyvi et al., An investigation of a new activated clotting time "MAX-ACT" in patients undergoing extracorporeal circulation, Anesth Anaig 92(3):578-83 (2001)), beschränkte Standardisierung (Murray et al., Heparin detection by the activated coagulation time: a comparison of the sensitivity of coagulation tests and heparin assays, J Cardiothorac Vasc Anesth 11: 24–8 (1997)) und Verfälschung von Messungen wegen des Vorhandenseins von Arzneistoffen, wie Aprotinin, und/oder wegen Hämodilution (d. h., Verdünnung der Blutprobe). Darüber hinaus ist die Anpassung des ACT-Tests für die Verwendung mit Testpatronen, wie solchen, die in den U.S.-Patenten 4 756 884 ; 5 110 727 und 6 060 323 beschrieben sind, auf Grund der mangelnden Anpassbarkeit des Verfahrens an kleinere Probevolumina problematisch gewesen.
  • Obgleich in den letzten Jahren ein gewisser Fortschritt zur Überwindung einiger der Beschränkungen der herkömmlichen ACT ( U.S.-Patent 6 417 004 ; Leyvi et al, 2001; U.S.-Patentanmeldungs-Veröffentlichung 20020127730) erfolgt ist, bleibt ein Bedarf nach alternativen Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren und Überwachen der Aktivität indirekter Thrombininhibitoren, wie Heparin, in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, bestehen. Insbesondere besteht ein Bedarf nach Verfahren und/oder Systemen, welche hohe Mengen indirekter Thrombininhibitoren nachweisen und/oder quantifizieren können, z. B. so hoch wie etwa 10 U/ml unfraktioniertes Heparin, wie sie häufig in der klinischen Praxis benötigt werden. Im Genaueren besteht ein Bedarf nach einem Verfahren und/oder System, das derartige hohen Mengen an indirekten Thrombininhibitoren aber auch geringe Mengen an indirektem Thrombininhibitor, wie etwa 0,75 U/ml unfraktioniertes Heparin, nachweisen und/oder quantifizieren kann. Das letztere Verfahren wird insbesondere in der klinischen Praxis benötigt, wo es im Allgemeinen notwendig ist, den indirekten Thrombininhibitor nach seiner Verabreichung, wenn im Allgemeinen hohe Mengen nachgewiesen/quantifiziert werden müssen, als auch nach der Aufhebung seiner Wirkung, wenn sehr niedrige Restmengen nachgewiesen/quantifiziert werden müssen, zu quantifizieren. Verglichen mit der Anwendung zwei verschiedener Verfahren/Systeme für die hohen und geringen Messungen, kann ein derartiges Doppelfunktions-Verfahren/System den Zeitaufwand verringern und Folgeanalyse-Kosten reduzieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins und/oder Quantifizieren mindestens eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält.
  • Das Verfahren umfasst
    • – Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und
    • – Messung mindestens eines Parameters, der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probenmischung anzeigt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein System zum Nachweisen des Vorhandenseins oder Quantifizieren mindestens eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält. Das System umfasst
    • (a) ein Aufnahmebehältnis oder Material zum Aufnehmen, Absorbieren oder Adsorbieren: (1) der Probe, und (2) mindestens eines Prothrombinaktivators zum Prozessieren von Prothrombin in der Probe zu Thrombin, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und
    • (b) mindestens einen Detektor zum direkten oder indirekten Nachweisen eines Vorliegens oder einer Menge des gebildeten Thrombins, wobei eine vom Detektor bereitgestellte Ablesung mit dem Vorhandensein oder der Menge des mindestens einen indirekten Thrombininhibitors in der Probe korrelierbar ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung einer Antagonisierung eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält. Dieses Verfahren umfasst
    • – Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist;
    • – Zugeben mindestens eines Antagonisten des indirekten Thrombininhibitors; und
    • – Messen mindestens eines Parameters, der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probenmischung anzeigt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Teile der Gerinnungskaskade, die im ACT-Assay durchlaufen werden, bevor bei Thrombin, dem Ziel eines indirekten Thrombininhibitors, angelangt wird.
  • 2 stellt die direkte Prothrombinaktivierung gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 3 zeigt den Nachweis mittlerer Mengen an Heparin unter Verwendung von Textarin.
  • 4 zeigt den Nachweis höherer Mengen an Heparin unter Verwendung von Noscarin in Kombination mit dem Faktor V-Aktivator RVV-V (Russell Viper Venom- Faktor V).
  • 5 zeigt den Nachweis hoher und niedriger Dosierungen von Heparin unter Verwendung verschiedener Kombinationen der Prothrombinaktivatoren Textarin und Noscarin.
  • 6 gibt die Genauigkeit der wiederholten Messung von Heparinkonzentrationen unter Anwendung des beschriebenen Verfahrens an (20 Bestimmungen unter Anwendung einer Plasmaprobe, die mit zunehmenden Heparinkonzentrationen versetzt war).
  • 7 zeigt den Effekt zunehmender Mengen von Protamin. Die Ergebnisse von 6 Proben aus Patienten, welche einer Operation am offenen Herzen unterzogen werden, sind dargestellt. Die benötigte Menge an Protamin konnte innerhalb von 3 Minuten quantifiziert werden.
  • 8 zeigt den Nachweis von Heparin unter Verwendung einer Lösung, die reich an Tissue-Faktor ist, wie z. B. angewandt für die Bestimmung der Prothrombin-Zeit (Rauten), oder einer Kontaktaktivator-Lösung, wie z. B. angewandt für die Bestimmung der aPTT (Kreise), als Auslöser für die Gerinnung. Wie gezeigt, führt die Zugabe steigender Mengen an Heparin zu der Probe zu einem exponentiellen Anstieg der Gerinnungszeiten, was die Menge an Heparin beschränkt, die durch dieses Verfahren quantifiziert werden kann.
  • 9 zeigt den Nachweis verschiedener Konzentrationen von unfraktioniertem Heparin (UFH) in Vollblut unter Verwendung eines einzelnen Reagens (Experiment 6) mit einem ROTEM-System.
  • 10 zeigt die Einheitlichkeit von Ergebnissen, die mit einem Noscarin 80 U/ml + Textarin 480 U/ml + RW-V 240 U/ml + CaCl2 0,06 mmol/ml in HEPES 50 mM, 0,5% BSA, pH 7,4 umfassenden Reagens erhalten werden, das frisch zubereitet (t = 0), 1,5 Stunden alt (t = 1,5) oder 3,5 Stunden alt (t = 3,5) war.
  • Ausführliche Beschreibung verschiedener und bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
  • Definitionen
  • Ein "indirekter Thrombininhibitor," gemäß der vorliegenden Erfindung, assoziiert sich vorübergehend oder permanent, zum Beispiel durch Bindung, mit einer Substanz, die direkt mit Thrombin interagiert, und übt eine thrombininhibierende Aktivität durch diese Assoziation aus. Im Allgemeinen enthält ein indirekter Thrombininhibitor mindestens eine Domäne, die eine derartige vorübergehende oder permanente Assoziation mit der Substanz, die direkt mit Thrombin interagiert, erlaubt. Ein indirekter Thrombininhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung kann insbesondere die Aktivität eines Inhibitors von Thrombin aktivieren oder steigern, der direkt mit Thrombin interagiert, oder kann die Aktivität eines Aktivators von Thrombin deaktivieren oder unterdrücken, der direkt mit Thrombin interagiert. Zum Beispiel übt der indirekte Thrombininhibitor Heparin seine inhibitorische Aktivität auf Thrombin vorwiegend durch Steigern der Aktivität des endogenen Gerinnungsinhibitors Antithrombin aus.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine Substanz, z. B., ein Prothrombinaktivator, aus einer Zusammensetzung, z. B. Schlangengift, "abgeleitet", wenn die Substanz aus der Zusammensetzung stammt.
  • Eine Messung oder Quantifizierung ist gemäß der vorliegenden Erfindung von z. B. einem Arzneistoff "im Wesentlichen unbeeinflusst", wenn die Messung oder Quantifizierung in der medizinischen Praxis trotz des Vorliegens des Arzneistoffs angewandt werden kann, und zwar ohne Einbringen eines korrigierenden Faktors.
  • Ein Reagens, Gemisch oder eine andere Zusammensetzung ist, gemäß der vorliegenden Erfindung, "im Wesentlichen frei" von einer Substanz, wenn jedwede Menge der Substanz, die vorhanden ist, eine physikalische Eigenschaft, wie die Stabilität, des Reagens, Gemischs oder anderen Zusammensetzung nicht negativ beeinflusst.
  • "Thrombinaktivierung" beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung die Zeit, zu der Thrombin effektiv wird und seine Wirkung zeigt.
  • "Thrombinaktivität" wird im Kontext der vorliegenden Erfindung als ein Begriff verwendet, der die Effekte von Thrombin in quantitativer Weise beschreibt.
  • Das "Heparin" und "Heparinderivate" gemäß der vorliegenden Erfindung können von beliebiger Herkunft sein. Zum Beispiel können sie aus einer natürlichen Quelle isoliert sein oder sie können durch verschiedene Verfahren synthetisiert werden. "Heparin" schließt in einer stärker technischen Bedeutung zum Beispiel UFH (unfraktioniertes Heparin) ein, das z. B. unter den Handelsbezeichnungen LIQUEMIN, THROMBOPHOB, CALCIPARIN und HEPARIN erhältlich ist, und welche einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden. Allerdings wird der Begriff "Heparin", wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, hierein nachstehend zumeist eher gattungsspezifisch benutzt, um auf jedwedes "Heparin" oder "Heparinderivat" Bezug zu nehmen, dass im beschriebenen Kontext verwendet werden kann.
  • "Heparinderivate" gemäß der vorliegenden Erfindung schließen jede Substanz ein, die mindestens das Heparinpentasaccharid umfasst, in der Lage ist, die Aktivität von Antithrombin durch Assoziation mit diesem zu erhöhen, und die nicht dem UFH, wie oben definiert, entspricht. Diese Substanzen schließen vorzugsweise mindestens 15 Oligosaccharide und weiter bevorzugt mindestens 18 Oligosaccharide ein (siehe „The New Heparins", The Ochsner Journal: Band 4, Nr. 1, S. 41-47 (2002)). "Heparinderivative" umfassen z. B. fraktioniertes Heparin (FH) und Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH), wie Certoparin, Dalteparin, Enoxparin, Nadroparin, Reviparin, Tinzaparin, die auch unter den Handelsbezeichnungen MONO-EMBOLEX, FRAGMIN, CLEXANE, FRAXIPARIN, CLIVARIN und INNOHEP erhältlich sind, sowie Dermatansulfat und andere Substanzen, welche, wahlfrei sulfatiertes, L-Iduronat und GalNAc-4-Sulfat als wiederkehrende Disaccharideinheiten umfassen und in der Lage sind, die Aktivität von Antithrombin durch Assoziation mit diesem zu erhöhen. "Heparinpentasaccharid" bezieht sich auf eine Struktureinheit von Heparin mit drei D-Glucosamin- und zwei Uronsäureresten. Der zentrale D-Glucosaminrest enthält eine einmalige 3-O-Sulfateinheit:
    Figure 00120001
    (Siehe auch U.S.-Patentveröffentlichungen 2002/01069143 und 2004/0038932 ).
  • Ebenfalls in dieser Definition eingeschlossen sind die sogenannten Heparinoide. Der Begriff Heparinoid beschreibt eine Gruppe von Substanzen mit einem Heparin-ähnlichen Effekt. Diese schließen, zum Beispiel, sulfatierte pflanzliche Oligo- und Polysaccharide, z. B. Polysulfat, hergestellt aus Alginsäure, Pektine, Xylane, Stärken und Dextrane, oder sulfatierte tierische Glycosaminoglycane ein. Besondere Erwähnung sollten Pentosanpolysulfate, z. B. Natriumpentosansulfonat, Xylansulfat, z. B. beta-1,4-D-Xylan-2,3-bis(hydrogensulfat), Xylanpoly(hydrogensulfat) und Natriumsalze davon, wie Dextransulfate, Chitinsulfate, Chondroitinpolysulfate, sowie die sogenannten Mucopolysaccharidpolysulfate, Polyvinylsulfonsäuren, auch bezeichnet als Polyethylensulfonsäuren, z. B. Natriumapolat, Polygalacturonsäuresulfat (Methylestermethylglucosid), Alginatsulfate, z. B. Natriumalginatsulfat und Polymannuronsäuresulfat (z. B. Danaparoid-Natrium, das unter der Handelsbezeichnung ORAGAN erhältlich ist; siehe auch U.S.-Patentanmeldung 2003/0161884), finden.
  • Ein "Prothrombinaktivator" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Prothrombinaktivator, der direkt auf Prothrombin wirkt. Prothrombinaktivatoren umfassen Substanzen, welche z. B. Cofaktoren oder andere Substanzen benötigen, die nicht Teil der Gerinnungskaskade sind, sowie Substanzen, die z. B. in ihrer Aktivität durch andere Substanzen gesteigert werden, einschließlich bestimmten Gerinnungsfaktoren. Der Begriff schließt jede Substanz ein, die direkt auf Prothrombin einwirkt und Prothrombin in eine Form von Thrombin umwandelt, die gegenüber Inhibition durch einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist. Bei einem Prothrombinaktivator kann es sich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, um aus Schlangengift abgeleitete Substanzen, wie Textarin, Oscutarin, Noscarin, Pseutarin, Trocarin, Notecarin oder Hopsarin, handeln. Viele Schlangengifte sind Gruppe C- und D-Prothrombinaktivatoren und zeigen Sequenzhomologien zu Säuger-FXa. Folglich kann ein Prothrombinaktivator ein "Derivat von FXa" sein. Dies schließt humanes oder nicht-humanes tierisches FXa wie auch synthetisches FXa, welche gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren mutiert wurden, um zum Beispiel einzelne Aminosäuren auszutauschen, zu deletieren etc., aber im Wesentlichen ihre Funktionalität beibehalten, sowie funktionelle Teile von natürlich vorkommenden oder synthetischen FXa's, welche gegebenenfalls mutiert sind und die Funktionalität von FXa beibehalten, ein. Mutierte FXa's können zum Beispiel Sequenzidentitäten von etwa 90%, 95%, 98% oder 99% mit derartigen humanen, nicht-humanen tierischen, synthetischen FXa's oder Fragmenten davon aufweisen. Unter Swiss Prot No. P00742 ist die Sequenz der unprozessierten 488 Aminosäuren großen Sequenz des humanen Gerinnungsfaktor X-Vorläufers offenbart (siehe auch, z. B., Leytus, S. et al. "Gene for Human Factor X: A Blood Coagulation Factor Whose Gene Organization is Essentially Identical with that of Factor IX and Protein C." Biochem., 1986, S. 5098–5102, Bd. 25; oder z. B. U.S.-Patent 6 905 846 , insbesondere 1).
  • Der Begriff "Protamin" definiert eine Gruppe einfacher, in Fischsperma vorgefundener, Proteine, die stark basisch sind, in Wasser löslich sind, und nicht durch Wärme koaguliert werden, und nach Hydrolyse hauptsächlich Arginin ergeben. Protamine sind fähig zum Inaktivieren indirekter Prothrombinaktivatoren, insbesondere durch Bindung an diese. Der Begriff "Protaminderivate" schließt Substanzen, wie Protaminsulfat und andere Protaminsalze, wie Protaminchlorid und Protaminhydrochlorid, ein, welche an Heparin und andere Glycosaminoglycane binden und sie inaktivieren.
  • Ein "Antagonist" gemäß der vorliegenden Erfindung ist jedes Molekül oder jede Substanz, welche(s) den Effekten eines indirekten Thrombininhibitors entgegenwirken kann. Ein derartiger Antagonist könnte seine Wirkung direkt, zum Beispiel durch Neutralisieren des indirekten Thrombininhibitors mittels Komplexbildung ausüben, aber könnte seine Wirkung auch indirekt ausüben. Diese Antagonisten sind häufig argininreiche Verbindungen oder Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, die einen Protamin-ähnlichen Effekt auf indirekte Prothrombinaktivatoren aufzeigen.
  • Ein indirekter Thrombininhibitor wird "effektiv" antagonisiert, wenn den antikoaguliernden Effekten des indirekten Thrombininhibitors zu einem Grad entgegengewirkt wird, der in der klinischen Praxis als ausreichend angesehen wird, um für einen Patient sicher zu sein, dem der Thrombininhibitor verabreicht wurde, d. h. ausreichend, um zu gewährleisten, dass der Patient nicht der Gefahr einer Blutung ausgesetzt wird, welche aus der Verabreichung des indirekten Thrombininhibitors resultiert.
  • Die vorliegende Erfindung sieht Verfahren und Systeme zum Nachweisen und Quantifizieren indirekter Thrombininhibitoren vor. Indirekte Thrombininhibitoren inhibieren die Gerinnungskaskade auf der Ebene von Thrombin, wodurch die Gerinnung des Bluts gestört wird. Um das Vorhandensein und/oder die Menge eines indirekten Thrombininhibitors in, z. B., einer Blutprobe zu bestimmen, wird die Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probe unter Verwendung eines geeigneten Parameters gemessen. Zu diesem Zweck wird die Gerinnungskaskade künstlich ausgelöst. Die vorliegende Erfindung sieht die Auslösung der Gerinnungskaskade an einer späten Stufe, vorzugsweise auf der Prothrombin-Stufe der Kaskade, vor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Prothrombinaktivator, vorzugsweise ein Reagens, das einen derartigen Prothrombinaktivator enthält, zu einer Probe gegeben und verursacht, dass das Prothrombin in der Probe zu Thrombin prozessiert wird. In dieser Ausführungsform könnte zusätzliches Prothrombin zugegeben werden, um zu vermeiden, dass das der Probe innewohnende Prothrombin reaktionslimitierend ist. Solches zusätzliches Prothrombin könnte als Teil eines zusätzlichen Reagens bereitgestellt werden und wird vorzugsweise mit entweder dem Prothrombinaktivator enthaltenden Reagens oder mit der Probe zur oder ungefähr zur Zeit, an der die beiden letzteren vereinigt werden, oder kurz nachdem eine Mischung der beiden hergestellt wurde, vermischt. Die Inhibition des gebildeten Thrombins durch irgendeinen indirekten Thrombininhibitor in der Probe wird dann durch Messen der Parameter, die Thrombinaktivität und/oder -aktivierung anzeigen, untersucht. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, lösen viele Nachweis- und Quantifizierungsverfahren für direkte als auch indirekte Thrombininhibitoren, wie das ACT-Assay (1), die Gerinnungskaskade an einer frühen Stufe aus. Dies macht diese Verfahren anfällig gegenüber Substanzen, die viele Faktoren und Schritte in der Gerinnungskaskade zwischen dem Punkt, an dem die Gerinnungskaskade ausgelöst wird, und Thrombin, stören. Durch Auslösen der Gerinnungskaskade an einer späteren Stufe werden Fehler, die aus diesen Störungen folgen, verringert, wenn nicht eliminiert. Insbesondere können Wechselwirkungen mit Faktoren wie FVIII, FV oder FXII und/oder anderen Schritten in der Gerinnungskaskade, welche Prothrombin vorausgehen, vollständig oder im Wesentlichen vermieden werden. Zum Beispiel stören Kallikreininhibitoren, die häufig während Prozeduren, wie der Operation am offenen Herzen, verwendet werden, Schritte in der Gerinnungskaskade, welche Prothrombin vorausgehen. Aprotinin stört zum Beispiel die Aktivierung von FXII. Wenn ein Verfahren, wie das ACT-Assay, angewandt wird, kann diese Wechselwirkung zu fehlerhaften Ablesungen führen. Außerdem führen bestimmte Bedingungen oder Arzneistoffe zu einer Knappheit oder einem Überschuss an Gerinnungsfaktor(en), welche Prothrombin in der Gerinnungskaskade, die zu Faktor Xa führt, vorausgehen. Dies kann erneut, in dem ACT- und anderen Assays, welche auf dem Auslösen der Gerinnungskaskade an einer frühen Stufe beruhen, zu fehlerhaften Ablesungen führen. Zum Beispiel entwickeln manche Patienten in Antwort auf Entzündung eine sogenannte "Akute-Phase-Reaktion", die zu hohen Spiegeln des Gerinnungsfaktors VIII (FVIII) in der Probe führt. Der Überschuss von FVIII führt, wenn ACT angewandt wird, um die vorhandene Menge an Heparin zu bestimmen, zu kurzen Grundlinien-ACT-Werten, da hohe Spiegel an Faktor VIII das Zeitintervall von der Aktivierung der ACT durch die Kontaktphase bis zum Nachweisen der Gerinnung durch die Thrombinaktivität verkürzen. Dies kann seinerseits zu einer Unterschätzung der in der Probe vorhandenen Menge an Heparin führen, weil in einem solchen Fall eine kurze Gerinnungszeit nicht eine geringe Heparinaktivität reflektiert, sondern eher einen hohen Spiegel an FVIII in der Probe. Ein derartiger Überschuss an FVIII beeinflusst allerdings in vielen Ausführungsformen nicht die Systeme und Verfahren der vorliegenden Erfindung, da die Gerinnungskaskade weiter stromabwärts ausgelöst wird. Daher bleiben die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung, in vielen Ausführungsformen, von diesen Knappheiten und/oder Überschüssen im Wesentlichen unbeeinflusst.
  • Die Aktivität des Prothrombinaktivators der vorliegenden Erfindung prozessiert Prothrombin zu Thrombin, das gegen indirekte Thrombininhibitoren anfällig ist. Die Inhibition des so hergestellten Thrombins kann überwacht werden, und sein Vorhandensein und/oder seine Menge können untersucht werden (2).
  • In bestimmten Ausführungsformen ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Quantifizierung einer niedrigen und/oder hohen Konzentration an indirekten Thrombininhibitoren. Wie nachstehend gezeigt wird, kann ein Prothrombininhibitor so ausgewählt werden, dass der indirekte Thrombininhibitor bei niedrigen Dosen oder hohen Dosen nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel zeigt die 3 eine Prothrombinaktivierung mit einem Prothrombinaktivator, wie Textarin. Dieser Gestaltungsaufbau bzw. dieses Set-up ermöglicht den Nachweis mittlerer Mengen an Heparin (siehe Beispiel 1). 4 zeigt, dass mit bestimmten Prothrombinaktivatoren, wie Noscarin, die Quantifizierung von ziemlich hohen Konzentrationen an Heparin möglich ist. Allerdings kann hier die Empfindlichkeit bezüglich niedrigerer Konzentrationen an Heparin reduziert sein.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann der Prothrombininhibitor so ausgewählt sein, dass sowohl niedrige als auch hohe Konzentrationen an indirektem Prothrombininhibitor nachgewiesen und/oder quantifiziert werden können. Vorzugsweise wird eine Kombination von Prothrombininhibitoren ausgewählt, um dieses Ziel zu erreichen. 5 zeigt die mit einer Kombination von Noscarin und Textarin erhaltenen Ergebnisse. Wie aus dieser Figur ersehen werden kann, bestimmen die verwendeten Konzentrationen an Noscarin und Textarin die Gestalt der Dosis-Antwort-Kurve, welche demgemäß angepasst werden kann. Zum Beispiel führt eine höhere Konzentration an Noscarin zu einer flacheren Dosis-Antwort-Kurve bei hohen Heparinkonzentrationen und vergrößert daher den Messbereich des Assays. Verschiedene Kombinationen von zwei oder mehr Prothrombinaktivatoren, wie Textarin und Noscarin, bei unterschiedlichen Konzentrationen können daher verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung zu erhöhen und die für den Test benötigte Zeit einzustellen.
  • Wie z. B. aus 5 ersichtlich ist, kann die Dosis-Antwort-Kurve der Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung nicht-linear sein: Zuerst kann es einen steilen Anstieg der Gerinnungszeit bei niedrigen Heparinkonzentrationen geben, der zu einem flacheren Teil der Kurve führt. Somit werden bereits kleine Mengen an Heparin wegen des steilen Anstiegs der Gerinnungszeit bei niedrigen Konzentrationen zuverlässig erfasst. Dies ermöglicht eine sehr niedrige Untergrenze der Quantifizierung, z. B., im Bereich von 0,2 U unfraktioniertem Heparin/ml, was zum Beispiel viel niedriger ist als die Untergrenze der Quantifizierung, die mit Verfahren, wie der ACT-Methode möglich ist, die lediglich gegenüber höheren Heparinkonzentrationen als 0,5 U/ml empfindlich ist. Andererseits beschränken die flacheren verlängerten Gerinnungszeiten bei höheren Heparinkonzentrationen (weniger steile Dosis-Antwort-Kurve) die Zeit, welche für die Bestimmung von hohen Heparinkonzentrationen erforderlich ist. Wenn die Dosis-Antwort-Kurve im gesamten Heparin-Konzentrationsbereich linear wäre, wären entweder sehr lange Gerinnungszeiten erforderlich, um hohe Heparindosierungen nachzuweisen, oder es würde sich eine geringe Empfindlichkeit im niedrigen Heparin-Konzentrationsbereich ergeben. Unter der Annahme, dass ein Testverfahren/System eine lineare Dosis-Antwort-Kurve aufweist und dass eine Verlängerung der Gerinnungszeit um mindestens 20 Sekunden erfordert wird, um Heparinaktivität zuverlässig nachzuweisen (auf Grund einer bestimmten Variation in den Gerinnungszeiten von Subjekten ohne Heparin-Behandlung), dann werden zum Beispiel Verfahren/Systeme mit einer steilen Dosis-Antwort-Kurve einen niedrigen Spiegel an Antikoagulans ausreichend sein lassen, um die Gerinnungszeit um 20 Sekunden zu verlängern. Allerdings wird eine sehr steile Dosis-Antwort-Beziehung zwischen dem Antikoagulans und der Gerinnungszeit, d. h. eine sehr steile Dosis-Antwort-Kurve, ebenfalls zu sehr langen Gerinnungszeiten bei höheren Antikoagulans-Konzentrationen führen. Wenn 0,1 U Heparin die Gerinnungszeit um 10 Sekunden verlängert, dann werden zum Beispiel 10 U Heparin die Gerinnungszeit um 1000 Sekunden verlängern. Falls jedoch 0,1 U Heparin die Gerinnungszeit nur um 2 Sekunden verlängert, dann werden 10 U Heparin die Gerinnungszeit nur um 200 Sekunden verlängern, aber 1 U Heparin wird erforderlich sein, um die Antikoagulans-Aktivität nachzuweisen. Die Verfahren und Systeme gemäß der vorliegenden Erfindung, welche eine steile Dosis-Antwort-Kurve bei niedrigen Dosierungen des Antikoagulans und eine weniger steile Dosis-Antwort-Kurve bei hohen Dosierungen an Antikoagulans vorsehen, erlauben die Quantifizierung sowohl hoher als auch niedriger Dosierungen von Antikoagulans bei vergleichsweise kurzen Nachweiszeiten.
  • Vor einer Operation, in der ein indirekter Thrombininhibitor zum Vermeiden der Gerinnung des Bluts des Patienten verwendet werden soll, kann es erwünscht sein, die Empfindlichkeit des Gerinnungssytems des Patienten gegenüber der Wirkung des indirekten Thrombininhibitors zu testen. Folglich werden, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, zunehmende Mengen an Heparin zu einer Patienten-Blutprobe zugegeben, um die Empfindlichkeit des Gerinnungssytems des Patienten gegenüber Heparin vorherzusagen und somit die Möglichkeit zu gewähren, eine geeignete Dosierung des indirekten Thrombininhibitors zu wählen.
  • In ähnlicher Weise ist es, am Ende einer Prozedur, die einen indirekten Thrombininhibitor erforderte, im Allgemeinen wünschenswert, den Effekt des indirekten Thrombininhibitor aufzuheben. Somit wird in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Analyse durchgeführt, in der zunehmende Mengen an Antagonisten von indirekten Thrombininhibitoren, wie Protamin, zugegeben werden, um die Menge an Antagonist zu quantifizieren, die erforderlich ist, um die Wirkung des indirekten Thrombininhibitors in der Probe aufzuheben oder praktisch aufzuheben. In 7 sind die Ergebnisse der Analyse von 6 Proben von UFH-behandelten Patienten, welche einer Operation am offenen Herzen unterzogen werden, gezeigt, wobei unter Zugabe steigender Protamin-Mengen getestet wurde. Abhängig von der in der Probe vorhandenen Menge an Heparin sind unterschiedliche Mengen an Protamin erforderlich, um das Heparin zu antagonisieren. Unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung konnte die zur Aufhebung des Effekts von Heparin in dem Patienten erforderliche Menge an Protamin innerhalb von etwa 3 Minuten quantifiziert werden. Jedoch umfasst die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, in denen eine derartige Menge innerhalb von etwa 1 Minute, etwa 2 Minuten, etwa 3 Minuten, etwa 4 Minuten, etwa 5 Minuten, etwa 6 Minuten, etwa 7 Minuten, etwa 8 Minuten, etwa 9 Minuten oder etwa 10 Minuten quantifiziert werden kann. Wie der Fachmann jedoch richtig einschätzen wird, variieren diese Zeiten erheblich, was unter anderem von dem indirekten Thrombininhibitor und dem jeweils verwendeten Antagonisten abhängig ist.
  • Manchmal ist es erwünscht, die Thrombose-Gefahr in einem Patienten zu verringern, obgleich dieser Patient noch gesund ist, oder vor einer schwach gefährdenden medizinischen Prozedur, welche die Thrombose-Gefahr geringfügig erhöht. In einem solchen Fall sind mäßige Mengen des indirekten Thrombininhibitors ausreichend, um die Entwicklung einer Thrombose zu verhindern. Deshalb bezieht sich eine "prophylaktische Dosis" eines indirekten Thrombininhibitors auf eine Menge/Konzentration eines indirekten Thrombininhibitors, die ausreichend ist, um die Bildung einer Thrombose zu verhindern, aber nicht ausreichend ist, um eine Thrombose, die schon vorhanden ist, zu behandeln. Für die Behandlung einer existierenden Thrombose oder für die Verhinderung einer Thrombose in Situationen, bei denen eine besonders hohe Gefahr einer Bildung einer Thrombose besteht, wie etwa wenn Blut in einer kardiopulmonären Bypass-Vorrichtung zirkuliert wird, werden im Allgemeinen signifikant höhere Dosierungen, nämlich "therapeutische Dosen," des indirekten Thrombininhibitors verabreicht. Im Falle von unfraktioniertem Heparin werden 0,75 U oder weniger Heparin/ml als eine prophylaktische Dosis angesehen, während höhere Dosen als 0,75 U Heparin/ml als eine therapeutische Dosis angesehen werden. Wie der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, schwanken die Dosen an indirektem Prothrombininhibitor, die für prophylaktische und Behandlungs-Zwecke verwendet werden, von einem indirekten Prothrombininhibitor zum Nächsten erheblich. Allerdings ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, die erforderlichen Dosen für den indirekten Prothrombininhibitor von Interesse leicht zu ermitteln. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, können die Verfahren und Systeme angewandt werden, um Mengen/Konzentrationen an indirektem Thrombininhibitor zu messen, die in einer Prophylaxe oder in einer Behandlung angewandt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind das Verfahren und die Systeme in der Lage, beides zu messen, Mengen/Konzentrationen von in einer Prophylaxe verwendetem indirekten Thrombininhibitor ("prophylaktische Dosen"), als auch solche, die in einer Behandlung verwendet werden ("therapeutische Dosen").
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Zeitintervalle zwischen der Zugabe eines Prothrombinaktivators zu einer Probe und dem Beginn von z. B. Gerinnung oder Thrombinaktivität, wie gemessen durch indirekte Parameter, wie Farbänderung wegen der Wirkung von Thrombin auf ein chromogenes Thrombinsubstrat, ermittelt. Mehrere direkte und indirekte Parameter können ebenfalls über ein bestimmtes Zeitintervall oder an vorbestimmten Zeiten anschließend an die Zugabe von Prothrombin gemessen werden. Die Länge dieser Intervalle/der festgelegten vorbestimmten Zeiten schwankt wiederum von einem indirekten Thrombininhibitor zum Nächsten. Allerdings sind solche Zeitintervalle/vorbestimmten Zeiten im Allgemeinen geringer als etwa 600 Sekunden, vorzugsweise geringer als etwa 500 Sekunden, weiter bevorzugt geringer als etwa 400 Sekunden oder geringer als etwa 300 Sekunden, aber üblicherweise größer als etwa 30 Sekunden oder etwa 60 Sekunden.
  • Eine große Vielzahl von Prothrombinaktivatoren kann im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Prothrombinaktivator verwendet, der aus einem Schlangengift abgeleitet ist. Noscarin, Oscuratin, Textarin, Pseutarin, Trocarin, Notecarin und Hopsarin sind nur einige dieser Schlangengifte. In einer anderen Ausführungsform kann der Prothrombinaktivator ein "Derivat von FXa" sein, wie hierin definiert. Dieser Begriff umfasst Peptide, die mindestens etwa 30% Identität mit dem entsprechenden natürlich vorkommenden Protein oder einem funktionellen Teil davon aufzeigen, üblicherweise Peptide, die mindestens etwa 70% Identität, noch üblicher mindestens etwa 80% Identität, vorzugsweise mindestens etwa 90% Identität, und weiter bevorzugt mindestens etwa 95% Identität aufzeigen, die ihr Vermögen beibehalten, Prothrombin in eine Form von Thrombin umzuwandeln, die gegenüber Inhibition durch einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann jedoch jede Substanz, welche Prothrombin in eine Form von Thrombin umwandelt, die gegenüber Inhibition durch einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist, zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren/System angepasst werden. Typischerweise können diese Substanzen durch ihre Fähigkeit, Blut oder Plasma gerinnen zu lassen, identifiziert werden. Zum Beispiel zeigt die Fähigkeit einer Substanz, Plasma gerinnen zu lassen, dem FVII und/oder FXII fehlt, dass sie die Gerinnung nicht über die Wege der Kontaktaktivierung oder Tissue-Faktor-Aktivierung aktiviert. Durch Verwenden verschiedener Konzentrationen eines identifizierten Prothrombinaktivators können die Gerinnungszeiten dann angepasst werden. Eine steigende Konzentration des Prothrombinaktivators führt typischerweise zu verkürzten Gerinnungszeiten für Proben mit und ohne indirekten Thrombininhibitor. Verkürzte Gerinnungszeiten erfordern typischerweise höhere Konzentrationen an indirektem Thrombininhibitor für eine zuverlässige Quantifizierung während einer festgelegten Nachweisperiode. Andererseits wird eine geringere Konzentration des Prothrombinaktivators zu längeren Gerinnungszeiten für Proben mit und ohne einem indirekten Thrombininhibitor führen. Verlängerte Gerinnungszeiten erhöhen die Messempfindlichkeiten und somit Unterschiede zwischen Proben, die verschiedene Mengen an indirekten Thrombininhibitoren enthalten. Durch Verwenden mehrerer Proben, die den indirekten Thrombininhibitor in Konzentrationen innerhalb des gewünschten Messbereichs enthalten, wird es im Allgemeinen ermöglicht, die Empfindlichkeit des Assays und die Nachweiszeiten anzupassen.
  • Prothrombinaktivatoren können dem Blut bei unterschiedlichen Konzentrationen (Units/ml) zugesetzt werden. Typische Konzentrationen für Prothrombinaktivatoren, die zum Beispiel aus Schlangengiften abgeleitet sind, betragen etwa 0,001 U/ml, etwa 0,0015 U/ml, etwa 0,002 U/ml, etwa 0,0025 U/ml, 0,003 U/ml, etwa 0,0035 U/ml, etwa 0,004 U/ml, etwa 0,0045 U/ml, etwa 0,005 U/ml, etwa 0,0055 U/ml, etwa 0,006 U/ml, etwa 0,0065 U/ml, 0,007 U/ml, etwa 0,0075 U/ml, etwa 0,008 U/ml, etwa 0,0085 U/ml, etwa 0,009 U/ml, etwa 0,0095 U/ml, etwa 0,01 U/ml, etwa 0,015 U/ml, etwa 0,02 U/ml, etwa 0,025 U/ml, 0,03 U/ml, etwa 0,035 U/ml, etwa 0,04 U/ml, etwa 0,045 U/ml, etwa 0,05 U/ml, etwa 0,055 U/ml, etwa 0,06 U/ml, etwa 0,065 U/ml, 0,07 U/ml, etwa 0,075 U/ml, etwa 0,08 U/ml, etwa 0,085 U/ml, etwa 0,09 U/ml, etwa 0,095 U/ml, etwa 0,1 U/ml, etwa 0,15 U/ml, 0,2 U/ml, etwa 0,25 U/ml, etwa 0,3 U/ml, etwa 0,35 U/ml, etwa 0,4 U/ml, etwa 0,45 U/ml, etwa 0,5 U/ml, etwa 0,55 U/ml, 0,6 U/ml, etwa 0,65 U/ml, etwa 0,7 U/ml und etwa 0,75 U/ml. In vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Prothrombinaktivator Teil eines Reagens, das für die Analyse mit einer geeigneten Probe vereinigt werden kann. Ein derartiges Reagens könnte ein fluides Reagens, insbesondere ein flüssiges Reagens, noch genauer ein wässriges Reagens sein (hierin ebenfalls als "in wässriger Lösung hergestelltes Reagens" bezeichnet). Wie unten noch ausführlicher erörtert ist, kann das Reagens auch ein trockenes Reagens sein, das einen oder mehrere Prothrombinaktivatoren und gegebenenfalls andere Substanzen in z. B. getrockneter oder lyophilisierter Form enthält. In bestimmten Ausführungsformen sind das Volumen an Reagens, zum Beispiel einem wässrigen Reagens, und das Volumen an Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, in etwa gleich, wobei sowohl das Reagens als auch die Probe zum Beispiel, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, ein Volumen von etwa 20 μl, etwa 40 μl, etwa 80 μl, etwa 160 μl, etwa 320 μl, etwa 640 μl, etwa 1 ml, etwa 2 ml, etwa 5 ml, etwa 10 ml oder 20 ml aufweisen. Falls es sich bei der Probe um Vollblut handelt, liegen die Probenmengen häufig zwischen etwa 100 μl und etwa 1 ml. Falls es sich bei der Probe um Plasma handelt, liegen die Probenmengen häufig zwischen etwa 50 μl und 150 μl. Die Verwendung ähnlicher Mengen an Reagens/Probe gestattet z. B. die Anwendung derselben Pipette zum Pipettieren von Blut und Reagens und kann in bestimmten Ausführungsformen das Mischen der zwei Lösungen erleichtern (siehe Beispiel 4). In anderen Ausführungsformen ist das Volumen an Reagens, wie einem wässrigen Reagens, das einen oder mehrere Prothrombinaktivatoren enthält, etwas oder wesentlich kleiner als das Probenvolumen. Dies ist zum Beispiel vorteilhaft, wenn Vollblut-Gerinnungskinetik mittels Thromboelastographie, Thromboelastometrie oder anderer Vollblut-Verfahren ausgewertet wird, die zum Messen der Koagulation des Bluts eines Patienten während chirurgischen Prozeduren angewandt werden. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, variieren die erwünschten relativen Volumina von Reagens zu Probe abhängig von der Anwendung erheblich, aber schließen zum Beispiel relative Volumina von Reagens zu Probe von etwa 1:15, etwa 1:10, etwa 1:5, etwa 1:2, vorzugsweise etwa 1:1 für die Untersuchung von Plasma (zum Minimieren des Probenvolumes) und ähnliche relative Volumina für andere Probentypen, einschließlich Vollblut, vorzugsweise etwa 1:15 für die Untersuchung von Vollblut (um die entsprechende Vollblutkinetik ohne Stören der Gerinnselbildung durch hohe Verdünnung zu bestimmen), ein. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls richtig einschätzen wird, liegen auch Ausführungsformen, in denen die relativen Volumina von Reagens zu Probe umgekehrt werden, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Wenn sie in Kombination verwendet werden, könnte ein Prothrombinaktivator bei viel niedrigeren Konzentrationen als der andere Prothrombinaktivator vorhanden sein. Zum Beispiel könnte Noscarin in einer Konzentration von 0,005 bis 0,002 U/ml vorhanden sein, und Textarin könnte bei einer Konzentration von 0,25 bis 0,30 vorhanden sein. Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, ist jedoch eine breite Vielfalt an Kombinationen von Konzentrationen der Prothrombinaktivatoren möglich, was vom Typ des Prothrombinaktivators und dem Zweck, für den er verwendet werden soll, abhängen wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Kombinationen von verschiedenen Prothrombinaktivatoren verwendet werden, um die Überwachung der Kinetik des indirekten Thrombininhibitors, insbesondere Heparin, zu verbessern und/oder zu optimieren. Zum Beispiel kann die Verwendung verschiedener Kombinationen der zwei Schlangengifte Textarin und Noscarin die Empfindlichkeit des Assays erhöhen und es gestatten, die für den Test erforderliche Zeit anzupassen. In bevorzugten Ausführungsformen vergehen mindestens etwa 10 Sekunden, vorzugsweise etwa 10 Sekunden zwischen dem Mischen der Probe und dem Reagens, bis die Gerinnung in einer Probe, die keinen indirekten Thrombininhibitor enthält, eingeleitet wird. Diese Zeitspanne gestattet das Vervollständigen des Mischens von Probe und Reagens und das Äquilibrieren von optischen oder mechanischen Variablen der Mischung, bevor die Gerinnung nachgewiesen wird. Allerdings führen verlängerte Zeitperioden vor dem Nachweis der Gerinnung in Mischungen, die indirekte Thrombininhibitoren bei höheren Konzentrationen umfassen, im Allgemeinen zu langen Verfahrenszeiten (d. h. Zeiten, bis Ergebnisse erhältlich sind) und beschränken auch den Durchsatz des Analysators (d. h. die Menge an Proben, welche während einer bestimmten Zeitperiode, z. B., 1 Stunde, getestet werden kann). Daher wird die Zeitperiode vor der Gerinnung gewöhnlich so begrenzt, dass die Testzeiten etwa 1000 Sekunden nicht überschreiten, vorzugsweise 300 Sekunden nicht überschreiten, und am stärksten bevorzugt 200 Sekunden nicht überschreiten. In bestimmten Ausführungsformen wird Calcium zugegeben. In anderen Ausführungsformen werden Phospholipide zugegeben, um die Bildung von Gerinnungsfaktorkomplexen zu erleichtern und die Aktivität von Prothrombinaktivatoren, wie Textarin, zu fördern. Andere Schlangengifte, wie RVV-V, die Hilfsfaktoren der Prothrombinaktivatoren, welche aus Schlangengift abgeleitet sind, aktivieren, können ebenfalls zugegeben werden. Zum Beispiel aktiviert RVV-V den Faktor V, der die Aktivität von Noscarin steigert. Welche der obigen Substanzen, falls vorhanden, zugegeben wird, hängt zumindest zum Teil von dem System ab, das für die Analyse verwendet wird und/oder davon, ob z. B. Vollblutproben oder Plasmaproben verwendet werden. Wenn zum Beispiel Vollblutproben in z. B. einem ROTEM-System, wie z. B. im U.S.-Patent 5 777 215 beschrieben, das später ausführlicher erörtert wird, analysiert werden, wird die Zugabe von Phospholipiden nicht bevorzugt. Tatsächlich werden zusätzliche Phospholipide vorzugsweise vermieden. Falls jedoch eine Plasmaprobe verwendet wird, kann die Zugabe von Phospholipiden vorteilhaft sein, weil dem Plasma an sich Phospholipide fehlen, die Oberflächen für Prothrombinaktivatoren darstellen könnten. In bestimmten Ausführungsformen sind derartige zusätzlichen Substanzen nicht Teil des anfänglichen Reagens, das den Prothrombinaktivator enthält, sondern werden lediglich an einem späteren Zeitpunkt mit diesem Reagens vermischt. Zum Beispiel kann in bestimmten Ausführungsformen unter Verwendung von trockenem Reagens jede dieser zusätzlichen Substanzen z. B. auf einen Teststreifen aufgetragen werden, sodass das Prothrombinaktivator enthaltende Reagens und z. B. die Phospholipide nur bei Kontakt mit einer flüssige Probe vermischt werden. In bestimmten Ausführungsformen können Plasmaproteine wie zusätzliches Prothrombin und/oder Antithrombin und/oder FV und/oder Fibrinogen vorzugsweise zu dem Reagens, das den Prothrombinaktivator enthält, zugegeben werden, um die Menge dieser Proteine in Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung zu standardisieren und daher Messungen der in der Probe vorhandenen Menge/Konzentration an indirektem Thrombininhibitor spezifischer bezüglich der Menge an getestem indirekten Thrombininhibitor zu machen. In bestimmten Ausführungsformen wird dem Reagens bevorzugt Prothrombin zugegeben, entweder zur Zeit oder kurz vor der Zugabe des Reagens zu der Probe. Alternativ dazu kann Prothrombin als Teil des Reagens vorgesehen werden, aber in einer Form, die nur für die Wirkung des Prothrombinaktivators nach Zugeben zur Probe anfällig ist. Die Standardisierung der Menge dieser Proteine zieht nach sich, dass die Messung genauer sein wird, weil die Gegenwart von Plasmaproteinen im Reagens im Allgemeinen jedweden Mangel oder Überschuss an Plasmaprotein in der getesteten Patientenprobe ausgleicht. Zum Beispiel kann eine Menge von 0,1–5 U Prothrombin, FV und/oder Antithrombin pro ml getesteter Plasmaprobe zugegeben werden. Eine Menge von 0,1–1 mg/ml Fibrinogen pro ml getesteter Plasmaprobe kann zugegeben werden. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass jedes Plasmaprotein, das an einer Reaktion teilnimmt, die einen Teil der Verfahren und Systeme der Erfindung bildet, aus humanem und/oder nicht humanem tierischen Plasma gereinigt und zu der Probe und/oder dem Reagens zugesetzt werden kann.
  • Wie oben erwähnt, können geringe und hohe Konzentrationen an indirektem Prothrombininhibitor durch die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung bestimmt und/oder quantifiziert werden. Was eine geringe oder hohe Konzentration eines indirekten Prothrombininhibitors ausmacht, hängt von der Natur des Inhibitors ab. Jedoch werden etwa 0,8 U unfraktioniertes Heparin/ml; etwa 0,75 U/ml; etwa 0,7 U/ml; etwa 0,65 U/ml; etwa 0,6 U/ml; etwa 0,55 U/ml; etwa 0,5 U/ml; etwa 0,45 U/ml; etwa 0,4 U/ml; etwa 0,35 U/ml; etwa 0,3 U/ml; etwa 0,25 U/ml; etwa 0,2 U/ml und weniger als geringe Dosen an unfraktioniertem Heparin angesehen. Konzentrationen über etwa 2,0 U unfraktioniertes Heparin/ml; etwa 2,5 U/ml; etwa 3,0 U/ml; etwa 3,5 U/ml; etwa 4,0 U/ml; 4,5 U/ml; etwa 5,0 U/ml; etwa 5,5 U/ml; etwa 6,0 U/ml; etwa 6,5 U/ml; etwa 7,0 U/ml; etwa 7,5 U/ml; etwa 8,0 U/ml; 8,5 U/ml; etwa 9,0 U/ml; etwa 9,5 U/ml; etwa 10,0 U/ml werden als mäßige und hohe Konzentrationen an unfraktioniertem Heparin angesehen. Daher können Assays entworfen werden, die niedrige und/oder hohe Konzentrationen an Heparin quantifizieren können.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Verfahren durch Verwendung hoch-gereinigter Enzyme für die Aktivierung von Prothrombin leicht standardisiert werden.
  • Somit sind in bestimmten Ausführungsformen nur sehr geringe Konzentrationen, wie etwa 0,005 U/ml, an Prothrombinaktivatoren erforderlich, insbesondere wenn gereinigte hochwirksame Enzyme verwendet werden. Eine geringe Menge an Aktivator kann leichter auf den Teststreifen oder Patronen von "Point-of-Care"-Analysatoren getrocknet werden und wird leichter innerhalb der Probe während des Assays gelöst, weshalb genauere und reproduzierbare Ergebnisse erzeugt werden. Somit werden die verwendeten Konzentrationen an Prothrombinaktivator wenigstens zum Teil von dem für die Analyse eingesetzten System abhängen. In zwei bevorzugten derartigen Systemen, nämlich der klinischen Koagulations-Analysevorrichtung Amelung KC4-MICRO und Vollblut-Analysatoren, die auf dem ROTEM (Rotationales Thromboelastogramm)-Prinzip basieren ( U.S.-Patent 5 777 215 ; R. J. LUDDINGTON; Übersichtsartikel: Thrombelastography/thromboelastometry, Clinical & Laborstory Haematology 27(2), S. 81 (April 2005); http://www.anaesthesiauk. com/article.aspx?articleid=100102 (vom 21. Dezember 2005); Calatzis et al., A new technique for fast and specific coagulation monitoring, European Surgical Research 28:S1 (89), 1996), betragen typische verwendete Mengen z. B. 0,005 U/ml Noscarin und 0,3 U/ml Texarin für KC4-MICRO und bis zu 40 U/ml Noscarin und 10 U/ml Texarin für das ROTEM-system.
  • Wie es der Fachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen wird, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden unter Verwendung eines fluiden, insbesondere flüssigen oder trockenen Reagens, einschließlich lyophilisiertem Reagens, umfassend die Prothrombinaktivator(en) und gegebenenfalls jedwede anderen Substanzen, die zugegeben werden könnten, um z. B. die Prozessierung des Prothrombins in einer Probe durch den Prothrombinaktivator der vorliegenden Erfindung zu erleichtern. Häufig ist die Verwendung von trockenem Reagens vorteilhaft, da seine Komponenten, wie die Prothrombinaktivator(en), in trockener Form eine bessere Stabilität aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen, in denen trockenes Reagens verwendet wird, kann das Reagens gebrauchsfertig für die Analyse bereitgestellt werden, d. h., ohne die Notwendigkeit irgendeiner Reagensvorbereitung. Trockenes Reagens kann auf Teststreifen oder Patronen für patientennahes Testen aufgetragen werden. Eine Probe, wie eine Blutprobe, kann auf eine(n) derartige(n) Teststreifen oder Patrone gegeben werden. Das Reagens wird durch die Blutprobe rekonstitutiert, und die Reaktion beginnt unverzüglich oder fast unverzüglich. Ein derartiger Gestaltungsaufbau ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung indirekter Thrombininhibitoren, insbesondere von Heparin, durch Personen ohne jegliche Laboratoriums-Kenntnisse und ermöglicht kurze Verfahrenszeiten für das Testen einer Probe.
  • Thrombinaktivität und/oder -aktivierung kann unter Verwendung verschiedener Parameter gemessen werden, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, dem Ausmaß der Gerinnung, das häufig durch die Änderung der Viskosität oder Elastizität der Probe ausgewertet wird. Andere Parameter schließen die Änderung der optischen Dichte oder Trübung der Probe ein. Indirekte Parameter schließen Thrombin-induzierte Änderungen von Thrombinsubstraten, wie fluorogenen oder amperogenen Substraten, oder Änderungen an der Ablesung einer Elektrode, welche Thrombinaktivität und/oder -aktivierung detektieren kann, ein.
  • Material und Methoden
  • Experiment 1:
  • Normales Plasma wurde mit steigenden Mengen an Heparin versetzt. Der aus Schlangengift abgeleitete Prothrombinaktivator Textarin wurde verwendet, um das Prothrombin in der Probe zu aktivieren. Eine Konzentration von 0,3 U/ml Plasma an Textarin wurde für das Experiment verwendet. Ein Volumen von 75 μl Plasma und 75 μl Textarin-Lösung wurden verwendet. Gerinnung wurde mittels eines von TRINITY BIOTECH hergestellten KC4TM-Koagulometers detektiert. Wie in 3 ersichtlich, führten steigende Mengen an Heparin zu einem fast linearen Anstieg der Gerinnungszeit. Hierbei konnten bis zu 3 U Heparin/ml innerhalb von 400 Sekunden erfasst werden.
  • Experiment 2:
  • Der Prothrombinaktivator Noscarin wurde ebenfalls bei Konzentrationen von 0,3 U/ml Blut verwendet. Die Wirkung von Noscarin ist abhängig von der Verfügbarkeit von aktiviertem FV. Deshalb wurde der FV-Aktivator, RW-V, in einer Konzentration von 5 U/ml Blut zugegeben. Erneut wurde normales Plasma mit steigenden Heparinkonzentrationen versetzt und getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die 4 zeigt dass die Quantifizierung von mehr als 5 U Heparin/ml innerhalb von 500 Sekunden erfolgte. Jedoch zeigt 4 ebenfalls, dass die Empfindlichkeit gegenüber geringeren Konzentrationen als 3 U/ml relativ gering war, wie durch die kurzen Gerinnungszeiten verdeutlicht wird.
  • Experiment 3:
  • Die Prothrombinaktivatoren Textarin und Noscarin wurden in variierenden Konzentrationen kombiniert. Im Besonderen wurden 0,005–0,002 U Noscarin/ml mit 0,25–0,3 U Textarin/ml kombiniert. Außerdem wurden Phospholipide in einer Konzentration von 50 Mikrogramm/ml zugegeben, gemeinsam mit der Zugabe des Schlangengifts RVV-V. RVV-V ist ein spezifischer Aktivator des (Blut)plättchenfaktors V, der die Aktivität von Noscarin erhöht. Schließlich optimierte eine Zugabe von 25 mM CaCl2 die Aktivität des gebildeten Thrombins. Die Zugabe von Phospholipiden erleichtert die Bildung von Gerinnungsfaktorkomplexen und fördert die Aktivität von Textarin. 5 zeigt die Ergebnisse des Experiments in einer Plasmaprobe. Abhängig von der verwendeten Menge an Noscarin oder Textarin änderte sich die Form der Dosis-Antwort-Kurve. Eine höhere Menge an Noscarin führte zu einer flacheren Dosis-Antwort-Kurve bei hohen Heparinkonzentrationen und verbesserte deshalb den Messbereich des Assays. 5 zeigt auch, dass die Dosis-Antwort-Kurven in allen Fällen bei niedriger Heparinkonzentration steil waren. Somit konnten bereits relativ kleine Mengen an Heparin zuverlässig nachgewiesen werden. Daher war eine Quantifizierung bei Bereichen von ungefähr 0,2 U unfraktioniertem Heparin/ml möglich.
  • Experiment 4:
  • In diesem Experiment wurden zwei Reagentien in wässriger Lösung hergestellt:
    • Reagens 1: 0,025 U/ml Noscarin in 25 mM CaCl2/2% HEPES-Puffer (pH 7,4)
    • Reagens 2: 0,3 U/ml Textarin + 50 μg/ml PL + 10 U/ml RW-V in 2% HEPES-Puffer (pH 7,4)
  • Die Reagentien wurden in eine Küvette (je 50 μl) eines Koagulometers (z. B. KC4TM von TRINITY BIOTECH) pipettiert, und die Messungen wurden ohne jede weitere Inkubation durch Zugeben von 50 μl Probe (Plasma) begonnen.
  • Ein Variationskoeffizient von 3–5% wurde in wiederholten Messungen von mit steigenden Heparin-Mengen versetzten Proben erhalten, wie in 6 gezeigt.
  • Ähnlich exakte Ergebnisse wurden erhalten, als das Testen mit frischem Plasma aus gesunden Spendern oder Patienten durchgeführt wurde.
  • Experiment 5:
  • Zwei Reagentien werden in wässriger Lösung hergestellt:
    • Reagens 1: 0,216 U/ml Noscarin in 141 mM CaCl2/2% HEPES-Puffer (pH 7,4)
    • Reagens 2: 6,4 U/ml Textarin + 283 μg/ml PL + 57 U/ml RW-V in 2% HEPES-Puffer (pH 7,4)
  • Die Reagentien wurden in die Testzelle (je 20 μl) pipettiert, und die Messung wurde ohne jede weitere Inkubation durch Zugeben von 300 μl Probe (Plasma oder Vollblut) begonnen.
  • Experiment 6:
  • Ein einzelnes Reagens wurde in wässriger Lösung hergestellt:
    • Reagens: Noscarin 80 U/ml + Textarin 480 U/ml + RW-V 240 U/ml + CaCl2 0,06 mmol/ml in 50 mM HEPES 0,5% BSA, pH 7,4.
  • Das Reagens wurde in die Testzelle (20 μl) eines ROTEM-Systems pipettiert, und die Messung wurde ohne jede weitere Inkubation durch Zugeben von 300 μl Vollblut (Probe) begonnen, was zu den folgenden Konzentrationen der Reagenskomponenten in der Probenmischung führte: Noscarin 5,3 U/ml Probenmischung, Textarin 32 U/ml Probenmischung, RW-V 16 U/ml Probenmischung, Calcium 0,06 mmol/ml Probenmischung. Das Reagens ist bei Raumtemperatur stabil (10). Verschiedene Konzentrationen an unfraktioniertem Heparin (UFH) konnten in einer passenden Vollblutprobe nachgewiesen werden (9).
  • Es wird davon ausgegangen, dass die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung in der Form einer Vielzahl von Ausführungsformen aufgenommen werden können, von denen nur einige wenige hier offenbart sind. Dem Fachmann wird es offensichtlich sein, dass andere Ausführungsformen existieren und nicht von der Absicht der Erfindung abweichen. Daher sind die beschriebenen Ausführungsformen veranschaulichend und sollten nicht als einschränkend ausgelegt werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Einfache Verfahren und Systeme zum Nachweisen und Quantifizieren indirekter Thrombininhibitoren, wie Heparin, die auf der Aktivierung von Prothrombin mit einem oder mehreren Prothrombinaktivatoren beruhen, werden beschrieben. Die Verfahren und Systeme sehen einen hohen Grad an Spezifität vor. Es werden ebenfalls Verfahren und Systeme beschrieben, die eine hohe Empfindlichkeit für geringe Konzentrationen an indirekten Thrombininhibitoren aufweisen und die durch große Messbereiche und hohe Genauigkeit gekennzeichnet sind.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (29)

  1. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins und/oder Quantifizieren mindestens eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, umfassend: – Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und – Messen mindestens eines Parameters, der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probenmischung anzeigt.
  2. Verfahren von Anspruch 1, wobei der Prothrombinaktivator Teil eines fluiden oder trockenen Reagens ist, das zu der Probe gegeben wird.
  3. Verfahren von Anspruch 1, wobei die Probenmischung ferner (a) eine Calciumquelle, (b) Phospholipide, (c) RVV-V, (d) zusätzliches Prothrombin, (e) Antithrombin, (f) FV, (g) Fibrinogen oder (h) jede Kombination von (a) bis (g) umfasst.
  4. Verfahren von Anspruch 3, wobei eines oder mehrere von (a) bis (g) Teil eines fluiden oder trockenen Reagens sind, das den Prothrombinaktivator enthält.
  5. Verfahren von Anspruch 1, wobei der mindestens eine Parameter ein direkter oder indirekter Parameter der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität ist.
  6. Verfahren von Anspruch 5, wobei der direkte Parameter der Thrombinaktivität die Gerinnung der Probe ist.
  7. Verfahren von Anspruch 5, wobei der indirekte Parameter der Thrombin aktivierung und/oder Thrombinaktivität eine Änderung in einem Thrombinsubstrat, wie einem chromogenen Thrombinsubstrat, einem fluorogenen Thrombinsubstrat oder einem amperogenen Thrombinsubstrat, ist.
  8. Verfahren von Anspruch 1, wobei der indirekte Thrombininhibitor unfraktioniertes Heparin oder ein Heparinderivat ist.
  9. Verfahren von Anspruch 8, wobei das Heparinderivat (a) fraktioniertes Heparin, (b) Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, (c) ein Heparinoid, (d) Dermatansulfat, (e) eine Substanz, die ein Heparinpentasaccharid enthält, das nicht in die Kategorien (a) bis (d) gehört, oder (e) eine Kombination von einem oder mehreren Heparinderivativen von (a) bis (e), die gegebenenfalls auch ein unfraktioniertes Heparin umfasst, ist.
  10. Verfahren von Anspruch 1, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator aus einem Schlangengift abgeleitet ist, oder ein Derivat von FXa ist.
  11. Verfahren von Anspruch 10, wobei der mindestens eine Schlangengiftabgeleitete Prothrombinaktivator Noscarin, Oscutarin, Textarin, Pseutarin, Trocarin, Notecarin, Hopsarin oder eine Kombination davon ist oder daraus abgeleitet wird.
  12. Verfahren von Anspruch 10, wobei der mindestens eine Schlangengiftabgeleitete Prothrombinaktivator in Konzentrationen von etwa 0,005 U/ml Probe bis etwa 40 U/ml Probe verwendet wird.
  13. Verfahren von Anspruch 1, wobei die Quantifizierung des mindestens einen indirekten Thrombininhibitors im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt von mindestens einem Arzneistoff, der Gerinnungsfaktor(en) beeinflusst, die Prothrombin in einer zu Faktor Xa führenden Gerinnungskaskade vorausgehen.
  14. Verfahren von Anspruch 13, wobei der Arzneistoff ein Kallikreininhibitor, wie Aprotinin, ist.
  15. Verfahren von Anspruch 1, wobei die Quantifizierung des mindestens einen indirekten Thrombininhibitors im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt von einem Mangel oder einem Überschuss an mindestens einem endogenen Gerinnungsfaktor(en), die Prothrombin in einer zu Faktor Xa führenden Gerinnungskaskade vorausgehen.
  16. Verfahren von Anspruch 15, wobei die endogenen Gerinnungsfaktor(en) Faktor VII I, Faktor VII, Faktor XI, Faktor IX, Faktor V, Faktoren X oder eine Kombination davon ist/sind.
  17. Verfahren von Anspruch 1, wobei der mindestens eine indirekte Thrombininhibitor quantifiziert wird durch: (a) ein Zeitintervall zwischen Zugabe des Prothrombinaktivators und Beginn der Gerinnung, (b) ein Zeitintervall zwischen Zugabe des Prothrombinaktivators und Beginn der Thrombinaktivität, (c) Quantifizieren einer Menge von Thrombin, die über ein Zeitintervall und/oder an einer oder mehreren vorbestimmten Zeiten anschließend an die Zugabe der Prothrombinaktivator(en) gebildet wird, (d) Überwachen einer Änderung der Viskosität oder Elastizität in der Probe über ein Zeitintervall und/oder an einer oder mehreren vorbestimmten Zeiten anschließend an die Zugabe der Prothrombinaktivator(en), (e) Überwachen einer Änderung in der optischen Dichte oder Trübung in der Probe über ein Zeitintervall und/oder an einer oder mehreren vorbestimmten Zeiten anschließend an die Zugabe der Prothrombinaktivator(en), oder Kombinationen von (a) bis (e).
  18. Verfahren von Anspruch 17, wobei Thrombin-spezifische Substrat(e) oder für Thrombinaktivität spezifische Elektrode(n) das in (c) gebildete Thrombin quantifizieren.
  19. Verfahren von Anspruch 1, wobei die indirekten Thrombininhibitor(en) sowohl bei Konzentrationen für Prophylaxe als auch Konzentrationen für eine Behandlung, nachweisbar sind.
  20. System zum Nachweisen des Vorhandenseins oder Quantifizieren mindestens eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, umfassend: (a) ein Aufnahmebehältnis oder Material zum Aufnehmen, Absorbieren oder Adsorbieren: (1) der Probe, und (2) mindestens eines Prothrombinaktivators zum Prozessieren von Prothrombin in der Probe zu Thrombin, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und (b) mindestens einen Detektor zum direkten oder indirekten Nachweisen eines Vorliegens oder einer Menge des gebildeten Thrombins, wobei eine vom Detektor bereitgestellte Ablesung mit dem Vorliegen oder der Menge des mindestens einen indirekten Thrombininhibitors in der Probe korrelierbar ist.
  21. System von Anspruch 20, wobei das System ein Kit ist, und wobei das Aufnahmebehältnis oder Material von (a) in einem Behälter vorliegt und den mindestens einen Prothrombinaktivator umfasst, und der Detektor von (b) in einem separaten Behälter vorliegt.
  22. Kit von Anspruch 21, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator Noscarin, Oscutarin, Textarin, Pseutarin, Trocarin, Notecarin, Hopsarin, eine Kombination davon, oder ein Derivat von FXa, ist.
  23. Kit von Anspruch 22, wobei das Aufnahmebehältnis oder Material ferner RVV-V und CaCl2 umfasst, aber im Wesentlichen frei von Phospholipiden ist.
  24. System von Anspruch 20, wobei der Prothrombinaktivator an dem Material ad- oder absorbiert ist.
  25. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder Quantifizieren von Thrombininhibition in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, umfassend: – Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; und – Messen von mindestens einem Parameter, der Thrombinaktivität in der Probenmischung anzeigt, wobei die Konzentration an Thrombininhibitor, die durch das Verfahren nachweisbar ist, sowohl Konzentrationen zur Prophylaxe als auch Konzentrationen zur Behandlung abdeckt.
  26. Verfahren zum Bestimmen einer Antagonisierung eines indirekten Thrombininhibitors in einer Probe, die mindestens eine Blutkomponente enthält, umfassend: – Zugeben mindestens eines Prothrombinaktivators zu der Probe, um eine Probenmischung zu erzeugen, wobei der mindestens eine Prothrombinaktivator verursacht, dass Prothrombin in der Probenmischung zu Thrombin prozessiert wird, das gegenüber Inhibition durch den mindestens einen indirekten Thrombininhibitor anfällig ist; – Zugeben mindestens eines Antagonisten des indirekten Thrombininhibitors; und – Messen von mindestens einem Parameter, der Thrombinaktivierung und/oder -aktivität in der Probenmischung anzeigt.
  27. Verfahren von Anspruch 26, wobei eine Menge an Antagonist bestimmt wird, die erforderlich ist, um den indirekten Thrombininhibitor vollständig oder effektiv zu antagonisieren.
  28. Verfahren von Anspruch 27, wobei die Menge durch Zugeben vorbestimmter Mengen des Antagonisten parallel oder aufeinanderfolgend zu aus einem bestimmten Patienten erhaltenen Probenmischungen ermittelt wird.
  29. Verfahren von Anspruch 26, wobei der Antagonist Protamin oder ein Protaminderivat ist.
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