KR102645212B1 - 지혈 조성물 - Google Patents
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Abstract
멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물은 복수의 담체 및 담체에 고정된 복수의 피브리노겐 결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제; 생체적합성 액체; 및 지혈에 사용하기에 적합하고 상기 생체적합성 액체에 불용성인 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자를 포함한다. 이러한 조성물은 특히 수술 과정에서 출혈의 조절을 위하여 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 지혈 조성물, 특히 멸균성의 바로 사용 가능한 형태의 유동성 지혈 조성물, 지혈 조성물을 제조하는 방법 및 특히 수술 과정에서 출혈의 조절을 위한 조성물의 용도에 관한 것이다.
가용성 전구체 피브리노겐으로부터 불용성 피브린 중합체의 형성은 혈액 응고의 최종 단계이다. 피브리노겐의 피브린으로의 전환은 하기 3가지 단계에서 일어난다: 피브리노겐의 트롬빈에 의한 피브린 단량체로의 제한된 단백질분해; 피브린 단량체의 절반 엇갈린, 이중 가닥 프로토피브릴로의 조립; 및 응괴를 강화시키기 위하여 조립된 피브린의 가교결합.
피브리노겐의 분자는 다이설파이드 결합에 의해 함께 연결된, 3쌍의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬, Aα, Bβ 및 γ로 이루어진다. 피브리노겐 사슬은 하나의 중심 E 영역에 연결된 2개의 원위 D 영역으로, 3개의 구별되는 구조적 영역으로 폴딩된다. 각각의 D 영역은 각각 γ 및 Bβ 사슬의 C 말단에 위치된 중합 'a' 및 'b' 구멍을 함유한다. 트롬빈은 중심 E 영역 내 피브리노겐의 Aα 및 Bβ 사슬의 아미노 말단으로부터, 짧은 펩타이드, 피브리노펩타이드 A(FpA) 및 B(FpB)의 제거를 촉매하여, 아미노-말단 서열 Gly-Pro-Arg-을 갖는 "노브(knob)(A)"; 및 아미노 말단 서열 Gly-His-Arg-을 갖는 "노브(B)"의 2개의 중합 부위를 노출시킨다. 하나의 피브린 단량체의 새롭게 노출된 중합 노브는 'A-a' 및 'B-b' 노브-구멍 상호작용을 통해 다른 피브린 단량체의 상응하는 구멍과 상호작용하여, 절반 엇갈린, 이중 가닥 프로토피브릴로 피브린 단량체의 조립을 유발시킨다.
프로토피브릴은 피브린 응괴의 3차원 망상체를 형성하도록 유착되는 더 두꺼운 섬유를 만들기 위하여 횡방향으로 응집된다. FpA는 FpB보다 더 신속하게 피브리노겐으로붙 절단된다. FpA의 제거는 프로토피브릴의 형성을 촉발시키는 한편, FpB의 제거는 이의 횡방향 응집과 일치한다. FpB 방출은, 이 반응의 개시 시에 매우 느리지만, 중합체 형성 시 가속된다. FpB 절단의 이러한 지연은 통상의 피브린 조립을 위해 필요하고, 또한 상이한 유형의 응괴의 형성과 연결된다. FpA만이 제거되는 피브린 I은, 덜 컴팩트하고, 플라스민에 의해 더 용이하게 소화되는 반면, FpA 및 FpB 둘 다가 제거되는 피브린 II는, 더욱 컴팩트하고 섬유소용해에 대해서 더욱 내성이 있다.
오로지 FpA 또는 원칙적으로 FpB를 제거하는 뱀독 효소에 의한 연구는, 피브린 응괴가 'A-a' 또는 'B-b' 상호작용에 의해 형성될 수 있는 것을 입증하였으며, 이는 두 상호작용이 프로토피브릴 형성을 매개할 수 있는 것을 나타낸다. 변이체 재조합 피브리노겐에 의한 실험은 'A-a' 상호작용이 약화된 경우 'B-b' 상호작용이 프로토피브릴 형성에 실질적인 역할을 할 수 있는 것은 나타내었다. 다른 연구는, 두 'B' 노브 및 'b' 구멍이 이용 가능한 경우에도 피브린 단편의 피브리노겐 분자에의 결합 동안 'A-a' 상호작용만이 일어나고, 그리고 'A-a' 상호작용이 배제된 경우에만 'B-b' 노브-구멍 상호작용이 명백한 것을 입증하였다. 그러나, 펩타이드 저해 연구는 'B-b' 상호작용이 'A-a'와 동시에 일어날 수 있는 것을 나타내었다.
피브린은 피브린 섬유 내 상이한 분자의 곁사슬 간의 공유 가교결합의 형성에 의해 안정화된다. 펩타이드 결합은 인자 XIIIa에 의해 촉매된 아미노기 전이 반응에서 특정 글루타민 및 라이신 곁사슬 간에 형성된다.
출혈 부위에서의 직접 압력의 인가는, 출혈의 공급원이 식별되기 어려울 경우(예를 어, 미만성 정맥 출혈에서), 또는 고유 응고장애가 존재할 경우 출혈을 조절하기에 충분하지 않을 수 있다. 지혈은 또한 특히 심장 또는 혈관 수술을 경험한 환자에서뿐만 아니라, 심폐 바이패스와 연관된 변화로부터 항혈소판 및 항응고제의 존재로 인해 위태롭게 된다. 이러한 경우에 국소 지혈제는 치혈을 달성하는 통상의 방법에 유용한 부가물을 제공한다.
젤라틴 기반의 지혈제는 외과 수술에서 사용된다. 젤라틴 분말은, 유체와 혼합될 때 최종 용도 및 분말과 유체의 비율에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 더 높은 농도의 유체가 사용되는 경우, 유동성 지혈제로서 유용한 페이스트 또는 슬러리가 확산 출혈, 특히 고르지 않은 표면 또는 도달하기 어려운 영역에서의 사용을 위해 제조될 수 있다. 이러한 페이스트는 조성물의 균일성을 제공하기 위해 분말 및 액체의 기계적 교반 및 혼합에 의해 사용 시점에서 제조된다. 이어서, 페이스트를 전달 수단 또는 애플리케이터, 예를 들어 주사기에 넣고 상처에 적용한다.
일부 젤라틴 기반의 지혈제는 동결 건조된 트롬빈과 함께 유동성 젤라틴 매트릭스로서 키트 형태로 상업적으로 입수 가능하다. 사용하기 전에, 동결 건조된 트롬빈을 물 또는 염수 중에서 재구성하고 젤라틴 매트릭스와 혼합한다. 젤라틴 매트릭스의 과립 성질은 물질이 임의의 불규칙한 상처 형상에 순응할 수 있게 한다. 혼합물의 성분은 출혈 부위에서 지혈을 촉진시키기 위하여 상승작용적으로 작용한다. 젤라틴 과립은 혈액에 노출 시 팽윤되어, 혈류를 감소시키고 부드러운 탐폰삽입을 제공한다. 과립 사이의 공간을 통과하는 혈액은 고농도의 트롬빈에 노출된다. 트롬빈은 효소적으로 혈액 내의 피브리노겐을 피브린 단량체로 전환시키며, 이러한 단량체는 중합된다. 피브린 중합체는 출혈 부위에서 젤라틴 과립 및 다른 세포 요소를 포획한다. 신체는, 정상적인 상처 치유의 시간 경과와 일치하여, 몇 주 이내에 얻어지는 응괴에 포함된 젤라틴 과립을 흡수한다.
상업적으로 입수 가능한 젤라틴 기반의 지혈 키트는 플로씰 지혈 매트릭스 키트(FLOSEAL Hemostatic Matrix kit)이다. 젤라틴 매트릭스는 일회용 주사기에서 멸균 겔로 제공되는 가교결합된 젤라틴 과립으로 구성된다. 트롬빈은 멸균 동결 건조 분말 제제로서 공급되며 희석제로서 멸균 염화나트륨으로 제공된다. 젤라틴 매트릭스는 소의 진핵 세포로부터 콜라겐을 추출한 다음 콜라겐을 젤라틴화시키고, 글루타르알데하이드로 가교결합시키고, 가교결합된 젤라틴을 500 내지 600㎛ 크기의 입자로 분쇄함으로써 제조된다. 또 다른 상업적으로 입수 가능한 키트는 트롬빈을 구비한 서지플로 지혈 매트릭스 키트(SURGIFLO Hemostatic Matrix Kit)이다. 상기 매트릭스는 트롬빈과 혼합되도록 사전충전형 주사기에 공급된다. 매트릭스를 제조하는데 사용된 젤라틴은 돼지 가죽으로부터 유래된다. 젤라틴을 가공 처리하여 젤라틴 분말 생성물을 수득한 다음, 이를 가공 처리하여 페이스트를 수득한다. 트롬빈은 물에 재구성하기 위한 동결 건조된 분말로서 제공된다.
젤라틴 매트릭스 및 트롬빈을 포함하는 지혈제는 수술 중 출혈을 조절하는데 효과적이지만, 이러한 유형의 제품은 몇 가지 단점을 갖는다. 특히, 트롬빈은 용액에서 안정하지 못하며, 적어도 이의 활성의 일부를 파쇄하지 않으면서 용액 중에서 멸균될 수 없다. 결과적으로, 트롬빈은 사용하기 몇 시간 이내에 젤라틴 매트릭스와 혼합하기 전에, 재구성을 위한 동결 건조된 분말로서 개별적으로 제공된다. 이러한 단계는 혼합물의 무균 상태를 손상시킬 위험이 있고, 외과 수술에 불편하며, 이러한 제품을 병원 밖의 외상성 상처 치료에 사용할 수 없게 만든다. 현재 상업적으로 입수 가능한 키트에 제공된 트롬빈은 일련의 분리 및 여과 단계를 통해서 승인된 혈장 수집 센터로부터 얻어진 혼주된 인간 혈장으로부터 제조된다. 이들 절차는 바이러스 또는 프리온 감염의 위험을 상당히 저감시키지만, 위험을 제거하지는 못한다.
따라서 외과 수술에서 출혈을 조절하기에 적합한 안정적인 바로 사용 가능한 지혈제를 제공할 필요가 있다. 또한, 트롬빈을 포함하는 통상의 유동성 지혈제보다 멸균에 내성이 있는 바로 사용 가능한 지혈제를 제공할 필요가 있다. 트롬빈을 포함하는 현재 상업적으로 입수 가능한 유동성 지혈제보다 바이러스 또는 프리온 감염성의 위험이 훨씬 더 저감된 지혈제에 대한 더 한층의 요구가 있다.
[선행기술 목록]
WO2012/104638
WO2015/005345
[선행기술 목록]
WO2012/104638
WO2015/005345
본 발명에 따르면, 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제를 포함하는 가용성 지혈제; 생체적합성 액체; 및 지혈에 사용하기에 적합하고 생체적합성 액체에 불용성인 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자를 포함하는 지혈 조성물이 제공된다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따르면, 조성물은 바로 사용 가능한, 유동성, 지혈 조성물이다.
본 발명의 조성물 내 지혈제는 놀랍게도 멸균, 특히 증기 멸균, 또는 건열 멸균(dry-heat sterilization)에 내성이 있는 것으로 판명되었다. 결과적으로, 본 발명의 조성물은 지혈 활성의 상당한 손실 없이 통상의 멸균 방법을 이용해서 멸균될 수 있다. 이것은 이 조성물이 수화된, 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물로서 제공될 수 있게 하기 때문에 중요한 이점이다. 트롬빈을 포함하는 통상의 젤라틴-기반 지혈제는 수화된 바로 사용 가능한 형태로 열 또는 증기 멸균된 경우 안정적이지 않다.
용어 "지혈"은 출혈을 정지 또는 최소화시키는 능력을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
용어 "생체적합성"은 물질이 독성 또는 유해하지 않고 면역 거부를 일으키지 않음으로써 살아있는 조직과 양립할 수 있는 것을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 물질은 바람직하게는 국제 표준화 기구(NAMSA, 오하이오주 노스우드 소재)에서 공표한 표준 # ISO 10993-1의 기준을 충족시켜야 한다.
용어 "유동성"은, 예를 들어 오리피스 또는 캐뉼러를 통해 압출될 때 또는 주걱을 사용하여 전달 부위로 패킹될 때 역치 수준을 넘어 응력을 받을 때 조성물이 유동하는 것을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 역치 응력은 전형적으로 3 x 104 Pa 내지 5 x 105 Pa의 범위이다. 그러나, 조성물은 역치 수준 아래의 응력을받을 때 일반적으로 움직이지 않은 채로 있을 것이다. 유동성 조성물은 일반적으로 조성물이 전달되는 표적 부위에서의 불규칙한 상처 형태에 순응할 수 있다.
지혈제, 액체 및 불용성 입자는 액상 전체를 통해서 실질적으로 균질하게 분산된 입자를 포함하는 연속적인, 생체적합성 액상을 포함하는 실질적으로 균질한 지혈 조성물을 제공하는데 유효한 조건 하에 조합되고 혼합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 균질한"은, 고체 입자가 고체:액체의 비 및 조성물의 임의의 부분 또는 단면의 밀도가 실질적으로 동일하도록 연속 액상을 통해서 균일하게 분산된 조성물의 물리적 상태를 나타낸다.
본 발명의 소정 양상에 따르면, 조성물은 흡수성이다. 용어 "흡수성"은, 환자의 신체의 (유방 이식물과 같은 이식 기구 내에 보호되지 않은) 표적 부위에 직접 투여될 경우, 조성물이 그들의 초기 적용 후에 1년 이하, 보통 1일 내지 1년, 더욱 보통 1 내지 120일, 또는 1 내지 90일, 또는 2 내지 30일의 시간 기간에 걸쳐서 분해되거나 가용화되는 것을 의미하도록 본 명세서에서 이용된다. 흡수 및 분해를 측정하는 프로토콜은 WO 98/08550에 제시되어 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 지혈제는 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 이것은 놀랍게도 지혈제가 본 발명의 지혈 조성물에 존재할 경우 피브리노겐을 중합시킬 수 있는 것으로 판명되었다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 지혈제는 수용액 중 트롬빈의 부재 중에 피브리노겐을 중합시킬 수 있다. 각각의 피브리노겐 분자는 피브리노겐-결합 펩타이드 중 적어도 2개에 결합할 수 있다. 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드가 각각의 담체에 고정되므로, 피브리노겐 분자는 담체를 통해서 함께 연결된다. 비-공유 결합은 피브리노겐 분자와 피브리노겐-결합 펩타이드 사이에 형성된다. 수용액 중에서, 중합된 피브리노겐을 포함하는 하이드로겔은 지혈제가 피브리노겐과 접촉될 경우 형성된다.
지혈제는 생체적합성 액체에, 그리고 혈장에 가용성이어야 한다. 지혈제는 용제 1㎖당 적어도 10㎎, 예를 들어, 10 내지 1000㎎/㎖, 33 내지 1000㎎/㎖, 또는 33 내지 100 ㎎/㎖의 용해도를 지닐 수 있다. 지혈제는 출혈 상처 부위에 투여하기 적합해야 한다. 담체는 중합체, 예를 들어 단백질, 다당류, 또는 합성 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 알부민은 단백질 담체의 일례이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 피브리노겐-결합 펩타이드는 담체에 공유적으로 고정된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 가용성 지혈제는 WO 2008/065388(이의 내용은 이의 전문이 본 명세서에 편입됨)에 기술된 바와 같은 바이오겔의 형성을 위한 가용성 제제이다. WO 2008/065388은 가용성 인간 혈청 알부민(HSA) 담체에 접합된 몇가지 피브리노겐-결합 펩타이드(각각 펩타이드의 아미노-말단 단부에 피브리노겐-결합 펩타이드 서열 GPRP-를 포함함)를 포함하는 제제를 이용하는 바이오겔의 형성을 기술한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 지혈제의 각각의 담체는 분지된 코어, 및 각각의 분지된 코어에 개별적으로 공유적으로 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 지혈제는 분지된 코어, 및 분지된 코어에 개별적으로 공유적으로 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머일 수 있다.
분지된 코어는,
2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기로서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된, 상기 2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 분지된 코어의 적어도 2개의 인접한 다작용성 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 분지된 코어의 적어도 하나의 다작용성 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 다작용성 아미노산 잔기가 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 측쇄를 통해 공유적으로 연결된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기; 또는
단일 다작용성 아미노산 잔기, 및 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 다작용성 아미노산 잔기의 각각의 작용기에 공유적으로 부착된 것을 포함할 수 있되;
여기서 다작용성 아미노산 잔기는 삼작용성 또는 사작용성 아미노산 잔기, 또는 삼중 및 사작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 또는 단일 다작용성 아미노산 잔기가 삼작용성 또는 사작용성 아미노산 잔기이다.
각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 분지된 코어에 대해 상이한 부착점을 가지므로, 피브리노겐-결합 펩타이드는 본 명세서에서 분지된 코어에 "개별적으로 공유적으로 부착된"이라고 한다.
분지된 코어는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 분지된 코어는 최대 10개의 다작용성 아미노산 잔기, 예를 들어, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 6개의 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
분지된 코어는 복수의 연속되는 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 분지된 코어는 최대 10개의 연속되는 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "삼작용성 아미노산"는 본 명세서에서 아민(-NH2)인 제1 작용기, 카복실산(-COOH)인 제2 작용기, 및 제3 작용기를 갖는 임의의 유기 화합물을 의미한다. 용어 "사작용성 아미노산"은 본 명세서에서 아민(-NH2)인 제1 작용기, 카복실산(-COOH)인 제2 작용기, 제3 작용기, 및 제4 작용기를 갖는 임의의 유기 화합물을 의미한다. 제3 및 제4 작용기는 피브리노겐-결합 펩타이드의 카복시 말단, 또는 피브리노겐-결합 펩타이드의 카복시 말단에 부착된 링커의 작용기와 반응할 수 있는 임의의 작용기일 수 있다.
다작용성 아미노산은 아미노기, 카복실기, 및 추가 작용기(삼작용성 아미노산을 제공하게 됨), 또는 추가의 2개 작용기(사작용성 아미노산을 제공하게 됨)를 보유하는 측쇄를 보유하는 중심 탄소원자(α- 또는 2-)를 포함할 수 있다.
상기 또는 각각의 다작용성 아미노산 잔기는 단백질형성성 또는 비단백질형성성 다작용성 아미노산의 잔기이거나, 또는 천연 또는 비천연 다작용성 아미노산의 잔기일 수 있다.
단백질형성성 삼작용성 아미노산은 아미노기, 카복실기, 측쇄 및 α-수소 레보 입체구조를 보유하는 중심 탄소 원자(α- 또는 2-)를 보유한다. 적합한 삼작용성 단백질형성성 아미노산의 예는 L-리신, L-아르기닌, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-아스파라긴, L-글루타민, 및 L-시스테인을 포함한다.
적합한 삼작용성 비단백질형성성 아미노산 잔기의 예는 D-리신, 베타-리신, L-오르니틴, D-오르니틴, 및 D-아르기닌 잔기를 포함한다.
따라서, 본 발명의 조성물의 지혈제에 사용하기 위한 적합한 삼작용성 아미노산 잔기의 예는 리신, 오르니틴, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 및 시스테인 잔기, 예컨대 L-리신, D-리신, 베타-리신, L-오르니틴, D-오르니틴, L-아르기닌, D-아르기닌, L-아스파르트산, D-아스파르트산, L-글루탐산, D-글루탐산, L-아스파라긴, D-아스파라긴, L-글루타민, D-글루타민, L-시스테인, 및 D-시스테인 잔기를 포함한다.
본 발명의 조성물의 지혈제에 사용하기 적합한 다작용성 비천연 아미노산의 예는 시트룰린, 2,4-다이아미노아이소부티르산, 2,2'-다이아미노피멜산, 2,3-다이아미노프로피온산, 및 시스-4-아미노-L-프롤린을 포함한다. 다작용성 비천연 아미노산은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)에서 입수할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 분지된 코어는 동종중합성 다작용성 아미노산 서열, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 폴리오르니틴 서열, 예컨대 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 6개의, 연속되는 리신, 아르기닌, 또는 오르니틴 잔기를 포함하는 분지된 코어를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 분지된 코어는 상이한 다작용성 아미노산 잔기, 예를 들어 1개 이상의 리신 잔기, 1개 이상의 아르기닌 잔기, 및/또는 1개 이상의 오르니틴 잔기를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 분지된 코어는 복수의 다작용성 아미노산 잔기, 및 1개 이상의 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
분지된 코어가 복수의 다작용성 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 인접한 다작용성 아미노산 잔기는 펩타이드 결합에 의한, 아미노산 측쇄 연결에 의해 함께 연결될 수 있거나, 또는 일부 인접한 다작용성 아미노산 잔기는 측쇄 연결에 의하고 나머지는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결될 수 있다.
추가 실시형태에서, 분지된 코어는 2개 이상의 다작용성 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드는 개별적으로 다작용성 아미노산 잔기 중 2개 이상의 각각에 부착되고, 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드는 개별적으로 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 부착된다.
다른 실시형태에 따라서, 2개의 피브리노겐-결합 펩타이드는 개별적으로 분지된 코어의 말단 다작용성 아미노산 잔기에 부착된다.
본 발명의 조성물 중 지혈제로서 사용하기에 적합한 펩타이드 덴드리머의 구조의 예는 다음과 같은 펩타이드 덴드리머를 포함한다:
본 발명의 조성물 중 지혈제로서 사용하기에 적합한 펩타이드 덴드리머는 하기 일반식 (I)을 포함할 수 있다:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커, 바람직하게는 비펩타이드 링커이고;
X는 삼작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는 Y가 -FBP일 때 -(링커)-FBP이거나, 또는 Y가 -NH2일 때 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고;
여기서, Xn은 삼작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 리신, L-오르니틴, 또는 아르기닌이고;
a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 NH2이고, Z는 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP일 때, 덴드리머의 구조는 다음과 같다:
a가 1인 경우:
또는 a가 2인 경우:
또는 a가 3인 경우:
대안적으로, Y가 -FBP일 때 Z는 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고,
여기서,
Xn은 삼작용성 아미노산 잔기, 바람직하게는 리신, L-오르니틴, 또는 아르기닌이고; 그리고
a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Y가 -FBP이고, Z가 -[-Xn-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이며 a는 1일 때, 덴드리머의 구조는 다음과 같다:
본 발명의 조성물 중 지혈제로서 사용하기에 적합한 펩타이드 덴드리머는 하기의 일반식 (II)를 포함할 수 있다:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 바람직하게는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는, 선택적 링커이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는
Y가 -FBP일 때, -R-(링커)-FBP이거나, 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이고,
여기서 R은 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이다.
결과적으로, 일 실시형태에서, Z는, Y가 -NH2일 때, 일 수 있고,
여기서 R은 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이고;
a는 1 내지 3이다.
대안적으로, a는 4 내지 10이거나, 또는 1 내지 10일 수 있다.
다른 실시형태에서, Z는, Y가 -FBP일 때,
이고,
여기서 R는 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH- 또는 -(CH2)3NHCNHNH-이고;
a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Z는, Y가 -FBP이고 a가 1일 때,
이다.
본 발명의 조성물 중 지혈제로서 사용하기에 적합한 펩타이드 덴드리머는 하기의 일반식 (III)을 포함할 수 있다:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 바람직하게는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는, 선택적 링커이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는, Y가 -FBP일 때, -(CH2)4NH-(링커)-FBP이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이다.
결과적으로, 일 실시형태에서, Z는 Y가 -NH2일 때, 일 수 있고,
여기서 a는 1 내지 3이다.
대안적으로, a는 4 내지 10이거나, 또는 1 내지 10일 수 있다.
다른 실시형태에서, Z는, Y가 -FBP일 때, 이고,
여기서 a는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 3이다.
예를 들어, Z는, Y가 -FBP이고 a가 1일 때, 이다.
임의의 적합한 피브리노겐-결합 펩타이드(FBP)가 본 발명의 조성물 중 지혈제에 이용될 수 있다. 예를 들어, FBP는 피브린에 자연적으로 결합된 피브리노겐의 영역에 또는 혈소판막 당단백질 GPIIb-IIIa에 의해 결합 가능할 수 있다. 피브리노겐에 대한 피브린 결합은 문헌[Mosesson et al. 2001, Ann. N.Y. Acad . Sci ., 936, 11-30]에 논의되어 있다. 피브리노겐에의 GPIIb-IIIa의 결합은 문헌[Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci ., 936, 340-354]에 논의되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩타이드"는 또한 펩타이드 유사체를 도입한다. 몇몇 펩타이드 유사체가 당업자에게 알려져 있다. 피브리노겐이 피브리노겐 결합 펩타이드에 결합할 수 있다면 임의의 적합한 유사체가 사용될 수 있다.
적합한 피브리노겐 결합 펩타이드의 예와 이들을 어떻게 식별하는지에 대해 WO 2005/035002, WO 2007/015107 및 WO 2008/065388에 제공되어 있다.
적합한 FBP의 서열의 예는 GPR-; GPRP-(서열번호 1); GPRV-(서열번호 2); GPRPFPA-(서열번호 3); GPRVVAA-(서열번호 4); GPRPVVER-(서열번호 5); GPRPAA-(서열번호 6); GPRPPEC-(서열번호 7); GPRPPER-(서열번호 8); GPSPAA-(서열번호 9); GHR-, GHRP-(서열번호 10), GHRPY-(서열번호 11), GHRPL-(서열번호 12), GHRPY 아마이드-(서열번호 13); APFPRPG(서열번호 14)를 포함한다.
FBP의 바람직한 예는 이의 아미노 말단 단부에 아미노산 서열 G(P,H)RX-(서열번호 15)를 포함하되, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, 그리고 (P,H)는 프롤린 또는 히스티딘이 그 위치에 존재하는 것을 의미한다.
담체에 부착된 FBP는 동일 또는 상이한 서열을 포함할 수 있다. FBP는 각각 길이가 3 내지 60, 3 내지 30, 또는 3 내지 10개의 아미노산 잔기일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 10-9 내지 10-6 M, 예를 들어 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 정도 또는 그 이상의 nM의 해리 상수(KD)로 피브리노겐에 결합한다. 대략 100 nM의 KD가 바람직하다. 해리 상수는 평형상태에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 기지 농도의 방사선-표지된 피브리노겐은 피브리노겐 결합 모이어티가 가교결합된 미세구와 항온처리될 수 있다. 전형적으로, 5μM 펩타이드가 1 gm 미세구에 가교결합되거나, 또는 15 내지 40 μ몰의 펩타이드가 1 gm의 미세구에 가교결합된다. 펩타이드-연결된 미세구를 0.5 ㎎/㎖로 희석시키고, pH 7.4의 등장성 완충액(예를 들어 0.15M NaCl을 함유하는 0.01M Hepes 완충액) 중에서 0.05 내지 0.5 ㎎/㎖ 농도의 방사선 표지된 피브리노겐과 최대 1시간 동안 20℃에서 항온처리한다. 미세구 상의 피브리노겐-결합 모이어티에 결합된 피브리노겐은 원심분리에 의해 유리 피브리노겐으로부터 분리될 수 있고 유리 및 결합 피브리노겐의 양을 측정할 수 있다. 다음에, 해리 상수는 결합:유리 피브리노겐의 농도 비율에 대하여 결합된 피브리노겐의 농도를 그래프로 그려서 스캣차드(Scatchard) 분석으로 계산될 수 있으며, 이때 곡선의 기울기가 KD를 의미한다.
몇몇 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한, 지혈제의 피브리노겐-결합 펩타이드, 특히 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 우선적으로 결합한다. 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 우선적으로 결합하는 적합한 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열의 예는, GPR-; GPRP-(서열번호 1); GPRV-(서열번호 2); GPRPFPA-(서열번호 3); GPRVVAA-(서열번호 4); GPRPVVER-(서열번호 5); GPRPAA-(서열번호 6); GPRPPEC-(서열번호 7); GPRPPER-(서열번호 8); GPSPAA-(서열번호 9)을 포함한다.
다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한, 지혈제의 피브리노겐-결합 펩타이드, 특히 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐의 구멍 'a'보다 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합한다. 피브리노겐의 구멍 'a'보다 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 적합한 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열의 예는 GHR-, GHRP-(서열번호 10), GHRPY-(서열번호 11), GHRPL-(서열번호 12), GHRPY아마이드-(서열번호 13)를 포함한다.
각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 독립적으로 이의 카복시-말단 단부에 (임의로 링커를 통해서), 또는 이의 아미노-말단 단부에 (임의로 링커를 통해서) 담체에, 또는 덴드리머의 분지된 코어에 부착될 수 있다. 피브리노겐-결합 펩타이드가 이의 아미노-말단 단부에 부착될 경우, 펩타이드의 카복시-말단 단부는 아마이드기를 포함할 수 있다. 펩타이드의 노출된 카복시-말단 단부에 카복실기(또는 음으로 하전된 카복실레이트 이온)보다는 오히려 아마이드기의 존재는, 피브리노겐에의 피브리노겐-결합 펩타이드의 결합을 최적화시키는데 도움을 줄 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 (임의로 링커를 통해서) 이의 카복시-말단 단부에 담체에, 또는 덴드리머의 분지된 코어에 부착된다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드는 (임의로 링커를 통해서) 이의 아미노-말단 단부에 담체에, 또는 덴드리머의 분지된 코어에 부착된다. 예를 들어, 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍'a'에 우선적으로 결합하는 적어도 하나의 피브리노겐-결합 펩타이드, 예컨대, 서열 APFPRPG(서열번호 14)를 포함하는 펩타이드는, (임의로 링커를 통해서) 이의 아미노-말단 단부에 담체에, 또는 덴드리머의 분지된 코어에 부착될 수 있다.
유리하게는, 지혈제, 또는 펩타이드 덴드리머는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다(본 명세서에서 '키메라' 지혈제, 또는 펩타이드 덴드리머라 칭함). 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 지혈제, 또는 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 대해서 상이한 결합 선택성을 가진 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 지혈제는 복수의 담체를 포함할 수 있되, 여기서 각각의 담체는 담체에 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 갖고, 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 담체는 제1 복수의 담체, 및 제2 복수의 담체를 포함하되, 여기서 제1 복수의 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드는 제2 복수의 담체에 부착된 피브리노겐-결합 펩타이드와는 상이한 서열이다.
다른 실시형태에 있어서, 각각의 담체는 이에 부착된 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드이다.
이론 상, 담체 분자당 피브리노겐-결합 펩타이드 수에 상한치는 없다. 최적수는 많은 인자, 예컨대 담체의 성질, 및 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착하기 위한 각각의 담체 상의 반응성 기의 수에 의존적인 공산이 있다. 그러나, 평균적으로, 담체 분자당 최대 100개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 존재하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 평균적으로, 담체 분자당 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개 또는 5개의 피브리노겐-결합 펩타이드가 존재한다. 바람직한 범위는 담체 분자당 10 내지 20개의 피브리노겐-결합 펩타이드이다.
담체는 피브리노겐-결합 펩타이드의 부착을 허용하는 반응성 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체는 이의 표면 상에 티올 모이어티 또는 아민 모이어티를 포함할 수 있다. 담체가 단백질성이면, 티올 또는 아민 모이어티가 아미노산, 예를 들어 시스테인 또는 라이신의 곁사슬에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 반응성 기가 담체에 첨가될 수 있다. 이것은, 담체가 알부민과 같은 단백질로부터 형성된 경우 특히 유리하다. 예를 들어, 담체는 담체 상의 1차 아민기와 반응할 수 있는 2-이미노티올란(2-IT)과 같은 시약을 이용해서 티올화될 수 있다. 대안적으로 시스타민은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 염산염(EDC) 및 N-하이드록시숙신아미드(NHS)의 존재 중에서 담체 상의 카복실기에 커플링되고 나서, 도입된 다이설파이드 결합의 환원적 절단을 수행할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피브리노겐-결합 펩타이드는 스페이서를 통해서 담체에 공유적으로 고정된다. 바람직한 스페이서는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 중합체를 포함하는 비-펩타이드 스페이서이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 각각 PEG 스페이서에 의해서 티올-반응성 기예를 들어, 말레이미드기)에 연결된 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 복수의 펩타이드 접합체는 티올화된 담체(예를 들어 위에 기재된 바와 같이 2-IT 또는 시스타민을 이용해서 제조됨)와 반응한다. 적합한 비-펩타이드 스페이서는 WO 2013/114132에 기술되어 있다.
상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 제1 피브리노겐-결합 펩타이드보다도 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 대해서 더 높은 선택성으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 가진 펩타이드 덴드리머는 비교적 넓은 범위의 펩타이드 덴드리머 농도에 걸쳐서 신속하게 피브리노겐을 중합시키는 것으로 판명되었다.
예를 들어, 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 아미노-말단 단부에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함할 수 있고, 그리고/또는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는, 이의 카복시-말단 단부에 아미노산 서열-APFPRPG(서열번호 14)를 포함할 수 있으며, 여기서 서열의 아미노산 잔기는 아미노-에서 카복시-로의 수순으로 표기되며, "-"는 펩타이드 덴드리머의 분지된 코어에, 또는 담체에 부착된 서열의 단부를 나타낸다. 카복시-말단 단부에 서열 -APFPRPG(서열번호 14)를 가진 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노-말단 단부에 서열 GPRP-(서열번호 1)를 가진 피브리노겐-결합 펩타이드보다도 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 대해서 더 높은 선택성으로 결합한다.
다른 실시형태에 있어서, 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 피브리노겐의 구멍 'a'보다 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 가진 펩타이드 덴드리머는, 피브리노겐과 중합하여 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍'a'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만을 함유하는 등가의 펩타이드 덴드리머에 비해서 상대적으로 치밀한 하이드로겔을 형성하는 것으로 판명되었다. 형성된 하이드로겔의 증가된 밀도는 구멍 'a' 및 피브리노겐의 구멍 'b'에 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드의 결합으로 인한 것으로 여겨지며, 이에 의해서 중합된 피브리노겐의 망상체를 강화시킨다.
예를 들어, 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 아미노-말단 단부에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)을 포함할 수 있고 그리고/또는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는, 이의 아미노 말단 단부에 아미노산 서열 GHRP-(서열번호 10), 또는 아미노산 서열 GHRPY-(서열번호 11)를 포함할 수 있다. 아미노-말단 단부에 서열 GPRP-(서열번호 1)를 가진 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'a'에 대해서 일부 선택성으로 결합한다. 아미노-말단 단부에, 서열 GHRP-(서열번호 10), 또는 GHRPY-(서열번호 11)을 가진 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합한다.
1개 이상의, 또는 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 비펩타이드 링커에 의해 지혈제의 담체에, 예를 들어, 펩타이드 덴드리머의 분지된 코어에 공유적으로 부착될 수 있다. 링커는 피브리노겐과 피브리노겐-결합 펩타이드의 결합을 방해하지 않는 임의의 적합한 링커일 수 있다. 링커는 가요성의, 직쇄 링커, 적합하게 직쇄 알킬기를 포함할 수 있다. 링커는 피브리노겐-결합 펩타이드가 서로로부터 멀리 연장될 수 있게 할 수 있다. 예를 들어, 링커는 NH(CH2)nCO-기를 포함할 수 있고, 여기서 n은 임의의 수, 적합하게 1 내지 10, 예를 들어 5이다. -NH(CH2)5CO-기를 포함하는 링커는 ε-아미노산 6-아미노헥산산(εAhx)의 사용에 의해 형성될 수 있다.
이론 상, 펩타이드 덴드리머에 존재할 수 있는 피브리노겐-결합 펩타이드의 총수에 제한은 없다. 그러나, 실제로, 임의의 특정 구조의 경우, 피브리노겐-결합 펩타이드의 수는 가변적일 수 있고 바람직한 피브리노겐 중합 특성, 예를 들어, 신속한 피브리노겐 중합 또는 피브리노겐과의 중합에 의해 생산되는 하이드로겔의 밀도에 최적인 수를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 펩타이드 덴드리머는 덴드리머당 총 최대 20개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드, 예를 들어, 덴드리머당 최대 10개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드, 또는 덴드리머당 최대 5개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 출원인은, 놀랍게도, 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 펩타이드 덴드리머와 펩타이드 접합체의 혼합물이 펩타이드 덴드리머, 또는 펩타이드 접합체 단독보다 더 용이하게 피브리노겐을 중합시킬 수 있는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 지혈제는 펩타이드 덴드리머, 및 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 접합체를 포함할 수 있다.
펩타이드 접합체는 동일한 서열 또는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 접합체는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍'a'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만 또는 피브리노겐의 구멍 'a'보다 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 피브리노겐-결합 펩타이드만, 또는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 우선적으로 결합하는 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드와 피브리노겐의 구멍 'a'보다 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다.
펩타이드 접합체는 피브리노겐-결합 펩타이드가 부착되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체는 1개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 단일의 아미노산 잔기, 예컨대, 라이신 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 담체를 포함하는 접합체의 이점은 고상 펩타이드 합성 방법을 이용해서 용이하게 제조될 수 있다는 점이다. 또한, 이것은 면역원성 제제의 사용 없이 용이하게 제조될 수 있고, 그리고 멸균에 내성이 있을 수 있다.
펩타이드 접합체의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는, 독립적으로, 이의 카복시-말단 단부에 (임의로 링커를 통해서), 또는 이의 아미노-말단 단부에 (임의로 링커를 통해서), 담체에 부착될 수 있다. 피브리노겐-결합 펩타이드가 이의 아미노-말단 단부에 부착되는 경우, 펩타이드의 카복시-말단 단부는 아마이드기를 포함할 수 있다.
일례에서, 펩타이드 접합체는 이하의 일반식을 가질 수 있다:
FBP-(링커)-X-(링커)-FBP
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커, 바람직하게는 비펩타이드 링커이고;
X는 아미노산, 바람직하게는 다작용성 아미노산, 가장 바람직하게는 삼작용성 아미노산 잔기, 예컨대 라이신, 오르니틴, 또는 아르기닌이다.
펩타이드 접합체는 덴드리머일 수 있다. 덴드리머는 분지된 코어 및 분지된 코어에 개별적으로 공유적으로 부착된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 분지된 코어는 1종 이상의 다작용성 아미노산을 포함할 수 있다. 각각의 다작용성 아미노산, 또는 복수의 다작용성 아미노산은 이에 공유적으로 부착된 1종 이상의 피브리노겐 결합 펩타이드를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드 접합체는 위에서 정의된 바와 같은 펩타이드 덴드리머일 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 우선적으로 결합할 수 있고, 펩타이드 접합체의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'a'보다 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합할 수 있다. 이러한 조성물은 그들이 펩타이드 덴드리머 또는 펩타이드 접합체 단독보다는 더욱 신속하게 피브리노겐을 중합시킬 수 있다는 점에서 상승 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 상승 효과의 기전이 완전하게 이해되지는 않았지만, 이론에 국한되지 않고, 상기 조성물이 더 많은 'A' 및 'B' 피브리노겐 중합 부위를 제공하기 때문에 그것이 일어날 수 있는 것으로 여겨진다.
대안적으로, 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 펩타이드 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'a'보다 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합할 수 있고, 펩타이드 접합체의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 우선적으로 결합한다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 지혈제의 특정 이점은 동물-유래 제품의 사용 없이 합성될 수 있고, 이에 따라서 이러한 제품으로부터 바이러스 또는 프리온 감염의 위험을 최소화시킬 수 있다는 것이라는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 조성물에 사용되는 생체적합성 액체는 수성 또는 비수성 액체일 수 있지만, 일반적으로 수성 액체이다. 수성 액체는 생체적합성 수용액, 예컨대, 염화칼슘 또는 염화나트륨의 수용액을 포함할 수 있다. 일반적으로, 생체적합성 액체는 생리적 pH에 가까울 것이고, 예를 들어, pH 6.0 내지 7.5, 예를 들어, pH 7.3 내지 7.5, 또는 pH 7.35 내지 7.45의 범위일 것이다.
생체적합성 액체는 완충액, 예를 들어 인산염, HEPES, 또는 Tris 완충액, 예컨대, 10 내지 150mM 인산염 완충액, 10 내지 150mM HEPES 완충액, 또는 10 내지 150mM Tris 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 함유된 입자의 양 및 평균 직경, 그리고 지혈제, 생체적합성 액체, 및 불용성 입자의 상대적인 양은, 이하에 기술된 바와 같이 지혈 및 물리적 특성을 가진 조성물을 제공하는데 효과적이다.
소정의 실시형태에 따르면, 조성물의 입자는 조성물의 유동성(예를 들어, 주사기를 통해서 압출되는 능력) 및 조성물이 조직 표면 및 정해진 공동부, 예컨대, 추간 공간, 조직 디보트(tissue divot), 구멍 또는 포켓 상의 또는 내의 부위 위로 흘러 이에 추종하도록 하는 능력을 증대시키는 치수 및 기타 물리적 특성을 갖는다.
본 발명의 조성물은 부분 수화되거나 또는 완전히 수화될 수 있고, 그리고 수화의 정도에 따라서 예를 들어 0% 내지 100%의 팽윤도를 나타낼 수 있다.
부분적으로 또는 완전히 수화된 입자의 예시적인 바람직한 크기 범위는 다음과 같다:
입자 크기:
본 발명의 조성물은 보통 부분적으로 또는 완전히 수화된 형태일 것이다. 다당류의 입자를 포함하는 건조 분말(20 중량% 아래의 수분 함량을 지님)은 본 발명의 조성물의 제조를 위한 출발 물질로서 유용할 수 있다. 전형적으로 50% 내지 80% 수화를 지니는 본 발명의 부분적으로 수화된 조성물은, 젖은 표적 부위, 예를 들어, 조직 디보트에의 적용 시 조성물이 더욱 팽윤되는 것이 바람직한 경우의 적용 분야에 유용하다. 완전히 수화된 조성물은 신경 및 기타 민감한 구조가 존재하는 척추 및 기타 영역에서와 같이 동소 팽윤이 바람직하지 않은 경우의 적용분야에서 유용하다.
"표적 부위"는 본 발명의 조성물이 전달되는 위치이다. 표적 부위는 손상 또는 외과 수술로 인해 출혈이 있는 또는 이미 있었던 부위일 수 있다. 보통, 표적 부위는 관심 대상 조직 위치일 것이지만, 몇몇 경우에, 관심 대상 위치를 덮기 위해 재료가 동소에서 팽윤될 때, 조성물은 관심 대상 위치 근처의 위치에 투여될 수 있다.
입자의 치수는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 다당류를 포함하는 출발 물질은, (1) 다당류 출발 물질의 가교 결합 전에 또는 후에 또는 (2) 가교결합된 또는 비가교결합된 다당류 출발 물질의 수화 전에 또는 후에, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 수화된 물질로서 또는 건조한 미립자 분말로서 파쇄될 수 있다. 용어 "건조"는 수분 함량이 전형적으로 20 중량%의 물 미만으로 충분히 낮아, 분말이 자유 유동할 것이고 개개의 입자가 응고되지 않을 것임을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 용어 "수화된"은 수분 함량이 충분히 높은, 전형적으로 평형 수화 수준의 50% 초과, 보통 평형 수화 수준의 80% 내지 95%의 범위인 것을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
건조 상태의 출발 물질의 기계적 파쇄는 입자 크기 및/또는 입자 크기 분포를 제어하는 것이 바람직한 경우에 바람직할 수 있다. 수화된 조성물보다 건조 입자의 분쇄를 제어하는 것이 더 쉽고, 따라서 감소된 입자의 크기는 조정하기가 더 쉽다. 반대로, 수화된 물질의 기계적 파쇄는 일반적으로 건조 중합 출발 물질의 분쇄보다 간단하고 더 적은 단계를 내포한다. 따라서, 궁극적인 입자 크기 및/또는 크기 분포가 중요하지 않은 경우, 수화된 물질의 파쇄가 바람직할 수 있다.
본 발명의 조성물은 오리피스 또는 다른 유동 제한부를 통한 압출에 의해 표적 부위로 전달될 때에 기계적으로 파쇄될 수 있거나, 또는 표적 부위로 전달되기 전에 기계적으로 파쇄될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 최종 사용 또는 전달 전에 기계적으로 파쇄될 수 있다. 다당류 사슬의 분자 가교결합은 기계적 파쇄 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 기계적 파쇄 단계의 주요 목적은 조성물이 전달될 공간을 추종하고 채울 수 있게 하는 크기를 갖는 다수의 입자를 생성하는 것이다. 기계적 파쇄의 또 다른 목적은 소 직경 튜브, 캐뉼라 및/또는 다른 애플리케이터 아래에서 표적 부위로의 조성물의 통과를 용이하게 하는 것이다. 조성물이 사용 전에 파쇄될 경우, 조성물은 압출 이외의 기술, 예를 들어, 주걱 또는 스푼을 사용하여 적용 또는 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 다당류는 초기에 (예컨대, 분무 건조에 의해) 제조될 수 있고/있거나 가교결합되기 전에, 흔히 보통 수화 전에 기계적으로 파쇄될 수 있다. 다당류는 보통 작은 범위 내에 좁게 한정된 목적하는 크기를 제공하도록 추가의 분쇄에 의해 파쇄될 수 있는 미세하게 분쇄된 또는 분말화된 건조 고체로서 제공될 수 있다. 체거름(sieving) 또는 사이클론 분급과 같은 추가의 크기 선택 단계 및 변형 단계가 또한 수행될 수 있다. 예시적인 재료를 위하여, 건조 입자 크기는 10 내지 1500㎛, 또는 50 내지 1000㎛의 범위일 수 있다. 예시적인 입자 크기 분포는 95 중량% 초과의 입자가 50 내지 700㎛의 범위가 되도록 된다.
중합체 출발 물질을 분쇄하는 방법은 균질화, 분쇄, 코아세르베이션(coacervation), 밀링(milling), 제트 밀을 포함한다. 분말형 다당류 출발 물질은 또한 분무 건조에 의해 형성 될 수 있다. 입자 크기 분포는 체거름, 응집 (aggregation) 또는 추가의 분쇄와 같은 통상적인 기술에 의해 추가로 조절되고 정제될 수 있다. 이어서 건조 분말형 고체를 수성 완충액에 현탁시키고 가교 결합시킬 수 있다. 다른 경우에, 다당류는 수성 완충액에 현탁되고 가교 결합된 다음 건조될 수 있다. 가교결합된 건조 다당류는 이어서 파쇄될 수 있고, 파쇄된 물질은 이어서 수성 완충액에 재현탁될 수 있다.
예시적인 제조 공정에 있어서, 건조 비-가교결합된 다당류 출발 물질은 균질화, 분쇄, 코아세르베이션 또는 밀링과 같은 통상의 단위 동작에 의해 기계적으로 파쇄될 수 있다. 분말은 생성물이 부분적으로 또는 완전히 수화된 경우 목적하는 범위의 입자 크기를 생성시키는 건조 입자 크기를 달성하기에 충분하게 파쇄된다. 이하에 더욱 논의되는 바와 같이, 건조 입자 크기와 완전히 수화된 하위단위 크기 간의 관계는, 재료의 팽윤성에 의존할 것이다.
대안적으로, 미립자 다당류 출발 물질은 분무 건조에 의해 형성될 수 있다. 분무 건조 공정은, 향류 또는 병류 가스 스트림, 전형적으로 가열된 가스 스트림으로 방출되는 액적을 형성하도록 작은 오리피스, 예컨대, 노즐을 통해 용액을 유동시키는 것에 의존한다. 가스는 용액 또는 분산액일 수 있는 액체 출발 물질로부터 용매를 증발시킨다. 건조 분말 출발 물질을 형성하기 위한 분무 건조의 사용은 출발 물질의 기계적 파쇄의 대안이다. 분무 건조 작업은 보통 매우 균일한 입자 크기를 갖는 비-가교결합된 건조 분말 제품을 생산한다. 이어서, 입자는 하기 기술된 바와 같이 가교결합될 수 있다.
많은 경우에, 기계적 파쇄는 입자 크기 및 입자 크기 분포 둘 다를 목적하는 범위 내에서 얻기에 충분하게 제어될 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 더 정밀한 입자 크기 분포가 필요한 경우, 파쇄된 물질을 추가로 처리하거나 또는 예를 들어, 체거름이나 응집에 의해, 목적하는 입도 분포를 제공하도록 선택될 수 있다. 기계적으로 파쇄된 중합체 출발 물질은 이후 더 상세히 기술되는 바와 같이 가교 결합 될 수 있다.
본 발명의 조성물의 입자 크기가 덜 중요한 경우, 건조된 다당류 출발 물질을 적절한 완충액에서 수화, 용해 또는 현탁시키고 기계적 파쇄 전에 가교 결합시킬 수 있다. 기계적 파쇄는 전형적으로 오리피스의 크기와 압출의 힘이 함께 입자 크기 및 입자 크기 분포를 결정하는 오리피스를 통해 물질을 통과시킴으로써 달성 될 것이다. 이 방법은 수화 및 가교결합 전에 건조 다당류 입자를 기계적으로 파쇄하는 것보다 조작 상 더 간단하지만, 입자 크기를 조절하는 능력은 덜 정확할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 조성물 중의 입자의 기계적 파쇠 전에 주사기 또는 다른 애플리케이터에 패킹될 수 있다. 이어서, 재료는 주사기를 통해 조직 표적 부위에 적용될 때 기계적으로 파쇄될 것이다. 대안적으로, 파쇄되지 않은 가교결합된 다당류 출발 물질은 사용 전에 건조 형태로 저장될 수 있다. 이어서, 건조 재료를 주사기 또는 다른 적절한 애플리케이터에 장입하고, 애플리케이터 내에서 수화시켜 본 발명의 조성물을 형성하고, 재료가 표적 부위에 전달 될 때 기계적으로 파괴될 수 있으며, 재차 전형적으로 오리피스 또는 작은 튜브 루멘을 통과할 수 있다.
다양한 생체적합성 천연, 반 합성 또는 합성 다당류가 본 발명의 조성물에 사용되는 입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 가교결합된 다당류의 입자는 특정 조성물에 대해 선택된 생체적합성 액체에 실질적으로 불용성이어야 한다. 적합하게는, 입자는 생체 적합성 액체 1㎖당 입자 10㎎ 미만, 예를 들어 1㎎/㎖ 미만 또는 0.1㎎/㎖ 미만의 용해도를 갖는다. 몇몇 실시형태에 따르면, 기계적, 화학적 및/또는 생물학적 지혈 활성을 제공하는 수-불용성 입자가 사용된다.
예시적인 다당류는 글리코사미노글리칸, 전분 유도체(예를 들어 산화된 전분), 셀룰로스 유도체(예를 들어 산화된 셀룰로스), 헤미셀룰로스 유도체, 자일란, 아가로스, 알지네이트, 알지네이트 유도체(예를 들어 산화된 알지네이트) 키토산, 키틴, 및 이들의 조합물을 포함한다.
다당류의 가교결합은 임의의 통상적인 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 다당류는 적절한 가교결합제를 사용하여 가교결합될 수 있다.
다당류 분자는 2종 이상의 다당류에 공유적으로 부착되는 이작용성 또는 다작용성 가교결합제를 이용해서 가교결합될 수 있다. 예시적인 이작용성 가교결합제는 알데하이드, 에폭사이드, 숙신이미드, 카보다이이미드, 말레이미드, 아자이드, 카보네이트, 아이소사이아네이트, 다이비닐설폰(DVS), 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에터(BDDE), 알코올, 아민, 이미데이트, 무수물, 다이아조아세테이트 또는 아지리딘을 포함한다. 대안적으로, 가교결합은, 가교결합을 형성하는 다른 곁사슬 또는 모이어티와 반응할 수 있도록 다당류 상의 곁사슬 또는 모이어티를 활성화시키는, 산화제 또는 다른 제제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
전형적으로, 출발 물질의 다당류 분자는 각각 10kDa 내지 10,000kDa, 또는 25kDa 내지 5,000kDa의 범위의 분자량을 갖는다. 전형적으로, 가교결합된 다당류 분자는 다른 다당류 분자에 대한 적어도 하나의 연결을 가질 것이고, 흔히 1 내지 5개의 연결을 가지며, 이때 실제의 가교결합 수준은 원하는 분해 속도를 제공하도록 선택될 수 있다.
다당류의 가교결합의 정도는 압출성, 주변 생물학적 유체의 흡수성, 응집성, 공간을 채우는 능력, 팽윤 능력 및 조직 부위에 부착하는 능력을 포함하는 조성물의 여러 기능적 특성에 영향을 미친다. 가교결합의 정도는 다당류의 불용성 입자가 사용되는 멸균 조건(예를 들어, 증기 또는 건열 멸균 조건)을 견딜 수 있어 입자를 포함하는 본 발명의 조성물을 멸균하는데 충분해야 한다. 가교결합의 정도는 가교결합제의 농도를 조절하거나, 가교결합제 및 다당류 출발 물질의 상대적 양을 변화시키거나, 반응 조건을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 전형적으로, 가교결합의 정도는 가교제의 농도를 조절함으로써 조절된다.
몇몇 실시형태(예를 들어, 하이알루론산을 포함하는 입자를 이용하는 실시형태)에 있어서, 입자의 평형 팽윤은 0% 내지 500%, 예를 들어 0% 내지 100%의 범위일 수 있다.
평형 팽윤은 가교결합의 정도를 변화시킴으로써 조절될 수 있고, 이것은 이어서 가교결합 조건, 예컨대, 가교결합 방법의 유형, 가교결합제의 노출 기간, 가교결합제의 농도 및 가교결합 온도를 변화시킴으로써 달성된다. 평형 팽윤값을 달리하는 재료는 상이한 적용 분야에서 다르게 수행한다. 가교결합 및 평형 팽윤을 조절하는 능력은 본 발명의 조성물이 다양한 용도로 최적화되도록 한다.
"팽윤 퍼센트"는 습윤 중량으로부터 뺀 건조 중량을 건조 중량으로 나누고 거기에 100을 곱한 값을 의미하며, 여기서 습윤 중량은. 습윤제가 재료의 외부로부터, 예를 들어, 여과에 의해 가능한 한 완전히 제거된 후에 측정되며, 건조 중량은 습윤제를 증발시키는데 충분한 시간 동안 상승된 온도로, 예를 들어, 120℃에서 2시간 동안 노출시킨 후에 측정된다. "평형 팽윤"은, 다당류 재료가 수분 함량이 일정하게 되도록 하는 충분한 시간 기간, 전형적으로 18 내지 24시간 동안 습윤제에 침지된 후에 평형에서의 팽윤 퍼센트로서 정의된다.
평형 팽윤 이외에도, 표적 부위로 전달하기 직전에 조성물의 수화를 조절하는 것 또한 중요하다. 0% 수화율을 지닌 물질은 팽윤되지 않을 것이다. 100% 수화율을 지닌 물질은 이의 평형 수분 함량에 있을 것이다. 0%에서 100% 사이의 수화율은 최소량과 최대량 사이의 팽윤에 해당할 것이다. 실제 문제로서, 많은 건조한 비-팽윤된 물질은 약간의 잔류 수분 함량, 보통 20 중량% 미만, 보다 일반적으로 8 중량% 내지 15 중량%를 지닐 것이다. 용어 "건조"가 본 명세서에서 사용될 때, 이것은 물질은 개별 입자가 자유 유동하고, 일반적으로 비-팽윤 상태인 낮은 수분 함량을 갖는 재료를 특정한다.
수화는, 예를 들어, 사용하기 전에 건조되거나 또는 부분적으로 수화된 가교결합된 물질에 첨가된 생체적합성 액체(예컨대, 수성 완충액)의 양을 조절함으로써 매우 간단하게 조절될 수 있다. 보통, 최소한도로, 주사기 또는 다른 전달 장치를 통한 압출을 허용하기에 충분한 수성 완충액을 도입하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 다른 경우에는 더 적은 유체 물질을 전달하기 위해 주걱 또는 다른 애플리케이터를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 의도한 용도는 또한 원하는 수화도를 결정하는 데 도움이 될 것이다. 습한 공동부를 채우거나 밀봉하길 원할 경우, 일반적으로 표적 부위로부터 수분을 흡수하여 공동부를 팽윤 및 충전시킬 수 있는 부분적으로 수화된 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 반대로, 완전히 또는 실질적으로 완전히 수화된 조성물은 뇌, 척추 부근 그리고 신경 부근의 표적 부위 및 배치 후 팽윤에 의해 손상될 수도 있는 기타 민감한 신체 구조에 적용하기에 바람직하다. 또한 과량의 완충액으로 본 발명의 조성물을 제조하여, 완전히 수화된 상 및 유리 완충 상을 갖는 2상 조성물을 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 따르면. 다당류 입자는 글리코사미노글리칸(GAG)을 포함한다. GAG는 아미노당(GlcNAc 또는 GalNAc) 및 우론산(글루쿠론산 및/또는 이두론산)을 함유하는 1차 입체형태를 갖는 반복 이당류 단위로 구성된 커다란 선형 다당류이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 적합한 글리코사미노글리칸은 하이알루론산(HA), 또는 이의 염이다.
HA는 β-D-(1→3) 글루쿠론산(GlcA) 및 β-D-(1→4)-N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 교번 잔기로 구성된다. 용어 "하이알루론산"은, 문헌상, 자연적으로 세포 표면에, 척추 동물의 결합 조직의 기본 세포외 물질에, 관절의 윤활액에, 눈의 안구내액(endobulbar fluid)에, 인간 제대 조직에 그리고 닭벼슬(cocks' comb)에서 발생되는 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민산의 잔기에 구성된 상이한 분자량을 가진 산성 다당류를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "하이알루론산"은 본 명세서에서 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민산의 교번 잔기를 가진 상이한 분자량을 가진 다당류의 혼합물을 포함하는 것으로 사용된다. 하이알루론산은 또한 하이알루로난, 하이알루로네이트, 또는 HA로서 공지되어 있다. 용어 하이알루로난 및 하이알루론산은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
하이알루론산의 함량은 변형된 카바졸 방법에 따라서 결정될 수 있다(Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334). 하이알루론산의 평균 분자량은 문헌[Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; 및 Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California]에 기술된 것들과 같이 당업계에서의 표준 방법을 이용해서 결정될 수 있다.
하이알루론산, 또는 이의 염은, 약 10,000 내지 10,000,000 Da, 25,000 내지 5,000,000 Da, 또는 50,000 내지 3,000,000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 하이알루론산 또는 이의 염은, 300,000 및 3,000,000 Da, 400,000 및 2,500,000 Da, 500,000 및 2,000,000 Da, 또는 600,000 및 1,800,000 Da의 범위의 분자량을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 하이알루론산 또는 이의 염은, 10,000 및 800,000 Da, 20,000 및 600,000 Da, 30,000 및 500,000 Da, 40,000 및 400,000 Da, 또는 50,000 및 300,000 Da의 범위의 낮은 평균 분자량을 갖는다.
하이알루론산의 무기 염의 예는 하이알루론산 나트륨, 하이알루론산 칼륨, 하이알루론산 암모늄, 하이알루론산 칼슘 하이알루론산 마그네슘, 하이알루론산 아연 및 하이알루론산 코발트를 포함한다.
수탉 벼슬은 하이알루론산을 위한 유의한 상업적 공급원이다. 미생물은 대안적인 공급원이다. US 4,801,539 및 EP 0,694,616은 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 균주를 이용해서 하이알루론산을 제조하는 발효 방법을 개시한다. WO 03/054163(전문이 본 명세서에 편입됨)은, 예를 들어, 그램-양성 바실러스(Bacillus) 숙주에서 하이알루론산 또는 이의 염의 재조합 제조를 기술한다.
미국 특허 제4,582,865호(Biomatrix Inc.)는 다이비닐 설폰(DVS)을 가교결합제로서 사용하는 HA의 가교결합된 겔의 제조를 기술한다. 다작용성 에폭시 화합물을 이용하는 가교결합된 HA 또는 이의 염의 제조는 EP 0 161 887 B1에 개시되어 있다. 공유 결합을 통해서 HA를 가교결합시키는데 이용되어온 기타 이작용성 또는 다작용성 시약은 폼알데하이드(U.S. 4,713,448, Biomatrix Inc.), 폴리아지리딘(WO 03/089476 A1, Genzyme Corp.), L-아미노산 또는 L-아미노에스터(WO 2004/067575, Biosphere S.P.A.)를 포함한다. 카보다이이미드는 또한 가교결합의 HA에 대해서 보고된 바 있다(U.S. 5,017,229, Genzyme Corp.; U.S. 6,013,679, Anika Research, Inc). 지방족 알코올에 의한 HA의 전체 또는 부분 가교결합된 에스터, 및 무기 또는 유기 염기와의 이러한 부분 에스터의 염이 US 4,957,744에 개시되어 있다.
화학적으로 가교결합 HA용의 바람직한 제제는 다이비닐 설폰(DVS), 1, 2, 7, 8-다이에폭시옥탄(DEO), 및 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에터(BDDE)를 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 입자를 생산하는데 적합한 가교결합된 HA 겔을 제조하는 방법은 WO 2006/056204, US 2010/0035838, US 2010/0028437, US 2005/0136122(이들 각각의 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 편입됨)에 기술되어 있다. HA계 하이드로겔 입자의 제조는 또한 문헌[Sahiner & Jia, Turk J Chem 32 (2008), 397-409: "One-Step Synthesis of Hyaluronic Acid-Based (Sub)micron Hydrogel Particles: Process Optimization 및 Preliminary Characterization"]에 기술되어 있다.
예를 들어, WO 2006/056204는 다이비닐설폰(DVS)과 가교결합된 하이알루론산, 또는 이의 염을 포함하는 하이드로겔을 제조하는 방법을 기술한다. 이 방법은 하이알루론산, 또는 이의 염의 알칼리 용액을 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 용액에 DVS를 첨가함으로써, 하이알루론산, 또는 이의 염이 DVS와 가교결합되어 겔을 형성시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 겔을 완충액으로 처리하는 단계(여기서 겔은 팽윤되어, DVS와 가교결합된 하이알루론산, 또는 이의 염을 포함하는 하이드로겔을 형성함)를 포함한다.
하이알루론산, 또는 이의 염은, 100 내지 3,000 kDa, 예를 들어, 500 내지 2,000 kDa, 또는 700 내지 1,800 kDa의 평균 분자량을 가질 수 있다. DVS는 1:1 및 100:1의 HA/DVS(건조 중량), 바람직하게는 2:1 및 50:1의 HA/DVS(건조 중량), 예를 들어 2.5:1 내지 8:1, 또는 5:1 HA/DVS(건조 중량)의 중량비로 단계 (a)의 용액에 첨가될 수 있다.
적합한 가교결합된 HA 하이드로겔은 가교결합된 HA 겔을 제조하는 노보자임의 하이아시스 링크 기술(Novozyme's Hyasis Link technology)을 이용해서 제조될 수 있다. 노보자임은 또한 비병원성 세균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 발효에 기반하는 재조합 제조 공정으로부터 얻어진, 바실러스-유래 하이알루론산인 하이아시스를 제공한다. 이 공정은 동물-유래 원료가 아닌 것을 이용한다.
가교결합된 HA 하이드로겔은, 예를 들어, 위에서 기술된 기계적 파쇄 방법 중 어느 하나를 이용해서, 미분화되어, 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 적합한 크기의 입자를 제공할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 가교결합된 HA 하이드로겔은 분쇄에 의해 미분화되고, 적합한 크기의 가교결합된 HA 하이드로겔 입자는 분쇄된 생성물을 체거름함으로써 선택된다.
본 발명에 따라 이용하기 위한 적합한 가교결합된 HA 하이드로겔 입자는 대략 100 내지 1500㎛, 또는 100 내지 1000㎛의 평균 직경(부분 또는 완전히 수화된 경우)을 지닌다. 일례는 HA 2.7% w/v; 가교결합 5:1의 HA:DVS를 포함하는 가교결합된 HA 하이드로겔 입자이며 평균 하이드로겔 입자 크기는 대략 400㎛이다.
통상의 젤라틴계 지혈제의 특정 단점은 젤라틴 매트릭스가 불투명하다는 점이다. 이는, 상처 부위에 정확한 투여를 행하고 출혈이 조절된 정도를 모니터링하는 것을 더욱 어렵게 만드는 가시성(visibility)을 방해할 수 있다. 출원인은 가교결합된 다당류 입자를 포함하는 페이스트, 특히 가교결합된 HA 하이드로겔 입자를 포함하는 수성 페이스트로부터, 예를 들어, 페이스트를 원심분리함으로써 기포를 제거하는 것이 그의 불투명도를 극적으로 저감시키고 실질적으로 투명한 페이스트를 제공하는 것을 발견하였다. 투명한 페이스트를 통해 상처 또는 봉합 라인의 출혈을 관찰할 수 있다. 이것은 외과의가 지혈을 보다 효과적으로 모니터링하여 필요한 경우 더욱 신속하게 개입할 수 있게 해준다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 생체적합성 액상 전체를 통해서 분산된 가교결합된 생체적합성 다당류의 불용성 입자를 포함하는 조성물의 불투명도를 저감시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 조성물을 원심 분리하여 조성물로부터 기포를 제거하는 단계를 포함한다.
또한, 생체적합성 액상 전체를 통해서 분산된 가교결합된 생체적합성 다당류의 불용성 입자를 포함하는 실질적으로 투명한 조성물이 제공된다. 액상은 위에서 기술된 바와 같은 생체적합성 액체에 의해 제공될 수 있다.
이러한 투명한 조성물은 본 발명의 지혈 조성물에 사용될 수 있고, 이에 따라서 본 발명의 실질적으로 투명한 지혈 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 실질적으로 투명한 지혈 조성물은, 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제를 생체적합성 액상 전체를 통해서 분산된 지혈에 이용하기에 적합한 가교결합된 생체적합성 다당류의 불용성 입자를 포함하는 실질적으로 투명한 조성물과 혼합함으로써 형성될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 실질적으로 투명한 지혈 조성물은 본 발명의 지혈 조성물로부터 기포를 제거함으로써 형성될 수 있다. 기포는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 원심 분리에 의해 지혈 조성물로부터 제거될 수 있다.
본 발명에 따르면, 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제; 생체적합성 액체; 및 지혈에 사용하기에 적합하고 생체적합성 액체에 불용성인 가교결합된 생체적합성 다당류의 입자를 포함하는 실질적으로 투명한 지혈 조성물이 추가로 제공된다.
본 발명의 조성물은, 1㎜ 이하의 직경, 예를 들어 적어도 0.5㎜, 0.4㎜, 0.3㎜, 0.2㎜, 또는 0.1㎜ 직경의 수술용 봉합사가 3㎜ 두께의 조성물을 통해 보인다면, 투명한 것으로 간주된다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 희석제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 희석제는 상처 부위에 대해서 본 발명의 조성물의 국소 투여에 적합한 것들을 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제는 완충액, 예컨대, Tris-HCl, 아세트산염, 또는 인산염 완충액, 첨가제, 예컨대, 세제 또는 가용화제(예를 들어, 트윈 80(Tween 80), 폴리솔베이트 80(Polysorbate 80)), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들어, 메타-크레졸, 파라벤(메틸, 프로필, 또는 부틸), 클로로부탄올, 페닐수은산염(예를 들어, 아세트산염, 붕산염, 질산염), 솔브산, 벤질 알코올), 및 증량물질(예를 들어, 락토스, 만니톨), 긴장성 제제(tonicity agent)(예를 들어, 당, 염화나트륨), 중합체성 화합물, 예컨대, 폴리락트산, 폴리글리콜산을 포함한다.
본 발명의 조성물은 조성물의 제조를 용이하게 하거나, 물리적 및 기계적 특성을 향상시키거나, 조성물의 지혈 특성을 향상시키거나 또는 항균 특성을 제공하기 위한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 유효량의 1종 이상의 첨가제 또는 화합물, 예컨대, 환자에게 전달될 생활성 성분(들), 점도 조절제, 예컨대, 탄수화물 및 알코올, 흡수율을 제어하기 위한 물질, 계면활성제, 항산화제, 보습제, 습윤제, 윤활제, 증점제, 희석제, 방사선 안정화제(예를 들어, 라디칼 포획제), 가소제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 조성물의 압출성 또는 주입성을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다. 사용될 때, 글리세롤이, 액상의 중량을 기준으로, 약 0 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 10 중량% 또는 약 5 중량%의 글리세롤이 조성물에 존재할 수 있다.
예시적인 생활성 성분은, 단백질, 탄수화물, 핵산, 및 무기 및 유기 생물학적 활성 분자, 예컨대, 효소, 항신생물제, 항균제, 예컨대, 정균제, 살균제, 항생제, 항바이러스제, 국소 마취제, 항염증제, 호르몬, 항신생혈관제, 항체, 신경 전달 물질, 향정신성 약품, 생식기 및 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 영향을 주는 약물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 생활성 성분은 전형적으로 비교적 낮은 농도, 전형적으로 조성물의 10 중량% 미만, 보통 5 중량% 미만, 흔히 1 중량% 미만에서 존재할 것이다.
"유효량"이란, 첨가제가 첨가되는 성질을 조성물에 제공하는데 필요한 양을 의미한다. 또한 유효량은 유해한 생물학적 영향을 미치지 않으면서 첨가될 수 있는 최대량에 의해 제한된다.
본 발명의 조성물의 생체적합성 액체 및 입자는 전형적으로 지혈을 제공하는데 사용하기에 적합한 조성물, 예를 들어, 페이스트, 또는 슬러리를 제공하는데 유효한 상대적인 양으로 존재한다. 소정의 실시형태에 있어서, 입자 대 액체의 중량비는 약 1:1 내지 약 1:12, 또는 약 1:3 내지 약 1:8 또는 약 1:5이다. 본 발명의 조성물은 전형적으로 1 중량% 내지 70 중량%, 예를 들어 5 중량% 내지 20 중량%, 또는 5 중량% 내지 16 중량%의 범위의 고형분 함량을 가질 것이다. 보다 높은 고형분 함량을 가진 조성물에 대해서, 전형적으로 16 중량% 초과, 전형적으로 0.1 중량% 내지 30 중량%, 또는 1 중량% 내지 5 중량%의 가소제가 조성물에 포함될 수 있다. 적합한 가소제는 폴리에틸렌 글리콜, 솔비톨, 및 글리세롤을 포함한다.
본 발명에 따르면, 또한 피브리노겐을 본 발명의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 피브리노겐을 중합하는 방법이 제공된다.
중합에 사용되는 피브리노겐 및 조성물의 상대 농도는, 조성물의 속성, 예를 들어 얼마나 많은 피브리노겐-결합 펩타이드가 존재하는지, 그리고 피브리노겐-결합 펩타이드의 서열에 좌우될 것이다. 본 출원인은 생리적 수준의 피브리노겐(3㎎/㎖)과 함께 0.005㎎/㎖ 내지 2㎎/㎖ 범위의 농도의 펩타이드 덴드리머를 사용해서 신속한 중합 시간을 관찰하였다.
몇몇 펩타이드 덴드리머에 대해서, 덴드리머의 농도가 증가함에 따라서, 피브리노겐 중합 속도(즉 "응고 시간")가 저감된다. 이론에 구속되는 일 없이, 이것은 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드에 의한 피브리노겐 분자의 'a' 및/또는 'b' 구멍의 포화로 인한 것으로 여겨진다. 이들 보다 높은 덴드리머 농도에서, 유리 피브리노겐 결합 구멍과(즉, 빈 'a' 및/또는 'b' 구멍과) 경쟁하는 과잉의 피브리노겐-결합 펩타이드가 있고, 이 경쟁은 중합이 일어나는 속도를 감소시키는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따르면, 또한 본 발명의 조성물 및 개별적으로 피브리노겐을 포함하는, 출혈을 치료하기 위한 키트가 제공된다.
조성물은 표적 부위에 존재하는 내인성(즉, 숙주) 피브리노겐을 중합시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 외인성 피브리노겐은 표적 부위에 본 발명의 조성물에 더하여 투여될 수 있다.
용어 "피브리노겐"은 트롬빈에 의해 전환되어 피브린을 형성할 수 있는 천연 피브리노겐, 재조합 피브리노겐 또는 피브리노겐의 유도체(예를 들어, 천연 또는 재조합 피브린 단량체 또는 자발 조립이 가능할 수 있거나 가능하지 않을 수 있는 피브린 단량체의 유도체)를 포함하도록 본 명세서에서 사용된다. 피브리노겐은 적어도 2개의 피브리노겐 결합 펩타이드를 결합 가능해야만 한다. 피브리노겐은 임의의 공급원으로부터, 그리고 임의의 종(소 피브리노겐 포함)으로부터 획득될 수 있지만, 바람직하게 인간 피브리노겐이다. 인간 피브리노겐은 자가 또는 공여자 혈액으로부터 획득될 수 있다. 대상체에게 투여될 때 감염의 위험을 감소시키기 때문에 자가 피브리노겐, 또는 재조합 피브리노겐이 바람직하다.
인간 대상에게 투여하기 위한 본 발명의 조성물의 적절한 양은, 예를 들어, 지혈제의 유형, 예를 들어 담체 분자당 얼마나 많은 피브리노겐 결합 펩타이드가 존재하는지, 그리고 상처 또는 출혈 부위의 유형 및 크기에 좌우될 것이다. 그러나, 지혈제의 전형적인 양은, 0.005 내지 25㎎/㎖, 예를 들어 0.01 내지 10㎎/㎖의 농도의 지혈제를 함유하는 조성물의 0.1㎖ 내지 50㎖, 예를 들어 0.1㎖ 내지 5㎖, 1 내지 50㎖, 또는 1 내지 5㎖이다.
인간 대상체에게 투여하기 위한 외인성 피브리노겐의 적합한 양은 0.1㎎ 내지 120㎎, 예를 들어 3㎎ 내지 120㎎이다.
본 발명의 조성물은 몇 가지 중요한 이점을 갖는다. 특히, 소정의 실시형태에 있어서, 지혈제는 통상의 고상 펩타이드 합성 절차를 이용해서 용이하게 제조될 수 있다. 이것은 이러한 생성물로부터 바이러스 또는 피리온 감염의 위험을 최소화한다. 최적 농도에서, 본 발명의 조성물의 지혈제는, 트롬빈의 부재 중에, 1초 미만에 피브리노겐을 중합할 수 있다. 본 발명의 조성물의 지혈제는 또한 인간 혈장에서 1초 미만에 피브리노겐을 중합할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 지혈제의 구조는 조성물의 의도된 사용을 위하여 이의 특성을 최적화시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐의 'a' 구멍에 우선적으로 결합하는 동일한 서열의 5개의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머는 피브리노겐을 거의 동시에 중합시킬 수 있다. 이와 대조적으로, 피브리노겐의 'a' 구멍에 우선적으로 결합하는 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드를 가진 '키메라' 펩타이드 덴드리머, 및 피브리노겐의 'b' 구멍에 우선적으로 결합하는 1개 이상의 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드는, 피브리노겐을 더욱 느리게 중합시킬 수 있지만, 보다 큰 밀도 및 크기의 하이드로겔을 형성한다.
본 발명의 조성물(특히 생체적합성 액체가 수성 액체인 본 발명의 조성물) 중의 지혈제는 놀랍게도 멸균, 특히 증기 멸균, 및 건열 멸균에 내성이 있는 것으로 판명되었다. 결과적으로, 본 발명의 조성물은, 지혈 활성의 상당한 손실 없이, 특히 피브리노겐과 중합하는 조성물의 지혈제의 능력의 상당한 손실 없이 통상의 멸균 방법을 이용해서 멸균될 수 있다. 이것은 이 조성물이 수화된, 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물로서 제공될 수 있게 하기 때문에 중요한 이점이다. 조성물은 사용 시간 이전에 잘 제조될 수 있는 한편, 열 또는 증기 멸균에 노출된 후에도 지혈 활성을 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "멸균"은 본 명세서에 기술되고 청구된 조성물 및 의료 기기에 관한 정부 표준에 의해 더욱 인정되고 기술된 바와 같이 살아 있는 세균 및/또는 미생물을 실질적으로 함유하고 있지 않은 것을 의미한다.
적합한 통상의 멸균 방법은 압력 하에 포화 증기를 사용하는 것("증기 멸균"), 또는 건열 멸균을 포함한다.
오토클레이브 내에서 압력 하 포화 증기에의 미생물의 노출은 효소 및 구조 단백질의 비가역적 변성을 초래한다. 오토클레이브는 오토클레이브의 내용물을 고압 포화 증기에, 예를 들어, 121℃(249℉)에서 약 15 내지 20분 동안 처리하여 멸균에 사용되는 압력 챔버이다. 변성이 발생하는 온도는 존재하는 물의 양에 반비례하여 변한다. 증기의 진입 전에 공기를 오토클레이브로부터 배기시켜야 한다. 이 방법은 수성 제제 및 외과용 드레싱 및 의료 기기에 특히 적합하다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물을 멸균하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 조성물을 멸균시키는데 유효한 시간, 온도 및 압력의 조건 하에, 감압 하에 포화 증기에 조성물을 노출시키는 단계를 포함한다. 오토클레이브 내에서 압력 하에 포화된 증기를 사용하는 멸균에 적합한 조건은 121 내지 124℃(200㎪)에서 적어도 15분, 126 내지 129℃(250 ㎪)에서 적어도 10분, 또는 134 내지 138℃(300㎪)에서 적어도 5분이다.
건열 멸균 공정에서, 1차적 치사 공정은 세포 성분의 산화인 것으로 여겨진다. 건열 멸균은 습열과 더 긴 노출 시간보다 더 높은 온도를 필요로 한다. 따라서, 상기 방법은 유해 효과 또는 침투에 대한 실패 때문에 증기에 의해 멸균될 수없는 열-안정성, 비수계 물질에 대해서 보다 편리하다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물을 멸균하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 조성물을 멸균시키는데 유효한 시간 및 온도 조건 하에 조성물을 건열에 노출시키는 단계를 포함한다. 건열 멸균을 위한 적합한 온도 및 시간은 180분 동안 160℃, 60분 동안 170℃, 또는 30분 동안 180℃이다. 기타 조건은 모든 바람직하지 않은 미생물의 효과적인 제거를 보장하기 위해 상이한 조건이 필요할 수 있다. 오븐에는 통상 처리된 모든 재료 전체를 통한 열의 균일한 분포를 확보하기 위하여 강제 통풍 시스템이 장착되어야 한다.
본 발명에 따르면, 또한 멸균성인 본 발명의 조성물이 제공된다. 본 발명의 멸균 조성물은 임의의 적합한 방법에 의해, 가장 적합하게는, 증기 멸균 또는 건열 멸균에 의해 멸균되어 있을 수 있다.
출원인은 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 지혈제가 121℃에서 25분 동안 오토클레이브에서 멸균화 후에 피브리노겐을 중합하고 40℃에서 적어도 13주 동안 저장한 경우에 안정적인 채로 있게 하는 능력을 보유하는 것을 확인하였다. 출원인은 또한 121℃에서 25분 동안 오토클레이브에서 멸균화 후에 피브리노겐을 중합하고 40℃에서 적어도 2주 동안 저장한 경우에 안정적인 채로 있게 하는 능력을 보유하는 것을 확인하였다. 40℃의 저장 온도는 가속된 안정성 연구를 위하여 사용되고, 약제학적 제품의 저장 동안 전형적으로 우세한 온도에서 예를 들어 실온 또는 냉장고 온도에서 보다 긴 기간 동안 저장이 예견된다.
본 발명의 조성물은 유리하게는 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 제형으로서 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 표적 부위에 조성물의 투여를 위하여 적합한 애플리케이터에 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 주사기, 주걱, 브러시, 스프레이와 같은 애플리케이터를 이용해서, 압력에 의해 수동으로, 또는 임의의 기타 통상의 수법에 의해 적용될 수 있다. 보통, 조성물은 재료의 비드, 층 또는 유사한 부분을 형성하도록 오리피스, 개구, 바늘, 튜브 또는 기타 통로를 통해 조성물을 압출 가능한 주사기 또는 유사한 애플리케이터를 이용해서 적용될 것이다. 조성물의 기계적 파쇄는 조성물이 0.01㎜ 내지 5.0㎜, 바람직하게는 0.5㎜ 내지 2.5㎜의 크기를 가진 주사기 또는 기타 애플리케이터 내의 오리피스를 통해서 압출됨에 따라서 일어난다. 그러나, 전형적으로, 조성물 내의 입자는 목적하는 입자 크기(수화 시 필요한 크기의 입자를 수득함)를 가진 분말로부터 제조되었던 것이거나, 최종 압출 또는 기타 적용 단계 전에 필요한 크기로 부분적으로 또는 전체적으로 기계적으로 파쇄될 것이다.
본 발명의 지혈 조성물이 이용될 수 있는 의료 기기는 지혈을 필요로 하는 표적 부위에 유동성 또는 주사 가능한 지혈 페이스트를 적용하기에 적합한 임의의 기기를 포함한다. 기기 또는 애플리케이터의 예는 주사기, 예컨대, 벡톤 딕슨(Becton Dickinson) 또는 모노젯 루어(Monoject luer) 주사기를 포함한다. 기타 적합한 기기는 미국 특허 제6,045, 570호(이 내용은 이의 전문이 참고로 편입됨)에 상세히 개시되어 있다.
조성물은 다양한 수화도에서 적용될 수 있지만, 보통 반드시는 아니지만 적어도 부분적으로 수화된다. 평형 수화 수준에서 적용될 경우, 조성물은 조직에 적용될 때 실질적으로 평형 수화를 나타내고 거의 또는 전혀 팽윤되지 않을 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 평형 팽윤 미만의 수화 수준에서 환자에게 전달된다. 조성물 내 입자는 혈액 또는 체액과 접촉 시 10 내지 20%까지 팽윤될 수 있다. 부분적으로 수화된 조성물의 팽윤은 조성물이 적용되는 조직 및 그 둘레로부터 수분의 흡수를 초래한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 표적 부위에 조성물을 투여하기 위한 지시서를 포함하는 키트를 제공한다. 조성물 및 지시서는 통상의 용기, 예컨대, 박스, 단지, 파우치 또는 접시에 함게 포함될 것이다. 지시서는 종이 또는 기타 재료의 별도의 시트 상에 인쇄되고 용기 상에 또는 내에 패키징될 수 있거나 또는 용기 자체에 인쇄될 수 있다. 보통, 조성물(들)은 별도의 멸균 주사기 또는 기타 애플리케이터에, 또는 별도의 병, 단지 또는 바이알에 제공될 것이다. 본 발명의 조성물이 비수화된 형태로 제공된다면, 키트는 임의로 수화용의 적합한 수성 완충액과 함께 별도의 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 애플리케이터에 제공되지 않는다면, 적합한 애플리케이터, 예컨대, 주사기가 또한 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 또한 본 발명의 지혈 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 생체적합성 액체, 가용성 지혈제, 및 지혈에 사용하기에 적합하고 생체적합성 액체에 불용성인 가교결합된 생체적합성 다당류의 입자를 함께 혼합하는 단계를 포함하며, 여기서 가용성 지혈제는 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제를 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 생체적합성 액체, 가용성 지혈제, 및 입자는 액상 전체를 통해서 실질적으로 균일하게 분산된 입자를 포함하는 연속 액상을 형성하는데 유효한 조건 하에 함께 혼합됨으로써, 실질적으로 균질한 지혈 조성물을 형성한다.
생체적합성 액체, 가용성 지혈제, 및 입자는 임의의 수순으로 또는 실질적으로 동시에 함께 혼합될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 생체적합성 액체와 입자는 함께 혼합되어, 입자가 액체 전체를 통해서 분산된 실질적으로 균질한 페이스트를 형성할 수 있고, 가용성 지혈제가 이어서 첨가되어 페이스트와 혼합되어 지혈 조성물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 액체, 또는 기타 액체(그러나 바람직하게는 물 또는 수성 액체, 예컨대, 수성 완충액) 내 지혈제의 용액은 실질적으로 균질한 페이스트에 첨가되어 페이스트와 혼합되어 지혈 조성물을 형성할 수 있다. 임의로, 균질한 페이스트는 가용성 지혈제의 첨가 전에 또는 후에 기포를 제거하기 위하여 원심분리될 수 있다. 대안적인 실시형태에 있어서, 가용성 지혈제는, 생체적합성 액체 중에 용해되거나 이와 혼합될 수 있고, 이어서 이 혼합물에 입자가 첨가되고 혼합되어 지혈 조성물을 형성할 수 있다. 임의로, 지혈 조성물은 이어서 기포를 제거하기 위하여 원심분리될 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 가용성 지혈제 및 입자는 실질적으로 동시에, 또는 다른 것 후 바로 생체적합성 액체에 첨가되고, 이어서 혼합되어 지혈 조성물 원심분리될 수 있다. 임의로, 이어서 조성물은 기포를 제거하기 위하여 원심분리될 수 있다. 기포의 제거는 조성물의 불투명도를 저감시켜, 실질적으로 투명하게 만들 것이다.
지혈 조성물은, 예를 들어, 증기 멸균 또는 건열 멸균에 의해 멸균될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 지혈 조성물은 수화된 유동성 페이스트 또는 슬러리에 제형화되고, 애플리케이터(예를 들어, 위에서 기술된 바와 같은 주사기 또는 기타 애플리케이터)에 패키징되고, 이어서 멸균화되어 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물을 포함하는 애플리케이터가 제공된다.
내부에 조성물이 패킹된 애플리케이터는 임의의 적합한 방법에 의해, 가장 적합하게는 증기 멸균 또는 건열 멸균에 의해 멸균될 수 있다.
본 발명의 조성물은 지혈 효과에 부가해서 밀봉 특성을 지닐 수 있다. 조성물은 출혈이 없거나 거의 없는 상체에 예방적으로 적용될 수 있고, 상처에 대해서 응집성의 보호적 장벽을 형성함으로써 상체가 치유되는 것을 도울 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 지혈 조성물이 제공된다.
본 발명의 방법에 따르면, 또한 출혈의 치료에 사용하기 위한 또는 상처의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 지혈 조성물이 제공된다.
본 발명의 방법에 따르면, 또한 출혈의 치료를 위한 또는 상처의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 지혈 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 방법에 따르면, 또한 출혈 상처에 유효량의 본 발명의 지혈 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 출혈을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법에 따르면, 상처에 유효량의 본 발명의 지혈 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
대상체, 예컨대, 인간 대상체에게 투여하기 위한 유효량의 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 지혈제의 유형, 예를 들어, 얼마나 많은 피브리노겐-결합 펩타이드가 담체 분자당 존재하는지 그리고 상체 또는 출혈 부위의 유형 및 크기에 좌우될 것이다. 그러나, 조성물의 전형적인 유효량은, 0.005 내지 25㎎/㎖, 예를 들어 0.01 내지 10㎎/㎖의 농도의 지혈제를 함유하는 조성물의 0.1㎖ 내지 50㎖, 예를 들어 0.1㎖ 내지 5㎖, 1 내지 50㎖, 또는 1 내지 5㎖이다.
본 발명의 실시형태는, 이하의 첨부된 도면을 참조하여, 오직 예로서 이제 설명한다:
도 1은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 바람직한 실시형태에서 사용하기 위한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면;
도 2는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 3은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 4는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 5는 상이한 펩타이드 덴드리머를 사용하여 피브리노겐의 중합에 의해 형성된 하이드로겔의 사진을 도시한 도면;
도 6은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 펩타이드 접합체와 펩타이드 덴드리머의 몇몇 조합의 능력을 도시한 도면;
도 7은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면;
도 8A는 간 생검 손상의 대략의 위치를 나타내는 토끼 간엽의 개략도를 도시한 도면. 도 8B는 출혈의 정도가 0 내지 5의 척도에 대해서 평가된 방법을 예시한 도면;
도 9는 생검된 토끼 간의 사진. 대조군으로 처리된 생검 부위는 "대조군"이란 표지로 위쪽에 표시되어 있다. 본 발명의 실시형태에 따른 조성물로 처리된 생검은 "HA 페이스트 + HXP12"라는 표지로 위쪽에 표시되어 있다;
도 10은 시간 경과에 따라서, 대조군과 비교된, 생검된 토끼 간의 출혈을 치료함에 있어서 본 발명의 조성물의 상이한 실시형태의 지혈 효과(지혈 성공%)의 그래프; 및
도 11a는 가교결합된 하이알루론산 겔 입자를 함유하는 투명한 페이스트의 사진을 나타낸 도면. 도 11b는 지혈제를 가진 투명한 페이스트를 지혈제와 혼합함으로써 형성된 본 발명의 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면. 도 11c는 동소에서 멸균된 본 발명의 조성물의 실시형태를 함유하는 주사기의 사진을 나타낸 도면. 도 11d는 주사기를 통해서 압출된 본 발명의 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면. 도 11e는 수술용 봉합사 재료 위에 침착된 본 발명의 투명한 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면.
도 1은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 바람직한 실시형태에서 사용하기 위한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면;
도 2는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 3은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 4는 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면(번호는 펩타이드 덴드리머의 식별을 나타냄);
도 5는 상이한 펩타이드 덴드리머를 사용하여 피브리노겐의 중합에 의해 형성된 하이드로겔의 사진을 도시한 도면;
도 6은 다양한 농도에서 피브리노겐을 중합시키는 펩타이드 접합체와 펩타이드 덴드리머의 몇몇 조합의 능력을 도시한 도면;
도 7은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머의 능력을 도시한 도면;
도 8A는 간 생검 손상의 대략의 위치를 나타내는 토끼 간엽의 개략도를 도시한 도면. 도 8B는 출혈의 정도가 0 내지 5의 척도에 대해서 평가된 방법을 예시한 도면;
도 9는 생검된 토끼 간의 사진. 대조군으로 처리된 생검 부위는 "대조군"이란 표지로 위쪽에 표시되어 있다. 본 발명의 실시형태에 따른 조성물로 처리된 생검은 "HA 페이스트 + HXP12"라는 표지로 위쪽에 표시되어 있다;
도 10은 시간 경과에 따라서, 대조군과 비교된, 생검된 토끼 간의 출혈을 치료함에 있어서 본 발명의 조성물의 상이한 실시형태의 지혈 효과(지혈 성공%)의 그래프; 및
도 11a는 가교결합된 하이알루론산 겔 입자를 함유하는 투명한 페이스트의 사진을 나타낸 도면. 도 11b는 지혈제를 가진 투명한 페이스트를 지혈제와 혼합함으로써 형성된 본 발명의 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면. 도 11c는 동소에서 멸균된 본 발명의 조성물의 실시형태를 함유하는 주사기의 사진을 나타낸 도면. 도 11d는 주사기를 통해서 압출된 본 발명의 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면. 도 11e는 수술용 봉합사 재료 위에 침착된 본 발명의 투명한 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸 도면.
실시예
1
펩타이드
덴드리머
및
펩타이드
접합체의 합성
펩타이드는 Fmoc 또는 Boc 보호된 아미노산(노바바이오켐사(Novabiochem))을 사용해서, 표준 Fmoc 펩타이드 합성에 의해 링크(Rink) 아마이드 MBHA 저적재 수지(노바바이오켐사, 0.36 m㏖/g) 상에서 합성하였다.
일반적으로, 단일-커플링 주기를 합성 전반에서 사용하였고 HBTU 활성화 화학을 적용하였다(HBTU 및 PyBOP(AGTC 바이오프로덕츠사(Bioproducts))가 커플링제로서 사용되었음). 그러나, 일부 위치에서 커플링은 예상보다 덜 효율적이었고 이중 커플링이 필요하였다.
펩타이드는 자동화 펩타이드 합성기 및 HBTU를 사용해서 분지점까지 그리고 펩타이드 분지에 대해 PyBOP을 사용해서 수동 펩타이드 합성에 의해 조립하였다.
자동화 합성 동안 3배 과량의 아미노산 및 HBTU가 각 커플링에 사용되었고 9배 과량의 다이메틸폼아마이드(DMF, 시그마사(Sigma)) 중 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 시그마사)이 사용되었다.
수동 합성의 경우, 3배 과량의 아미노산 및 PyBOP가 각 커플링에 사용되었고 9배 과량의 N-메틸파이롤리다이논(NMP, 시그마사) 중 DIPEA가 사용되었다.
DMF 중 20% 피페리딘(시그마사)을 사용한 성장하는 펩타이드 사슬의 탈보호(Fmoc기 제거)도 역시 항상 효율적일 수는 없고 이중 탈보호를 필요로 할 수 있다.
분지는 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, 또는 Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 사용해서 만들었다.
고체 지지체로부터 펩타이드의 최종 탈보호 및 절단은 2 내지 3시간 동안 트라이아이소프로필실란(TIS, Sigma), 물 및 아니솔(Sigma)(1:1:1, 5%)을 함유하는 95% TFA(Sigma)로 수지의 처리에 의해 수행하였다.
절단된 펩타이드는 냉 원심분리에 의해 펠렛화시킨 냉 다이에틸 에터(시그마사)에서 침전시키고 원심분리에 의해 펠렛화시키고 동결건조시켰다. 펠렛을 물(10-15㎖)에 재용해시키고, 여과하고, C-18 컬럼(피노메넥스(Phenomenex), 20 ㎖/분의 유속) 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용해서 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 생성물을 동결건조시키고 ESI-LC/MS 및 분석용 HPLC에 의해 분석하고 순수한 것을 확인하였다(>95%). 질량 결과는 모두 계산된 값과 일치하였다.
펩타이드
덴드리머
및
펩타이드
접합체
상기 기술된 방법을 사용해서 합성된 펩타이드 덴드리머 및 펩타이드 접합체의 구조를 하기에 도시한다.
펩타이드 서열 말단의 "NH2-"기는 서열의 아미노 말단의 아미노기를 의미한다. 펩타이드 서열 말단의 "-am"기는 서열의 카복시 말단의 아마이드기를 의미한다.
펩타이드 접합체 1번:
펩타이드
접합체 2번:
펩타이드
덴드리머
3번:
펩타이드
덴드리머
4번:
펩타이드
덴드리머
5번:
펩타이드
덴드리머
8번:
펩타이드
덴드리머
9번:
펩타이드
덴드리머
10번:
펩타이드
덴드리머
11번:
펩타이드
덴드리머
12번:
펩타이드
덴드리머
13번:
실시예
2
피브리노겐과
펩타이드
덴드리머의
공중합
덴드리머 12번은 5개의 연속되는 라이신 잔기를 갖는 분지된 코어를 포함한다. 라이신 잔기는 인접한 라이신 잔기의 측쇄를 통해 공유적으로 연결된다.
피브리노겐을 중합시키는 펩타이드 덴드리머 12번의 능력을 평가하였다. 0.005-2 ㎎/㎖ 범위의 농도로, 용액 중 30㎕의 덴드리머를 3 ㎎/㎖(혈중에 존재하는 피브리노겐의 수준)인 100㎕ 정제된 인간 피브리노겐에 첨가하였다. 피브리노겐의 중합은 시그마 아멜룽(Sigma Amelung) KC4 델타 응집 분석기를 사용해서 분석하였다. 도 1은 덴드리머의 농도가 증가함에 따른 중합(응고) 시간(초)의 그래프를 도시한다.
그 결과는 덴드리머가 매우 낮은 농도의 덴드리머에서 조차도, 거의 순간적으로 피브리노겐과 공중합할 수 있었음을 보여준다. 0.5 ㎎/㎖가 넘는 덴드리머 농도에서 응고 시간의 증가는 피브리노겐 내 자유 결합 포켓의 수와 비교하여 과량의 피브리노겐-결합 펩타이드로 설명될 것으로 여겨진다. 더 높은 농도에서, 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐 결합 포켓을 포화시킬 수 있어, 피브리노겐과 공중합할 수 없는 과량의 덴드리머 분자의 유의한 수를 야기시킨다.
실시예
3
피브리노겐과의 공중합 속도에 대한
덴드리머당
피브리노겐-결합
펩타이드
수 변화의 효과
이 실시예는 피브리노겐과의 공중합 속도에 대한 펩타이드 덴드리머당 피브리노겐-결합 펩타이드의 수를 변화시킨 효과를 조사한다.
피브리노겐과 공중합하는 펩타이드 덴드리머 4번, 5번, 10번, 11번 및 12번의 능력은 실시예 2에 기술된 동일한 방법을 사용하여 평가하였다. 각 덴드리머의 농도는 0.005 내지 0.5 ㎎/㎖의 범위로 변화될 수 있다. 도 2는 각각의 상이한 덴드리머의 농도를 증가시킴에 따른 응고 시간(초)의 그래프를 도시한다.
그 결과는 덴드리머 5번(오직 2개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 가짐)은 피브리노겐과 공중합할 수 없었음을 보여준다. 피브리노겐-결합 펩타이드의 수가, 대략 0.125 내지 대략 0.275 ㎎/㎖의 덴드리머 농도에서, 3개에서 5개로 증가됨에 따라 공중합 속도가 증가하였다. 대략 0.125 ㎎/㎖ 덴드리머 이하의 농도에서, 덴드리머 10번(3개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 가짐)은 덴드리머 4번(4개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 가짐)보다 더 빠른 응고 시간을 야기시켰다. 대략 0.02 내지 0.5 ㎎/㎖ 범위에서, 덴드리머 12번(5개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 가짐)은 거의 순식간에 응고를 일으켰다. 대략 0.05 내지 0.3 ㎎/㎖ 범위에서, 덴드리머 11번(4개 피브리노겐-결합 펩타이드/덴드리머를 가짐)도 또한 거의 순식간에 응고를 일으켰다.
피브리노겐이 덴드리머에 의해 중합되는 속도를 대체로 덴드리머당 피브리노겐-결합 펩타이드의 수가 증가함에 따라 증가된다고 결론내렸다.
실시예
4
피브리노겐과의 공중합 속도에 대한 피브리노겐-결합
펩타이드
배향, 및 상이한 피브리노겐-결합
펩타이드
서열의 효과
피브리노겐-결합 펩타이드의 배향이 피브리노겐과 공중합하는 펩타이드 덴드리머의 능력에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 단일 삼작용성 아미노산 잔기(라이신)에 부착된 3개 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머를 합성('3-분지형' 덴드리머라 칭함)하였는데, 피브리노겐-결합 펩타이드의 하나는 이의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되고, 이의 카복시 말단에는 아미드화되게 배향되었다. 피브리노겐과 공중합되는 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 덴드리머의 능력을 또한 시험하였다.
펩타이드 덴드리머 3번 및 10번의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각 서열 GPRPG(서열번호 17)이다. 펩타이드 덴드리머 10번의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 카복시 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된다. 펩타이드 덴드리머 3번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 하나는 이의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된다. 그 펩타이드의 카복시 말단은 아마이드기를 포함한다.
펩타이드 덴드리머 8번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 2개는 서열 GPRPG(서열번호 17)이고, 제3 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된 서열 APFPRPG(서열번호 14)이다. 그 펩타이드의 카복시 말단은 아마이드기를 포함한다.
펩타이드 덴드리머 9번의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 2개는 서열 GPRPFPA(서열번호 3)이고, 제3 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된 서열 APFPRPG(서열번호 14)이다. 그 펩타이드의 카복시 말단은 아마이드기를 포함한다.
서열 GPRPG(서열번호 17)는 피브리노겐의 구멍 'a' 및 구멍 'b'에 결합하지만, 구멍 'a'에 약간의 선호도가 있다. 서열 GPRPFPA(서열번호 3)는 피브리노겐의 구멍 'a'에 높은 선호도로 결합한다. 서열 Pro-Phe-Pro는 펩타이드 사슬의 골격을 안정화시키고 노브-구멍 상호작용의 친화성을 강화시킨다(Stabenfeld et al., BLOOD, 2010, 116: 1352-1359).
피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력은 0.005 내지 0.5 ㎎/㎖ 범위인 각 덴드리머의 농도에 대해, 실시예 2에 기술된 동일한 방법을 사용해서 평가하였다. 도 3은 각각의 상이한 덴드리머의 농도 증가에 따라 획득된 응고 시간(초)의 그래프를 도시한다.
그 결과는 3-분지형 덴드리머의 피브리노겐-결합 펩타이드 중 하나의 배향을 변화시켜서, 펩타이드가 그 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향되는 것(즉, 덴드리머 3번)은 피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력을 감소시켰음을 보여준다(덴드리머 10번과 덴드리머 3번의 응고 시간을 비교). 그러나, 높은 피브리노겐 농도에서, 덴드리머 3번은 피브리노겐과 공중합할 수 있었다(데이터 제시 생략).
그의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 갖는 3-분지형 덴드리머는 피브리노겐과 공중합할 수 있었다(덴드리머 8번의 결과를 참조).
피브리노겐-결합 펩타이드 중 2개는 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 서열(서열 GPRPFPA(서열번호 3))을 포함하고, 이들 펩타이드는 그들 카복시 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된 것이고, 나머지 펩타이드는 이의 아미노 말단이 분지된 코어에 부착되게 배향된 역방향 서열(즉, 서열 APFPRPG(서열번호 14))을 포함하는 것인 3-분지형 덴드리머(덴드리머 9번)가 또한 피브리노겐과의 공중합에서 매우 활성이 있었다.
실시예
5
피브리노겐과
공중합하는
상이한 피브리노겐-결합
펩타이드
서열을 갖는
펩타이드
덴드리머의
능력
GPRPG(서열번호 15) 및 GPRPFPA(서열번호 3) 모티프는 피브리노겐 상의 'a' 홀에 주로 결합한다. 이 실시예는 피브리노겐과 공중합하는 키메라 펩타이드 덴드리머(즉, 동일한 분지된 코어에 부착된 상이한 피브리노겐-결합 펩타이드 서열을 갖는 펩타이드 덴드리머)의 능력 평가를 기술한다.
펩타이드 덴드리머 13번은 서열 GPRPG-(서열번호 17)('a' 구멍에 결합 선호도를 가짐)을 갖는 2개 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 서열 GHRPY-(서열번호 11)('b' 구멍에 우선적으로 결합함)을 갖는 2개 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 4-분지형 펩타이드 덴드리머이다. 비키메라 펩타이드 덴드리머 11번 및 12번은 각각 4-분지 및 5-분지 펩타이드 덴드리머이다. 이들 덴드리머의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 서열 GPRPG-(서열번호 17)을 갖는다. 덴드리머 11번, 12번 및 13번의 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 카복시 말단에서 분지된 코어에 부착된다.
피브리노겐과 공중합하는 덴드리머의 능력은 0.005 내지 0.5 ㎎/㎖ 범위의 각 덴드리머 농도에서, 실시예 2에 기술된 동일한 방법을 사용하여 평가하였다. 도 4는 각각의 상이한 덴드리머의 농도가 증가함에 따라 획득된 응고 시간(초)의 그래프를 도시한다.
그 결과는 키메라 덴드리머를 사용한 응고 속도가 0.3 ㎎/㎖ 이하의 농도에서 비키메라 덴드리머보다 느렸음을 보여준다. 그러나, 도 5는 상이한 덴드리머를 사용해서 얻은 하이드로겔의 사진을 도시한다. 겔은 사용된 펩타이드 덴드리머의 번호(11번, 12번 및 13번)로 표지하였고, "P"는 몇몇 피브리노겐-결합 펩타이드가 가용성 인간 혈청 알부민에 부착된 생성물을 사용해서 형성된 하이드로겔을 표지한다. 키메라 덴드리머에 의해 형성된 하이드로겔은 덴드리머 11번 및 12번)을 사용해서 형성된 하이드로겔과 비교하여 더 조밀하였고 유체를 덜 함유하였다(3 ㎎/㎖ 피브리노겐, 또는 더 높은 농도의 피브리노겐). 따라서, 응고 시간은 키메라 덴드리머를 사용하여 더 느렸지만, 이 덴드리머를 사용해서 형성된 하이드로겔이 더 조밀하였다.
실시예
6
피브리노겐과
공중합하는
펩타이드
덴드리머와
펩타이드
접합체의 혼합물의 능력
서열 GPRP-(서열번호 1)의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 'a' 구멍에 강력하게 우선적으로 결합한다(Laudano et al., 1978 PNAS 7S). 펩타이드 접합체 1번은, 각각이 라이신 잔기에 부착된, 이 서열을 갖는 2종의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 제1 펩타이드는 이의 카복시 말단에서 링커를 통해 라이신 잔기에 부착되고, 제2 펩타이드는 이의 아미노 말단에서 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된다. 제2 펩타이드의 카복시 말단은 아마이드기를 포함한다.
서열 GHRPY-(서열번호 11)의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 'b' 구멍에 강력하게 우선적으로 결합한다(Doolittle and Pandi, Biochemistry 2006, 45, 2657-2667). 펩타이드 접합체 2번은 이의 카복시 말단에 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된, 이 서열을 갖는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함한다. 역방향 서열(YPRHG(서열번호 16))을 갖는, 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 이의 아미노 말단에서 링커에 의해 라이신 잔기에 부착된다. 제2 펩타이드의 카복시 말단은 아마이드기를 포함한다.
링커는 펩타이드가 서로 멀리 연장될 수 있게 한다.
펩타이드 접합체 1번 또는 2번(2 ㎎/㎖)은 펩타이드 덴드리머 3번 또는 4번, 및 피브리노겐과 혼합하였고, 피브리노겐과 공중합하는 혼합물의 능력은 0.025 내지 0.5 ㎎/㎖ 범위인 각 덴드리머의 농도에 대해, 실시예 2에 기술된 동일한 방법을 사용해서 평가하였다. 도 6은 각각의 상이한 덴드리머의 농도를 증가시켜서 얻은 응고 시간(초)의 그래프를 도시한다.
그 결과는 놀랍게도, 펩타이드 접합체 2번(즉, B-노브 펩타이드를 가짐) 및 덴드리머 펩타이드를 함유하는 혼합물만이 상승적이고 증가된 활성이었던데 반해, 펩타이드 접합체 1번(A-노브 펩타이드)을 함유하는 혼합물은 펩타이드 접합체 2번 또는 펩타이드 덴드리머에 첨가시 활성이 없었음을 보여준다.
실시예
7
인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시키는
펩타이드
덴드리머의
능력
인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시키는 몇몇 상이한 펩타이드 덴드리머(4번, 5번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 13번)의 능력을 시험하였다.
30㎕의 각 덴드리머(0.25 ㎎/㎖의 농도)를 37℃에서 100㎕ 인간 혈장에 첨가하였고, 피브리노겐의 중합 반응은 시그마 아멜룽 KC4 델타 응집 분석기를 사용해서 결정하였다.
각 덴드리머의 응고 시간은 도 7에 도시하였고, 펩타이드 덴드리머 10번, 11번, 4번, 12번 및 13번이 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시킬 수 있음을 보여주었고, 덴드리머 12번이 특히 효과적이었다(1초 미만의 응고 시간). 그러나, 펩타이드 덴드리머 5번, 8번 및 9번은 인간 혈장에서 피브리노겐을 중합시킬 수 없었다.
실시예
8
용액 중 지혈제에 대한 증기
멸균화의
효과
본 실시예는 식염수 중 제형화된 지혈제(펩타이드 덴드리머 12번(실시예 1 참조): "HXP12")의 지혈 활성에 대한 증기 멸균화의 효과를 기술한다.
50㎎/㎖의 농도의 HXP12를 150mM 염화나트륨으로 0.5㎎/㎖의 농도까지 희석시켰다. 이 제형을 6㎖ 벌크 용액(60㎕의 HXP12 스톡을 이용)으로서 준비하였다. 400㎕의 이 벌크 용액을 각각 나사-끼워맞춤 기밀 덮개를 구비한 2㎖ 유리 바이알에 대해서 사용하였다. 각 바이알을 121℃에서 25분 동안 오토클레이빙하였다(200㎪). 멸균화 후, 이 바이알을 40℃에 배치하고 최대 27주 동안 저장하였다.
피브리노겐을 중합하는 저장된 샘플의 능력을 시험하기 위하여, 각 샘플을 20mM 인산염 완충액, pH 7.6으로 0.05㎎/㎖의 농도로 희석시켰다. 30㎕의 각 희석된 샘플을 20mM 인산염 완충액, pH 7.6에 조성된 3㎎/㎖의 농도의 100㎕의 인간 피브리노겐에 첨가하였다. 37℃에서 피브리노겐을 중합하는 각 희석된 샘플 내 HXP12의 능력('응고' 활성)은 시그마 아멜룽 KC4 델타 응집 분석기를 사용해서 결정하였다. 비멸균된 대조 샘플의 중합 활성 또한 결정하였다. 이 결과는 이하의 표 1에 요약되어 있다.
| HXP12 | 인간 피브리노겐 중 응고 활성(초) | |||||
| 오토클레이빙 안함 | 121℃에서 오토클레이빙 | 멸균 후 40℃에서 저장 | ||||
| 4주 | 7주 | 13주 | 27주 | |||
| c=0.05 ㎎/㎖ | 1.1 | 1.0 | 0.9 | 1.2 | 1.1 | 1.1 |
표 1의 결과는, 식염수 중 조성된 지혈제가 121℃에서 25분 동안 오토클레이브(200㎪)에서 증기에 의한 멸균 후 피브리노겐을 중합하는 그의 능력을 보유하고 이 활성은 40℃에서 적어도 27주 동안 저장 후에도 유지되는 것을 나타낸다.
실시예
9
바로 사용 가능한, 유동성, 지혈 조성물에 대한 증기 멸균의 효과
본 실시예는 하이알루론산(HA) 가교결합된 입자를 포함하는 바로 사용 가능한, 유동성 페이스트로서 제형화된 지혈제(HXP12)의 지혈 활성에 대한 증기 멸균화의 효과를 기술한다.
수중 용해된 0.6㎖의 HXP12를 10mM 인산염 완충액 중에 수화된 1.4g의 HA 하이드로겔 입자(HA 농도 2.7%; 가교결합 5:1 [HA/다이비닐 설폰 "DVS"], 완전히 수화된 입자 크기 400㎛)와 혼합하여 HXP12의 농도가 1㎎/㎖인 페이스트를 형성하였다. 200㎎의 페이스트를 유리 바이알에 분취하고, 각 바이알을 덮개로 덮었다. 바이알을 121℃에서 25분 동안 오토클레이빙(200㎪)하였다. 멸균 후, 바이알을 가속된 노화 과정을 시뮬레이션하기 위하여 80℃에서 추가로 16시간 동안 놓았다. 샘플을 4시간 및 16시간에 평가하였다.
HXP12를 저장된 샘플로부터 추출하고 20mM 인산염 완충액(pH 7.2)으로 0.1㎎/㎖의 농도로 희석시켰다. 30㎕의 각각의 추출된 샘플을 100㎕의 인간 혈장(알파 랩스사(Alpha Labs))에 첨가하고, 37℃에서 피브리노겐('응고' 활성)을 중합시키는 각 희석된 샘플 내 HXP12의 능력은 시그마 아멜룽 KC4 델타 응집 분석기를 사용해서 결정하였다. 비멸균된 대조 샘플의 중합 활성 또한 결정하였다. 이 결과는 이하의 표 2에 요약되어 있다.
| 추출된 HXP12 | 인간 혈장 중 응고 활성(초) | |||
| 오토클레이빙 안함 | 121℃에서 오토클레이빙 | 멸균 후, 80℃에서 가속된 노화 연구 | ||
| 4시간 | 16시간 | |||
| c=0.1 ㎎/㎖ | 2.0 | 2.6 | 2.8 | 4.8 |
표 2의 결과는, HA 하이드로겔 입자를 가진 바로 사용 가능한, 유동성 페이스트로서 제형화된 HXP12 펩타이드가 121℃에서 25분 동안 오토클레이브(200㎪)에서 증기에 의한 멸균 후 인간 혈장으로부터 피브리노겐을 중합하는 능력을 보유하고 그리고 이 활성은 80℃에서 적어도 4시간 동안 저장 후에도 유지되는 것을 나타낸다.
실시예
10
바로 사용 가능한, 유동성, 지혈 조성물에 대한 증기 멸균 효과
본 실시예는 하이알루론산(HA) 가교결합된 입자로 이루어진 바로 사용 가능한, 유동성 페이스트로서 제형화된 지혈제(HXP12)의 지혈 활성에 대한 증기 멸균화의 효과를 기술한다.
10 mM 인산염 완충액, 160 mM Arg.HCl(pH 6.8)에서 제형화된 0.6㎖의 HXP12의 용액을 1.4g의 HA 하이드로겔 입자(HA 농도 2.7%; 가교결합 5:1 [HA/다이비닐 설폰 "DVS"], 완전히 수화된 입자 크기 400㎛)와 혼합하여 HXP12의 농도가 1㎎/㎖인 페이스트를 형성하였다. 200㎎의 페이스트를 유리 바이알에 분취하고, 각 바이알을 덮개로 덮었다. 바이알을 121℃에서 25분 동안 오토클레이빙(200㎪)하였다. 멸균 후, 바이알을 40℃에 놓았다. 샘플을 0, 2주 및 4주에 평가하였다.
HXP12를 를 저장된 샘플로부터 추출하고 20mM 인산염 완충액(pH 7.2)으로 0.06 ㎎/㎖의 농도로 희석시켰다. 30㎕의 각각의 추출된 샘플을 20 mM 인산염 완충액(pH 7.2)에 제형화된 100㎕의 인간 피브리노겐에 3㎎/㎖의 농도로(혈중에서 확인된 피브리노겐의 수준) 첨가하였다. 37℃에서 피브리노겐을 중합하는 각 희석된 샘플 내 HXP12의 능력('응고' 활성)은 시그마 아멜룽 KC4 델타 응집 분석기를 사용해서 결정하였다. 비멸균된 대조 샘플의 중합 활성 또한 결정하였다. 이 결과는 이하의 표 3에 요약되어 있다.
| 추출된 HXP12 | c=3㎎/㎖에서 인간 피브리노겐 중 응고 활성(초) | |||
| 오토클레이빙 안함 | 121℃에서 오토클레이빙 | 멸균 후, 40℃에서 가속된 노화 연구 | ||
| 2주 | 4주 | |||
| c=0.06 ㎎/㎖ | 1.0 | 3.3 | 3.6 | 5.4 |
표 3의 결과는, HA 하이드로겔 입자를 가진 바로 사용 가능한, 유동성 페이스트로서 제형화된 HXP12 펩타이드가 121℃에서 25분 동안 오토클레이브(200㎪)에서 멸균 후 인간 피브리노겐으로부터 피브리노겐을 중합하는 능력을 보유학, 그리고 이 활성은 40℃에서 적어도 2주 동안 저장한 후에도 유지되는 것을 나타낸다.
실시예
11
토끼 간
생검
손상 모델에서 본 발명의 지혈 조성물의 지혈 활성의 평가
본 실시예는, 각각 상이한 농도의 지혈제(HXP12 펩타이드 덴드리머)를 가진 3개의 상이한 본 발명의 조성물의 지혈 활성의 시험을 기술한다.
방법
7g의 HA 페이스트(HA 농도 2.7%; 5:1; HA/DVS, 완전히 수화된 입자 크기 400㎛)를 주사기에 미리 채우고 3가지 상이한 농도 중 하나에서 3㎖의 HXP12 펩타이드 덴드리머와 혼합하여, 10㎖의 최종 생성물을 얻었다. 각 10㎖ 생성물에 대한 최종 HXP12 농도는 다음과 같았다: 샘플 B, 1㎎/㎖; B2, 0.5㎎/㎖; B3, 1.4㎎/㎖. 대조군(C)으로서, 7g의 HA 페이스트를 3㎖의 식염수와 혼합하였다.
헤파린화된 토끼(품종: 뉴질랜드 화이트(New Zealand White); 성별: 수컷)를 마취시켰다. 모두 3개의 간엽을 복강으로부터 인출하고 식염수로 젖은 거즈 면봉에 놓았다. 샘플은, 이하의 표 3에 나타낸 바와 같이 3개의 간엽에 대해 순차로 작성된 생검 손상에 대해 시험되었다. 도 8A는 3개의 간엽 상의 간 손상의 대략적인 배향 및 수순을 나타낸다.
| 절단 번호: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 간엽: | 좌측 | 좌측 | 중앙 | 중앙 | 우측 | 우측 | 우측 |
| 절단 명칭: | LL1 | LL2 | CL1 | CL2 | RL1 | RL2 | RL3 |
대략 6㎜ 생검 펀치를 사용하여 간엽 상에 대략 5㎜ 깊이로 생검을 작성하였다. 사전 칭량된 건조한 면봉을 사용하여 15초 동안 상처에서 나오는 혈액을 수집하였다. 면봉은 이어서 출혈 중증도의 척도로서 칭량하였다. 면봉 제거 후, 상처를 다른 면봉으로 건조시키고, 이어서 시험 샘플이 적용되었다.
시험된 샘플의 적용 후에, 식염수로 적신 멸균 거즈 면봉을 출혈 표면에 적용하고, 주사기를 이용해서 거즈와 출혈 표면 사이의 최대 2㎖의 샘플 B, B2, 또는 B3, 또는 2㎖의 대조군(C)을 생검 상처 내로 분배하였다. 적용 후 1분 동안 거즈 면봉에 완만한 압력을 가하였다. 젖은 거즈의 제거 후에, 상처는 시험 샘플의 적용 후 1, 3, 6, 9 및 12분(즉, 압력 인가 1분을 포함)에 지혈에 대해서 평가되었다.
0, 1, 2, 3, 4 및 5의 출혈 점수를 출혈 없음, 삼출, 매우 약함, 약함, 보통 및 중증 출혈로 각각 배정하였다(도 8B). 출혈 정도에 대한 점수는 Adams 등(J Thromb Thrombolysis DOI 10.1007/s 11239-008-0249-3)으로부터 개조하였다. 성공적인 지혈을 위하여, 식염수로 적신 면봉으로 간엽을 덮고, 각 간엽이 위에서 기술된 바와 같은 처리를 받을 때까지 그 절차를 반복하였다.
결과
도 9는 생검된 간 중 하나의 사진이다. 혈액은 대조군으로 처리된 생검 부위로부터 흐르는 것을 볼 수 있는 한편("대조군" 표지로 위에 표시됨), HA 페이스트 및 HXP12를 포함하는 본 발명의 조성물로 처리된 생검 부위에서의 지혈 효과("HA 페이스트 + HXP12" 표지로 위에 표시됨)는 명확하게 볼 수 있다.
도 10은 평가 시간(분)에 걸쳐서, 대조군과 비교된, 샘플 B, B2, 및 B3의 지혈 효과(지혈 성공%)의 그래프를 도시하고 있다. 대조군과 대조적으로, HA 페이스트 및 HXP12 펩타이드 덴드리머를 포함하는 상이한 조성물 각각은 강력한 응고 활성을 입증하였다. 이 활성은 용량-의존성이며, 보다 높은 농도의 HXP12를 가진 조성물(샘플 B 및 B3)은, 12분 평가 전체에 걸쳐서 대략 80% 내지 100%의 지혈 활성을 입증하고 있다. 가장 낮은 농도의 HXP12를 가진 조성물(샘플 B2)은 평가의 최조 3분 동안 100%의 지혈 활성을 나타내었지만, 이것은 이어서 나머지 9분에 걸쳐서 대략 75%까지 저감되었다.
이 실시예는, 본질적으로 지혈성이 아닌 HA 입자 및 응고 특성을 가진 펩타이드 덴드리머를 포함하는 본 발명의 조성물의 실시형태는 놀랍게도 출혈을 조절하는데 효과적인 것을 나타낸다.
실시예
12
가교결합된 HA 겔 입자, 및 지혈제를 포함하는 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물
가교결합된 하이알루론산(HA) 겔 입자(HA 농도 2.7%; 5:1; HA/DVS, 완전히 수화된 입자 크기 400㎛)로 제조된 유동성 페이스트는 이 페이스트를 600rpm에서 5분 동안 원심분리시킴으로써 투명하게 되었다. 투명한 페이스트는 도 11a에 도시되어 있다.
7g의 투명한 HA 페이스트를 3㎖의 HXP12 펩타이드 덴드리머(10mM 인산염 완충액, 160mM Arg.HCl에 제형화됨, pH 6.8)와 혼합하여 10㎖의 최종 생성물을 얻었다. HXP12의 최종 농도는 1.05㎎/㎖였다. 도 11b는 얻어진 조성물의 몇몇의 사진을 나타낸다. 이 사진은 상처에 대해서 연속 층을 형성하도록 충분히 응집성이고 따라서 상처를 밀봉하는데 사용될 수 있는 것을 나타낸다.
조성물을 유리 바이알에 넣고, 오토클레이브(200㎪)에서 121℃에서 25분 동안 증기 멸균에 의해 멸균시켰다.
도 11c는 조성물을 함유하는 주사기의 사진을 나타낸다. 도 11d는 조성물을 함유하는 주사기를 나타내며, 여기서 조성물의 일부는 플런저를 사용해서 주사기 배럴의 선단에 있는 개구부를 통해서 압출되었다.
도 11e는 크기 코드 "0", 직경 0.3 내지 0.39㎜의 수술용 봉합사 재료 위에 침착된 본 발명의 투명한 조성물의 실시형태의 사진을 나타낸다. 봉합사 재료는 투명한 조성물을 통해서 명확하게 볼 수 있다.
외과의사는 투여할 때 본 발명의 투명한 조성물을 통해 볼 수 있다. 이것은 조성물을 올바르게 투여하고 출혈을 조절하거나 중단시키는 데 효과가 있었는지의 여부를 결정하는 것을 훨씬 더 쉽게 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Haemostatix Limited
<120> Haemostatic Compositions
<130> WO2016/181137
<140> PCT/GB2016/051346
<141> 2016-05-11
<150> GB1508024.5
<151> 2015-05-11
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Pro Arg Pro
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Pro Arg Val
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Pro Arg Pro Phe Pro Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Pro Arg Val Val Ala Ala
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Pro Arg Pro Val Val Glu Arg
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Pro Arg Pro Ala Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gly Pro Arg Pro Pro Glu Cys
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Pro Arg Pro Pro Glu Arg
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gly Pro Ser Pro Ala Ala
1 5
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gly His Arg Pro
1
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly His Arg Pro Tyr
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly His Arg Pro Leu
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Carboxy-terminal end comprises an amide group
<400> 13
Gly His Arg Pro Tyr
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Carboxy-terminal end may comprise an amide group
<400> 14
Ala Pro Phe Pro Arg Pro Gly
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Pro or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid
<400> 15
Gly Xaa Arg Xaa
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Carboxy-terminal end comprises an amide group
<400> 16
Tyr Pro Arg His Gly
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Gly Pro Arg Pro Gly
1 5
Claims (45)
- 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물로서,
복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 가용성 지혈제;
생체적합성 액체; 및
상기 생체적합성 액체에 불용성인 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자를 포함하는 지혈 조성물로서,
상기 지혈제의 각각의 담체는 상기 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 공유적으로 부착된 분지된 코어를 포함하고,
상기 분지된 코어는,
2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기로서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기에 개별적으로 공유적으로 부착되는, 상기 2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 적어도 2개의 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 각각에 개별적으로 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 상기 다작용성 아미노산 잔기들 중 적어도 하나에 개별적으로 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기; 또는
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 다작용성 아미노산 잔기가 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 곁사슬을 통해서 공유적으로 연결된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기를 포함하고,
상기 다작용성 아미노산 잔기는 삼- 또는 사-작용성 아미노산 잔기, 또는 삼- 및 사-작용성 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 지혈 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 지혈 조성물은 증기 멸균에 의해, 또는 건열 멸균(dry-heat sterilization)에 의해 멸균된, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 액체는 연속 액상을 제공하고, 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자는 상기 액상 전체를 통하여 균질하게 분산된, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분지된 코어는 복수의 연속 다작용성 아미노산 잔기를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분지된 코어는 최대 10개의 다작용성 아미노산 잔기를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 다작용성 아미노산 잔기는 라이신, 오르니틴, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 또는 시스테인 잔기를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 지혈제는 하기 일반식 (I)의 것인, 지혈 조성물:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커이고;
X는 삼작용성 아미노산 잔기이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는 -[-X-(링커)-FBP]a-(링커)-FBP이고;
여기서, a는 1-10이다. - 제7항에 있어서,
-(링커)-는 -NH(CH2)nCO-를 포함하는 링커이고, 여기서 n은 1-10이고;
X는 라이신, 오르니틴, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 또는 시스테인 잔기이고; 또는,
a는 1-3인, 지혈 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 지혈제는 하기 일반식 (II)의 것인, 지혈 조성물:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는,
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -FBP이고 a가 1-10 일때, 이되,
여기서, R은 -(CH2)4NH-, -(CH2)3NH-, 또는 -(CH2)3NHCNHNH이다. - 제9항에 있어서, -(링커)-는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는 링커이고; 또는 a는 1-3인, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 지혈제는 하기 일반식 (III)의 것인, 지혈 조성물:
식 중,
FBP는 피브리노겐-결합 펩타이드이고;
-(링커)-는 선택적 링커이고;
Y는 -FBP 또는 -NH2이고;
Z는,
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -NH2일 때, 이거나; 또는
Y가 -FBP이고 a가 1-10일 때, 이다. - 제11항에 있어서, -(링커)-는 -NH(CH2)5CO-를 포함하는 링커이고; 또는 a는 1-3인, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩티드가 -NH(CH2)nCO-(여기서 n은 1-10임)를 포함하는 링커에 의해 상기 분지된 코어에 부착되는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 우선적으로 결합하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'a'보다 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 지혈제는 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 복수의 담체는 제1 복수의 담체, 및 제2 복수의 담체를 포함하고, 상기 제1 복수의 담체에 부착된 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 제2 복수의 담체에 부착된 상기 피브리노겐-결합 펩타이드와는 상이한 서열인, 지혈 조성물.
- 제16항에 있어서, 각각의 담체는 당해 담체에 부착된 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드를 갖는, 지혈 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 구멍 'a'에 대해서 결합의 상이한 선택성을 갖는, 지혈 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 대해서 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드보다도 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 대해서 더 높은 결합 선택성으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노-말단 단부에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 카복시-말단 단부에 아미노산 서열 -APFPRPG(서열번호 14)를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 상이한 서열의 피브리노겐-결합 펩타이드는 피브리노겐의 구멍 'b'보다 피브리노겐의 구멍 'a'에 우선적으로 결합하는 제1 피브리노겐-결합 펩타이드, 및 피브리노겐의 구멍 'a'보다 피브리노겐의 구멍 'b'에 우선적으로 결합하는 제2 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 제1 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노-말단 단부에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1)를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 제2 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노 말단 단부에 아미노산 서열 GHRP-(서열번호 10), 또는 아미노산 서열 GHRPY-(서열번호 11)를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 액체는 수용액인, 지혈 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 수용액은 식염수인, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 다당류는 글리코사미노글리칸, 산화된 셀룰로스, 키토산, 키틴, 알지네이트, 산화된 알지네이트, 또는 산화된 전분을 포함하는, 지혈 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 하이알루론산을 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자는 가교결합된 하이알루론산 과립을 포함하되, 상기 과립의 과반수는 부분적으로 또는 완전히 수화된 형태로 100 내지 1500㎛의 범위의 직경을 갖는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물의 중량으로 1 내지 70%, 또는 5 내지 20%의 고형분 함량을 갖는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자 대 상기 액체의 중량비가 1:1 내지 1:12, 또는 1:3 내지 1:8인, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 투명한, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 카복시 말단에서 상기 분지된 코어에 부착되고, 아미노 말단에 아미노산 서열 GPRP-(서열번호 1) 또는 GHRP-(서열번호 10)를 포함하는, 지혈 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 지혈제가 하기 일반식의 것인, 지혈 조성물:
- 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 출혈의 치료에 또는 상처의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 멸균된 바로 사용 가능한 유동성 지혈 조성물을 제조하는 방법으로서,
생체적합성 액체, 가용성 지혈제, 및 상기 생체적합성 액체에 불용성인 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자를 함께 혼합하는 단계로서, 상기 가용성 지혈제는 복수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 복수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하고, 상기 지혈제의 각 담체는 피브리노겐-결합 펩타이드가 개별적으로 공유적으로 부착된 분지된 코어를 포함하는, 상기 혼합하는 단계; 및
상기 조성물을 멸균시키는 단계를 포함하고,
상기 분지된 코어는,
2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기로서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 다작용성 아미노산 잔기에 개별적으로 공유적으로 부착되는, 상기 2 내지 10개의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 1개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 적어도 2개의 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 각각에 개별적으로 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기;
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 피브리노겐-결합 펩타이드가 상기 분지된 코어의 상기 다작용성 아미노산 잔기들 중 적어도 하나에 개별적으로 공유적으로 부착된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기; 또는
복수의 다작용성 아미노산 잔기로서, 2개 이상의 다작용성 아미노산 잔기가 인접한 다작용성 아미노산 잔기의 곁사슬을 통해서 공유적으로 연결된, 상기 복수의 다작용성 아미노산 잔기를 포함하고,
상기 다작용성 아미노산 잔기는 삼- 또는 사-작용성 아미노산 잔기, 또는 삼- 및 사-작용성 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 방법. - 제38항에 있어서, 상기 조성물은 증기 멸균, 또는 건열 멸균에 의해 멸균되는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 액체, 지혈제, 및 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자가, 액상 전체에 균질하게 분산된 생체적합성 가교결합된 다당류의 입자를 포함하는 연속 액상을 형성하기 위해 혼합되고, 이에 의해 균질한 지혈 조성물을 형성하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 혼합물을 원심분리시켜, 상기 혼합물로부터 기포를 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 생체적합성 액체 및 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자는 상기 가용성 지혈제의 첨가 전에 함께 혼합되는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 가용성 지혈제의 첨가 전에 상기 생체적합성 액체와 상기 생체적합성의 가교결합된 다당류의 입자의 혼합물을 원심분리시켜 상기 혼합물로부터 기포를 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 삭제
- 삭제
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