CN107592814A - 止血组合物 - Google Patents

Abstract

一种无菌的、即用型的、可流动的止血组合物包含可溶性止血剂，所述止血剂包含多个载体和固定至所述载体的多个纤维蛋白原结合肽；生物相容性液体；以及生物相容性交联多糖的颗粒，所述颗粒适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体中。此类组合物可以用于控制出血，尤其是手术程序中的出血。

Description

止血组合物

本发明涉及止血组合物，具体地是呈无菌即用形式的可流动止血组合物，涉及产生所述止血组合物的方法，并且涉及所述组合物用于控制出血，尤其是在手术程序中的出血的用途。

不可溶性血纤维蛋白聚合物由其可溶性前体纤维蛋白原形成是血液凝结的最终阶段。纤维蛋白原转化成血纤维蛋白以三个步骤发生：通过凝血酶将纤维蛋白原有限地蛋白水解成血纤维蛋白单体；将血纤维蛋白单体组装成半交错的双链初原纤维；以及将所组装的血纤维蛋白交联以加强凝结。

纤维蛋白原分子由通过二硫键连接在一起的三对不同的多肽链Aα、Bβ和γ组成。纤维蛋白原链被折叠成三个不同的结构区域，两个远端D区域连接至一个中心E区域。每个D区域含有分别位于γ链和Bβ链的C端的聚合‘a’孔和‘b’孔。凝血酶催化短肽血纤维蛋白肽A(FpA)和B(FpB)分别从中心E区域中纤维蛋白原的Aα链和Bβ链的氨基端去除，从而暴露出两个聚合位点：“突起A”，其具有氨基端序列Gly-Pro-Arg-；以及“突起B”，其具有氨基端序列Gly-His-Arg-。一个血纤维蛋白单体的最新暴露的聚合突起物通过‘A-a’和‘B-b’突起-孔相互作用与另一个血纤维蛋白单体的相应孔相互作用，从而使得血纤维蛋白单体组装成半交错的双链初原纤维。

初原纤维侧向聚集以形成较厚纤维，所述纤维积聚以形成血纤维蛋白凝块的三维网络。FpA比FpB更快地从纤维蛋白原裂解。FpA的去除引发初原纤维的形成，而FpB的去除与其侧向聚集一致。FpB释放在反应开始时非常缓慢，在聚合物形成时加速。FpB裂解的此延迟对于正常血纤维蛋白组装是必需的，并且也与不同类型的凝块形成相连接。其中仅去除FpA的血纤维蛋白I更不紧凑并且更容易被纤溶酶消化，而其中FpA和FpB二者均去除的血纤维蛋白II更紧凑并且更耐纤维蛋白溶解。

使用仅去除FpA或主要去除FpB的蛇毒酶的研究证实血纤维蛋白凝块可通过‘A-a’或‘B-b’相互作用来形成，这指示两种相互作用均可以介导初原纤维形成。使用变体重组纤维蛋白原的实验显示当‘A-a’相互作用变弱时‘B-b’相互作用可在初原纤维形成中起重要作用。其他研究已证明，‘A-a’相互作用发生在血纤维蛋白片段与纤维蛋白原分子的结合期间，甚至在‘B’突起和‘b’孔二者均是可用的时，并且‘B-b’突起-孔相互作用仅在排除‘A-a’相互作用时是清楚的。然而，肽抑制研究指示，‘B-b’相互作用可与‘A-a’同时发生。

血纤维蛋白通过在血纤维蛋白纤维中的不同分子的侧链之间形成共价交联来稳定。在通过因子XIIIa催化的转酰胺基反应中在特异性谷氨酰胺与赖氨酸侧链之间形成肽键。

当出血来源难以鉴定(例如，在弥漫性静脉出血中)时或者当存在固有凝血病时，在出血部位处施加直接压力可能不足以控制出血。止血也由于抗血小板剂和抗凝剂的存在(尤其是在经历心脏或血管手术的患者中)以及与心肺转流术相关的变化而受损。在此类情况下，局部止血剂为实现止血的常规方法提供有用的助剂。

在手术程序中使用基于明胶的止血剂。明胶粉末当与流体混合时可根据其最终用途和流体与粉末的比率以各种形式制备。例如，在采用较高浓度的流体时，可制备适用作可流动止血剂的糊料或浆料以供用于弥漫性出血，特别是来自不平坦表面或难以到达的区域。此类糊料在使用时通过将粉末和液体机械搅拌和混合来制备以提供组合物的均匀性。然后将糊料放置到递送装置或涂敷器(例如，注射器)中并且应用于伤口。

一些基于明胶的止血剂作为具有冻干凝血酶的可流动明胶基质以试剂盒形式可商购获得。在使用前，将冻干凝血酶以水或盐水重构并且将其与明胶基质混合。明胶基质的颗粒状性质使材料能够适应任何不规则的伤口几何形状。混合物的组分协同地用于促进在出血部位处的止血。明胶颗粒在暴露于血液时膨胀，从而减小血流并且产生轻微堵塞。穿过颗粒之间的空隙的血液暴露于高浓度的凝血酶。凝血酶将血液中的纤维蛋白原酶促转化成可聚合的血纤维蛋白单体。血纤维蛋白聚合物陷入明胶颗粒和出血部位处的其他细胞元件中。身体在几周内再吸收并入所得凝块中的明胶颗粒，这与正常伤口愈合的时间进程一致。

一种可商购获得的基于明胶的止血试剂盒是FLOSEAL止血基质试剂盒。明胶基质由交联明胶颗粒组成，在一次性注射器中作为无菌凝胶提供。凝血酶作为无菌的冷冻干燥的粉末制备物供应，并且使用无菌氯化钠作为稀释剂来提供。明胶基质通过从牛真皮中提取胶原、接着使胶原明胶化、使其与戊二醛交联以及将交联的明胶研磨成500-600μm大小的颗粒来制成。另一种可商购获得的试剂盒是SURGIFLO止血基质试剂盒(具有凝血酶)。所述基质以预先填充的注射器供应以与凝血酶混合。用于制成基质的明胶来源于猪皮。对明胶进行处理以产生明胶粉末产品，然后对所述产品进行处理以产生糊料。凝血酶作为冻干粉末提供以用水重构。

虽然包含明胶基质和凝血酶的止血剂有效于控制手术期间的出血，但是这种类型的产品具有几种缺点。具体地，凝血酶在溶液中不稳定并且不能在溶液中消毒而不破坏其至少一些活性。因此，凝血酶作为冻干粉末单独地提供以用于重构，之后在使用前的几个小时与明胶基质混合。这些步骤有危及混合物的无菌性的风险，不便用于手术程序，并且使产品在医院外治疗创伤性伤口不可行。目前可商购获得的试剂盒中提供的凝血酶由合并的人类血浆制备，从特许血浆收集中心，通过一系列分离和过滤步骤获得。虽然这些程序显著减小了病毒或朊病毒感染的风险，但是它们并未消除风险。

因此，需要提供适用于控制手术程序中的出血的稳定的即用型止血剂。还需要提供比包含凝血酶的常规可流动止血剂更耐消毒的即用型止血剂。还需要比包含凝血酶的目前可商购获得的可流动止血剂具有甚至进一步减小的病毒或朊病毒感染的风险的止血剂。

根据本发明，提供一种止血组合物，其包含：可溶性止血剂，所述止血剂包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽的；生物相容性液体；以及生物相容性交联多糖的颗粒，所述颗粒适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体中。

根据本发明的某些实施例，所述组合物是即用型可流动止血组合物。

已发现，本发明的组合物中的止血剂出乎意料地耐受消毒，特别是蒸汽消毒或干热消毒。因此，本发明的组合物可使用常规消毒方法消毒而没有止血活性的显著损失。这是重要的优点，因为其允许所述组合物作为水合的、无菌的、即用型的、可流动的止血组合物提供。常规基于明胶的包含凝血酶的止血剂当以水合的即用形式进行热消毒或蒸汽消毒时是不稳定的。

本文所用术语“止血”意指停止出血或使出血最小化的能力。

本文所用术语“生物相容性”意指材料与或组织相容而没有毒性或损伤并且不引起免疫排斥。材料应优选地满足由国际标准化组织(NAMSA,Northwood,Ohio)发布的标准#ISO 10993-1中的标准。

本文所用术语“可流动”意指组合物在经历超过预定水平的应力时，例如在挤出穿过孔或插管时或使用刮刀包装到递送部位时流动。所述阈值应力的范围通常为3x 10⁴Pa至5x 10⁵Pa。然而，组合物当经历低于阈值水平的应力时将保持大体上固定的。可流动组合物大体上能够适应所述组合物所递送的靶位点处的不规则伤口几何形状。

止血剂、液体和不可溶性颗粒可在有效于提供基本上均匀的止血组合物的条件下合并和混合，所述止血组合物包含连续的生物相容性液相、包含基本上均匀分散在整个液相中的颗粒。

如本文所用，“基本上均匀”是指在组合物中固体颗粒均匀分散在整个连续液相中以使得固体：液体的比率和组合物的任何部分或横截面的密度基本上相同的组合物的物理状态。

根据本发明的某些方面，所述组合物是可再吸收的。本文所用术语“可再吸收”意指所述组合物当直接施用于患者身体靶部位(并且在植入装置诸如乳房植入物内未受到保护)时在初始应用之后一年或更少，通常1天至1年、更通常1至120天、或1至90天、或2至30天的时间段内将降解或溶解。用于测量再吸收和降解的方案列出在WO 98/08550中。

用于本发明的组合物中的止血剂包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽。出乎意料地发现，止血剂当存在于本发明的止血组合物中时能够聚合纤维蛋白原。

用于本发明的组合物中的止血剂能够在凝血酶不存在下在水溶液中聚合纤维蛋白原。每个纤维蛋白原分子可以结合至少两个纤维蛋白原结合肽。因为多个纤维蛋白原结合肽固定至每个载体，纤维蛋白原分子通过载体连接在一起。在纤维蛋白原分子与纤维蛋白原结合肽之间形成非共价键。在水溶液中，当止血剂与纤维蛋白原接触时形成包含聚合纤维蛋白原的水凝胶。

止血剂应可溶于生物相容性液体和血浆中。止血剂可具有至少10mg/ml溶剂的溶解度，例如10-1000mg/ml、33-1000mg/ml或33-100mg/ml。所述止血剂应适用于施用于出血伤口部位。所述载体可包含聚合物，例如蛋白质、多糖或合成的生物相容性聚合物(诸如聚乙二醇)或其任何组合。白蛋白是蛋白质载体的实例。在优选的实施方案中，所述纤维蛋白原结合肽共价固定至载体。

在一些实施方案中，可溶性止血剂是用于形成生物凝胶的可溶药剂，如WO 2008/065388所述的(所述专利的内容整体并入本文)。WO 2008/065388描述了使用包含缀合至可溶性人类血清白蛋白(HSA)载体的若干个纤维蛋白原结合肽(各自在所述肽的氨基端包含纤维蛋白原结合肽序列GPRP)的药剂形成生物凝胶。

在本发明的一些实施例中，止血剂的每个载体包含分支核心和单独地共价连接至每个分支核心的多个纤维蛋白原结合肽。例如，止血剂可以是包含分支核心和单独地共价连接至所述分支核心的多个纤维蛋白原结合肽的肽树枝状体。

分支核心可包含：

两个至十个多官能氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的多官能氨基酸残基；

多个多官能氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的至少两个相邻多官能氨基酸残基中的每个残基；

多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的所述多官能氨基酸残基中的至少一个；

多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个多官能氨基酸残基通过相邻多官能氨基酸残基的侧链共价连接；或者

单个多官能氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至多官能氨基酸残基的每个官能团；

其中所述多官能氨基酸残基包括三官能或四官能氨基酸残基或三官能和四官能氨基酸残基，或者所述单个多官能氨基酸残基是三官能或四官能氨基酸残基。

每个纤维蛋白原结合肽具有不同的与分支核心的连接点，因此纤维蛋白原结合肽在本文中被认为“单独地共价连接”至分支核心。

分支核心包含任何适合的氨基酸序列。分支核心可包含多达十个多官能氨基酸残基，例如两个至十个或两个至六个多官能氨基酸残基。

分支核心可包含多个连续多官能氨基酸残基。分支核心可包含多达十个连续多官能氨基酸残基。

本文所用的术语“三官能氨基酸”是指具有为胺(-NH₂)的第一官能团、为羧酸(-COOH)的第二官能团和第三官能团。本文所用的术语“四官能氨基酸”是指具有为胺(-NH₂)的第一官能团、为羧酸(-COOH)的第二官能团、第三官能团以及第四官能团。第三官能团和第四官能团可以是能够与纤维蛋白原结合肽的羧基端反应或者与连接至纤维蛋白原结合肽的羧基端的接头的官能团反应的任何官能团。

多官能氨基酸可包含具有氨基、羧基和带有另一个官能团(由此提供三官能氨基酸)或另外两个官能团(由此四官能氨基酸的侧链的中心碳原子(α-或2-)。

所述多官能氨基酸残基或每个多官能氨基酸残基可以是蛋白原性或非蛋白原性多官能氨基酸或者天然或非天然多官能氨基酸残基。

蛋白原性三官能氨基酸包括具有氨基、羧基、侧链和α氢左旋构象的中心碳原子(α-或2-)。适合的三官能蛋白原性氨基酸的实例包括L-赖氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺以及L-半胱氨酸。

适合的三官能非蛋白原性氨基酸残基的实例包括D-赖氨酸、β-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸以及D-精氨酸残基。

因此，用于本发明的组合物的止血剂中的适合的三官能氨基酸残基的实例包括：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺以及半胱氨酸残基，例如L-赖氨酸、D-赖氨酸、β-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-半胱氨酸以及D-半胱氨酸残基。

适用于本发明的组合物的止血剂中的适合的多官能非天然氨基酸的实例包括瓜氨酸、2,4-二氨基异丁酸、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸以及顺式-4-氨基-L-脯氨酸。多官能非天然氨基酸可获自Sigma-Aldrich。

在一些实施方案中，分支核心可包含均聚多官能氨基酸序列，例如聚赖氨酸、聚精氨酸或聚鸟氨酸序列，诸如分支核心包含两个至十个或两个至六个连续的赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸残基。在其他实施方案中，分支核心可包含不同的多官能氨基酸残基，例如一个或多个赖氨酸残基、一个或多个精氨酸残基和/或一个或多个鸟氨酸残基。

在其他实施方案中，分支核心可包含多个多官能氨基酸残基和一个或多个其他氨基酸残基。

在分支核心包含多个多官能氨基酸残基时，相邻多官能氨基酸残基可以通过氨基酸侧链连接、通过肽键连接在一起，或者一些相邻多官能氨基酸残基可以通过侧链连接连接在一起并且其他多官能氨基酸残基通过肽键连接在一起。

在其他实施方案中，分支核心可包含两个或更多个多官能氨基酸残基，并且至少一个纤维蛋白原结合肽单独地连接至每个或更多个多官能氨基酸残基中的每一个，并且两个或更多个纤维蛋白原结合肽单独地连接至分支核心的多官能氨基酸残基中的至少一个。

根据其他实施方案，两个纤维蛋白原结合肽单独地连接至分支核心的末端多官能氨基酸残基。

适用作本发明的组合物中的止血剂的肽树突状体的结构的实例包括肽树突状体，其中：

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基；

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基和两个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基；

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽所连接的第三个三官能氨基酸残基；或者

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第三个三官能氨基酸残基以及一个纤维蛋白原结合肽所连接的第四个三官能氨基酸残基。

适用作本发明的组合物中的止血剂的肽树突状体可包含以下通式(I)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地是非肽接头；

X是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸；

Y是-FBP或-NH₂；

当Y是-FBP时Z是–(接头)-FBP，或者当Y是-NH₂时Z是-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP；

其中：

X_n是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、L-鸟氨酸或精氨酸；并且

a是1-10，优选地是1-3。

例如，当Y是NH₂时，Z是-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP，树枝状体的结构如下：

其中a是1：

或者，其中a是2：

或者，其中a是3：

可替代地，当Y是-FBP时Z是-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP；

其中：

X_n是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、L-鸟氨酸或精氨酸；并且

a是1-10，优选地是1-3。

例如，当Y是-FBP时，Z是-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP并且a是1，树枝状体的结构如下：

适用作本发明的组合物中的止血剂的肽树突状体可包含以下通式(II)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-NH(CH₂)₅CO-；

Y是-FBP或-NH₂；

Z是：

-R-(接头)-FBP，这是在Y是-FBP时，或者

其中R是-(CH₂)₄NH-、-(CH₂)₃NH-或-(CH₂)₃NHCNHNH-。

因此，在一个实施方案中，Z可以是：

其中R是-(CH₂)₄NH-、-(CH₂)₃NH-或-(CH₂)₃NHCNHNH-；

其中a是1-3。

可替代地，a可以是4-10，或者其可以是1-10。

在另一实施方案中，Z是：

其中R是-(CH₂)₄NH-、-(CH₂)₃NH-或-(CH₂)₃NHCNHNH-；

其中a是1-10，优选地是1-3。

例如，Z是：

适用作本发明的组合物中的止血剂的肽树突状体可包含以下通式(III)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-NH(CH₂)₅CO-；

Y是-FBP或-NH₂；

Z是：

-(CH₂)₄NH-(接头)-FBP，这是在Y是-FBP时；或者

因此，在一个实施方案中，Z可以是：

其中a是1-3。

可替代地，a是4-10，或者其可以是1-10。

在另一实施方案中，Z是：

其中a是1-10，优选地是1-3。

例如，Z是：

任何适合的纤维蛋白原结合肽(FBP)可用于本发明的组合物中的止血剂中。例如，FBP可能够结合至纤维蛋白原的区域，所述区域天然结合至血纤维蛋白或通过血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa结合。血纤维蛋白与纤维蛋白原的结合讨论于Mosesson等人2001,Ann.N.Y.Acad.Sci.,936,11-30。GPIIb-IIIa与纤维蛋白原的结合讨论于Bennett,2001,Annals of NY Acad.Sci.,936,340-354。

如本文所用的术语“肽”也并入肽类似物。若干种肽类似物是技术人员已知的。可以使用任何适合的类似物，只要纤维蛋白原能够结合至纤维蛋白原结合肽。

适合的纤维蛋白原结合肽的实例以及其可识别的方式提供于WO 2005/035002、WO2007/015107和WO 2008/065388。

适合的FBP的序列的实例包括：GPR-；GPRP-(SEQ ID NO:1)；GPRV-(SEQ ID NO:2)；GPRPFPA-(SEQ ID NO:3)；GPRVVAA-(SEQ ID NO:4)；GPRPVVER-(SEQ ID NO:5)；GPRPAA-(SEQ ID NO:6)；GPRPPEC-(SEQ ID NO:7)；GPRPPER-(SEQ ID NO:8)；GPSPAA-(SEQ ID NO:9)；GHR-,GHRP-(SEQ ID NO:10)、GHRPY-(SEQ ID NO:11)、GHRPL-(SEQ ID NO:12)、GHRPY酰胺-(SEQ ID NO:13)；APFPRPG(SEQ ID NO:14)。

FBP的优选实例在其氨基端包含氨基酸序列G(P,H)RX-(SEQ ID NO:15)，其中X是任何氨基酸并且(P,H)意指脯氨酸或组氨酸存在于该位置处。

连接至载体的FBP可包含相同或不同的序列。FBP各自的长度可以是3-60个、3-30个或3-10个氨基酸残基。

在一些实施方案中，每种纤维蛋白原结合肽以10^-9至10^-6M之间的解离常数(K_D)结合至纤维蛋白原，所述解离常数例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400nM或更大。约100nM的K_D是优选的。解离常数可在平衡时测量。例如，已知浓度的放射性标记的纤维蛋白原可用微球体温育，纤维蛋白原结合部分已于所述微球体交联。通常，5μM肽与1gm微球体交联，或者摩尔的肽与1gm的微球体交联。将肽连接的微球体稀释至0.5mg/ml，并且在具有浓度为0.05与0.5mg/ml之间的放射性标记的纤维蛋白原的pH 7.4等渗缓冲液(例如，含有0.15M NaCl的0.01M Hepes缓冲液)中在20℃下孵育1h。微球体上结合至纤维蛋白原结合肽的纤维蛋白原可以通过离心作用与游离纤维蛋白原分离并且测量游离的和结合的纤维蛋白原的量。解离常数然后可通过Scatchard分析通过将结合的纤维蛋白原的浓度针对结合纤维蛋白原：游离纤维蛋白原的浓度的比率作图来计算，其中曲线的斜率表示K_D。

根据一些实施方案中，用于本发明的组合物中的止血剂(具体地是肽树突状体)的纤维蛋白原结合肽相对于结合纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’。相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的适合纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括：GPR-；GPRP-(SEQ ID NO:1)；GPRV-(SEQ ID NO:2)；GPRPFPA-(SEQ ID NO:3)；GPRVVAA-(SEQID NO:4)；GPRPVVER-(SEQ ID NO:5)；GPRPAA-(SEQ ID NO:6)；GPRPPEC-(SEQ ID NO:7)；GPRPPER-(SEQ ID NO:8)；GPSPAA-(SEQ ID NO:9)。

根据其他实施方案中，用于本发明的组合物中的止血剂(具体地是肽树突状体)的纤维蛋白原结合肽相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’。相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至孔‘b’的纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括：GHR-、GHRP-(SEQ ID NO:10)、GHRPY-(SEQ ID NO:11)、GHRPL-(SEQ ID NO:12)、GHRPY酰胺-(SEQ ID NO:13)。

纤维蛋白原结合肽可独立地在其羧基端(任选地通过接头)或其氨基端(任选地通过接头)连接至载体或连接至树突状体的分支核心。如果纤维蛋白原结合肽连接在其氨基端，则所述肽的羧基端可包含酰胺基团。酰胺基团而非羧基(或带负电荷羧酸根离子)在所述肽的暴露的羧基端处的存在可有助于优化纤维蛋白原结合肽与纤维蛋白原的结合。

在一些实施例中，每个纤维蛋白原结合肽在其羧基端连接(任选地通过接头)至载体，或者连接至树突状体的分支核心。在其他实施例中，至少一个纤维蛋白原结合肽在其氨基端连接(任选地通过接头)至载体，或者连接至树突状体的分支核心。例如，相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的至少一个纤维蛋白原结合肽，诸如包含序列APFPRPG(SEQ ID NO:14)可在其氨基端连接(任选地通过接头)至载体，或者连接至树突状体的分支核心。

有利地是，止血剂或肽树突状体包含具有不同序列的纤维蛋白原结合肽(在本文中称为“嵌合”止血剂或肽树突状体)。例如，在一些实施方案中，止血剂或肽树突状体包含具有结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于结合至孔‘b’的不同选择性的纤维蛋白原结合肽。

用于本发明的组合物中的止血剂可包含多个载体，其中每个载体具有连接至所述载体的多个纤维蛋白原结合肽，并且其中连接至载体的所述纤维蛋白原结合肽包含具有不同序列的纤维蛋白原结合肽。

在一些实施方案中，所述多个载体包含多个第一载体和多个第二载体，其中连接至多个第一载体的纤维蛋白原结合肽具有不同于连接至多个第二载体的纤维蛋白原结合肽的序列。

在其他实施方案中，每个载体具有连接至所述载体的不同序列的纤维蛋白原结合肽。

在理论上，每个载体分子的纤维蛋白原结合肽的数目不存在上限。最佳数目可能取决于许多因素，包括载体的性质和每个载体上用于连接纤维蛋白原结合肽的反应基团的数目。然而，优选的是，每个载体分子平均存在多达100个纤维蛋白原结合肽。优选地，每个载体分子平均存在至少三个、优选地至少四个或五个纤维蛋白原结合肽。优选的范围是每个载体分子10-20个纤维蛋白原结合肽。

载体可包含允许纤维蛋白原结合肽连接的反应基团。例如，载体可在其表面上包含硫醇部分或胺部分。如果载体是蛋白质性的，则硫醇部分或胺部分可由氨基酸(例如半胱氨酸或赖氨酸)的侧链提供。可替代地，反应基团可添加到载体。如果载体由蛋白质诸如白蛋白形成，则这是特别有利的。例如，载体可以使用能够与载体上的伯胺基团反应的试剂(诸如2-亚氨基四氢噻吩(2-IT))硫醇化。可替代地，胱胺可以在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下偶合至载体上的羧基，接着还原性裂解所引入的二硫键。

在一些实施方案中，所述纤维蛋白原结合肽通过间隔物共价固定至基底。优选的间隔物是非肽间隔物，例如包含亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)。在一个优选的实施方案中，使各自包含通过PEG间隔物连接至硫醇反应基团(例如，马来酰亚胺基团)的纤维蛋白原结合肽的多个肽缀合物与硫醇化载体(例如，使用如上所述的2-IT或胱胺制备)反应。适合的非肽间隔物描述于WO 2013/114132中。

具有不同序列的纤维蛋白原结合肽可包含相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的第一纤维蛋白原结合肽和以比所述第一纤维蛋白原结合肽更高的选择性结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于结合至孔‘b’的第二纤维蛋白原结合肽。已发现具有此类纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体在相对宽范围的肽树突状体浓度内快速聚合纤维蛋白原。

例如，第一纤维蛋白原结合肽可在其氨基端包含氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO:1)，和/或第二纤维蛋白原结合肽可在其羧基端包含氨基酸序列-APFPRPG(SEQ ID NO:14)，其中所述序列的氨基酸残基以氨基至羧基顺序指示，并且“-”指示连接至肽树突状体的分支核心或连接至载体的序列的末端。在其羧基端具有序列–APFPRPG(SEQ ID NO:14)的纤维蛋白原结合肽以比在其氨基端具有序列GPRP-(SEQ ID NO:1)的纤维蛋白原结合肽更高的选择性结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于结合至孔‘b’。

在其他实施方案中，具有不同序列的纤维蛋白原结合肽可包含相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的第一纤维蛋白原结合肽和相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至孔‘b’的第二纤维蛋白原结合肽。已发现具有此类纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体与纤维蛋白原聚合以形成与仅含有相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的纤维蛋白原结合肽的等效肽树突状体相比相对密集的水凝胶。据信所形成的水凝胶的密度增加是由于树突状体的纤维蛋白原结合肽与纤维蛋白原的孔‘a’和孔‘b’的结合，从而加强聚合纤维蛋白原的网络。

例如，第一纤维蛋白原结合肽可在其氨基端包含氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO:1)，和/或第二纤维蛋白原结合肽可在其氨基端包含氨基酸序列GHRP-(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列GHRPY-(SEQ ID NO:11)。在其氨基端具有序列GPRP-(SEQ ID NO:1)的纤维蛋白原结合肽以一些选择性结合至纤维蛋白原的孔‘a’。在其氨基端具有序列GHRP-(SEQ ID NO:10)或GHRPY-(SEQ ID NO:11)的纤维蛋白原结合肽优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’。

一个或多个或每个纤维蛋白原结合肽可通过非肽接头共价连接至止血剂的载体，例如连接至肽树突状体的分支核心。接头可以是不干扰纤维蛋白原与纤维蛋白原结合肽的结合的任何适合的接头。所述接头可包括柔性的直链接头，适合地是直链烷基。此类接头允许肽彼此远离地延伸。例如，所述接头可包含-NH(CH₂)_nCO-基团，其中n是任何数值，适合地是1-10，例如5。包含-NH(CH₂)₅CO-基团的接头可通过使用ε‐氨基酸6‐氨基己酸(εAhx)来形成。

在理论上，可存在于肽树突状体中的纤维蛋白原结合肽的总数目不存在限制。然而，实际上，对于任何特定结构而言，可以对纤维蛋白原结合肽的数目进行改变和测试，以确定用于所需纤维蛋白原聚合特性，例如用于纤维蛋白原聚合的速度或通过与纤维蛋白原聚合产生的水凝胶的密度的最佳数目。肽树突状体可包含总计每个树突状体多达二十个纤维蛋白原结合肽，例如每个树突状体多达十个纤维蛋白原结合肽或者每个树突状体多达五个纤维蛋白原结合肽。

申请人已发现，出乎意料地，包含两个或更多个纤维蛋白原结合肽的肽树突状体与肽缀合物的混合物能够比单独的肽树突状体或肽缀合物更快地聚合纤维蛋白原。

因此，适用于本发明的组合物中的止血剂可包含肽树突状体和含有两个或更多个纤维蛋白原结合肽的肽缀合物。

肽缀合物可包含具有相同序列或不同序列的纤维蛋白原结合肽。例如，肽缀合物可包含相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的唯一纤维蛋白原结合肽、或者相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至孔‘b’的唯一纤维蛋白原结合肽、或者相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至孔‘a’的一个或多个纤维蛋白原结合肽和相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至孔‘b’的一个或多个纤维蛋白原结合肽。

肽缀合物可包含纤维蛋白原结合肽所连接的载体。适合的载体可包含一个或多个氨基酸残基，例如单个氨基酸残基，诸如赖氨酸氨基酸残基。包含含有一个或多个氨基酸残基的载体的缀合物的优点在于它们可容易使用固相肽合成方法制成。另外，它们可容易在未使用免疫原性试剂的情况下产生并且可耐受消毒。

肽缀合物的每个纤维蛋白原结合肽可独立地在其羧基端(任选地通过接头)或其氨基端(任选地通过接头)连接至载体。如果纤维蛋白原结合肽连接在其氨基端，则所述肽的羧基端可包含酰胺基团。

在一个实例中，肽缀合物可具有以下通式：

FBP-(接头)-X-(接头)-FBP

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地是非肽接头；

X是氨基酸，优选地是多官能氨基酸，最优选地是三官能氨基酸残基，诸如赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

肽缀合物可以是肽树突状体。树枝状体可包含分支核心和单独地共价连接至所述分支核心的多个纤维蛋白原结合肽。分支核心可包含一个或多个多官能氨基酸。每个多官能氨基酸或多个多官能氨基酸可具有共价连接至所述分支核心的一个或多个纤维蛋白原结合肽。在一些实施方案中，肽缀合物可以是如上文所定义的肽树突状体。

用于本发明的组合物中的肽树突状体的纤维蛋白原结合肽可以相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’，并且肽缀合物的纤维蛋白原结合肽可以相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’。已发现此类组合物具有协同效应，因为它们能够比单独的肽树突状体或肽缀合物更快速地聚合纤维蛋白原。此协同效应的机制未得到充分的理解，但是在未受到理论约束的情况下，认为其可能发生，因为所述组合物提供更多‘A’和‘B’纤维蛋白原聚合位点。

可替代地，用于本发明的组合物中的肽树突状体的纤维蛋白原结合肽可以相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’，并且肽缀合物的纤维蛋白原结合肽相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’。

将了解的是，用于本发明的组合物中的止血剂的特定优点在于，它们可在未使用动物来源的产品的情况下合成，从而使来自此类产品的病毒或朊病毒感染的风险最小化。

用于本发明的组合物中的生物相容性液体可以是水性或非水性液体，但是通常是水性液体。水性液体可包括生物相容性水溶液，诸如氯化钙或氯化钠水溶液。通常，生物相容性液体将接近于生理pH，例如在范围pH 6.0-7.5，例如pH 7.3-7.5或pH 7.35-7.45内。

生物相容性液体可包括缓冲液，例如磷酸盐、HEPES或Tris缓冲液，诸如10-150mM磷酸盐缓冲液、10-150mM HEPES缓冲液或10-150mM Tris缓冲液。

本发明的组合物中所含有的颗粒的量和平均直径以及止血剂、生物相容性液体和不可溶性颗粒的相对量有效于提供具有止血和物理特性的组合物，如下文所述的。

根据某些实施例中，所述组合物的颗粒具有增强所述组合物的流动性(例如，挤出穿过注射器的能力)和组合物流动到组织上或组织内的部位上并适应所述部位的能力的尺度和其他物理特性，所述部位包括组织表面和限定腔，诸如脊柱内空间、组织表皮、孔或囊。

本发明的组合物可部分水合或完全水合并且可根据水合程度展示例如0％至100％的膨胀度。

部分或完全水合的颗粒的示例性和优选的尺寸范围如下：

颗粒尺寸：

本发明的组合物将通常呈部分或完全水合的形式。包含多糖颗粒的干燥粉末(具有低于20重量％的含湿量)可适用作用于制备本发明的组合物的起始材料。本发明的部分水合的组合物(通常具有50％至80％水合)适用于以下应用，其中需要组合物在施用于湿润靶部位(例如，组织表皮)时进一步膨胀。完全水合的组合物适用于以下应用，其中不需要原位膨胀，诸如在脊柱和存在神经和其他敏感结构的其他区域中。

“靶部位”是本发明的组合物待递送到的位置。靶部位可以是由于损伤或手术程序而出血或先前出血的部位。通常，靶部位将是感兴趣的组织位置，但是在一些情况下，所述组合物可施用于感兴趣位置附近的位置，例如当材料原位膨胀以覆盖感兴趣的位置时。

所述颗粒的尺寸可以各种方式实现。例如，包含多糖的起始材料可(1)在多糖起始材料交联之前或之后破坏，或者(2)在交联或未交联多糖起始材料水合，例如水合为完全或部分水合的材料或干微粒粉末之前或之后破坏。本文所用术语“干燥”意指含湿量是足够低的，通常低于20重量％的水，以使得所述粉末将自由流动并且个别颗粒将不会聚集。本文所用术语“水合”意指含湿量是足够高的，通常高于平衡水合水平的50％，通常在平衡水合水平的80％至95％范围内。

干燥状态的起始材料的机械破坏在需要控制颗粒尺寸和/或颗粒尺寸分布的情况下可以是优选的。控制干燥颗粒的粉碎可能比水合组合物更容易，并且所得减小的颗粒的尺寸因此更容易调节。相反，水合材料的机械破坏通常比干燥聚合物起始材料的粉碎更简单并且涉及更少的步骤。因此，当最终颗粒尺寸和/或颗粒尺寸分布不是关键的时，水合材料的破坏可能是优选的。

本发明的组合物可在通过挤出穿过孔或其他流动限制来递送至靶部位时进行机械破坏，或者其可在递送至靶部位之前进行机械破坏。可替代地，本发明的组合物可在最终使用或递送之前进行机械破坏。多糖链的分子交联可在机械破坏之前或之后进行。机械破坏步骤的主要目的是形成具有使组合物能够适应并填充所述组合物所递送的空间的尺寸的多个颗粒。机械破坏的另一个目的是促使组合物向下穿过小直径管插管和/或其他涂敷器到达靶部位。当组合物在使用之前破坏时，其可通过除挤出之外的技术(例如，使用刮刀或勺子)应用或施用。

在一些实施方案中，多糖可在交联之前，通常在水合之前初始制备(例如通过喷雾干燥)和/或机械破坏。多糖可提供为细分或粉末状的干固体，其可通过进一步粉碎来破坏，以提供具有通常较窄地局限于小范围内的所需尺寸的颗粒。还可进行进一步尺寸选择和修改步骤，诸如筛分或旋流器分级。对于示例性材料，干颗粒尺寸范围可以是10-1500μm或50-1000μm。示例性颗粒尺寸分布使得大于95重量％的颗粒处于范围μm。

用于粉碎聚合物起始材料的方法包括均质化、碾磨、凝聚、研磨、喷射研磨。粉末状多糖起始材料也可通过喷雾干燥来形成。颗粒尺寸分布可通过常规技术诸如筛分、聚集或进一步碾磨来进一步控制和精炼。然后可将干粉末状固体悬浮在水性缓冲液中并且使其交联。在其他情况下，可以将多糖悬浮在水性缓冲液中，使其交联，并且然后干燥。然后可破坏所述交联的干燥多糖，并且随后将破坏的材料重悬在水性缓冲液中。

在一个示例性生产过程中，通过常规单元操作诸如均质化、碾磨、凝聚或研磨来机械破坏干燥未交联多糖起始材料。将所述粉末充分破坏以实现在产品部分或完全水合时产生所需范围的颗粒尺寸的干颗粒尺寸。在干颗粒尺寸与完全水合的亚单元尺寸之间的关系将取决于材料的可膨胀性，如下文进一步讨论的。

可替代地，微粒状多糖起始材料也可通过喷雾干燥来形成。喷雾干燥过程依赖于使溶液流动穿过小孔口，诸如喷嘴，以形成释放到逆流或并流气流(通常为加热的气流)中的液滴。气体从液体起始材料中蒸发溶剂，所述液体起始材料可以是溶液或分散液。使用喷雾干燥形成干燥粉末状起始材料是起始材料的机械破坏的替代方案。喷雾干燥操作同村将产生具有高度均匀的颗粒尺寸的未交联干燥粉末产品。然后这些颗粒可交联，如下文所述的。

在许多情况下，机械破坏可充分控制以获得所需范围内的颗粒尺寸和颗粒尺寸分布。然而，在其他情况下，在需要更精确的颗粒尺寸分布时，可进一步处理或选择所破坏的材料以例如通过筛分或聚集来提供所需颗粒尺寸分布。机械破坏的聚合物起始材料然后可以交联，如下文更详细描述的。

在本发明的组合物的颗粒尺寸不太重要时，可以将所干燥多糖起始材料水合、溶解或悬浮在适合的缓冲液中并且交联，之后机械破坏。机械破坏通常将通过使材料穿过孔口来实现，其中孔口的尺寸和挤出的力一起决定颗粒尺寸和颗粒尺寸分布。虽然此方法通常在操作上比在水合和交联之前的干燥多糖颗粒的机械破坏更简单，但是控制颗粒尺寸的能力可能不太精确。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包装在注射器或其他涂敷器中，之后机械破坏组合物中的颗粒。在所述材料通过注射器应用于组织靶部位时，这些材料将受到机械破坏。可替代地，未破坏的、交联的多糖起始材料在使用之前可以干燥形式储存。然后可将干燥材料装载到注射器或其他适合的涂敷器中，在所述涂敷器内水合以形成本发明的组合物，并且在所述材料递送至靶部位时机械破坏，通常再次穿过孔口或小管腔。

各种生物相容性天然、半合成或合成多糖可用于制备本发明的组合物中所用的颗粒。交联多糖的颗粒应基本上不可溶于对于特定组合物所选择的生物相容性液体中。适合地，所述颗粒具有小于10mg颗粒/ml生物相容性液体的溶解度，例如小于1mg/ml或小于0.1mg/ml。根据一些实施方案，使用提供机械、化学和/或生物止血活性的水不可溶性颗粒。

示例性多糖包括糖胺聚糖、淀粉衍生物(例如氧化淀粉)、纤维素衍生物(例如氧化纤维素)、半纤维素衍生物、木聚糖、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐衍生物(例如氧化藻酸盐)、脱乙酰壳多糖、甲壳质以及其组合。

多糖的交联以任何常规方式实现。例如，多糖可使用适合的交联剂交联。

多糖分子可使用双官能或多官能交联剂交联，所述交联剂共价连接至两个或更多个多糖。示例性双官能交联剂包括醛类、环氧树脂类、琥珀酰亚胺类、碳化二亚胺类、马来酰亚胺类、叠氮化物类、碳酸盐类、异氰酸酯类、二乙烯砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、醇类、胺类、亚氨酸酯类、酸酐类、重氮基乙酸酯类或氮丙啶类。可替代地，交联可通过使用氧化剂或其他试剂诸如高碘酸盐来实现，所述试剂活化多糖上的侧链或部分，以使得它们与其他侧链或部分反应以形成交联键。

通常，起始材料的多糖分子将各自具有范围为10kDa至10,000kDa或25kDa至5,000kDa的分子量。通常，交联的多糖分子将与另一个多糖分子具有至少一个连接，通常具有1至5个连接，其中交联的实际水平可被选择来提供所需生物可降解率。

多糖的交联程度对组合物的若干官能特性具有影响，所述官能特性包括可挤出性、周围生物流体的吸收性、粘结性、填充空间的能力、可膨胀性以及粘附至组织部位的能力。交联的程度应足够用于多糖的不可溶性颗粒，以能够抵抗待用于消毒本发明的包含所述颗粒的组合物的消毒条件(例如，蒸汽消毒或干热消毒条件)。交联的程度可通过调节交联剂的浓度、改变交联剂和多糖起始材料的相对量或改变反应条件来控制。通常，交联的程度通过改变交联剂的浓度来控制。

在一些实施方案中(例如，使用包含透明质酸的颗粒的实施方案)，颗粒的平衡膨胀范围可以是0％至500％，例如0％至100％。

平衡膨胀可通过改变交联的程度来控制，所述交联的程度反而通过改变交联条件，诸如交联方法的类型、交联剂暴露的持续时间、交联剂的浓度以及交联的温度来实现。具有不同平衡膨胀值的材料在不同应用中不同地进行。控制交联和平衡膨胀的能力使得本发明的组合物得到优化，以用于各种用途。

“膨胀百分比”意指从湿重减去干重，除以干重并乘以100，其中湿重是在润湿剂已尽可能完全从材料外部去除(例如通过过滤)之后测量，并且其中干重是在暴露于高温下持续足以蒸发掉润湿剂的时间(例如在120℃下2小时)之后测量。“平衡膨胀”被定义为在多糖材料已浸入在润湿剂中持续足以使水含量变得恒定的时间段(通常18至24小时)之后平衡的膨胀百分比。

除了平衡膨胀之外，就在递送至靶部位之前控制组合物的水合也是十分重要的。具有0％水合的材料将是未膨胀的。具有100％水合的材料将是在其平衡时的水含量。在0％与100％之间的水合将对应于在最小量与最大量之间的膨胀。作为实际情况，许多干燥的未膨胀材料将具有一些残余的含湿量，通常低于20重量％，更通常地是8重量％至15重量％。但本文中使用术语“干燥”时，其是指具有低含湿量的材料，其中个别颗粒自由流动并且通常未膨胀。

水合可非常简单地调节，例如通过在使用前控制添加到干燥或部分水合的交联材料的生物相容性液体(诸如水性缓冲液)的量来调节。通常，在最低限度上，将希望引入足够的水性缓冲液以允许挤出穿过注射器或其他递送装置。然而，在其他情况下，可能希望利用刮刀或其他涂敷器以用于递送较少流体材料。预期用途也将有助于确定所需水合程度。在希望填充或密封潮湿空腔的情况下，通常希望采用部分水合的组合物，其可通过从靶部位吸收水分来膨胀并填充空腔。相反，完全或基本上完全水合的组合物对于大脑中、脊柱附近以及神经和可被放置后的膨胀损害的其他敏感性身体结构附近的靶部位的应用是优选的。还可以使用过量缓冲液制备本发明的组合物，从而产生具有完全水合相和自由缓冲液相的双相组合物。

根据本发明的一些实施方案，多糖颗粒包含糖胺聚糖(GAG)。GAG是由具有含有氨基糖(GlcNAc或GalNAc)和糖醛酸(葡糖醛酸和/或艾杜糖醛酸)的主要结构的重复二糖单元构成的大线性多糖。根据本发明使用的适合糖胺聚糖是透明质酸(HA)或其盐。

HA由β-D-(1→3)葡糖醛酸(GlcA)和β-D-(1→4)-N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的交替残基组成。术语“透明质酸”在文献中用于意指具有不同分子量的由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺酸构成的酸性多糖，其天然地存在于细胞表面中、脊椎动物的结缔组织的碱性细胞外物质中、关节的滑液中、眼球内液中、人类脐带组织中以及公鸡的鸡冠中。本文所用术语“透明质酸”包括具有不同分子量的多糖的混合物，所述多糖具有D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺酸的交替残基。透明质酸也称为透明质素、透明质酸盐或HA。术语透明质素和透明质酸在本文中可互换使用。

透明质酸的含量可根据修改的咔唑方法来确定(Bitter和Muir,1962,AnalBiochem.4：330-334)。透明质酸的平均分子量可使用本领域中的标准方法来确定，诸如Ueno等人,1988,Chem.Pharm.Bull.36,4971-4975；Wyatt,1993,Anal.Chim.Acta 272:1-40；以及Wyatt Technologies,1999,"Light Scattering University DAWN CourseManual"and"DAWN EOS Manual"Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,California所述的。

透明质酸或其盐可具有约10,000-10,000,000Da、25,000-5,000,000Da或50,000-3,000,000Da的分子量。在具体实施方案中，透明质酸或其盐具有以下范围的分子量：300,000与3,000,000Da之间、400,000与2,500,000Da之间、500,000与2,000,000Da之间或600,000与1,800,000Da之间。在其他实施方案中，透明质酸或其盐具有以下范围的低平均分子量：10,000与800,000Da之间、20,000与600,000Da之间、30,000与500,000Da之间、40,000与400,000Da之间或50,000与300,000Da之间。

透明质酸的无机盐的实例包括透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌以及透明质酸钴。

公鸡鸡冠是透明质酸的重要商业来源。微生物是替代性来源。US 4,801,539和EP0,694,616公开了用于使用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)菌株制备透明质酸的发酵方法。WO 03/054163(整体并入本文)描述了透明质酸或其盐例如在格兰阳性芽孢杆菌宿主中的重组产生。

美国专利号4,582,865(Biomatrix Inc.)描述了使用二乙烯砜(DVS)作为交联剂制备HA的交联凝胶。EP 0 161 887B1中公开了使用多官能环氧树脂化合物制备交联HA或其盐。已用于通过共价键合交联HA的其他双官能或多官能试剂包括甲醛(U.S.4,713,448,Biomatrix Inc.)、聚氮丙啶(WO 03/089476A1,Genzyme Corp.)、L-氨基酸或L-氨基酯(WO2004/067575,Biosphere S.P.A.)。还已报道碳化二亚胺用于交联HA(U.S.5,017,229,Genzyme Corp.；U.S.6,013,679,Anika Research,Inc)。US 4,957,744中公开了HA与脂肪醇的总体不部分交联的酯以及此类部分酯与无机碱或有机碱的盐。

用于化学交联HA的优选试剂包括二乙烯基砜(DVS)、1,2,7,8-二环氧基辛烷(DEO)和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

用于制成适用于产生用于本发明的组合物中的颗粒的交联HA凝胶的方法描述于WO 2006/056204、US 2010/0035838、US 2010/0028437、US 2005/0136122，每份专利的内容整体并入本文。基于HA的水凝胶的产生也描述于Sahiner & Jia,Turk J Chem 32(2008),397–409:“One-Step Synthesis of Hyaluronic Acid-Based(Sub)micron HydrogelParticles:Process Optimization and Preliminary Characterization”。

例如，WO 2006/056204描述了产生包含与二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS添加到步骤(a)的溶液中，从而使透明质酸或其盐与DVS交联以形成凝胶；以及(c)用缓冲液处理步骤(b)的凝胶，其中所述凝胶膨胀并且形成包含与DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。

透明质酸或其盐可具有以下平均分子量：100与3,000kDa之间，例如500与2,000kDa之间或700与1,800kDa之间。DVS可以以下重量比添加到步骤(a)的溶液中：1:1与100:1之间的HA/DVS(干重)，优选2:1与50:1之间的HA/DVS(干重)，例如2.5:1至8:1或5:1HA/DVS(干重)。

适合的交联HA水凝胶可使用用于制备交联HA凝胶的Novozyme’s Hyasis Link技术产生。Novozymes也提供芽孢杆菌来源的透明质酸Hyasis，其由基于非致病性细菌菌株枯草芽孢杆菌的发酵的重组制造方法获得。所述方法未使用动物来源的原材料。

交联HA水凝胶可例如使用上文所述的任何机械破坏方法来微粉化，以提供具有用于本发明的组合物中的适合尺度的颗粒。在一个具体实施方案中，交联HA水凝胶通过碾磨来微粉化，并且具有适合尺寸的交联HA水凝胶颗粒通过筛分碾磨的产品来选择。

根据本发明使用的适合的交联HA水凝胶颗粒具有大约100-1500μm或100-1000μm的平均直径(当部分或完全水合时)。一个实例是包含HA 2.7％w/v的交联HA水凝胶颗粒；使5:1的HA:DVS交联，其中平均水凝胶颗粒尺寸是大约400μm。

常规基于明胶的止血剂的特定缺点在于明胶基质是不透明的。这可阻碍可见度，使得准确施用于伤口部位并监测控制出血的程度更困难。申请人已发现例如通过将包含交联多糖颗粒的糊料(具体地是包含交联HA水凝胶颗粒的水性糊料)离心来从所述糊料中去除气，显著降低了其不透明度并且提供基本上透明的糊料。伤口或缝合线的出血可通过透明糊料来观察。这使得外科医生能够更有效地监测止血并且在需要时更快地干预。

根据本发明的另一个方面，提供一种减小组合物的不透明度的方法，所述组合物包含分散在整个生物相容性液相中的交联生物相容性多糖的不可溶性颗粒，所述方法包括将所述组合物离心以将气泡从所述组合物中去除。

还提供一种基本上透明的组合物，其包含分散在整个生物相容性液相中的交联生物相容性多糖的不可溶性颗粒。所述液相可通过如上文所述的生物相容性液体来提供。

此透明的组合物可用于本发明的止血组合物中，从而提供本发明的基本上透明的止血组合物。例如，本发明的基本上透明的止血组合物可通过将包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽的可溶性止血剂与包含适用于分散在整个生物相容性液相中的止血剂中的交联生物相容性多糖的不可溶性颗粒的基本上透明的组合物混合来形成。

可替代地，本发明的基本上透明的止血组合物可通过从本发明的止血组合物中去除气泡来形成。所述气泡可通过任何适合的方法，例如通过离心来从止血组合物中去除。

根据本发明，还提供一种基本上透明的止血组合物，其包含：含有多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽的可溶性止血剂；生物相容性液体；以及适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体中的交联生物相容性多糖颗粒。

如果具有1mm直径或更小、例如至少0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm直径的手术缝合线穿过3mm厚度的组合物是可见的，则本发明的组合物被认为是透明的。

本发明的组合物可还包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。适合的药学上可接受的赋形剂和稀释剂是技术人员已熟知的。药学上可接受的赋形剂和稀释剂包括适用于将本发明的组合物局部施用于伤口部位的那些赋形剂和稀释剂。适合的药学上可接受的赋形剂或稀释剂包括缓冲液(诸如Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐缓冲液)、添加剂(诸如洗涤剂或增溶剂(例如，Tween 80、聚山梨酸酯80))、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，间甲酚、对羟基苯甲酸酯(甲酯、丙酯或丁酯)、氯代丁醇、苯汞盐(例如，乙酸盐、硼酸盐、硝酸盐)、山梨酸、苯甲醇)、以及增量剂(例如，乳糖、甘露糖醇)、张度剂(例如，糖、氯化钠)、聚合物化合物(诸如，聚乳酸、聚乙醇酸)。

本发明的组合物还可包含有助于组合物的制备、增强物理和机械特性、增强组合物的止血特性或提供抗微生物特性的添加剂。例如，本发明的组合物还可包含有效量的一种或多种添加剂或化合物，诸如有待递送至患者的生物活性组分、粘度调节剂(诸如碳水化合物和醇)、控制再吸收速率的材料、表面活性剂、抗氧化剂、湿润剂、润湿剂、润滑剂、增稠剂、稀释剂、照射稳定剂(例如，自由基清除剂)、增塑剂或稳定剂。例如，甘油可被添加来增强组合物的可挤出性或可注射性。当利用时，甘油以基于液相的重量约0重量％至约20重量％、或约1重量％至约10重量％或约5重量％的甘油存在于组合物中。

示例性生物活性组分包括但不限于蛋白质、碳水化合物、核酸以及无机和有机生物学活性分子，诸如酶类、抗肿瘤药、抗微生物剂(诸如抑菌剂、杀菌剂、抗生素、抗病毒剂)、局麻药、抗炎剂、激素类、抗血管生成剂、抗体、神经递质、精神药物、影响生殖器官的药物以及寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)。此类生物活性组分通常将以相对低的浓度存在，通常低于组合物的10重量％，通常低于5重量％并且常常低于1重量％。

“有效量”意指添加添加剂而为组合物提供那些特性所需要的量。有效量也通过可以添加而不会引起有害生物影响的最大量限制。

本发明的组合物的生物相容性液体和颗粒通常以相对有效于提供适用于提供止血的组合物(例如糊料或浆料)的量存在。在某些实施方案中，颗粒与液体的重量比是约1:1至约1:12或约1:3至约1:8或约1:5。本发明的组合物将通常具有以下范围的固体含量：1重量％至70重量％，例如5重量％至20重量％，或5重量％至16重量％。对于具有较高固体含量(通常超过16重量％)的组合物，组合物中可包含增塑剂，通常为0.1重量％至30重量％或1重量％至5重量％。适合的增塑剂包括聚乙二醇、山梨醇和甘油。

根据本发明，还提供一种聚合纤维蛋白原的方法，其包括使纤维蛋白原与本发明的组合物接触。

用于聚合的组合物和纤维蛋白原的相对浓度将取决于组合物的形式，例如存在多少纤维蛋白原结合肽和纤维蛋白原结合肽的序列。申请人观察到使用0.005mg/ml至2mg/ml浓度范围的肽树突状体与生理水平的纤维蛋白原(3mg/ml)的快速聚合时间。

对于一些肽树突状体，随着树突状体浓度增加，纤维蛋白原聚合的速度(即，“凝结时间”)降低。在不受理论约束的情况下，认为这是由于树突状体的纤维蛋白原结合肽对纤维蛋白原分子的‘a’孔和/或‘b’孔的饱和。在较高树突状体浓度下，存在过量纤维蛋白原结合肽竞争游离纤维蛋白原结合孔(即，对于空的‘a’孔和/或‘b’孔)，并且认为此竞争降低了聚合发生的速率。

根据本发明，还提供一种用于治疗出血的试剂盒，其包含本发明的组合物和单独地纤维蛋白原。

所述组合物可聚合存在于靶部位处的内源(即宿主)纤维蛋白原。在一些实施方案中，内源纤维蛋白原可与本发明的组合物一起施用于靶部位。

本文所用术语“纤维蛋白原”包括天然纤维蛋白原、重组纤维蛋白原或可通过凝血酶转化形成血纤维蛋白的纤维蛋白原衍生物(例如，天然或重组血纤维蛋白单体或者能够或不能给自发组装的血纤维蛋白单体的衍生物)。纤维蛋白原应能够结合至少两个纤维蛋白原结合肽。纤维蛋白原可从任何来源和任何物种(包括牛纤维蛋白原)获得，但优选地是人类纤维蛋白原。人类纤维蛋白原可以从自体或供体血液中获得。自体纤维蛋白原或重组纤维蛋白原是优选的，因为这减小了当施用于受试者时感染的风险。

本发明的组合物施用于人类受试者的适合量将取决于例如止血剂的类型，例如每个载体分子存在多少纤维蛋白原结合肽，并且取决于伤口或出血部位的类型和尺寸。然而，止血剂的典型量是0.1ml至50ml，例如0.1ml至5ml、1至50ml或1至5ml的浓度为0.005至25mg/ml，例如0.01至10mg/ml的含有止血剂的组合物。

外源纤维蛋白原用于施用于人类受试者的适合量是0.1mg至120mg，例如3mg至120mg。

本发明的组合物具有若干个重要的优点。具体地，在某些实施方案中，止血剂可容易使用常规固相肽合成程序制造。这使来自此类产品的病毒或朊病毒感染的风险最小化。在最佳浓度下，本发明的组合物的止血剂可在凝血酶不存在下在小于一秒内聚合纤维蛋白原。本发明的组合物的止血剂也可在小于一秒内聚合人类血浆中的纤维蛋白原。

用于本发明的组合物中的止血剂的结构可被选择来优化其用于组合物的预期用途的特性。例如，包含具有相同序列的优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’的五个纤维蛋白原结合肽的肽树突状体能够几乎立即聚合纤维蛋白原。相比之下，具有优选结合至纤维蛋白原的‘a’孔的一个或多个纤维蛋白原结合肽和优选结合至纤维蛋白原的‘b’孔的一个或多个不同纤维蛋白原结合肽的‘嵌合’肽树突状体可更缓慢聚合纤维蛋白原，但形成具有更大密度和尺寸的水凝胶。

已发现，本发明的组合物(尤其是其中生物相容性液体是水性液体的本发明的组合物)中的止血剂出乎意料地耐受消毒，特别是蒸汽消毒和干热消毒。因此，本发明的组合物可使用常规消毒方法消毒而没有止血活性的显著损失，尤其没有本发明的止血剂与纤维蛋白原聚合的能力的显著损失。这是重要的优点，因为其允许所述组合物作为水合的、无菌的、即用型的、可流动的止血组合物提供。所述组合物可在使用之前制备好，同时甚至在经历热消毒或蒸气消毒之后仍维持止血活性。

如本文所用，“无菌”意指基本上没有活细菌和/或微生物并且如政府标准所进一步识别和描述的，与本文所描述和要求保护的组合物和医学装置有关。

适合的常规消毒方法包括在压力下使用饱和蒸汽(“蒸汽消毒”)或干热消毒。

微生物在高压釜中暴露于压力下的饱和蒸汽引起酶和结构性蛋白不可逆地变性。高压釜是用于通过使高压釜的内容物经历高压饱和蒸汽进行消毒的压力室，例如在121℃(249°F)下约15-20分钟。发生变性的温度与存在的水的量相反地变化。空气应在蒸汽进入之前从高压釜中排空。此方法特别适用于水性制备物并且适用于手术敷料和医学装置。

根据本发明，提供一种消毒本发明的组合物的方法，其包括在有效于消毒所述组合物的时间、温度和压力的条件下使所述组合物暴露于压力下的饱和蒸汽。在高压釜中使用高压下的饱和蒸汽消毒的适合条件是：在121℃-124℃(200kPa)下至少15分钟、在126℃-129℃(250kPa)下至少10分钟或者在134℃-138℃(300kPa)下至少5分钟。

在干热消毒过程中，认为主要致命过程是细胞成分的氧化。干热消毒需要比湿热更高的温度和更长的暴露时间。因此，所述方法对于由于其有害作用或不能渗透而不能通过蒸汽消毒的热稳定性非水性材料而言更方便。

根据本发明，提供一种消毒本发明的组合物的方法，其包括在有效于消毒所述组合物的时间和温度的条件下使所述组合物暴露于干热。用于干热消毒的适合温度和时间是：160℃持续180分钟、170℃持续60分钟或者180℃持续30分钟。其他条件对于不同制备物可能是必需的，以确保有效消除所有不希望的微生物。烘箱应正常装备强制空气系统，以确保热量均匀分布在所处理的所有材料中。

根据本发明，也提供一种本发明的组合物，所述组合物是无菌的。本发明的无菌组合物可通过任何适合的方法，最适合地通过蒸汽消毒或干热消毒来消毒。

申请人已发现，用于本发明的组合物中的止血剂在高压釜中在121℃下消毒25分钟之后保留聚合纤维蛋白原的能力，并且当在40℃下储存至少十三周时仍保持稳定。申请人还已发现，本发明的组合物在高压釜中在121℃下消毒25分钟之后保留聚合纤维蛋白原的能力，并且当在40℃下储存至少十三周时仍保持稳定。40℃的储存温度用于加速稳定性研究，并且预测在药物产品储存期间通常普遍的温度(例如室温或冰箱温度)下的较长时间段的储存。

本发明的组合物有利地作为无菌的、即用型的、可流动的制剂提供。此类组合物可以提供在适合的涂敷器中以用于将所述组合物施用于靶部位。

本发明的组合物可使用涂敷器，诸如注射器、刮刀、刷子、喷雾器、手动压力或通过任何其他常规技术来应用。通常，所述组合物将使用能够将所述组合物挤出穿过孔口、孔、针、管或其他路径以形成珠粒、层或材料的其他部分的注射器或类似涂敷器来应用。组合物的机械破坏可在所述组合物挤出穿过注射器或其他涂敷器中通常具有0.01mm至5.0mm、优选0.5mm至2.5mm范围内的尺寸的孔口时发生。然而，通常，组合物中的颗粒将由具有所需颗粒尺寸的粉末制备(在水合时产生具有需要的尺寸的颗粒)，或者将在进行最终挤出或其他应用步骤之前部分或完全机械破坏成需要的尺寸。

其中利用本发明的止血组合物的医学装置包括适用于将可流动或可注射止血糊料应用到需要止血的靶部位的任何装置。装置或涂敷器的实例包括注射器，诸如BectonDickinson或Monoject luer注射器。其他适合的装置详细公开于美国专利号6,045,570中，所述专利的内容以引用的方式整体并入。

所述组合物可以不同水合程度应用，但是通常并非必需是至少部分水合的。当以其平衡水合水平应用时，组合物当应用于组织时将展示出基本上平衡的水合和少量或几乎没有膨胀。在一些实施方案中，所述组合物以低于其平衡膨胀的水合水平递送至患者。组合物中的颗粒当与血液或体液接触时将膨胀10％至20％。部分水合的组合物的膨胀通过从应用组合物的组织和周围吸收水分而引起。

本发明还提供包含本发明的组合物和用于将所述组合物施用于靶部位的书面说明书的试剂盒。所述组合物和书面说明书将一起包含在常规容器中，诸如盒子、广口瓶、小袋或托盘。书面说明书印刷在单独的纸片或其他材料上并且包装在容器上或容器内或者可印刷在容器本身上。通常，组合物将提供在单独的无菌注射器或其他涂敷器或单独的瓶、广口瓶或小瓶中。如果本发明的组合物以非水合形式提供，所述试剂盒可任选地包括具有用于水合的适合水性缓冲液的单独容器。如果本发明的组合物未提供在涂敷器中，则也可提供适合的涂敷器，诸如注射器。

根据本发明，还提供一种制成本发明的止血组合物的方法，其包括将生物相容性液体、可溶性止血剂和适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体的交联生物相容性多糖的颗粒混合在一起，其中所述可溶性止血剂包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽。

在具体实施方案中，将生物相容性液体、可溶性止血剂和颗粒在有效于形成包含基本上均匀分散在整个连续液相中的颗粒的液相的条件下混合在一起，从而形成基本上均匀的止血组合物。

所述生物相容性液体、可溶性止血剂和颗粒可以任何顺序或基本上同时混合在一起。例如，在一个实施方案中，可以将生物相容性液体和颗粒混合在一起以形成其中所述颗粒分散在整个液体中的基本上均匀的糊料，并且然后可以添加可溶性止血剂并且将其与所述糊料混合以形成止血组合物。例如，可将生物相容性液体或其他液体(但优选地为水或水性液体，诸如水性缓冲液)中的止血剂溶液添加到基本上均匀的糊料中并且将其与所述糊料混合以形成止血组合物。任选地，可以在添加可溶性止血剂之前或之后将所述均匀糊料离心以去除气泡。在一个替代性实施方案中，可以将可溶性止血剂溶解于生物相容性液体中或者将其与所述生物相容性液体混合，并且然后可将颗粒添加到混合物并混合以形成止血组合物。任选地，然后可以将止血组合物离心以去除所有气泡。在另一个实施方案中，可以在基本上同时或者一个接着一个地将所述可溶性止血剂和颗粒添加到所述生物相容性液体中并且然后混合以形成止血组合物。任选地，然后可以将所述组合物离心以去除所有气泡。气泡的去除将减小组合物的不透明度，从而使其基本上透明。

止血组合物可以例如通过蒸汽消毒或干热消毒来消毒。

在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物可以被配制成水合的可流动糊料或浆料，并且将其装入到涂敷器(例如，如上文所述的注射器或其他涂敷器)，然后将其消毒以提供无菌的、即用型的、可流动止血组合物。

因此，根据本发明，提供一种包含本发明的无菌的、即用型的、可流动的止血组合物的涂敷器。

其内部具有包装的组合物的涂敷器可通过任何适合的方法，最适合地通过蒸汽消毒或干热消毒来消毒。

本发明的组合物除了止血作用之外可具有密封特性。所述组合物可以预防性地应用于未出血或几乎未出血的伤口并且将在伤口上形成粘结的保护性屏障，从而有助于伤口愈合。

根据本发明，提供一种用作药物的本发明的止血组合物。

根据本发明，还提供一种用于治疗出血或用于治疗伤口的本发明的止血组合物。

根据本发明，还提供本发明的止血组合物用于制造用于治疗出血或用于治疗伤口的药物的用途。

根据本发明，还提供一种治疗出血的方法，其包括将有效量的本发明的止血组合物施用于出血伤口。

根据本发明，还提供一种治疗伤口的方法，其包括将有效量的本发明的止血组合物施用于伤口。

本发明的组合物施用于受试者(诸如人类受试者)的有效量将取决于例如止血剂的类型，例如每个载体分子存在多少纤维蛋白原结合肽，并且取决于伤口或出血部位的类型和尺寸。然而，组合物的典型有效量是0.1ml至50ml，例如0.1ml至5ml、1至50ml或1至5ml的浓度为0.005至25mg/ml，例如0.01至10mg/ml的含有止血剂的组合物。

现仅借助示例并参考附图来描述本发明的实施方案，在附图中：

图1示出优选实施方案中使用的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力；

图2示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图3示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图4示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图5示出通过使用不同肽树突状体聚合纤维蛋白原来形成的水凝胶的照片；

图6示出肽树突状体与肽缀合物的不同组合聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力；

图7示出若干种不同的肽树突状体聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力；

图8A示出指示肝活检损伤的位置的兔肝叶的示意图。图8B示出以0至5的标度评定的出血程度；

图9是活检兔肝的照片。用对照治疗的活检部位示出在标签“对照”上方。用根据本发明的实施方案的组合物治疗的活检部位示出在标签“HA糊料+HXP12”上方；

图10示出本发明的组合物的不同实施方案与对照相比随着时间治疗活检兔肝的出血的止血作用(止血成功％)的图；并且

图11A示出含有交联透明质酸凝胶颗粒的透明糊料的照片。图11B示出通过将透明糊料与止血剂混合来形成的本发明的组合物的实施方案的照片。图11C示出含有已原位消毒的本发明的组合物的实施方案的注射器的照片。图11D示出已挤出穿过注射器的本发明的组合物的实施方案的照片。图11E示出已沉积在手术缝合线材料上方的本发明的透明组合物的实施方案的照片。

实施例1

肽树突状体和肽缀合物的合成

在Rink酰胺MBHA低负荷树脂(Novabiochem，0.36mmol/g)通过标准Fmoc肽合成使用Fmoc或Boc保护的氨基酸(Novabiochem)合成肽。

大体上，在整个合成中使用单次偶合循环并且采用HBTU活化化学(HBTU和PyBOP(来自AGTC Bioproducts)用作偶合剂)。然而，在一些位置处，偶合比预期更低效并且需要双倍偶合。

使用自动肽合成器和多达分支点的HBTU并且通过使用肽分支的PyBOP进行手动肽合成来组装肽。

对于自动合成，将三倍过量的氨基酸和HBTU用于每次偶合并且使用二甲基甲酰胺(DMF,Sigma)中九倍过量的二异丙基乙胺(DIPEA,Sigma)。

对于手动合成，将三倍过量的氨基酸和PyBOP用于每次偶合并且使用N-甲基吡咯烷酮(NMP，Sigma)中九倍过量的DIPEA。

使用DMF中的20％哌啶(Sigma)对生长的肽链去保护(Fmoc基团去除)同样不能总是有效的并且需要双倍去保护。

使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Lys(Mtt)-OH制成分支。

通过用含有三异丙基硅烷(TIS,Sigma)、水和苯甲醚(Sigma)(1:1:1,5％)的95％TFA(Sigma)处理树脂2-3小时来进行肽的最终去保护和所述肽从固体支持体中裂解。

裂解的肽沉积在冷乙醚(Sigma)中，通过离心来成团并且冻干。将小球重新溶解在水(10-15mL)中，将其过滤，并且通过反相HPLC使用C-18柱(Phenomenex，流速为20ml/min)和含有0.1％TFA的乙腈/水梯度进行纯化。将所纯化的产物冻干并且通过ESI-LC/MS和分析性HPLC进行分析并且已证实是纯的(>95％)。质量结果全部与计算的值一致。

肽树突状体和肽缀合物

下文示出了使用以上所述的方法合成的肽树突状体和肽缀合物的结构。

在肽序列末端处的“NH₂-”基团是指在序列的氨基端处的氨基。在肽序列末端处的“-am”基团是指在序列的羧基端处的酰胺基团。

肽缀合物编号：1：

肽缀合物编号2：

肽树突状体编号3：

肽树突状体编号4：

肽树突状体编号5：

肽树突状体编号8：

肽树突状体编号9：

肽树突状体编号10：

肽树突状体编号11：

肽树突状体编号12：

肽树突状体编号13：

实施例2

肽树突状体与纤维蛋白原的共聚合

树突状体编号12包含具有五个连续赖氨酸残基的分支核心。赖氨酸残基通过相邻赖氨酸残基的侧链共价连接。

评定肽树突状体编号12聚合纤维蛋白原的能力。将浓度范围为0.005-2mg/ml的30μl树突状体溶液添加到100μl 3mg/ml纯化的人类纤维蛋白原(血液中可见的纤维蛋白原水平)中。使用Sigma Amelung KC4δ凝固分析仪分析纤维蛋白原的聚合。图1示出在树突状体浓度逐渐增加的情况下聚合(凝血)时间(以秒计)的图。

结果显示树突状体能够几乎立即与纤维蛋白原共聚，甚至在树突状体的非常低的浓度下也是如此。在树突状体浓度超过0.5mg/ml的情况下凝血时间的增加被认为通过与纤维蛋白原内游离的结合口袋的数目相比过量的纤维蛋白原结合肽来解释。在较高浓度下，树突状体的纤维蛋白原结合肽可以使纤维蛋白原结合口袋饱和，从而产生不能与纤维蛋白原工具的显著大量的过量树突状体分子。

实施例3

改变每个树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目对与纤维蛋白原共聚的速度的影 响

此实施例研究了改变每个肽树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目对与纤维蛋白原共聚的速度的影响。

使用实施例2中所述的相同方法评定肽树突状体编号4、5、10、11和12与纤维蛋白原共聚的能力。每个树突状体的浓度在0.005-0.5mg/ml之间改变。图2示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，树突状体编号5(仅具有两个纤维蛋白原结合肽/树突状体)不能与纤维蛋白原共聚。由于纤维蛋白原结合肽的数目从三个增加到五个，在～0.125至～0.275mg/ml的树突状体浓度下，共聚的速度增加。在低于～0.125mg/ml树突状体的浓度下，树突状体编号10(具有三个纤维蛋白原结合肽/树突状体)产生比树突状体4(具有四个纤维蛋白原结合肽/树突状体)更快的凝血时间。在范围～0.02-0.5mg/ml内，树突状体编号12(具有五个纤维蛋白原结合肽/树突状体)产生几乎即时的凝血。在范围～0.05-0.3mg/ml内，树突状体编号11(具有四个纤维蛋白原结合肽/树突状体)也产生几乎即时的凝血。

可以得出结论，纤维蛋白原由树突状体聚合的速度通常随着每个树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目增加而增加。

实施例4

纤维蛋白原结合肽取向和不同的纤维蛋白原结合肽序列对与纤维蛋白原共聚的 速度的影响

为了评定纤维蛋白原结合肽的取向是否可影响肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，合成了包含连接至单个三官能氨基酸残基(赖氨酸)的三个纤维蛋白原结合肽的肽树突状体(称为‘三分支’树突状体)，但是纤维蛋白原结合肽之一被取向成其氨基端连接至分支核心，并且在其羧基端酰胺化。还测试包含不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力。

肽树突状体编号3和10的纤维蛋白原结合肽各自具有序列GPRPG(SEQ ID NO:17)。肽树突状体编号10的每种纤维蛋白原结合肽被取向成其羧基端连接至分支核心。肽树突状体编号3的纤维蛋白原结合肽之一被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

肽树突状体编号8的纤维蛋白原结合肽中的两种具有序列GPRPG(SEQ ID NO:17)，并且第三纤维蛋白原结合肽具有序列APFPRPG(SEQ ID NO:14)，其被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

肽树突状体编号9的纤维蛋白原结合肽中的两种具有序列GPRPFPA(SEQ ID NO:3)，并且第三纤维蛋白原结合肽具有序列APFPRPG(SEQ ID NO:14)，其被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

序列GPRPG(SEQ ID NO:17)结合至纤维蛋白原的孔‘a’和孔‘b’，但是对孔‘a’有一些偏爱。序列GPRPFPA(SEQ ID NO:3)以高偏好结合纤维蛋白原中的孔‘a’。序列Pro-Phe-Pro使肽链的主链稳定并且增强突起-孔相互作用的亲和力(Stabenfeld等,BLOOD,2010,116:1352-1359)。

使用实施例2所述的相同方法评定树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.005-0.5mg/ml。图3示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，改变三分支树突状体的纤维蛋白原结合肽之一的取向，以使得所述肽被取向成其氨基端连接至分支核心(即，树突状体编号3)，从而减小树突状体与纤维蛋白原共聚的能力(比较树突状体编号3的凝血时间与树突状体编号10的凝血时间)。然而，在较高纤维蛋白原浓度下，树突状体编号3能够与纤维蛋白原共聚(数据未示出)。

具有被取向成其氨基端连接至分支核心的不同序列的纤维蛋白原结合肽的三分支树突状体能够与纤维蛋白原共聚(参见树突状体编号8的结果)。

三分支树突状体在与纤维蛋白原共聚合时也具有非常大的活性，其中纤维蛋白原结合肽包含优选结合至纤维蛋白原中的孔‘b’的序列(序列GPRPFPA(SEQ ID NO:3))，其中这些肽被取向成其羧基端连接至分支核心，并且其他肽包含可逆序列(即序列APFPRPG(SEQID NO:14)，其被取向成其氨基端连接至分支核心(树突状体编号9)。

实施例5

具有不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力

GPRPG(SEQ ID NO:15)和GPRPFPA(SEQ ID NO:3)基序主要结合至纤维蛋白原上的‘a’孔。此实施例描述了对嵌合肽树突状体(即，具有连接至相同分支核心的不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体)与纤维蛋白原共聚的能力的评定。

肽树突状体编号13是包含具有序列GPRPG-(SEQ ID NO:17)的两个纤维蛋白原结合肽(其对‘a’孔具有结合偏好)和具有序列GHRPY-(SEQ ID NO:11)的两个纤维蛋白原结合肽(其优选结合至‘b’孔)的嵌合四分支肽树突状体。非嵌合肽树突状体编号11和12分别是四臂树突状体和五臂树突状体。这些树突状体的每种纤维蛋白原结合肽具有序列GPRPG-(SEQ ID NO:17)。树突状体编号11、12和13的每种纤维蛋白原结合肽在其羧基端连接至分支核心。

使用实施例2所述的相同方法评定树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.005-0.5mg/ml。图4示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，使用嵌合树突状体进行的凝血速度比在低于0.3mg/ml浓度的非嵌合树突状体更慢。然而，图5示出了使用不同树突状体获得的水凝胶的照片。凝胶使用所用的肽树突状体(11、12和13)的数目标记，并且“P”标记使用产物形成的水凝胶，其中若干种纤维蛋白原结合肽连接至可溶性人类血清白蛋白。通过嵌合树突状体形成的水凝胶与使用树突状体编号11和12形成的水凝胶更稠密并且含有更少流体(在3mg/ml纤维蛋白原下或在更高浓度的纤维蛋白原下)。因此，尽管使用嵌合树突状体的凝血时间更慢，但是使用此树突状体形成的水凝胶更稠密。

实施例6

肽树突状体和肽缀合物的混合物与纤维蛋白原共聚的能力

序列GPRP-(SEQ ID NO:1)的纤维蛋白原结合肽牢固并优选地结合至纤维蛋白原的孔‘a’(Laudano等,1978PNAS 7S)。肽缀合物编号1包含具有此序列的两个纤维蛋白原结合肽，其各自连接至赖氨酸残基。第一肽在其羧基端通过接头连接至赖氨酸残基，并且第二肽在其氨基端通过接头连接至其赖氨酸残基。第二肽的羧基端包含酰胺基团。

序列GHRPY-(SEQ ID NO:11)的纤维蛋白原结合肽牢固并优选地结合至纤维蛋白原的孔‘b’(Doolittle和Pandi,Biochemistry 2006,45,2657-2667)。肽缀合物编号2包含具有此序列的第一纤维蛋白原结合肽，在其羧基端通过接头连接至赖氨酸。具有反向序列(YPRHG(SEQ ID NO:16))的第二纤维蛋白原结合肽在其氨基端通过接头连接至赖氨酸残基。第二肽的羧基端包含酰胺基团。

接头允许肽彼此远离地延伸。

将肽缀合物编号1或2(2mg/ml)与肽树突状体编号3或4和纤维蛋白原混合，并且使用实施例2所述的相同方法评定所述混合物与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.025-0.5mg/ml。图6示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，出乎意料地，仅含有肽缀合物编号2(即具有B-突起肽)和树突状体肽的混合物是协同的和增加的活性，而含有肽缀合物编号1(A-突起肽)当添加到肽缀合物编号2或肽树突状体时是无活性的。

实施例7

肽树突状体聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力

测试若干种不同的肽树突状体(编号4、5、8、9、10、11、12、13)聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力。

将30μL各树突状体(在0.25mg/ml的浓度下)添加到37℃的100μL人类血浆中，并且使用Sigma Amelung KC4δ凝固分析仪确定纤维蛋白原的聚合。

每种树突状体的凝血时间示出在图7中，并且显示肽树突状体10、11、4、12和13能够聚合人类血浆中的纤维蛋白原，其中树突状体编号12是特别有效的(具有小于一秒的凝血时间)。然而，肽树突状体编号5、8和9不能聚合人类血浆中的纤维蛋白原。

实施例8

蒸汽消毒对溶液中的止血剂的影响

此实施例描述了蒸汽消毒对以盐水配制的止血剂(肽树突状体编号12(参见实施例1)：“HXP12”)的止血活性的影响。

将浓度为50mg/ml的HXP12用150mM氯化钠稀释至0.5mg/ml的浓度。将制剂制备为6ml本体溶液(使用60μl HXP12原液)。将400μl的此本体溶液用于每个2ml玻璃瓶，所述玻璃瓶具有螺纹配合的气密盖。将每个小瓶在121℃下高压消毒(200kPa)25分钟。在消毒之后，将小瓶置于40℃下并且储存27周。

为了测试所储存样品聚合纤维蛋白原的能力，将每种样品用pH7.6的20mM磷酸盐缓冲液稀释至0.05mg/ml。将30μl每种稀释的样品添加到100μl人类纤维蛋白原中，所述纤维蛋白原的浓度为3mg/ml，以pH 7.6的20mM磷酸盐缓冲液配制。使用Sigma Amelung KC4δ凝固分析仪确定在37℃下每种稀释样品中的HXP12聚合纤维蛋白原的能力(‘凝血’活性)。还确定未消毒对照样品的聚合活性。结果总结于下表1中。

表1

表1中的结果显示以盐水配制的止血剂在通过高压釜(200kPa)中121℃的蒸汽消毒25分钟之后保留其聚合纤维蛋白原的能力，并且此活性甚至在40℃下储存至少27周之后仍保留。

实施例9

蒸汽消毒对即用型可流动止血组合物的影响

此实施例描述了蒸汽消毒对配制为包含透明质酸(HA)交联颗粒的即用型可流动糊料的止血剂(HXP12)的止血活性的影响。

将0.6ml HXP12溶解于水中的溶液与1.4g以10mM磷酸盐缓冲液水合的HA水凝胶颗粒(HA浓度为2.7％；交联5:1[HA/二乙烯基砜“DVS”]，完全水合的颗粒尺寸为400μm)混合以形成HXP12的浓度为1mg/ml的糊料。将200mg糊料等份分装到玻璃瓶中，并且将每个小瓶用盖封闭。将所述小瓶在121℃下高压消毒(200kPa)25min。在消毒之后，将小瓶再置于80℃下16小时以模拟加速老化过程。在4小时和16小时评定小鼠。

将HXP12从储存的样品中提取并且用pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液稀释至0.1mg/ml的浓度。将30μl每种提取的样品添加到100μl人类血浆(Alpha Labs)中，并且使用SigmaAmelung KC4δ凝固分析仪确定在37℃下每种稀释的样品中的HXP12聚合纤维蛋白原的能力(‘凝血’活性)。还确定未消毒对照样品的聚合活性。结果总结于下表2中。

表2

表2中的结果显示配制为具有HA水凝胶颗粒的即用型可流动糊料的HXP12肽在通过高压釜(200kPa)中121℃的蒸汽消毒25分钟之后保留其聚合来自人类血浆的纤维蛋白原的能力，并且此活性甚至在80℃下储存至少4小时之后仍保留。

实施例10

蒸汽消毒对即用型可流动止血组合物的影响

此实施例描述了蒸汽消毒对配制为由透明质酸(HA)交联颗粒制成的即用型可流动糊料的止血剂(HXP12)的止血活性的影响。

将0.6ml以pH 6.8的10mM磷酸盐缓冲液、160mM Arg.HCl配制的HXP12与1.4g HA水凝胶颗粒(HA浓度为2.7％；交联5:1[HA/二乙烯基砜“DVS”]，完全水合的颗粒尺寸为400μm)混合以形成HXP12的浓度为1mg/ml的糊料。将200mg糊料等份分装到玻璃瓶中，并且将每个小瓶用盖封闭。将所述小瓶在121℃下高压消毒(200kPa)25min。在消毒之后，将小瓶再置于40℃下。在0周、2周和4周评定样品。

将HXP12从储存的样品中提取并且用pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液稀释至0.06mg/ml的浓度。将30μl每种提取的样品添加到100μl人类纤维蛋白原中，所述纤维蛋白原的浓度为3mg/ml(血液中可见的纤维蛋白原水平)，以pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液配制。使用SigmaAmelung KC4δ凝固分析仪确定在37℃下每种稀释样品中的HXP12聚合纤维蛋白原的能力(‘凝血’活性)。还确定未消毒对照样品的聚合活性。结果总结于下表3中。

表3

表3中的结果显示配制为具有HA水凝胶颗粒的即用型可流动糊料的HXP12肽在高压釜(200kPa)中在121℃下消毒25分钟之后保留其聚合来自人类纤维蛋白原的纤维蛋白原的能力，并且此活性甚至在40℃下储存至少2周之后仍保留。

实施例11

在兔肝活检损伤模型中评定本发明的止血组合物的止血活性

此实施例描述了本发明的三种不同组合物的止血活性的测试，所述组合物各自具有不同浓度的止血剂(HXP12肽树突状体)。

方法

将7g HA糊料(HA浓度为2.7％；5:1；HA/DVS，完全水合的颗粒尺寸为400μm)预先填充到注射器中并将其与3ml三个不同浓度之一的HXP12肽树突状体混合，从而产生10ml最终产品。每个10ml产品的最终HXP12浓度是样品B，1mg/ml；B2，0.5mg/ml；B3，1.4mg/ml。作为对照(C)，将7g HA糊料与3ml盐水混合。

将肝素化兔(品种：新西兰白兔；性别：雄性)麻醉。将肝的所有三个叶从腹腔中取出并且放置在盐水润湿的纱布拭子上。对样品的活检损伤进行测试，所述损伤依次在三个肝叶上形成，如以下表3所列出的。图8A示出肝损伤在三个肝叶上的近似取向和顺序。

表4肝叶的损伤的顺序和位置

在肝叶上使用6mm活检穿孔器形成大约5mm深度的活检。使用预先称量的干燥拭子，收集排出伤口的血液，持续15秒。然后称量拭子，作为出血严重性的量度。在取出拭子之后，用于另一个拭子干燥伤口并且然后应用测试样品。

对于测试样品的应用，将盐水润湿的无菌纱布拭子应用到出血表面，并且使用注射器将多达2ml的样品B、B2或B3或者2ml的对照(C)在纱布与出血表面之间分配到活检伤口。将轻微压力施加到纱布拭子，在施加之后持续一分钟。在移除湿润纱布之后，在应用测试样品之后1、3、6、9以及12min(即，包括一分钟压力施加)评价伤口的止血。

将0、1、2、3、4以及5的出血评分分别分配给无出血、渗出、非常轻微、轻微、中度以及严重出血(图8B)。出血程度的评分改编自Adams等人(J Thromb Thrombolysis DOI10.1007/s11239-008-0249-3)。在成功止血时，用盐水浸渍的拭子覆盖叶并且重复程序，直到每个叶已接受如上文所述的治疗。

结果

图9是活检肝之一的照片。可以看出血液从用对照治疗的活检部位(示出在标签“对照”上方)流动，而在用包含HA糊料和HXP12的本发明的组合物治疗的活检部位(示出在标签“HA糊料+HXP12”上方)处的止血作用是清楚可见的。

图10示出样品B、B2和B3与对照相比随着评价时间(以分钟计)的止血作用(止血成功％)的图。与对照相比，包含HA糊料和HXP12肽树突状体的不同组合物各自证实强凝结活性。此活性是剂量依赖性的，其中具有较高浓度的HXP12的组合物(样品B和B3)在整个12分钟评价中证实了大约80％-100％止血活性。具有最低浓度的HXP12的组合物(样品B2)证实了前三分钟评价的100％止血活性，但是此活性随后在其余9分钟内降低至～75％。

此实施例显示，包含基本上不止血的HA颗粒和具有凝结特性的肽树突状体的本发明的组合物的实施方案出乎意料地有效于控制出血。

实施例12

包含交联HA凝胶颗粒和止血剂的无菌的、即用型的、可流动的止血组合物

通过将糊料以600rpm离心5分钟来将由交联透明质酸(HA)凝胶颗粒(HA浓度为2.7％；5:1；HA/DVS，完全水合的颗粒尺寸为400μm)制成的可流动糊料制成透明的。透明糊料示出在图11A中。

将7g透明HA糊料与3ml HXP 12肽树突状体(以pH 6.8的10mM磷酸盐缓冲液、160mMArg.HCl配制)，从而得到10ml最终产品。HXP12的最终浓度是1.05mg/ml。图11B示出一些所得组合物的照片。所述照片显示组合物是足够粘性的以在伤口上形成连续层，并且因此可用于密封伤口。

将所述组合物置于玻璃瓶中，并且通过在高压釜中(200kPa)在121℃下蒸汽消毒25分钟来消毒。

图11C示出含有所述组合物的注射器的照片。图11D示出含有所述组合物的注射器，其中一些组合物已在注射器筒尖端处使用其柱塞挤出穿过开口。

图11E示出已沉积在尺寸编码为“0”、直径为0.3-0.39mm的手术缝合线材料上方的本发明的透明组合物的实施方案的照片。缝合线材料穿过透明组合物是清楚可见的。

外科医生当施用所述组合物时可穿过本发明的透明组合物查看。这使得更容易正确施用所述组合物，并且确定其是否有效于控制或停止出血。

序列表

<110> Haemostatix Limited

<120> 止血组合物

<130> P/73071.WO01

<150> GB1508024.5

<151> 2015-05-11

<160> 17

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gly Pro Arg Pro

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gly Pro Arg Val

1

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Gly Pro Arg Pro Phe Pro Ala

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gly Pro Arg Val Val Ala Ala

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Gly Pro Arg Pro Val Val Glu Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gly Pro Arg Pro Ala Ala

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gly Pro Arg Pro Pro Glu Cys

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Gly Pro Arg Pro Pro Glu Arg

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Gly Pro Ser Pro Ala Ala

1 5

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Gly His Arg Pro

1

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Gly His Arg Pro Tyr

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Gly His Arg Pro Leu

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> 羧基端包含酰胺基团

<400> 13

Gly His Arg Pro Tyr

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 羧基端可包含酰胺基团

<400> 14

Ala Pro Phe Pro Arg Pro Gly

1 5

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Pro或His

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 任何氨基酸

<400> 15

Gly Xaa Arg Xaa

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> 羧基端包含酰胺基团

<400> 16

Tyr Pro Arg His Gly

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Gly Pro Arg Pro Gly

1 5

Claims (45)

1.一种无菌的、即用型的、可流动的止血组合物，其包含：

可溶性止血剂，所述可溶性止血剂包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽；

生物相容性液体；以及

生物相容性交联多糖的颗粒，所述颗粒适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述止血组合物已通过蒸汽消毒或通过干热消毒来消毒。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述生物相容性液体提供连续液相，并且所述聚合物颗粒基本上均匀地分散在整个所述液相中。

4.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述止血剂的每个载体包含分支核心，并且所述纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述分支核心包含：

两个至十个多官能氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的多官能氨基酸残基；

多个多官能氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的至少两个相邻多官能氨基酸残基中的每个残基；

多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述分支核心的所述多官能氨基酸残基中的至少一个；

多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个多官能氨基酸残基通过相邻多官能氨基酸残基的侧链共价连接；或者

单个多官能氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至所述多官能氨基酸残基的每个官能团；

其中所述多官能氨基酸残基包括三官能或四官能氨基酸残基或三官能和四官能氨基酸残基，或者所述单个多官能氨基酸残基是三官能或四官能氨基酸残基。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述分支核心包含多个连续的多官能氨基酸残基。

7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述分支核心包含多达十个多官能氨基酸残基。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述多官能氨基酸残基或所述多个多官能氨基酸残基包括赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的组合物，其中所述止血剂具有以下通式(I)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地是非肽接头；

X是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基；

Y是-FBP或-NH₂；

当Y是-FBP时，Z是–(接头)-FBP或-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP，或者

当Y是-NH₂时，Z是-[-X_n-(接头)-FBP]_a-(接头)-FBP；

其中：

X_n是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸残基；并且

a是1-10，优选地是1-3。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述止血剂具有以下通式(II)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-NH(CH₂)₅CO-；

Y是-FBP或-NH₂；

Z是：

-R-(接头)-FBP，这是在Y是-FBP时，或者

其中R是-(CH₂)₄NH-、-(CH₂)₃NH-或-(CH₂)₃NHCNHNH。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的组合物，其中所述止血剂具有以下通式(III)：

其中：

FBP是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-NH(CH₂)₅CO-；

Y是-FBP或-NH₂；

Z是：

-(CH₂)₄NH-(接头)-FBP，这是在Y是-FBP时；或者

12.根据权利要求4至11中任一项所述的组合物，其中每个纤维蛋白原结合肽通过非肽接头连接至所述分支核心。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述接头包括直链接头，优选地是直链烷基。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述接头包括：

–NH(CH₂)_nCO–，其中n是1-10。

15.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述纤维蛋白原结合肽相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’，优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述纤维蛋白原结合肽相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’，优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’。

17.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述止血剂包含具有不同序列的纤维蛋白原结合肽。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述多个载体包含多个第一载体和多个第二载体，其中连接至所述多个第一载体的所述纤维蛋白原结合肽具有不同于连接至所述多个第二载体的所述纤维蛋白原结合肽的序列。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中每个载体具有连接至所述载体的具有不同序列的纤维蛋白原结合肽。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述具有不同序列的纤维蛋白原结合肽具有结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于结合至孔‘b’的不同选择性。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中所述具有不同序列的纤维蛋白原结合肽包含相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’的第一纤维蛋白原结合肽和以比所述第一纤维蛋白原结合肽更高的结合选择性结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’的第二纤维蛋白原结合肽。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述第一纤维蛋白原结合肽在其氨基端包含氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO:1)。

23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述第二纤维蛋白原结合肽在其羧基端包含氨基酸序列-APFPRPG(SEQ ID NO:14)。

24.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中所述具有不同序列的纤维蛋白原结合肽包含相对于结合至纤维蛋白原的孔‘b’优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’的第一纤维蛋白原结合肽和相对于结合至纤维蛋白原的孔‘a’优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’的第二纤维蛋白原结合肽。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述第一纤维蛋白原结合肽在其氨基端包含氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO:1)。

26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中所述第二纤维蛋白原结合肽在其氨基端包含氨基酸序列GHRP-(SEQ ID NO:10)，优选地是氨基酸序列GHRPY-(SEQ ID NO:11)。

27.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述生物相容性液体是水溶液。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述水溶液是盐水溶液。

29.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述多糖包括糖胺聚糖、氧化纤维素、脱乙酰壳多糖、甲壳质、藻酸盐、氧化藻酸盐或氧化淀粉。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述糖胺聚糖包括透明质酸。

31.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述颗粒包括交联透明质酸颗粒，其中大部分所述颗粒以部分或完全水合的形式具有范围100-1500μm的直径。

32.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其具有所述组合物的1重量％-70重量％或5重量％-20重量％的固体含量。

33.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述颗粒与所述液体的重量比是1:1至1:12或1:3至1:8。

34.根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物是透明的。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，其用作药物。

36.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，其用于治疗出血或者用于治疗伤口。

37.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物在制造用于治疗出血或者用于治疗伤口的药物中的用途。

38.一种治疗出血的方法，其包括向出血伤口施用有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的组合物。

39.一种治疗伤口的方法，其包括向伤口施用有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的组合物。

40.一种制备无菌的、即用型的、可流动的止血组合物的方法，其包括：

将生物相容性液体、可溶性止血剂和适用于止血并且不可溶于所述生物相容性液体的生物相容性交联多糖的颗粒混合在一起，其中所述可溶性止血剂包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽；以及

对所述组合物进行消毒。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述组合物通过蒸汽消毒或通过干热消毒来消毒。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述液体、所述药剂和所述颗粒在有效于形成包含基本上均匀分散在整个连续液相中的所述颗粒的所述液相的条件下混合在一起，从而形成基本上均匀的止血组合物。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其还包括将所述混合物离心以从所述混合物中去除气泡。

44.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述生物相容性液体和所述颗粒在添加所述可溶性止血剂之前混合在一起。

45.根据权利要求44所述的方法，其还包括在添加所述可溶性止血剂之前将所述生物相容性液体和所述颗粒的所述混合物离心以从所述混合物中去除气泡。