CN113512132A - 一种快速止血水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速止血水凝胶及其制备方法，属于医用材料技术领域，该快速止血水凝胶的制备方法为：将壳聚糖溶于MES/HCL缓冲液，加入偶联剂，搅拌均匀，再加入胍基乙酸，搅拌反应后将产物透析，干燥，得到改性壳聚糖水凝胶。本发明一快速止血水凝胶止血效果佳、可快速愈合伤口、抗菌性高，可用于创伤、出血、受损组织和出血组织。

Description

一种快速止血水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种快速止血水凝胶及其制备方法。
背景技术
快速止血材料可以高效控制外伤伤口的失血，从而有效降低战争和日常意外事故中外伤大出血伤员的死亡率。但是由于创伤救治过程受各种复杂因素的影响，目前还尚未开发出理想的止血材料应用于现场和院前救治。理想的止血材料应具备以下特点：止血功能强大，能在2分钟内控制静脉和动脉的大量出血；使用前无需额外的混合工作和借助其他设备；使用简便，只需简单的操作步骤即可完成止血；轻质耐用，携带方便，在恶劣的环境下均能使用；在较宽的温度范围可以保持稳定(理想温度在-10～55℃)，并且保质期长(有效期至少2年)；不会对人体造成损伤和无病毒等感染的风险；价格低廉。另外，作为理想止血材也需要具备较强的吸收创面渗液能力、更换次数少、抗菌抗染、长期存留对伤口无刺激、缓释药物、可体内吸收等。然而现有止血材料仍然存在许多不足，如纤维蛋白类止血材料的环境适应性差，价格昂贵，保质期短；天然蛋白类止血材料可能导致过敏反应和系统性炎症；天然多糖类止血材料稳定性较差、存在杂蛋白等容易引起过敏反应，等等；无机类止血材料不具有生物可降解，且在生物安全性方面存在缺陷，等等。因此，开发安全性更好，止血效果更佳的快速止血材料势在必行。
发明内容
本发明的目的在于一种能快速激活凝血因子，减少血细胞凝集块形成的时间，降低凝血时间，且可快速愈合伤口，抗菌性高的改性壳聚糖。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种改性壳聚糖，其结构式为：
Figure BDA0003005095610000011
天然高分子壳聚糖良好的生物相容性和抗菌止血能力，但纯壳聚糖止血效果有限，在某些特殊创面止血效果不稳定，本发明采用胍基乙酸对壳聚糖进行改性，在羧基和氨基位置处通过形成酰胺键结合，获得的改性壳聚糖能快速激活凝血因子，明显减少血细胞凝集块形成的时间，从而大大降低凝血时间，提高壳聚糖的止血效果；且该改性壳聚糖细胞相容性良好，有利于细胞的增殖和新生肉芽的生长，可快速愈合伤口，同时壳聚糖的抗菌性也得到提高。
本发明的又一目的，在于提供一种止血效果佳、可快速愈合伤口、抗菌性高的快速止血水凝胶，包括上述改性壳聚糖。
根据本发明一实施方式，快速止血水凝胶的体外凝血时间小于60s。
本发明的又一目的，在于提供一种上述快速止血水凝胶的制备方法，将壳聚糖溶于MES/HCL缓冲液，加入偶联剂，搅拌均匀，再加入胍基乙酸，搅拌反应后将产物透析，干燥，得到改性壳聚糖水凝胶。
根据本发明一实施方式，MES/HCL缓冲液中MES浓度为20-30mmol/L，pH为4.0-6.0。
本发明的又一目的，在于提供一种上述快速止血水凝胶在治疗损伤中的用途。
根据本发明一实施方式，损伤选自创伤、出血、受损组织和出血组织。
本发明的有益效果为：本发明采用胍基乙酸对壳聚糖进行改性，在羧基和氨基位置处通过形成酰胺键结合，获得的改性壳聚糖能快速激活凝血因子，明显减少血细胞凝集块形成的时间，从而大大降低凝血时间，提高壳聚糖的止血效果；且该改性壳聚糖细胞相容性良好，有利于细胞的增殖和新生肉芽的生长，可快速愈合伤口，同时壳聚糖的抗菌性也得到提高。含有本发明改性壳聚糖的水凝胶止血效果佳、可快速愈合伤口、抗菌性高，可用于创伤、出血、受损组织和出血组织。
附图说明
图1为本发明实施例1中壳聚糖和改性壳聚糖的红外吸收光谱图；
图2为本发明实施例2中壳聚糖和壳聚糖阿魏酸衍生物的红外吸收光谱图；
图3为本发明试验例1中快速止血水凝胶对凝血因子的影响；
图4为本发明试验例1中快速止血水凝胶的凝血时间的测定结果；
图5为本发明试验例1中L929细胞的相对增殖率的计算结果；
图6为本发明试验例1中快速止血水凝胶的抑菌率；
图7为本发明试验例1中快速止血水凝胶的水蒸气透过率和氧气透过率。
具体实施方式
本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本发明一实施方式提供了一种改性壳聚糖，其结构式为：
Figure BDA0003005095610000031
天然高分子壳聚糖良好的生物相容性和抗菌止血能力，但纯壳聚糖止血效果有限，在某些特殊创面止血效果不稳定，本实施方式采用胍基乙酸对壳聚糖进行改性，在羧基和氨基位置处通过形成酰胺键结合，获得的改性壳聚糖能快速激活凝血因子，明显减少血细胞凝集块形成的时间，从而大大降低凝血时间，提高壳聚糖的止血效果；且该改性壳聚糖细胞相容性良好，有利于细胞的增殖和新生肉芽的生长，可快速愈合伤口，同时壳聚糖的抗菌性也得到提高。
于本发明一实施方式中，一种壳聚糖的改性方法的反应过程为：
Figure BDA0003005095610000032
本发明一实施方式还提供了一种快速止血水凝胶，包括上述改性壳聚糖。
于本发明一实施方式中，快速止血水凝胶的体外凝血时间小于60s。
为了提高快速止血水凝胶的抗菌性、水蒸汽透过率和氧渗透性，从而提高快速止血水凝胶的止血效果，于本发明一实施方式中，快速止血水凝胶还包括壳聚糖阿魏酸衍生物，壳聚糖阿魏酸衍生物的抗菌效果优于壳聚糖，所以，壳聚糖阿魏酸衍生物的加入能够提高快速止血水凝胶的抗菌性；此外，壳聚糖阿魏酸衍生物可与改性壳聚糖网络相互缠绕，形成了更加致密的网络结构，从而提高使快速止血水凝胶的机械强度，且还能改善快速止血水凝胶的水蒸汽透过率和氧渗透性，加快伤口的愈合速率，且不影响其止血效果。优选的，快速止血水凝胶中改性壳聚糖和壳聚糖阿魏酸衍生物的重量比为3-22:1。
于本发明一实施方式中，壳聚糖阿魏酸衍生物的制备方法为：在阿魏酸-甲醇溶液中加入磷酸盐缓冲液、漆酶和壳聚糖，在室温下搅拌反应3-6h。反应后依次用大量的磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗，干燥，即得壳聚糖阿魏酸衍生物。
本发明一实施方式还提供了一种快速止血水凝胶的制备方法，将壳聚糖溶于MES/HCL缓冲液，加入偶联剂，搅拌均匀，再加入胍基乙酸，搅拌反应后将产物透析，干燥，得到改性壳聚糖水凝胶。
于本发明一实施方式中，MES/HCL缓冲液中MES浓度为20-30mmol/L，pH为4.0-6.0。
于本发明一实施方式中，偶联剂为EDC和NHS。
于本发明一实施方式中，一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为20-30mmol/L，pH＝4.0-6.0)中，搅拌1-3h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为20-30mmol/L，pH＝4.0-6.0)中，搅拌1-3h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将胍基乙酸加入到EDC/NHS溶液中，胍基乙酸和壳聚糖的重量比为1:2-5，胍基乙酸和EDC的重量比为1:0.2-0.4，搅拌反应1-3h后加入到壳聚糖溶液中，于40-60℃条件下搅拌反应10-16h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000-8000的透析袋中，蒸馏水透析3-5d，冷冻干燥，得到改性壳聚糖水凝胶粉。
于本发明一实施方式中，一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为20-30mmol/L，pH＝4.0-6.0)中，搅拌1-3h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为20-30mmol/L，pH＝4.0-6.0)中，搅拌1-3h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将胍基乙酸加入到EDC/NHS溶液中，胍基乙酸和壳聚糖的重量比为1:2-5，胍基乙酸和EDC的重量比为1:0.2-0.4，搅拌反应1-3h后加入到壳聚糖溶液中，于40-60℃条件下搅拌反应10-16h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000-8000的透析袋中，蒸馏水透析3-5d，冷冻干燥，得到改性壳聚糖水凝胶粉；
4)将改性壳聚糖水凝胶粉和壳聚糖阿魏酸衍生物分别利用去离子水配成1-5wt％的改性壳聚糖水溶液和1-5wt％的壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液；
5)按照重量比为3-22:1将改性壳聚糖水溶液和壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液混合均匀，再加入EDC/NHS溶液，搅拌反应5-15min，然后在2000-5000rpm下离心5-10min去除气泡，于4℃下继续交联反应10-15h，即得快速止血水凝胶，干燥，即得快速止血水凝胶粉。
本发明一实施方式还提供了一种快速止血水凝胶在治疗损伤中的用途。
于本发明一实施方式中，损伤选自创伤、出血、受损组织和出血组织。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌2h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌1.5h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将胍基乙酸加入到EDC/NHS溶液中，胍基乙酸和壳聚糖的重量比为1:3.2，胍基乙酸和EDC的重量比为1:0.3，搅拌反应2h后加入到壳聚糖溶液中，于50℃条件下搅拌反应12h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000的透析袋中，蒸馏水透析4d，冷冻干燥，得到改性壳聚糖水凝胶粉。
改性壳聚糖的结构式为：
Figure BDA0003005095610000061
将壳聚糖和改性壳聚糖分别与溴化钾混合后压片得样片，然后使用红外光谱仪对样片进行结构分析，扫描功率为50kHz，扫描范围为4000-500cm-1，扫描16次，分辨率为4.0m-1，以空气作为采样背景。壳聚糖和改性壳聚糖的红外吸收光谱如图1所示，图中a为壳聚糖的红外吸收光谱，图中b为改性壳聚糖的红外吸收光谱，可以看出，在改性壳聚糖的红外谱图中，在1642cm-1和1433cm-1处出现均新的吸收峰，其中，1642cm-1处的吸收峰属于胍基乙酸的胍基基团-CH4N2，1433cm-1处的吸收峰属于胍基乙酸的羧基基团-COO，以上结果说明胍基乙酸成功接到壳聚糖上。
实施例2：
壳聚糖阿魏酸衍生物的制备方法，具体为：将0.2g阿魏酸溶于20mL甲醇中得阿魏酸-甲醇溶液，加入150mL 60mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液、2mg漆酶和4g壳聚糖，在室温下搅拌反应3-6h，反应后依次用磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇和丙酮对产物进行漂洗，干燥，即得壳聚糖阿魏酸衍生物。
将壳聚糖和壳聚糖阿魏酸衍生物和溴化钾混合后压片得样片，然后使用红外光谱仪对样片进行结构分析，扫描功率为50kHz，扫描范围为4000-500cm-1，扫描16次，分辨率为4.0cm-1，以空气作为采样背景。壳聚糖和壳聚糖阿魏酸衍生物的红外吸收光谱如图2所示，可以看出，图中a为壳聚糖的红外吸收光谱，图中c为壳聚糖阿魏酸衍生物的红外吸收光谱，可以看出，在壳聚糖阿魏酸衍生物的红外谱图中，在1709cm-1和1664cm-1处出现均新的吸收峰，其中，1709cm-1处的吸收峰属于酯键，1664cm-1处的吸收峰属于酰胺键，以上结果说明成功获得壳聚糖阿魏酸衍生物。
实施例3：
一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌2h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌1.5h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将胍基乙酸加入到EDC/NHS溶液中，胍基乙酸和壳聚糖的重量比为1:3.2，胍基乙酸和EDC的重量比为1:0.3，搅拌反应2h后加入到壳聚糖溶液中，于50℃条件下搅拌反应12h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000的透析袋中，蒸馏水透析4d，冷冻干燥，得到改性壳聚糖水凝胶粉；
4)将改性壳聚糖水凝胶粉和实施例2得壳聚糖阿魏酸衍生物分别利用去离子水配成2.5wt％的改性壳聚糖水溶液和2.5wt％的壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液；
5)按照重量比为16:1将改性壳聚糖水溶液和壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液混合均匀，再加入EDC/NHS溶液，搅拌反应10min，然后在4000rpm下离心6min去除气泡，于4℃下继续交联反应12h，即得快速止血水凝胶，干燥，即得快速止血水凝胶粉。
实施例4：
一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌2h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌1.5h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将胍基乙酸加入到EDC/NHS溶液中，胍基乙酸和壳聚糖的重量比为1:3.2，胍基乙酸和EDC的重量比为1:0.3，搅拌反应2h后加入到壳聚糖溶液中，于50℃条件下搅拌反应12h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000的透析袋中，蒸馏水透析4d，冷冻干燥，得到改性壳聚糖水凝胶粉；
4)将改性壳聚糖水凝胶粉和壳聚糖分别利用去离子水配成2.5wt％的改性壳聚糖水溶液和2.5wt％的壳聚糖水溶液；
5)按照重量比为16:1将改性壳聚糖水溶液和壳聚糖水溶液混合均匀，再加入EDC/NHS溶液，搅拌反应10min，然后在4000rpm下离心6min去除气泡，于4℃下继续交联反应12h，即得快速止血水凝胶，干燥，即得快速止血水凝胶粉。
实施例5：
一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌2h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌1.5h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将壳聚糖溶液加入到EDC/NHS溶液中，壳聚糖和EDC的用量与实施例1相同，于50℃条件下搅拌反应12h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000的透析袋中，蒸馏水透析4d，冷冻干燥，得到壳聚糖水凝胶粉。
实施例6：
一种快速止血水凝胶的制备方法，具体为：
1)将壳聚糖加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌2h，完全溶解，得到壳聚糖溶液；
2)将摩尔比为1:1的EDC和NHS加入MES/HCL缓冲液(MES浓度为22mmol/L，pH＝5.0)中，搅拌1.5h，完全溶解，得到EDC/NHS溶液；
3)将壳聚糖溶液加入到EDC/NHS溶液中，壳聚糖和EDC的用量与实施例1相同，于50℃条件下搅拌反应12h，然后将产物装入截留相对分子质量为5000的透析袋中，蒸馏水透析4d，冷冻干燥，得到壳聚糖水凝胶粉；
4)将壳聚糖水凝胶粉和实施例2得壳聚糖阿魏酸衍生物分别利用去离子水配成2.5wt％的改性壳聚糖水溶液和2.5wt％的壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液；
5)按照重量比为16:1将壳聚糖水溶液和壳聚糖阿魏酸衍生物水溶液混合均匀，再加入EDC/NHS溶液，搅拌反应10min，然后在4000rpm下离心6min去除气泡，于4℃下继续交联反应12h，即得快速止血水凝胶，干燥，即得快速止血水凝胶粉。
试验例1：
快速止血水凝胶的性能测试
1.凝血因子的激活试验
在20μL人血浆中加入20μL PBS溶液稀释，加入20μL 2mg/mL实施例1快速止血水凝胶粉与人血浆37℃孵育15min，设为试验1组；在20μL人血浆中加入20μL PBS溶液稀释，加入20μL 2mg/mL实施例3快速止血水凝胶粉与人血浆37℃孵育15min，设为试验2组；在20μL人血浆中加入20μL PBS溶液稀释，加入20μL 2mg/mL实施例4快速止血水凝胶粉与人血浆37℃孵育15min，设为试验3组；在20μL人血浆中加入20μL PBS溶液稀释，加入20μL 2mg/mL实施例5快速止血水凝胶粉与人血浆37℃孵育15min，设为试验4组；在20μL人血浆中加入20μLPBS溶液稀释，加入20μL 2mg/mL实施例6快速止血水凝胶粉与人血浆37℃孵育15min，设为试验5组；在20μL人血浆中加入20μL PBS溶液稀释，加入20μL 0.9％生理盐水孵育37℃15min，设为空白组；孵育结束后14000r/min离心5min，取上清，加入2×SDS上样缓冲液和2.5％β-ME，热水浴5min后，上样于8％丙烯酰胺胶，12μL/孔，100V，跑胶，120V湿转2h后，封闭1h，FXII抗体37℃孵育2h后，TBST洗膜，37℃二抗孵育1h后显影。结果如图3，可以看出，与空白组相比，试验1组中FXII含量明显降低，这说明试验1组用实施例1得快速止血水凝胶能够快速激活FXII生成FXIIa，导致纤维蛋白生成，内源性凝血系统的激活，产生止血效应，降低凝血时间；与试验1组相比，试验2组中FXII含量变化不明显，这说明快速止血水凝胶中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入对其止血效果无不良影响。
2.快速止血水凝胶的凝血时间
精确称取0.10g快速止血水凝胶粉(试验1组为实施例1组快速止血水凝胶粉，试验2组为实施例3组快速止血水凝胶粉，试验3组为实施例4组快速止血水凝胶粉，试验4组为实施例5组快速止血水凝胶粉，试验5组为实施例6组快速止血水凝胶粉)，送至内径为0.8cm的洁净干燥试管底部，空白对照组为未抗凝新鲜全血。将新西兰大白耳兔置于保定器内，从新西兰兔采集未抗凝新鲜全血5mL，自血液进入采血针时立即启动秒表，加入1mL新鲜全血于试管中立即用漩涡混合器混匀3s，将试管置于37℃电热恒温水浴锅，每隔5s倾斜一次试管，观察血液流动状态，直至血液不流动，记录全血凝固时间，平行测定3次。
快速止血水凝胶的凝血时间的测试结果如图4所示，可以看出，本发明试验1组至试验5组用实施例1和实施例3得快速止血水凝胶均能有效的降低凝血时间；与试验4组相比，试验1组用实施例1得快速止血水凝胶的凝血时间较低，凝血时间小于60s，这说明实施例1用改性壳聚糖能够大大降低凝血时间，提高壳聚糖的止血效果；与试验1组相比，试验2组用实施例3得快速止血水凝胶的凝血时间变化不明显，且凝血时间小于60s，这说明快速止血水凝胶中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入对其止血效果无不良影响。以上结果与凝血因子的激活试验结果一致。
3.快速止血水凝胶的细胞毒性
浸提液的制备：分别精密称定经钴60辐照25kGy灭菌的快速止血水凝胶0.5g到浸提瓶，根据医疗器械生物学评价标准(GB/T16886.12-2017)制备浸提液，即试验样品除材料的“吸收容量”外，以0.1g/mL比例进行浸提，将1640培养基放入37℃水浴预热30min，按除止血材料吸附容量，再以0.1g/mL比例加入培养基到上述含有止血粉浸提瓶中，37℃浸提72h。72h后取上层浸提液，10000rpm，离心10min。取上层浸提液，过膜(0.22μm)除菌，制备100％浸提液。
细胞培养：L929细胞在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的1640培养液中培养，培养箱条件设为37℃，5％CO2。当细胞处于对数生长期末汇合度约80％时，采用含1mM EDTA的0.25％胰酶溶液消化。将L929细胞接种于96孔板内，每孔3×103个，然后将96孔板放置于培养箱中孵育24h。取出96孔板，弃去旧液，分别加入收集的浸提液，每孔加150μL，继续放置培养箱中培养。48h后，取出，每孔加入CCK-8工作液(无血清1640：CCK-8＝10:1)现配现用。放置培养箱中反应1-2h。放置酶标仪中读取OD值。测试波长450，每种样品设6个复孔，空白培养液为对照组。相对增殖率(％)通过如下公式计算：
相对增殖率＝OD样品[OD450]/OD空白对照[OD450]×100％。
L929细胞的相对增殖率的计算结果如图5，图中，试验1组为实施例1快速止血水凝胶，试验2组为实施例3快速止血水凝胶，试验3组为实施例4快速止血水凝胶，试验4组为实施例5快速止血水凝胶，试验5组为实施例6快速止血水凝胶。从图5可以看出，试验1组细胞的相对增殖率高于试验4组，这说明实施例1用改性壳聚糖细胞相容性良好，有利于细胞的增殖和新生肉芽的生长，可快速愈合伤口；试验2组细胞的相对增殖率高于试验1组，这说明快速止血水凝胶中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入能够提高速止血水凝胶的细胞相容性，从而加快伤口的愈合速率。
4.快速止血水凝胶的抗菌性
称取5g牛肉膏，10g蛋白胨，10g氯化钠溶解在1000mL的ddH2O中，搅拌至充分溶解，并将pH调至7.0-7.5，高压灭菌得到；固体培养基按每1000mL培养基加15g琼脂粉，高压灭菌得到细菌培养基。分设置三组共同培养，试验1组为实施例1快速止血水凝胶，试验2组为实施例3快速止血水凝胶，对照组没有快速止血水凝胶，使其处于生长对数期。将大肠杆菌菌种于37℃条件下4mL培养液中培养18h，然后将菌种培养液用普通培养基依次稀释至100、102、104、108倍。所有待测材料均裁剪成直径为4cm的圆片，并分别放于不同的磨口锥形瓶中，同时加入上述细菌溶液，最后可以通过如下公式计算抑菌率(％)：
抑菌率(％)＝(对照组活菌总数-试验组活菌总数)/对照组活菌总数×100％。
快速止血水凝胶的抑菌率如图6，从图6可以看出，试验1组用实施例1快速止血水凝胶的抑菌率高于试验4组，这说明实施例1用改性壳聚糖的抑菌性好，亦即，采用胍基乙酸对壳聚糖进行改性，能够提高壳聚糖的抗菌性；试验2组用实施例3快速止血水凝胶的抑菌率高于试验1组，这说明快速止血水凝胶中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入能够提高速止血水凝胶的抑菌性。
5.快速止血水凝胶的水蒸气透过率
将ASTM E96-00标准测试方法稍作改动，用于测定复合膜/复合海绵的水蒸气透过率。取统一规格西林瓶，并添加一定质量的无水CaCl2于西林瓶，以保持瓶内无水环境。根据西林瓶口直径，将复合膜与复合海绵裁成相应直径圆片，用液体石蜡将其封在西林瓶口上方，以保证西林瓶口完全被复合材料遮盖，且材料与瓶口接触处密封完好。将经过处理的西林瓶置于底部含有NaCl溶液(75％RH)的密封罐中，整个密封罐置于30℃恒温箱24h，称取西林瓶前后重量差以计算复合材料的水蒸气透过率。通过如下公式计算水蒸气透过率：
水蒸气透过率(kg/(24h·m2))＝(W0-Wt)/(24h·A)，式中，
A-西林瓶口的面积(mm2)；
W0-西林瓶刚放置在37℃时的初始质量(g)；
Wt-西林瓶放置时间T后的质量(g)；
T-24h。
水蒸气透过率过小可能引起创面渗出物过量积累，而水蒸气透过率过大则可能导致创面过度干燥。快速止血水凝胶的水蒸气透过率如图7，从图7可以看出，试验1组用实施例1快速止血水凝胶的水蒸气透过率稍小于试验4组，这说明实施例1用快速止血水凝胶膜能够减少水分蒸发损失，有利于维持湿润伤口环境；试验2组用实施例3快速止血水凝胶膜的水蒸气透过率远小于试验1组，这说明实施例3用快速止血水凝胶膜中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入能够改善速止血水凝胶的水蒸气透过率，大大减少水分蒸发损失，从而湿润伤口环境。
6.快速止血水凝胶的氧气透过率
将200mL煮沸后冷却的蒸馏水添加到250mL止的烧瓶中，然后在瓶口放置快速止血水凝胶膜(制备方法如快速止血水凝胶的水蒸气透过率的测定方法)并密封好，测试氧气的渗透率。在开放的环境中放置24h后，用Winkler方法分析水中溶解的氧气含量。
快速止血水凝胶的氧气透过率如图7，从图7可以看出，试验1组用实施例1快速止血水凝胶的氧气透过率稍高于试验4组，这说明实施例1用快速止血水凝胶膜允许一定量的氧气穿透，适用于细胞再生，并有助于加速愈合过程；试验2组用实施例3快速止血水凝胶膜的氧气透过率远大于试验1组，这说明实施例3用快速止血水凝胶膜中壳聚糖阿魏酸衍生物的加入能够改善速止血水凝胶的氧气透过率，适用于细胞再生，并有助于加速愈合过程。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种改性壳聚糖，其结构式为：
Figure FDA0003005095600000011
2.一种快速止血水凝胶，包括权利要求1所述的改性壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的一种快速止血水凝胶，其特征在于：所述快速止血水凝胶的体外凝血时间小于60s。
4.一种权利要求2或3所述的快速止血水凝胶的制备方法，将壳聚糖溶于MES/HCL缓冲液，加入偶联剂，搅拌均匀，再加入胍基乙酸，搅拌反应后将产物透析，干燥，得到改性壳聚糖水凝胶。
5.根据权利要求4所述的一种快速止血水凝胶的制备方法，其特征在于：所述MES/HCL缓冲液中MES浓度为20-30mmol/L，pH为4.0-6.0。
6.一种权利要求2或3所述的快速止血水凝胶在治疗损伤中的用途。
7.根据权利要求6所述的一种快速止血水凝胶在治疗损伤中的用途，其特征在于：所述损伤选自创伤、出血、受损组织和出血组织。
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