CN111549005B - 一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料 - Google Patents

一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料，凝血酶原激活因子其cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列，是一种人工合成的活性酶，安全无毒，能够迅速激活凝血酶原，并进一步形成稳定的血纤蛋白，从而达到快速止血的目的；本发明的快速止血材料，以氧化石墨烯和聚乳酸等为基底材料，通过非共价键的方式将基底材料与凝血酶原激活因子与氯化钙结合，能够最大限度的保持凝血酶原激活因子的活性和稳定性；其中氧化石墨烯材料具有超强的吸附作用，能够从伤口表面有效吸收各个分子量的有害物质，包括蛋白质水解和热变性产物、生物胺、炎性介质和细菌霉素等，能够减少炎症反应和伤口愈合时间。

Description

一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血 材料
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体说是一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料。
背景技术
凝血酶原激活因子是止血材料的有效添加因子，它能够直接激活凝血酶原形成凝血酶，具有显著的止血效果，但是目前国内外对于凝血酶原激活因子的研究较少，没有很有效的凝血酶原激活因子。
目前的止血材料有三类：第一类是通过材料的物理或化学作用，吸收伤口附近血液中的水分，使伤口处血液的凝血成分浓缩，聚集，从而加速凝血；或通过材料表面电荷与血细胞之间的静电作用，提高红细胞或血小板的粘附和聚集能力，增加血块粘性促进凝血，如沸石类，高岭土类，淀粉类，明胶类和海藻酸盐类等；第二类是利用材料对组织很强的粘着力直接封闭创面，从而实现止血。这类止血材料主要是人工合成高分子，比如：α-氰基丙烯酸酯类、PEG类等合成高分子，它们遇到血液后能迅速形成粘性很强的胶体，迅速封堵血管，从而止血；第三类是直接或间接提高具有止血活性的物质，止血材料通过表面有效化学或生物成分与血液成分进行反应，启动或提高内源性和外源性凝血途径，进而加速凝血。纤维蛋白胶、短肽类、凝血酶等类型的止血材料都是依靠快速启动血液的内源性止血系统来促进血液凝固，从而止血。
沸石类止血时水合放热，对皮肤等软组织易造成损伤；高岭土类应用后不能完全从伤口处移除，可引起异物肉芽肿或脓肿形成；淀粉类对于难以控制的大出血，止血效果有限；明胶类需要机体的凝血因子参与才能止血，并且容易增加伤口感染，尤其是污染的伤口，并且黏附性差、易脱落，用于内脏止血需要丝线固定；壳聚糖类止血材料的止血机理是壳聚糖表面带正电荷，使得带负电的红细胞容易聚集在其表面，也可以激活血液中的补体系统，对血小板也有聚集作用，但是对于广泛的出血创面，壳聚糖的止血效果有限。
第二类的止血材料可导致血管栓塞并且在降解过程中释放出氰和甲醛等有毒物质，可诱导注射部位周边产生炎症和组织坏死。氰基丙烯酸酯黏合剂对黏合组织的表面要求较高，在使用时必须保证干燥、洁净，不能有血液和消化液等存在。
纤维蛋白胶已应用于临床肿瘤摘除后创面的广泛出血和肝、肾等实质脏器术中的出血等。但是，由于其具有黏合性和促凝作用，严禁应用于血管内以防止形成血栓阻塞血管。纤维蛋白胶的黏附力不好，易从伤口处脱落。目前常使用的纤维蛋白胶是由冻干粉和溶剂组成，使用时要先溶解，不适用突发情况，也不方便储存和运输，且纤维蛋白胶成本较高，种种原因限制了其使用。
综上以上止血材料均存在一定的缺陷，首先对内脏大出血，尤其是动脉出血的直接止血作用有限，其次，对于遗传性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，如血友病人出血，并没有有效的止血材料，因此，开发新的凝血酶原激活因子，并将其应用到止血材料中达到有效止血，是目前亟待解决的。
发明内容
为解决现有止血材料对内脏大出血，尤其是动脉出血不能快速止血及对血友病人不能有效止血的问题，本发明的目的是提供一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种凝血酶原激活因子，cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列。
本发明还包括凝血酶原激活因子的制备方法，包括以下步骤：
①根据SED ID NO：1所示的碱基序列设计引物，并分别在其5’端引物和3’端引物引入酶切位点，5’端引物的酶切位点为Bam HI，3’端引物的酶切位点为XhoI；
5’端引物为GGATCCATGGCTCCTCAACTACTCCT；
3’端引物为CTCGAGTTGAATATATCACTTTTATTCTGTTCC；
②回收含有凝血酶原激活因子的DNA片段；
③用限制性内切酶Bam HI和Xho I对纯化后的凝血酶原激活因子DNA和表达载体pPIC9K进行双酶切，酶切温度为37℃，酶切时间为2.5～3.5小时，纯化回收酶切后的目的基因和载体；
④连接目的基因与载体，连接产物转入至大肠杆菌感受态中表达，挑选阳性重组质粒，测序，确定与SED ID NO：1所示的碱基序列一致；
⑤限制性内切酶切阳性重组质粒使其线性化，酶切温度为37℃，8～12小时后回收纯化酶切产物，将其电转至毕赤酵母感受态中，电转槽设置电转参数为1500V，25μF，200Ω，电击时间6ms，电击完毕加入1M冰预冷的D-山梨醇，混匀，转入灭菌的离心管中，30℃培养箱中孵育2～3小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养3～4天，得到单菌落；
⑥挑选单菌落，菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母，得到凝血酶原激活因子酵母工程菌；
⑦将凝血酶原激活因子酵母工程菌接种至pH为5.5～6.5的培养基中，培养发酵95～100小时，用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化，填料为琼脂糖树脂，先用2～4倍柱体积的平衡液洗涤柱子，再用2～4倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到凝血酶原激活因子；
所述平衡液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和10mM咪唑；
所述洗脱液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和200mM咪唑。
优选的，步骤⑦中的培养基为BMGY培养基，具体组成，以重量份计包括2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母氮碱，4×10-5D-维生素，1％甘油，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
进一步优选的，步骤⑦中的BMGY培养基中，还包括1.5％甲醇和终浓度为10mM的抗坏血酸。
优选的，冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-60～-40℃下预冷冻6～12小时，干燥仓真空度在5～15Pa下进行升华干燥，温度为20～25℃，时间10～12小时，升华结束后，升温至30～35℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥。
本发明还包括一种凝血酶原激活因子在制备快速止血材料方面的应用。
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯15～25份，聚乳酸60～80份，聚酰胺6～10份，聚丙烯腈3～6份，聚乙烯吡咯烷酮1～5份，凝血酶原激活因子0.1～0.5份，氯化钙8～10份和纳米二氧化钛2～6份。
优选的，聚乙烯比咯烷酮K30。
本发明还包括快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将60～80份聚乳酸加入到600～800份有机溶剂中，向其中加入6～10份聚酰胺和3～6份聚丙烯腈，在20～35℃下搅拌1～2小时，然后向其中加入1～5份聚乙烯吡咯烷酮和15～25份氧化石墨烯，搅拌30～60分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比5～8：1组成；
纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压20～24KV，流速0.4～0.8ml/h，接收距离为13～17cm；
⑵将0.1～0.5份凝血酶原激活因子，8～10份氯化钙，2～6份纳米二氧化钛加入到200～400份去离子水中，开启搅拌，在10～40℃下搅拌1～3小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在10～40℃下震荡处理10～15小时，然后在10～40℃下真空干燥，得到快速止血材料。
优选的，静电纺丝成型的参数设置为电压24KV，流速0.8ml/h，接收距离为13cm。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的凝血酶原激活因子，作为一种人工合成的活性酶，安全无毒，能够迅速激活凝血酶原，并进一步形成稳定的血纤蛋白，从而达到快速止血的目的；本发明的凝血酶原激活因子凝血时间短，凝血性能高，能够防止由凝血酶缺乏引起的手术出血或损伤，对动脉大出血的止血效果显著，并且适用于凝血功能障碍患者；
本发明的凝血酶原激活因子的制备方法能够由含有特定的cDNA碱基序列得到含有该DNA片段的工程菌菌，经分离纯化即可得到凝血酶原激活因子，相比从动物体内提取凝血酶原激活因子，更加安全，步骤流程易于控制，能够批量生产。
本发明的快速止血材料，安全无毒副作用，既能快速止血又能防止二次出血和感染，可以用于事故急救、手术止血和战时创伤止血时，尤其适用于动脉大出血，能够快速止血，并且不会产生二次创伤。本发明的快速止血材料由于含有凝血酶原激活因子，能够直接激活凝血酶原形成凝血酶，因而对血友病人也同样具有显著的止血效果，具有广阔的应用前景。
本发明的快速止血材料，以聚乳酸、聚酰胺和聚丙烯腈等经过静电纺丝成医用无纺布作为基底材料，通过非共价键的方式将基底材料与凝血酶原激活因子与氯化钙结合，能够最大限度的保持凝血酶原激活因子的活性和稳定性；本发明的快速止血材料具有超强的吸附作用，能够从伤口表面有效吸收各个分子量的有害物质，包括蛋白质水解和热变性产物、生物胺、炎性介质和细菌霉素等，能够减少炎症反应和伤口愈合时间；聚乳酸中含有特定重量份数的聚丙烯腈、聚酰胺和氧化石墨烯，一方面，能够作为相容性材料促进各组分的均匀混合，避免基底材料、凝血酶原激活因子与氯化钙的物理分离，另一方面，能够提高基底材料的力学强度，氯化钙的存在能够促进血凝块的稳定性，防止二次出血。
本发明的快速止血材料的制备方法，流程少，易操作，便于实现大规模工业化生产。
附图说明
图1为凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药对血清的凝固作用结果示意图；
图2为比较凝血酶原激活因子对人体正常血清及乏VIII因子血清的凝固作用结果示意图；
图3为凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药的对正常血清的凝血酶形成作用结果示意图；
图4为凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药的对乏VIII因子血清的凝血酶形成作用结果示意图；
图5为止血材料或带有云南白药粉末的纱布敷于创面处的图片；
图6为止血材料或带有云南白药粉末的纱布取下纱布后的止血情况图；
附图标记：1凝血酶原激活因子，2Celox颗粒，3云南白药，4空白对照组，5实验组，6云南白药对照组。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种凝血酶原激活因子及含有凝血酶原激活因子的快速止血材料，通过以下技术方案实现：
一种凝血酶原激活因子，cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列。
本发明还包括凝血酶原激活因子的制备方法，包括以下步骤：
①根据SED ID NO：1所示的碱基序列设计引物，并分别在其5’端引物和3’端引物引入酶切位点，5’端引物的酶切位点为Bam HI，3’端引物的酶切位点为Xho I；
5’端引物为GGATCCATGGCTCCTCAACTACTCCT；
3’端引物为CTCGAGTTGAATATATCACTTTTATTCTGTTCC；
②回收含有凝血酶原激活因子的DNA片段；
在紫外灯下将电泳胶的目的片段切下，放入小离心管中，加入100μL NaI溶液(100μg胶：100μL NaI)，然后置于55℃水浴中溶解凝胶；加入玻璃粉50μL，以使DNA吸附在玻璃粉上，从而使DNA与琼脂糖凝胶分离，25℃放置15分钟，在5,000g下离心5分钟；冲洗沉淀2次以除去杂质，每次冲洗混合后，都需离心操作；在25℃下离心干燥2分钟；用TE(1mM EDTA，10mMTris-Hcl)溶解吸附在玻璃粉上的DNA，之后离心，弃沉淀，琼脂糖凝胶电泳检测回收质量；
其中冲洗液组成为：乙醇，1mM EDTA，10mM Tris-Hcl；
③用限制性内切酶Bam HI和Xho I对纯化后的凝血酶原激活因子DNA和表达载体pPIC9K进行双酶切，酶切温度为37℃，酶切时间为2.5～3.5小时，纯化回收酶切后的目的基因和载体；
具体的纯化回收步骤为：
目的基因/载体均100μL，加入10μL 3M NaAc和300μL 100％乙醇，混匀，-80℃冷冻过夜，12000rpm离心10min，4℃，弃上清，加入70％乙醇1mL，混匀，12000rpm离心5min，4℃，弃上清，离心干燥3分钟，得到酶切后的目的基因和载体；
④连接目的基因与载体，连接产物转入至大肠杆菌感受态中表达，挑选阳性重组
Figure BDA0002501893230000071
⑤限制性内切酶切阳性重组质粒使其线性化，酶切温度为37℃，8～12小时后回收纯化酶切产物，将其电转至毕赤酵母感受态中，电转槽设置电转参数为1500V，25μF，200Ω，电击时间6ms，电击完毕加入1mL 1M冰预冷的D-山梨醇，混匀，转入灭菌的离心管中，30℃培养箱中孵育2～3小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养3～4天，得到单菌落；
线性化反应条件：
Figure BDA0002501893230000072
酶切产物的回收纯化：
酶切产物600μL，加入H2O 200μL，800μL酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，25℃，11000rpm离心8分钟，取上清，加入800μL氯仿/异戊醇(体积比1：1)，25℃，11000rpm离心8分钟，取上清，加800μL100％冰冷乙醇，混匀，在-80℃，静置10分钟，4℃，11000rpm离心8分钟，弃上清，留沉淀，离心干燥，3分钟，加TE溶解至终浓度为2μg/μL，-20℃保存；
⑥挑选单菌落，菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母，得到凝血酶原激活因子酵母工程菌；
挑选单菌落：在组氨酸缺乏的条件下筛选重组子，分别配置G418浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的YPD平板，待长出的单菌落可以挑起时，用灭菌的牙签将单菌落逐个点种到含G418浓度为1mg/mL的YPD平板上，再将长势良好，菌落比较大的单克隆转接到含G418浓度为2mg/mL的YPD平板上，依次类推，最后挑选在G418浓度为4mg/mL的YPD平板上菌落大的单克隆，以获取G418抗性株；
菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母的步骤为：首先用酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌落基因组，将提取到的基因组DNA稀释10倍后作为模板进行PCR，PCR结束后取3μL产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
PCR反应体系：
Figure BDA0002501893230000081
PCR反应程序：
Figure BDA0002501893230000082
⑦将凝血酶原激活因子酵母工程菌接种至pH为5.5～6.5的培养基中，培养发酵95～100小时，用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化，填料为琼脂糖树脂，先用2～4倍柱体积的平衡液洗涤柱子，再用2～4倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到凝血酶原激活因子；
所述平衡液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和10mM咪唑；
所述洗脱液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和200mM咪唑。
优选的，步骤⑦中的培养基为BMGY培养基，具体组成，以重量份计包括2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母氮碱，4×10-5D-维生素，1％甘油，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液；本发明优选的培养基可以为凝血酶原激活因子酵母工程菌提供生长中的各种营养物质。
进一步优选的，步骤⑦中的BMGY培养基中，还包括1.5％甲醇和终浓度为10mM的抗坏血酸，本发明优选的培养基组分可以抑制其他杂菌的生长，并且不对凝血酶原激活因子酵母工程菌的生长造成影响，抗坏血酸的存在。在培养基中加入抗坏血酸能够减少ROS对细胞的损伤，增加毕赤酵母细胞的生存能力，减少外源蛋白的降解。本实验所选取的毕赤酵母菌株为甲醇利用快速型表型，以甲醇为唯一碳源时，能强烈诱导外援蛋白的表达，因此以甲醇为诱导物诱导外源蛋白表达。
优选的，冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-60～-40℃下预冷冻6～12小时，干燥仓真空度在5～15Pa下进行升华干燥，温度为20～25℃，时间10～12小时，升华结束后，升温至30～35℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥；本发明优选的冷冻干燥步骤，可以很好地保持凝血酶原激活因子的酶活性。
本发明还包括一种凝血酶原激活因子在制备快速止血材料方面的应用。
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯15～25份，聚乳酸60～80份，聚酰胺6～10份，聚丙烯腈3～6份，聚乙烯吡咯烷酮1～5份，凝血酶原激活因子0.1～0.5份，氯化钙8～10份和纳米二氧化钛2～6份。
优选的，聚乙烯比咯烷酮K30，能够增加聚乳酸、聚酰胺和聚丙烯腈的相容性，并且将氧化石墨烯很好的分散在其中。
本发明还包括快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将60～80份聚乳酸加入到600～800份有机溶剂中，向其中加入6～10份聚酰胺和3～6份聚丙烯腈，在20～35℃下搅拌1～2小时，然后向其中加入1～5份聚乙烯吡咯烷酮和15～25份氧化石墨烯，搅拌30～60分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比5～8：1组成；
纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压20～24KV，流速0.4～0.8ml/h，接收距离为13～17cm；
⑵将0.1～0.5份凝血酶原激活因子，8～10份氯化钙，2～6份纳米二氧化钛加入到200～400份去离子水中，开启搅拌，在10～40℃下搅拌1～3小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在10～40℃下震荡处理10～15小时，然后在10～40℃下真空干燥，得到快速止血材料。
优选的，静电纺丝成型的参数设置为电压24KV，流速0.8ml/h，接收距离为13cm。
本发明实施例所用的DNA回收试剂盒为日本Takara公司的DNARecovery Kit回收试剂盒；表达载体pPIC9K由美国Invirogen公司生产；酵母基因组提取试剂盒由Solarbio公司生产。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种凝血酶原激活因子，其cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列。
一种凝血酶原激活因子的制备方法，包括以下步骤：
①根据SED ID NO：1所示的碱基序列设计引物，并分别在其5’端引物和3’端引物引入酶切位点，5’端引物的酶切位点为Bam HI，3’端引物的酶切位点为Xho I；
5’端引物为GGATCCATGGCTCCTCAACTACTCCT；
3’端引物为CTCGAGTTGAATATATCACTTTTATTCTGTTCC；
②回收含有凝血酶原激活因子的DNA片段；
在紫外灯下将电泳胶的目的片段切下，放入小离心管中，加入100μL NaI溶液(100μg胶：100μL NaI)，然后置于55℃水浴中溶解凝胶；加入玻璃粉50μL，以使DNA吸附在玻璃粉上，从而使DNA与琼脂糖凝胶分离，25℃放置15分钟，在5,000g下离心5分钟；冲洗沉淀2次以除去杂质，每次冲洗混合后，都需离心操作；在25℃下离心干燥2分钟；用TE(1mM EDTA，10mMTris-Hcl)溶解吸附在玻璃粉上的DNA，之后离心，弃沉淀，琼脂糖凝胶电泳检测回收质量；
其中冲洗液组成为：乙醇，1mM EDTA，10mM Tris-Hcl。
③用限制性内切酶Bam HI和Xho I对纯化后的凝血酶原激活因子DNA和表达载体pPIC9K进行双酶切，酶切温度为37℃，酶切时间为2.5小时，纯化回收酶切后的目的基因和载体；
具体的纯化回收步骤为：
目的基因/载体均100μL，加入10μL 3M NaAc和300μL 100％乙醇，混匀，-80℃冷冻过夜，12000rpm离心10min，4℃，弃上清，加入70％乙醇1mL，混匀，12000rpm离心5min，4℃，弃上清，离心干燥3分钟，得到酶切后的目的基因和载体；
④连接目的基因与载体，连接产物转入至大肠杆菌感受态中表达，挑选阳性重组质粒，测序，确定与SED ID NO：1所示的碱基序列一致；
Figure BDA0002501893230000111
⑤限制性内切酶切阳性重组质粒使其线性化，酶切温度为37℃，8小时后回收纯化酶切产物，将其电转至毕赤酵母感受态中，电转槽设置电转参数为1500V，25μF，200Ω，电击时间6ms，电击完毕加入1mL 1M冰预冷的D-山梨醇，混匀，转入灭菌的离心管中，30℃培养箱中孵育2小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养3天，得到单菌落；
线性化反应条件：
Figure BDA0002501893230000112
酶切产物的回收纯化：
酶切产物600μL，加入H2O 200μL，800μL酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，25℃，11000rpm离心8分钟，取上清，加入800μL氯仿/异戊醇(体积比1：1)，25℃，11000rpm离心8分钟，取上清，加800μL100％冰冷乙醇，混匀，在-80℃，静置10分钟，4℃，11000rpm离心8分钟，弃上清，留沉淀，离心干燥，3分钟，加TE溶解至终浓度为2μg/μL，-20℃保存；
⑥挑选单菌落，菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母，得到凝血酶原激活因子酵母工程菌；
挑选单菌落：在组氨酸缺乏的条件下筛选重组子，分别配置G418浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的YPD平板，待长出的单菌落可以挑起时，用灭菌的牙签将单菌落逐个点种到含G418浓度为1mg/mL的YPD平板上，再将长势良好，菌落比较大的单克隆转接到含G418浓度为2mg/mL的YPD平板上，依次类推，最后挑选在G418浓度为4mg/mL的YPD平板上菌落大的单克隆，以获取G418抗性株；
菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母的步骤为：首先用酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌落基因组，将提取到的基因组DNA稀释10倍后作为模板进行PCR，PCR结束后取3μL产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
PCR反应体系：
Figure BDA0002501893230000121
PCR反应程序：
Figure BDA0002501893230000122
Figure BDA0002501893230000131
⑦将凝血酶原激活因子酵母工程菌接种至pH为5.5的BMGY培养基中，培养发酵95～100小时，用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化，填料为琼脂糖树脂，先用2～4倍柱体积的平衡液洗涤柱子，再用2～4倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到凝血酶原激活因子；
所述平衡液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和10mM咪唑，pH值为8.0的缓冲液；
所述洗脱液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和200mM咪唑，pH值为8.0的缓冲液；
冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-50℃下预冷冻10小时，干燥仓真空度在10Pa下进行升华干燥，温度为22℃，时间11小时，升华结束后，升温至32℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥。
实施例2
除下述步骤外，其余步骤与实施例1的凝血酶原激活因子的制备方法步骤相同，具体的：
步骤③中的酶切时间为3.5小时，步骤⑤中的12小时后回收纯化酶切产物，30℃培养箱中孵育3小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养4天，得到单菌落；
步骤⑦中的培养基的pH为6.0，具体组成为以重量份计包括2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母氮碱，4×10-5D-维生素，1％甘油，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-60℃下预冷冻6小时，干燥仓真空度在5Pa下进行升华干燥，温度为20℃，时间10小时，升华结束后，升温至30℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥。
实施例3
除下述步骤外，其余步骤与实施例1的凝血酶原激活因子的制备方法步骤相同，具体的：
步骤③中的酶切时间为3.0小时，步骤⑤中的10小时后回收纯化酶切产物，30℃培养箱中孵育2.5小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养3.5天，得到单菌落；
步骤⑦中的培养基的pH为6.0，具体组成为以重量份计包括2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母氮碱，4×10-5D-维生素，1％甘油，1.5％甲醇，终浓度为10mM的抗坏血酸，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-40℃下预冷冻12小时，干燥仓真空度在15Pa下进行升华干燥，温度为25℃，时间12小时，升华结束后，升温至35℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥。
实施例4
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯15份，聚乳酸60份，聚酰胺6份，聚丙烯腈3份，聚乙烯吡咯烷酮1份，凝血酶原激活因子0.1份，氯化钙8份和纳米二氧化钛2份。
实施例5
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯25份，聚乳酸80份，聚酰胺10份，聚丙烯腈6份，聚乙烯吡咯烷酮5份，凝血酶原激活因子0.5份，氯化钙10份和纳米二氧化钛6份。
实施例6
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯18份，聚乳酸70份，聚酰胺8份，聚丙烯腈5份，聚乙烯吡咯烷酮K30 3份，凝血酶原激活因子0.3份，氯化钙9份和纳米二氧化钛5份。
实施例7
一种快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯20份，聚乳酸75份，聚酰胺7份，聚丙烯腈4份，聚乙烯吡咯烷酮K30 4份，凝血酶原激活因子0.4份，氯化钙8.5份和纳米二氧化钛4份。
实施例8
实施例4所述快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将60份聚乳酸加入到800份有机溶剂中，向其中加入6份聚酰胺和3份聚丙烯腈，在20℃下搅拌1小时，然后向其中加入1份聚乙烯吡咯烷酮和15份氧化石墨烯，搅拌30分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7：1组成；
⑵将0.1份凝血酶原激活因子，8份氯化钙，2份纳米二氧化钛加入到200份去离子水中，开启搅拌，在10℃下搅拌3小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在10℃下震荡处理10小时，然后在10℃下真空干燥，得到快速止血材料。
实施例9
实施例5所述快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将80份聚乳酸加入到600份有机溶剂中，向其中加入10份聚酰胺和6份聚丙烯腈，在35℃下搅拌2小时，然后向其中加入5份聚乙烯吡咯烷酮和25份氧化石墨烯，搅拌60分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比5：1组成；
⑵将0.5份凝血酶原激活因子，10份氯化钙，6份纳米二氧化钛加入到400份去离子水中，开启搅拌，在40℃下搅拌3小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在40℃下震荡处理15小时，然后在40℃下真空干燥，得到快速止血材料。
实施例10
实施例6所述快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将70份聚乳酸加入到630份有机溶剂中，向其中加入8份聚酰胺和5份聚丙烯腈，在30℃下搅拌1.5小时，然后向其中加入3份聚乙烯吡咯烷酮K30和18份氧化石墨烯，搅拌40分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比8：1组成；
纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压22KV，流速0.5ml/h，接收距离为15cm；
⑵将0.3份凝血酶原激活因子，9份氯化钙，5份纳米二氧化钛加入到300份去离子水中，开启搅拌，在20℃下搅拌2小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在30℃下震荡处理12小时，然后在30℃下真空干燥，得到快速止血材料。
实施例11
实施例7所述快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：
⑴以重量份计，将75份聚乳酸加入到770份有机溶剂中，向其中加入7份聚酰胺和4份聚丙烯腈，在25℃下搅拌2小时，然后向其中加入4份聚乙烯吡咯烷酮K30和20份氧化石墨烯，搅拌50分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比6：1组成；
纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压24KV，流速0.8ml/h，接收距离为13cm；
⑵将0.4份凝血酶原激活因子，8.5份氯化钙，4份纳米二氧化钛加入到350份去离子水中，开启搅拌，在25℃下搅拌1.5小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在25℃下震荡处理11小时，然后在30℃下真空干燥，得到快速止血材料。
一、测试实施例1的凝血酶原激活因子对血清的凝固作用
1.研究对象：
a.实施例1的凝血酶原激活因子：白色冻干粉末，取0.7mg粉末溶于1mL PBS中，配成浓度为0.7mg/mL的溶液；
b.Celox颗粒：浅灰色粉末，取10mg粉末与1mL PBS混合，涡旋，配成浓度为10mg/mL的混合液；
c.云南白药：棕色粉末，取10mg粉末与1mL PBS混合，涡旋，配成浓度为10mg/mL的混合液；
2.试剂
a.人体正常血清：冻干粉末，溶于1mL PBS；
b.人体乏VIII因子血清：冻干粉末，溶于1mL PBS；
c.显色底物S2238：冻干粉末，取2.5mg溶于1.3mL PBS；
3.实验过程
3.1比较实施例1的凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药对人体正常血清的凝固作用
0.1mL正常人体血浆中，分别加入0.1mL凝血酶原激活因子(0.7mg/mL)、0.01mL云南白药(10mg/mL)+0.09mL PBS、0.01mL Celox(10mg/mL)+0.09mL PBS，反应体系为0.2mL，反应一段时间，将试管倾斜放置后观察血浆凝固情况，结果如图1所示，实施例1的凝血酶原激活因子，10秒内即可观察到血清凝固，但Celox、云南白药均没有血清凝固现象(试管倾斜后血清流淌)，继续增加用量，最后也未观察到凝固现象，因此凝血酶原激活因子对人体正常血清具有很好的凝固作用。
3.2比较凝血酶原激活因子对人体正常血清及乏VIII因子血清的凝固作用
为精确检测血清中的纤维蛋白的聚合，我们采用酶标仪检测血清凝固过程的吸光度，将人体血清稀释5倍，取0.04ml正常血清，乏VIII因子血清于96孔板不同孔中，分别加入0.14ml PBS及0.02ml实施例1所得凝血酶原激活因子，反应体系为0.2mL，迅速将96孔板置于酶标仪中开始检测，E＝350nm，记录反应未开始时的吸光度为零，结果如表1和图2所示。由表1和图2的结果可以看出，本发明的凝血酶原激活因子在缺乏VIII因子血清中的促凝作用与在正常血浆中的基本相同，说明本发明的凝血酶原激活因子对乏VIII因子的患者同样具有良好的促凝作用。
表1比较凝血酶原激活因子对人体正常血清及乏VIII因子血清的凝固作用结果表
Figure BDA0002501893230000171
Figure BDA0002501893230000181
3.3凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药的凝血酶形成作用
用显色底物S2238来检测血清中凝血酶的产生，在0.015ml人体正常血清中分别混合0.015mL凝血酶原激活因子、Celox或云南白药于96孔板中，加入适量PBS，再加入0.1mLS2238起始反应，反应体系为0.25mL，迅速将96孔板置于酶标仪中开始检测，E＝405nm。结果如表2和图3显示，正常人体血清中，凝血酶原激活因子诱导的凝血酶活性很高，15min后开始进入平台。
表2凝血酶原激活因子、Celox颗粒和云南白药的对正常血清的凝血酶形成作用
Figure BDA0002501893230000182
Figure BDA0002501893230000191
采用上述同样的方法，检测凝血酶原激活因子、Celox和云南白药对乏VIII因子血清中的凝血酶活性，结果如表3和图4所示，结果显示，乏VIII因子血清中的凝血酶产生曲线趋势与正常血浆中曲线趋势类似，表明本发明的凝血酶原激活因子在正常血浆和乏VIII因子血浆中都有良好的促凝血酶生成作用。
表3凝血酶原激活因子等对乏VIII因子血清的凝血酶活性测试结果表
Figure BDA0002501893230000192
由表2和表3的数据可以看出，Celox颗粒和云南白药对人正常血清和乏VIII因子血清的促凝血酶活形成作用均很小。
二、大鼠体内止血实验
实验对象：雄性SD大鼠(250～280g)；
实验试剂：氯仿、实施例11所得快速止血材料、云南白药；
实验材料：麻醉装置、大鼠固定操作台、镊子、手术刀、手术剪刀、培养皿、纱布、电子天平等；
实验方法：实验大鼠被随机分为3组，每组4-5只，分别为空白对照组、实验组(使用实施例11所得快速止血材料)和云南白药对照组(云南白药)。采用急性机械损伤法建立大鼠创伤性出血性肝损伤模型。实验中，使用氯仿麻醉大鼠，随后将其固定于操作台上，将大鼠腹部从正中切开，露出肝脏，并将肝脏置于培养皿中，切除肝脏左叶约1cm长，0.5cm深的组织，制造出血创面，并迅速将空白纱布、实施例11所得快速止血材料或带有云南白药粉末的纱布敷于创面处，如图5所示，1min后取下纱布，观察止血情况，如图6所示，称量取下带血纱布的重量，并计算出血量，各组的出血量如表4所示。
表4出血1分钟后各组的出血量结果表
空白对照组 实验组 云南白药对照组
出血量/g 14.20±0.12 6.32±0.14 9.77±0.06
由图5和表4的结果可以看出，本发明的快速止血材料作用于创面时，出血量最少，图6显示实验结束后移除纱布，空白对照组大部分处于出血状态，本发明的快速止血材料对创面有很强的吸附作用，可以有效止血，并且纱布移除后，没有二次出血的情况，阳性对照组有二次出血的情况。
三、小猪脾脏止血
在小猪(20kg±1kg)脾脏表面造成一个面积4×4cm，深2mm的人工渗血的创面，将实施例11所得快速止血材料附于创面上，在上面轻压4分钟，观察创面的止血情况及敷料与创面的粘合情况。
实施例11所得快速止血材料在脾脏的人工渗血创面的止血时间为小于2分钟，并且止血时与创面粘附紧密，不易脱落，手术3天，小猪存活良好；剖腹后，创面被大网膜包裹，腹腔内无内出血，无积液，无漏胆汁，腹腔化脓或感染的情况。
四、猪股动脉出血的止血
步骤为：选取实验用成年巴马小型猪(20kg±1kg)15只，雌雄不限，随机分配成3组，分别为空白对照组、实验组(使用实施例11所得快速止血材料)和云南白药对照组。实验前禁食24h，不禁水，使用戊巴比妥钠静脉注射麻醉。麻醉后将小型猪仰卧位固定在手术台上，左下肢腹股沟局部75％乙醇消毒，游离股动脉5cm，注意不要损伤临近的股静脉和股神经。动脉插管，放置传感器检测血压变化。右下肢腹股沟局部75％乙醇消毒，游离股动脉5cm，注意不要损伤临近的股静脉和股神经。测量动脉直径，穿线，结扎远心端，使用血管夹夹闭股动脉近心端，使用眼科剪做一切口(1/2血管)，放开血管夹，自由喷血25s后，收集流出的血液(以备后续称重)；然后分别迅速用空白纱布、快速止血材料或将带有云南白药的纱布置于各组动物的创伤口进行压迫止血。压迫止血2min，观察止血情况，若没有止血继续压迫，观察2min，仍无法止血时更换纱布继续行压迫止血。若10min未止血，则代表止血失败，试验结束称量取下带血纱布的重量，并计算失血量，止血时间和失血量如表5所示。
表5猪股动脉出血的止血时间和失血量
空白对照组 实验组 云南白药对照组
出血时间/min 止血失败 ＜2min 小于5min
25s失血量/g 45.12±15.24 46.05±14.18 45.89±18.45
止血过程失血量/g 38.10±8.28 1.04±1.54 5.24±4.35
试验结束，将实验组和云南白药对照组的小型猪用医用纱布进行包扎，试验结束3天，小猪的状态均良好，阳性对照组小猪中有2头出现二次出血的现象，实验组的小猪无二次出血情况。由上述材料可以看出，本发明的快速止血材料的出血量少，能够快速止血，并且无二次出血的情况发生。
序列表
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 一种凝血酶原激活因子及含凝血酶原激活因子的快速止血材料
<130> 20200521A-1
<141> 2020-05-21
<150> 202010406661X
<151> 2020-05-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2093
<212> DNA
<213> 虎蛇(Notechis scutatus)
<400> 1
atggctcctc aactactcct cactctgatc ctctgttttc tgtggagtct cccagaggct 60
gaaagtaatg tattcttaaa aagcaaagtg gcaaatagat ttttgcaaag aacaaaacga 120
gctaattcac tgtttgagga atttaaagct ggaaacattg aaagggaatg cattgaggag 180
agatgttcaa aagaagaagc cagggaggca tttgaagata acgagaaaac tgagaccttc 240
tggaatgttt atgtagatgg ggatcagtgt tcatcaaacc cctgtcatta tggcgggaca 300
tgcaaagatg gcattggtag ttatacctgt acctgcttgg ctggctatga agggaaaaac 360
tgtcaatatg tcttatatca gtcctgcaga gtggacaatg gtaactgttg gcacttctgc 420
aaacctgttc aaaacgaaat tcagtgttca tgtgctgaaa gttacctttt gggagatgat 480
gggcactctt gtgttgctgg aggtgacttt tcgtgtggta gaaatataaa agcaaggaac 540
aaggtggaag caagtctgcc tgactttagg cagtcccaga atgcaacttt gctgaaaaaa 600
tctgataatc caagccctga tatcagagtt gttaatggaa cagactgcaa actgggtgaa 660
tgtccatggc aggcacttct gataaatgat caaggagatg ggttttgtgg aggaacaatt 720
ttgagtccca tctatgtgct tactgcagcc cactgcatta accagaccaa gtacattaga 780
gttgttgtag gggaaataga catatcaaga aaagaaacca gacgtcttct ttctgtggat 840
aaaatatatg tgcatacaaa atttgttcct cccaactatt actatgtgca tcaaaacttt 900
gatcgtgtcg cctatgacta tgatatagcc atcatccgaa tgaagacccc tatccagttc 960
tctgaaaatg tggttcctgc ctgccttccc actgctgatt ttgccaacga agtcctcatg 1020
aaacaagatt ctggcatcgt tagtggattt gggcgtattc gatttaaaga accgacctct 1080
aacacactta aagtcattac ggttccttat gtggacaggc acacctgcat gctttccagt 1140
gattttcgaa ttactcaaaa tatgttctgt gctggctatg atactctgcc tcaagatgca 1200
tgccagggag acagtggggg gccccacatc actgcataca gagataccca ctttattact 1260
gggattatca gctgggggga aggatgtgca cggaaaggca aatatggtgt ttacacaaaa 1320
gtgtccagat tcatcccttg gataaaaaaa ataatgagtc taaagtaacc cagtacagag 1380
tcaagcactg gtcagctcta aaaatcatcc agtggcatat ttcatgcagc aataatgcat 1440
tgggttagaa cattcatgat atccactttg gttcagaact cttcagatgt agtgccactt 1500
ttaaatataa cattcaagtc atgtagcttt cctatttatc gagagctttt ttcttctggt 1560
attaatccct tctggcacat agaatgagta gactatttca tttcagctct tgtctcttgt 1620
gtacctatct tttacgacct tttctaaaga tttatacagg tttgtaattt ataatccttc 1680
aaatagaagc tcagcaggaa tatttgttcc ctttgtaata caacctccag ttcccttgag 1740
accatcagtt gggttaatca aggtagtgcc caactgggta atcagctgaa ttgttttcca 1800
atttaattta ccccaaacag aagcagaggt caaaccaagc cttcagtact gttgccttct 1860
acttctatgg agggggagtt agggacgtca taaaactttg ctctacgaat ccaacacttc 1920
atgtcaaaaa tttcttgaag aaagtgaaca gaattctgta tttcccaaat ggttattcca 1980
ctcgcgtgct cacattttgg gttattttgt gtgatcaaaa tttccagtga caggatctga 2040
ttgagatgat cactaactgg gttataggaa cagaataaaa gtgatatatt caa 2093

Claims (10)

1.一种凝血酶原激活因子，其特征在于：其cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列。
2.权利要求1所述凝血酶原激活因子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
①根据SED ID NO：1所示的碱基序列设计引物，并分别在其5’端和3’端引物中引入酶切位点，5’端引物的酶切位点为Bam HI，3’端引物的酶切位点为Xho I；
5’端引物为GGATCCATGGCTCCTCAACTACTCCT；
3’端引物为CTCGAGTTGAATATATCACTTTTATTCTGTTCC；
②回收含有凝血酶原激活因子的DNA片段；
③用限制性内切酶Bam HI和Xho I对纯化后的凝血酶原激活因子DNA和表达载体pPIC9K进行双酶切，酶切温度为37℃，酶切时间为2.5～3.5小时，纯化回收酶切后的目的基因和载体；
④连接目的基因与载体，连接产物转入至大肠杆菌感受态中表达，挑选阳性重组质粒，测序，确定与SED ID NO：1所示的碱基序列一致；
⑤限制性内切酶切阳性重组质粒使其线性化，酶切温度为37℃，8～12小时后回收纯化酶切产物，将其电转至毕赤酵母感受态中，电转槽设置电转参数为1500V，25μF，200Ω，电击时间6ms，电击完毕加入1M冰预冷的D-山梨醇，混匀，转入灭菌的离心管中，30℃培养箱中孵育2～3小时，孵育完毕，菌液涂布平板，30℃倒置培养3～4天，得到单菌落；
⑥挑选单菌落，菌落PCR筛选凝血酶原激活因子重组毕赤酵母，得到凝血酶原激活因子酵母工程菌；
⑦将凝血酶原激活因子酵母工程菌接种至pH为5.5～6.5的培养基中，培养发酵95～100小时，用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化，填料为琼脂糖树脂，先用2～4倍柱体积的平衡液洗涤柱子，再用2～4倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到凝血酶原激活因子；
所述平衡液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和10mM咪唑；
所述洗脱液为20mM Tris-HCl，含500mM NaCl和200mM咪唑。
3.根据权利要求2所述凝血酶原激活因子的制备方法，其特征在于：步骤⑦中的培养基为BMGY培养基，具体组成，以质量体积比计包括2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母氮碱，4×10-5D-维生素，1％甘油，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求3所述凝血酶原激活因子的制备方法，其特征在于：步骤⑦中的BMGY培养基中，还包括1.5％甲醇和终浓度为10mM的抗坏血酸。
5.根据权利要求3所述凝血酶原激活因子的制备方法，其特征在于：冷冻干燥的具体步骤为，将物料在真空冷冻干燥机中，于-60～-40℃下预冷冻6～12小时，干燥仓真空度在5～15Pa下进行升华干燥，温度为20～25℃，时间10～12小时，升华结束后，升温至30～35℃，进入解析阶段，当加热板温度与物料温度一致时，结束干燥。
6.权利要求1所述一种凝血酶原激活因子的应用，其特征在于：在制备快速止血材料方面的应用。
7.一种快速止血材料，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：氧化石墨烯15～25份，聚乳酸60～80份，聚酰胺6～10份，聚丙烯腈3～6份，聚乙烯吡咯烷酮1～5份，凝血酶原激活因子0.1～0.5份，氯化钙8～10份和纳米二氧化钛2～6份；
所述凝血酶原激活因子的cDNA序列为SED ID NO：1所示的碱基序列。
8.根据权利要求7所述的一种快速止血材料，其特征在于：所述聚乙烯比咯烷酮为聚乙烯比咯烷酮K30。
9.权利要求7～8所述的任一种快速止血材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
⑴以重量份计，将60～80份聚乳酸加入到600～800份有机溶剂中，向其中加入6～10份聚酰胺和3～6份聚丙烯腈，在20～35℃下搅拌1～2小时，然后向其中加入1～5份聚乙烯吡咯烷酮和15～25份氧化石墨烯，搅拌30～60分钟得到纺丝液，经静电纺丝成型得到医用无纺布；
其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比5～8：1组成；
⑵将0.1～0.5份凝血酶原激活因子，8～10份氯化钙，2～6份纳米二氧化钛加入到200～400份去离子水中，开启搅拌，在10～40℃下搅拌1～3小时，得到凝血酶原激活因子溶液；
⑶将步骤⑴所得医用无纺布加入到步骤⑵所得凝血酶原激活因子溶液中，在10～40℃下震荡处理10～15小时，然后在10～40℃下真空干燥，得到快速止血材料。
10.根据权利要求9所述的一种快速止血材料的制备方法，其特征在于：静电纺丝成型的参数设置为电压24KV，流速0.8ml/h，接收距离为13cm。
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