CN108495658B - 止血材料 - Google Patents

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Abstract

公开了一种止血材料，其中凝血酶受体活化剂被共价结合至生物相容性基质。

Description

止血材料
技术领域
本发明涉及止血材料以及生产和使用该材料的方法。
背景技术
不受控制的出血仍然是创伤和手术损伤中死亡的主要原因[1]。因此，开发有效的治疗方法来控制出血具有最重要的临床和社会价值。在过去的几十年中，已经开发了许多止血产品[2]，包括基于纤维蛋白的胶或密封剂[3a,b]，沸石散剂[4a,b]，交联明胶基质[5a,b]等。但是，这些产品中的每一种都有其各自的局限性。纤维蛋白产品成本高、保质期短且机械强度低[6]。沸石矿物容易引起严重的灼伤并且不可被降解[6]。只有当与高剂量的凝血酶结合时，交联明胶基质才能在几分钟内止血[7]。然而，由于自体蛋白水解，凝血酶在溶液中不稳定。已知高浓度的凝血酶会诱导人体角质细胞的凋亡并能导致伤口愈合障碍[8]。因此，存在设计具有改善的安全性的替代止血材料的强烈需要。特别地，设计避免使用高浓度凝血酶的有效策略是一种理想的解决方案。
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，它在血液凝结(凝固)中发挥重要的作用[9a,b]。作为关键凝固蛋白酶，凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化成由转谷氨酰胺酶(FXIII)交联的纤维蛋白网络[10]。另外，凝血酶通过刺激蛋白酶活化受体(PAR)成为最有效的血小板活化剂[11,12]。在被凝血酶活化后，血小板在物理上改变GP IIb/IIIa受体的构象并为纤维蛋白原提供高亲和力的结合位点，从而提供纤维蛋白原交联的血小板聚集。PAR-1和PAR-4均存在于人血小板上，但凝血酶活化人血小板主要由PAR-1介导[13]。图7A描述了凝血酶活化PAR-1的分子机制。PAR-1在血小板中高度表达[14a,b]，并且通过凝血酶蛋白水解切割PAR-1受体的细胞外N末端结构域的一部分而启动PAR-1的活化。蛋白水解产生新的N端配体结构域(SFLLRN(SEQ ID NO：1)，又称凝血酶受体激动剂肽-6：TRAP6)，其与胞外环2内的受体相互作用并触发PAR-1活化的信号通路。已经证明短TRAP6肽(SFLLRN)可以单独作为有效的血小板活化剂，并通过PAR-1信号传导刺激血小板的聚集[15]。
Figure BDA0001643829620000011
TRAP试验已成为全血或富含血小板血浆中的标准体外测定法，用于定量测定由TRAP6引发的血小板功能。TRAP试验允许分析通过PAR-1信号传导活化的血小板功能而不引发纤维蛋白的形成，反之，当凝血酶作激动剂时则会引发纤维蛋白的形成，这是由于样品中使用了凝血酶抑制剂。
WO 96/40033 A1公开了具有止血剂的止血材料，包括ε-氨基己酸和凝血酶受体活化肽，其中将止血剂喷雾或涂布在止血基质上以获得这样的基质：药剂物理(而非共价)地吸附在基质上。这种贴剂具有这样的缺点：其提供的止血剂在接触到患者的出血区域时容易从贴剂释放。这样就存在导致全身性血栓形成事件的潜在危险，特别是考虑到循环中没有循环拮抗剂。
WO 03/057072 A2公开了止血组合物，其包含纤维素和与其共价连接的多糖。
发明内容
本发明的目的是：提供用于控制出血的具有凝血酶受体活化剂的改进的止血材料。
因此，本发明提供一种止血材料，其中凝血酶受体活化剂与生物相容性基质共价结合。
利用本发明首次显示凝血酶受体活化剂可以共价固定在生物相容性基质上，从而获得适合施用于需要其的人类患者的改进的止血材料。作为优选的实施方案，TRAP6、TRAP7或TRAP8与合成的水凝胶基质(例如，基于聚乙烯醇的聚合物)的共价结合产生合适的止血材料，在相当长的一段时间内以安全、局部的方式维持血小板活化的活性，从而能够改善止血，特别是通过诱导的血小板聚集。
根据本发明的生物相容性基质可以是适合施用于人类患者的任何基质，特别是用于伤口覆盖或填充人类患者的体积缺陷(例如在器官中)。根据本发明，优选使用现有技术中已经提出的用于这种目的的基质材料。一般而言，“生物相容性”基质是可以施用于人类患者的基质，并且在施用过程中以及与患者接触时不会引起负面影响。“生物相容性”基质是不含威胁、毒害、阻碍或不利于活组织(例如，暴露于伤口表面的人体组织)的材料或组分的基质。这种基质的例子是“传统”伤口覆盖物，例如贴剂、海绵，还有可流动或可喷洒的基质、粉末等，例如FloSealTM(交联明胶基质)、SurgifloTM(牛凝胶糊剂)。鉴于贴剂有利于一般伤口的覆盖，非物质止血剂(大多数显著可流动的基质)可以在与液体/固体接触相反侧的同一位置释放，或者可以用于柔性填充空腔或提供柔性支架(“体积缺陷”)。该基质应该是化学活性的或化学活化的，从而凝血酶受体活化剂可以共价结合到本发明的基质上。例如，基质可以具有羟基、乙烯基、羧基或氨基，以允许凝血酶受体活化剂共价结合到基质上。
优选地，基质是止血基质，即基质材料本身就具有止血性质。这样的材料在本领域中是可获取的且包括例如胶原、明胶或壳聚糖。
优选的生物相容性基质选自生物材料，优选蛋白质、生物聚合物或多糖基质，特别是胶原、明胶、纤维蛋白、淀粉或壳聚糖基质；以及合成的聚合物，优选聚乙烯醇、聚乙二醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)等。
优选地，本发明的基质是可生物降解的，即其在一段时间后被患者身体自然吸收。无论如何，材料(包括基质)必须是生物相容的，即对被施用该材料的患者没有伤害作用。这种可生物降解材料特别适用于在体内已实现止血的情况，即在手术过程中且手术后位点被关闭。
因此，基质优选为选自生物聚合物例如蛋白质或多糖的生物材料。特别优选的是选自胶原、明胶、纤维蛋白、多糖(例如透明质酸)、壳聚糖，以及它们衍生物的生物材料，更优选胶原和壳聚糖，特别优选胶原。用于本发明的该胶原基质可以衍生自任何适于形成凝胶的胶原，包括来自液体、糊状、纤维状或粉状胶原材料的材料，其可以加工成多孔或纤维基质以及颗粒。胶原凝胶(用于生产海绵或片材)的制备可包括：酸化直至发生凝胶形成并随后进行pH中和。为了提高凝胶形成能力或溶解度，胶原可以(部分)经水解或修饰，只要干燥时形成稳定的海绵或片材的性质不会减弱即可。用于结合凝血酶受体活化剂的基质可以是生物聚合物，即天然存在的聚合物或其衍生物，或者可以是合成的聚合物。可用于本发明止血材料的生物聚合物的例子包括胶原等多肽、明胶等胶原衍生物、弹性蛋白和弹性蛋白衍生物，以及多糖如透明质酸、淀粉、纤维素或其衍生物(例如氧化纤维素)。优选地，生物聚合物是人生物聚合物，其可以从个体分离，或者可以是合成的生物聚合物，例如重组生产的生物聚合物。
在各种实施方案中，基质包含重组人聚合物。特别地，重组人聚合物可以是重组人胶原，例如I型重组人胶原、III型重组人胶原、或其组合。在一个实施方案中，基质包含III型重组人胶原。在另一个实施方案中，基质包含I型重组人胶原。例如，重组人明胶可以源自III型重组人胶原。在另一个实施方案中，基质包含来源于I型重组人胶原的重组明胶。在另一实施方案中，基质包含通过表达编码多核苷酸直接产生的重组明胶。
优选地，本发明中用作基质的多糖选自下组：纤维素、烷基纤维素、甲基纤维素、烷基羟烷基纤维素、羟烷基纤维素、硫酸纤维素、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、几丁质、羧甲基几丁质、透明质酸、透明质酸盐、藻酸盐、藻酸、藻酸丙二醇酯、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝血酶、果胶、支链淀粉、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、角叉菜胶、壳聚糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡萄糖醛酸、聚古罗糖醛酸、所述多糖的衍生物、或其组合。
本发明的基质也可以基于合成的聚合物。合成的可吸收的聚合物可以是脂肪族聚酯聚合物、脂肪族聚酯共聚物、或其组合。
本发明的基质也可以以由纤维制成的织造或非织造的织物的形式提供。这种纤维优选由生物相容的和/或生物可降解的材料制成。目前已经使用了许多这样的纤维来提供止血织物。在一些实施方案中，该非织造或织造的纤维可包含一种或多种多糖，例如果胶、乙酰化果胶、透明质酸及其衍生物等。在一些实施方案中，果胶和/或乙酰化果胶可以来源于甜菜。在其他实施方案中，多糖可以是非纤维素多糖。织造或非织造的纤维还可以包括包含其他生物可降解聚合物的纤维，包括聚乙交酯、聚丙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(t-己内酯)、聚(二恶烷酮)、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸)、藻酸盐、胶原、壳聚糖、明胶、纤维蛋白原、弹性蛋白、聚醚、聚酐、聚酯、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚三亚甲基碳酸酯及其他。另外，也可以使用天然蛋白质纤维，例如棉花、丝绸和羊毛。
优选地，本发明的基质材料以各种形态的颗粒提供，包括用于流动性止血剂的粉末或基质。例如，颗粒的(中值粒径)尺寸可以为1至1000μm，优选10至1000μm，尤其是200至800μm。作为可流动止血剂的合适基质在例如WO 98/08550 A或WO 2003/007845 A中公开。
根据特别优选的实施方案，本发明使用聚乙烯醇(PVA)作为基质材料。PVA是源自聚乙酸乙烯酯的部分水解的水溶性聚合物。由于其优越的生物相容性，本发明中用作基质的基于PVA的水凝胶已被广泛用于组织工程和给药系统(FDA批准)[16a,b]。另外，由于PVA水凝胶独特地强于其他大多数合成的水凝胶而被众所周知。
本发明使用共价结合至适于止血的基质上的凝血酶受体活化剂。凝血酶受体活化剂的优选实施方案是凝血酶受体活化肽(TRAP)。TRAP是具有不同氨基酸长度的肽家族，其对应于凝血酶受体的新N末端区域。这些合成的或重组的肽模拟凝血酶受体蛋白胞外域的活化形式，并起凝血酶激动剂的作用。
US 5,256,766 A和WO 96/40033 A1描述了药物化合物和止血贴片，其含有用于促进血液凝固的TRAP或“激动剂”，例如局部应用于血友病患者的内出血部位。激动剂被公开为模拟凝血酶刺激成纤维细胞增殖的能力，并伴随血小板聚集。因此TRAP可用于促进止血和伤口愈合。通过使用TRAP，可以提供有效的止血材料和止血绷带，其可以完全不含生物化合物如凝血酶和纤维蛋白原，以及没有伴随的病毒污染危险。
可以被并入本发明材料的典型的TRAP包括能够激活凝血酶受体的肽，例如US 5,256,766 A中由式AAx--AAy--(AAi)n--z所确定的激动剂。
已经公开的其它激活成纤维细胞并涉及伤口愈合的TRAP包括肽TRAP 508-530，氨基酸AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV(SEQ ID NO：2)；和TRAP 517-530，氨基酸RGDACEGDSGGPFV(SEQ ID NO：3)。更合适的TRAP公开于Carney等，J.Clin Invest.89：14691477(1992)；Furman等，PNAS 95(1998),3082-3087和Cromack等，J.Surg.Res.53：117(1992)。因此，可用于本发明的合适的TRAP例如包括肽SFLLRNPNDKYEPF(SEQ ID NO：4)、SFLLRNPNDKYEP(SEQID NO：5)、SFLLRNPNDKYE(SEQ ID NO：6)、SFLLRNPNDKY(SEQ ID NO：7)、SFLLRNPNDK(SEQ IDNO：8)、SFLLRNPND(SEQ ID NO：9)、SFLLRNPN(TRAP8(SEQ ID NO:10))、SFLLRNP(TRAP7(SEQID NO:11))、SFLLRN(TRAP6)、SFLLR、SFLL和SFL，及其酰胺化形式。由于TRAP是小分子肽，它们比凝血酶等大分子蛋白质血小板活化剂更稳定。TRAP的稳定性有助于本发明材料的特性，使其无需冷藏即可储存。
优选地，凝血酶受体活化剂(优选TRAP)具有接头，以便将TRAP共价结合到基质上。优选的接头是氨基酸(单氨基酸，例如半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸等，优选半胱氨酸)，或具有例如2至5个氨基酸残基的短氨基酸接头，优选包含选自半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和甘氨酸的氨基酸。优选地，二肽接头可以是Cys-Gly-(末端“-”表示连接凝血酶受体活化剂的键)、-Gly-Cys、Cys-Arg-、-Arg-Cys、-Asn-Cys、Cys-Asn-、-Pro-Cys、Cys-Pro-；优选地，三肽接头可以是Cys-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Cys、-Pro-Asn-Cys、Cys-Asn-Pro-、Cys-Pro-Asn-、-Asn-Pro-Cys等，或包含2至5个氨基酸残基(已知用于药物肽与载体或基质结合)的任意其他肽接头。
根据一个特别优选的实施方案，本发明材料的凝血酶受体活化剂是凝血酶受体活化肽(TRAP)，优选TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(用于PAR-2(人)(SEQ ID NO：12))、TFRGAP(用于PAR-3(人)(SEQ ID NO：13))、GYPGQV(用于PAR-4(人)(SEQ ID NO：14))、或其酰胺化形式，以及上述试剂的混合物。
本发明的止血材料可以具有可用于治疗需要止血材料的人类患者的任何合适的形式，即可流动或可喷雾的形式；二维形式(其中与其他两维相比，第三维度上的延伸较小(例如小于1/10或1/20)；或者三维形式(例如海绵、糊剂、空腔植入物等)。优选地，本发明的材料的二维或三维实施方案例如可以是海绵、织造或非织造的织物，预成型的形状体，优选为圆柱体或圆锥体(例如用于拔牙)，或用作柔性或非柔性支架，颗粒或颗粒状材料，或片材。如果基质能够从伤口吸收液体，从而一旦将材料应用于到伤口就从伤口处吸引更多凝血组分以实现血小板的聚集，则是特别优选的。此外，优选地，该材料是柔性的并且适合应用于具有各种形状的不同组织和位置。
本发明的止血材料的其他优选实施方案包含其它成分，例如抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂(如抑肽酶或ECEA)、生长因子、维生素、细胞等。然而，在优选的实施方案中，本发明的材料可以具有或可以不具有这样的其他成分，前提是该材料不含可能对止血材料的储存性或给药产生不利影响的成分。因此，优选地，本发明的止血材料基本上没有任何蛋白质降解活性，特别是没有蛋白酶活性，特别没有凝血酶活性。凝血酶经常加入到止血材料中以促进纤维蛋白裂解和凝块形成；然而，它对于止血材料也可能是能蛋白水解的，这可能是、特别是在该材料的生产和储存过程中不希望的。通过本发明，不需要添加或存在凝血酶或类似组分，因此可以将其省略而不会对止血材料的止血性质产生负面影响。
优选地，本发明的止血材料以能够吸收血液等液体材料的状态被提供。吸收血液(以及其中的组分促进血块形成、止血和伤口闭合)的能力显著提高了止血材料的总体功效。例如，本发明的止血材料以干燥形式或者以仍然允许材料吸收另外的液体材料(即，用仍低于其浸润能力的量的液体湿润)的湿润形式提供。这允许血液进入和/或通过止血材料，以便在放大的体积或整个体积(或几乎全部)的施用材料内，提供(例如在伤口闭合过程中)有用的血液成分。
根据另一方面，本发明涉及一种制备本发明的止血材料的方法。这种制造止血材料的方法的特征在于，将凝血酶受体活化剂共价结合到止血基质上的步骤。
优选地，凝血酶受体活化剂是凝血酶受体活化肽(TRAP)，优选TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(用于PAR-2(人))、TFRGAP(用于PAR-3(人))、GYPGQV(用于PAR-4(人))，或其酰胺化形式，以及这些试剂的混合物。
当然，对于本发明重要的是，凝血酶受体活化剂在与生物相容性基质共价结合后保持其凝血酶受体活化活性。没有任何生物分子能轻易地连接到生物相容性表面并仍然保留其生物功能。在产生本发明的过程中，发现使用常规结合技术共价结合本发明的凝血酶受体活化剂(例如TRAP6肽)的C-或N-末端，通常会导致所述生物活性的丧失。因此，提供确实保留凝血酶受体活化剂(肽)的完整生物功能性的共价固定方法并不是微不足道的，并且需要依靠本公开来获得包含这样功能的实施方式。
例如，使用传统的肽结合技术，例如使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺的那些；C末端，Asp和Glu的反应)或NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；N末端、Lys的反应)，并没有产生活性固定化凝血酶受体活化剂(因为它们通常是非特异性的，倾向于与酸性氨基酸或赖氨酸发生副反应，使依赖于N-末端的肽失活等[29],[30],[31])。使用半胱氨酸和/或迈克尔加成的技术也可能具有这样的风险：由于可能与胺基团发生副反应而丧失功能[32]。因此，这种传统的结合技术会导致活性的损失。虽然已经报道了多种用于肽固定的化学方法[34]，但这些方法中的大多数依赖于与C-末端羧基(例如EDC)的反应[29]，或依赖于与N末端伯胺(例如NHS)的反应[30],[31]，或依赖于通过基于马来酰亚胺或乙烯基砜基团的迈克尔加成与半胱氨酸残基的反应[32]。不幸的是，大部分报道的反应都是非特异性的，并且易发生与酸性/碱性氨基酸(对于EDC/NHS)或与胺基(对于迈克尔加成)的副反应，这会引起肽活性的不利损失。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯缀合是最常用的通过与肽的N-末端反应将生物活性肽(例如细胞粘附RGD)共价固定到聚合物底物上的方法[35]。尽管伯胺对于NHS酯是最具反应性的基团，但最近的研究表明，可能与其他肽残基(例如对于酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸是-OH，对于精氨酸是胍基)发生一系列副反应[30],[31]。此外，此前关于TRAP(SFLLRN-)的结构-功能关系的研究强调了N端处氨基酸保持肽活性的重要性[36]。考虑到这些情况，已经发现，重要的是本发明开发一种肽固定化方法，其能避免与凝血酶受体活化剂(肽，如TRAP6)的N端的副反应以保持生物活性。
因此本发明提供了固定形式的具有保留活性的凝血酶受体活化活性剂。事实证明，其不能通过常规的用于肽固定的现有技术方法提供。因此，本发明还通过使用例如生物正交反应(例如含半胱氨酸的TRAP6在PVA降冰片烯上的光点击缀合，其提供了非常高的缀合效率(>95％)、位点特异性和模块化(modularity))，提供了不存在与N-或C-端或酸性或碱性氨基酸发生副反应的风险的特定结合技术(参见上文)的集合。很明显，相同的缀合方法也适用于具有降冰片烯基团的其他底物，例如天然来源的分子(明胶，透明质酸，藻酸盐等)和合成的类似物(比如PEG)。此外，与聚合物结合的凝血酶受体活化活性肽缀合物通过PAR-1受体信号传导而被血细胞内化的可能性低于其可溶形式，因为用于本发明的生物相容性固体基质(例如PVA基质(数百个重复单元))的聚合物基质的尺寸远大于短TRAP6序列。总之，本发明的将具有保留活性的凝血酶受体活化活性剂结合至生物相容性固体基质(例如通过用于TRAP6肽固定的光点击缀合)的方法，为局部止血以及其他医学应用提供了显著的实用价值。
根据该方法的优选实施方案，止血基质被化学基团(例如烯基、巯基、炔基、叠氮基、氢化叠氮基(hydroazide)、肼)官能化，优选这样的基团：通过生物正交反应(例如巯基-烯加成、炔烃-叠氮化物环加成、狄尔斯-阿尔德反应、酰肼-肼反应)可使凝血酶受体活化剂高效共价结合。
优选地，凝血酶受体活化剂修饰有经生物正交基团(例如烯基、巯基、炔基、叠氮基、氢化叠氮基、肼)处理的肽序列，特别是修饰有具有-SH基团的半胱氨酸部分。
在本发明方法的优选实施方案中，用烯基例如降冰片烯、马来酰亚胺、烯丙基化合物、乙烯基酯、丙烯酸酯，碳酸乙烯酯，甲基丙烯酸酯等对止血材料进行官能化。
根据本发明方法的一个特别有利的实施方案，化学结合通过光诱导反应进行，特别是通过自由基介导的巯基-(降冰片-)烯光点击化学(参考[18a])或(其他)光触发点击化学(参考[18b])进行。
本发明的止血材料可以通过本领域中采用的常规步骤，例如通过适当的消毒和包装步骤，制成商品。例如，本发明材料可以通过如下处理：紫外/可见光照射(200-500nm)，优选借助具有不同吸收波长的光引发剂(例如Irgacure 184，2959)，优选水溶性引发剂(Irgacure 2959)。这种照射通常在1-60分钟的照射时间内进行，但也可以根据具体方法施加更长的照射时间。本发明的材料可以最终无菌包裹，以便在使用前保持无菌并且包装(例如通过添加特定产品信息单)到合适的容器(盒子等)中。
另一方面，本发明还涉及本发明的止血材料在手术和/或治疗损伤和/或创伤中的应用。本发明的止血材料对于增加血小板源生长因子的释放和加速伤口愈合是特别合适且有效的。
这使得本发明的止血材料成为用于吻合术的封闭、缝合线的封闭以及保障切除部位止血的优异工具。
根据本发明的另一个方面，本发明的止血材料也可以以这样的方式提供：组合了向患者施用材料所需的其它组分的试剂盒形态。例如，如果止血材料可以以可流动的干燥形式(例如作为颗粒或作为粉末)提供或作为可流动的糊剂提供，则优选为这种材料提供可以在施用给患者之前不久添加的合适的缓冲溶液。这样的缓冲溶液通常包含(除了缓冲组分，如磷酸盐、碳酸盐、TRIS等缓冲体系)二价金属离子(优选Ca2+离子)或其他功能性组分(如果其不存在于基质上或基质中)，例如抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂(如抑肽酶或ECEA)、生长因子、维生素、细胞等。该试剂盒可进一步包含用于施用或准备施用止血材料的装置，例如注射器、管、导管、钳子、剪刀、消毒垫或洗剂等。
因此，本发明涉及一种试剂盒，优选用于手术和/或治疗损伤和/或创伤，其包含
-本发明的止血材料，和
-至少一种给药装置，优选选自以下组：缓冲溶液，特别是含有Ca2+离子的缓冲溶液，注射器、管、导管、钳子、剪刀、消毒垫或洗剂。
优选地，缓冲溶液还包含选自以下的组分：抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂(特别是抑肽酶或ECEA)、生长因子、维生素、细胞，或其混合物。可选地，所述试剂盒还可以包含具有选自下组的组分的容器：抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂(特别是抑肽酶或ECEA)、生长因子、维生素、细胞，或其混合物。
通过以下实施例和附图进一步对本发明进行说明，但本发明不限于此。
附图说明
图1显示了(A)PVA-NB和PVA-TRAP6的合成示意图(在50℃下，在纯DMSO中反应12小时，TsOH：对甲苯磺酸，I2959：Irgacure 2959，即一种常用的水溶性PI)；(B)PVA、PVA-NB和PVA-TRAP6缀合物的1H-NMR(D2O)光谱；以及(C)通过MTT实验测定的暴露于具有变化的聚合物浓度(1％、0.5％和0.1％)的PVA-NB中24/48小时后的C2C12细胞的归一化存活力(n>3)和(D)通过MTT实验测定的暴露于具有变化的聚合物浓度(1％、0.5％和0.1％)的PVA-TRAP6溶液中24/48小时后的C2C12细胞的归一化存活力(n>3)。
图2显示了(A)-(C)ROTEM表征的全血对被研究材料响应的凝血过程(CT：以秒为单位的凝血时间，即直至凝块达到2mm坚度(firmness)的潜伏期；MCF：以毫米为单位的最大血块硬度)。(A)绘制的ROTEM曲线显示全血对TRAP6(0.1mM)，PVA-TRAP6(0.1mM TRAP6-)，PVA-NB和0.9％NaCl对照组响应的凝血过程；(B)不同剂量(0.01、0.1、1mM)的未缀合和缀合的TRAP6(PVA-TRAP6)对CT的影响；以及(C)TRAP6、PVA-TRAP6和PVA-NB在最佳TRAP6-浓度(0.1mM)下的CT的对比分析。(D)响应于TRAP6(0.1mM)、PVA-TRAP6(0.1mM TRAP6)和PVA-NB的血小板功能的多板(Multiplate)分析；每次测量都重复进行。(E)多板关键参数的比较：单位聚集面积。
图3显示了(A)温育15分钟后，通过测定CD62p/CD42共表达测量的TRAP6介导的血小板活化的FACS分析。重复进行实验，数据呈现为CD62p和CD41表位±SD阳性的血小板百分比。(B)柱状图显示用特异性CD41PE和CD62p APC抗体染色的样品值。(C)温育15分钟后，经TRAP6处理的样品、经PVA-TRAP6处理的样品和经PVA-NB处理的对照组样品的CD62p和CD41表达的代表性点状图。
图4显示了(A)示意图，其显示：通过自由基介导的光点击化学法，UV-光交联PVA-NB与二硫苏糖醇(DTT)，制备PVA-NB水凝胶。(B)使用原位振荡光流变测定法，测定具有不同的巯基对NB比率(0.4、0.8、1.0和1.2)的PVA水凝胶的机械特性：G'-凝胶储能模量，10％的PVA-NB，0.5％的I2959，60秒延迟，光强度：20mW/cm2；50μm狭缝厚度，10％应变，10Hz。(C)光聚合的PVA-NB水凝胶球粒的示例(比例尺：1厘米)。(D)巯基对NB的比率(N)对G'-平台值的影响：N＝0.4(I)、0.8(II)、1.0(III)、1.2(IV)。(E)在PBS中溶胀48小时后，PVA-NB水凝胶(I-IV)的平衡质量溶胀比率。
图5显示了(A)通过连续冻干和冷冻碾磨制备PVA水凝胶(I，-SH：-NB＝0.4)颗粒(PVA-NB-P)的示意图；(B)通过光引发的巯基-NB缀合，用含半胱氨酸的TRAP6肽将PVA-NB-P表面官能化的示意图，-SH：NB＝1.2，0.1％PI(Li-TPO)的PBS溶液，20mW/cm2；(C，D)PVA-TRAP6-P的SEM图像，比例尺：100μm(C)，10μm(D)。
图6显示了(A)-(B)响应于PVA-NB-P和PVA-TRAP6-P(盐水中10wt％)的悬浮液的全血凝血过程的ROTEM表征。(A)所绘ROTEM曲线显示响应于PVA-NB-P和PVA-TRAP6-P悬浮液的全血凝血过程；(B)比较分析PVA-NB-P、PVA-TRAP6和NaCl(对照组)的CT。(C)-(F)颗粒状聚合物的FACS分析。(C)温育15分钟后，通过测定CD62p/CD41共表达来测量TRAP6介导的血小板活化的FACS分析。使用来自不同供体(n＝2)的血样重复实验两次，数据以CD62p和CD41表位±SD阳性的血小板百分比表示。(D，E，F)温育15分钟后，经PVA-NB-P处理的样品和经PVA-TRAP6-P处理的样品(阳性对照：0.1mM TRAP6，阴性对照：NaCl)的CD62p和CD41的共表达的代表性点状图。
图7显示了(A)蛋白酶活化受体-1(PAR-1)活化的分子机制。(B)TRAP6-肽基序被共价固定在合成的聚乙烯醇(PVA)水凝胶内，即，TRAP6呈递水凝胶，其能够以高度局部化的方式活化血小板。
图8显示了通过旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)测定的TRAP6(非缀合的，1mM)和聚合物-TRAP6缀合物对血液凝固的影响。A：凝血时间(CT)；B：凝块形成时间(CFT)。通过PEG-10k-NHS与TRAP6的N-末端反应制备PEG-TRAP6，通过可光点击的PVA降冰片烯(22kDa)与TRAP6(SFLLRNPNC)中的半胱氨酸残基反应制备PVA-TRAP6。用PEG-10k-甘氨酸作为空白聚合物对照组。所有样品重复测量三份。
图9示出实验性证据：与1mM TRAP6、1mM PVA-NB和盐水相比，PVA-TRAP6(1mM)中保留有生物活性。A：通过Multiplate-TRAP方法测量的总血小板聚集面积；B：通过流式细胞术(FACS)测量的由于血小板活化引起的CD41/CD62P共表达的水平。
具体实施方式
实施例：
合成的血小板活化水凝胶基质诱导局部止血的进展
本发明的实施例通过水溶性PVA-TRAP6缀合物作为血小板活化的聚合物模型以及不溶性(交联的)PVA-TRAP6水凝胶颗粒(PVA-TRAP6-P)证明本发明用于安全的和局部的加速止血。在本文中，首次证明了TRAP血小板活化肽(如TRAP6)可以被共价固定在合成的水凝胶基质中(图7B)用于控制出血。通过这种止血材料，测试了假设：聚合物缀合的TRAP6肽可以保持它们对血小板活化的活性，同时以安全、局部的方式加速止血，并且不会发生血小板活化剂的全身释放。水溶性PVA-TRAP6缀合物被设计为血小板活化的聚合物模型以及不溶性(交联的)PVA-TRAP6水凝胶颗粒(PVA-TRAP6-P)，用于安全的和局部的加速止血。这些新的聚合物-肽缀合物使用高效巯基-降冰片烯光点击化学制备。使用旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)、血小板聚集试验(多板)和流式细胞术(FACS)，系统地表征这些材料活化血小板的程度。
几种止血策略依赖于使用血液成分如纤维蛋白原和凝血酶，这些成分的成本高且储存期短。在本发明实施例中，开发了用于快速局部止血的具有成本效益的合成生物材料。不使用凝血酶，将凝血酶受体激动剂肽-6(TRAP6)共价结合在聚乙烯醇(PVA)水凝胶上。首先，通过光缀合，将含半胱氨酸的TRAP6共价连接到PVA-降冰片烯(PVA-NB)骨架上，制备可溶性PVA-TRAP6。使用C2C12成肌细胞的细胞毒性研究表明：PVA-NB和PVA-TRAP6是无毒的。血栓弹力测定法显示，TRAP6的止血活性以缀合形式保留，其与相同浓度的游离TRAP6溶液相当。0.1％的PVA-TRAP6溶液可将凝血时间(CT)缩短至生理CT的约45％。血小板聚集试验和FACS进一步证实了高的血小板活化效率。为了潜在的临床应用，研发了用于局部血小板活化和止血的TRAP6呈递水凝胶颗粒(PVA-TRAP6-P)。通过光聚合的PVA-NB水凝胶颗粒(PVA-NB-P)与TRAP6的生物功能化，制备PVA-TRAP6-P。已证明，PVA-TRAP6-P可有效地将CT缩短至约50％。FACS显示，PVA-TRAP6-P可以活化血小板至与可溶性TRAP6对照组相当的程度。总之，PVA-TRAP6-P代表了一类用于安全止血和伤口愈合的有前途的生物材料。
1.实验部分
1.1.材料和试剂
除非另有说明，所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司并按原样使用。
1.2.PVA-降冰片烯(PVA-NB)的合成
在三颈烧瓶中，在氩气氛下，将10g PVA(22kDa)和20mg对甲苯磺酸在60℃下溶于250mL无水DMSO中1h。在第二个烧瓶中，在氩气氛下，将2g顺式-5-降冰片烯-内型-2,3-二羧酸酐(0.1当量的-OH基团)溶于50mL无水DMSO中。将得到的溶液滴加到含有PVA的第一个烧瓶中。反应在50℃保持12小时。反应后，通过用10mM NaHCO3溶液透析24小时，并随后用去离子(DI)水透析12小时，来纯化粗产物。冷冻干燥后，得到无色固体PVA-NB，回收率为95％。1H-NMR(D2O)：δ(ppm)：6.2(2H,s,-CH＝CH-)，3.3(2H,s,-C＝CCH-CH-)，3.1(2H,s,-C＝C-CH-CH-)，1.3(2H,s,-CH2-)。
取代度(DS)：7.5％。
1.3.PVA-TRAP6缀合物的合成
通过巯基-烯光点击缀合，将含半胱氨酸的TRAP6肽(N-C：SFLLRNPNC(SEQ ID NO:15))，中国肽业有限公司(China Peptide Co.))共价连接到PVA-NB的骨架上，来制备PVA-TRAP6。具体地，将60mg PVA-NB溶解于0.5％Irgacure 2959(I2959，BASF)的PBS溶液中，以使大分子单体终浓度为5％。向该溶液中加入100mg的TRAP6-Cys肽(1.2当量的NB基团)。将所获得的溶液在氩气下搅拌，并用过滤的紫外光(320-500nm)以20mW/cm2照射300秒。紫外光由Omnicure S2000灯导向。
1.4.PVA-NB水凝胶的制备
将PVA-NB(DS-7.5％)溶解在0.5％的I2959溶液中，达到终浓度10％。然后，将该溶液的等分试样与适量的二硫苏糖醇(DTT)混合，使-SH/-NB比率分别为0.4(I)、0.8(II)、1.0和1.2(III)。通过在多孔PDMS模具(孔径：6mm)中光聚合，制备水凝胶球粒。具体地，将200μL的大分子单体溶液移液至由PDMS模具(厚度：1.5mm)分隔的两个玻璃盖玻片之间，然后在过滤的紫外光(20mW/cm2)下暴露600秒。将球粒从载玻片上分离，并用无菌PBS洗涤。
1.5.制备PVA-NB水凝胶颗粒(PVA-NB-P)
如前所述制备水凝胶前体溶液(I-III)并在相同条件下(除了使用10mL圆柱形玻璃小瓶作为模具)进行光聚合。光聚合后，将水凝胶圆柱体转移到100mL烧杯中，并用PBS洗涤(更换2次)12小时，以除去未反应的聚合物和PI。然后，将溶胀的水凝胶用液氮冷冻并冻干。最后，使用RETSCH Cryomill RS232，将干燥的PVA-NB基质研磨成细粉末。
1.6.TRAP6呈递PVA水凝胶颗粒(PVA-TRAP6-P)的制备
通过将TRAP6-Cys肽共价连接到PVA-NB-P上的残余NB基团上，制备PVA-TRAP6-P。具体地，将100mg的PVA-NB分散在0.1％可见光PI(LAP)的PBS溶液中[19]，使聚合物终含量为5％。向该悬浮液中加入特定量的TRAP6-Cys肽(1.2当量的NB基团)。在氩气下搅拌所获得的悬浮液，并用紫外光(365nm)以20mW/cm2照射300秒。紫外光由Omnicure LX400LED灯导向。
1.7.光流变性(Photo-rheometry)
如先前报道[27]的那样，在模块化光流变仪(Anton Paar MCR-302)上进行光流变性测定。具体地，将MCR302与来自光导(Omnicure S2000)的经过滤的紫外光(320-500nm)整合到玻璃板的底部。具体地，应用板对板振荡光流变测定法，来实时监测光聚合过程中水凝胶制剂的固化动力学。由Ocean Optics USB 2000+光谱仪测定，板表面的光强度约为20mW/cm2。可以监测样品的储能模量(G′)和损耗模量(G″)作为辐照时间的函数。凝胶点是在G′和G″交叉点附近确定的。
1.8.水吸收
使用一般方案测定PVA-NB水凝胶的质量溶胀比[28]。如上所述制备水凝胶球粒(n＝3)，并使其在室温下在DI H2O中溶胀24小时。称重湿球粒以确定平衡溶胀质量(Ms)，然后冻干以获得干重(Md)。平衡质量溶胀比(Qm)计算为Ms/Md。
1.9.MTT实验
通过MTT实验评价PVA、PVA-NB和PVA-TRAP6大分子单体溶液的细胞毒性。将C2C12细胞在补充有5％胎牛血清(FCS)、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素(均来自奥地利西格玛奥德里奇公司)的Dulbecco修饰的Eagles培养基(DMEM)中培养。在DMEM培养基中制备具有三种浓度(5％、1％和0.1％)的大分子单体溶液。然后以每孔5×103个细胞的密度，将C2C12细胞接种在96孔板中的200μL培养基中。温育24小时后(37℃，5％的CO2)，将100μL各个大分子单体溶液一式三份地加入到细胞中。温育24小时后，细胞用无菌PBS洗涤两次，然后加入100μL噻唑蓝四唑鎓溴化物(MTT)工作溶液(PBS中5mg/mL)。温育1小时后，弃去液体并加入100μl的DMSO以溶解甲瓒晶体。最后，使用酶标仪在540nm处测量吸光度。
1.10.旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)
ROTEM(TEM Innovation公司，德国)用于监测血小板活化的聚合物和全血随时间的相互作用。ROTEM系统包含一个振荡传感针，该传感针浸入盛有血液样本的温控容器中。可以在同一个设备中并行开展四个测试。通常，柠檬酸盐血液样品的凝固由重新钙化而引发。可以机械地监测纤维蛋白凝块的形成动力学，并通过集成计算机对典型曲线和数值参数进行计算。
收集来自三名未服药且健康的供体血液，使用来自肘前静脉的最小静脉，通过21号针头采集血液。舍弃前3ml后，将血液收集在含有0.3ml缓冲液的3.2％柠檬酸钠的3.5ml试管(Vacuette；Greiner Bio-One)中。分析前将样品保持在37℃的预热阶段至少10分钟，并在3小时内处理。全血样品的ROTEM分析通过加入20μl的CaCl2(
Figure BDA0001643829620000141
200mM)重新钙化而开始。柠檬酸盐血液重新钙化后，立即将聚合物溶液和/或聚合物悬浮液直接加入到比色皿中，并如先前报道[21]的那样轻轻地上下移液来混合。每个ROTEM比色皿的终反应体积为370μl，由300μl的柠檬酸盐全血，20μl的CaCl2和50μl的聚合物溶液或聚合物悬浮液组成。
根据信号计算以下ROTEM参数并将其包含在统计分析中：以秒计(秒)的凝血时间(CT)，即，直到凝块达到2mm硬度的潜伏期，其是初始纤维蛋白形成的量度；以秒计的凝块形成时间(CFT)，即，从CT直至凝块达到20mm的硬度的时间，其指示血小板功能和纤维蛋白原特性；α角，x轴与形成曲线从CT点开始的切线之间的角度(°)，与CFT相当；以毫米为单位的最大凝块硬度(MCF)，曲线的最大幅度，其表示凝块的绝对强度；和A30(mm)，即30分钟后的凝块硬度。
1.11.多板(Multiplate)分析
多板测试的原理是基于这样的事实，即血小板在活化时变粘，并因此容易粘附并聚集在多板测试比色皿中的金属传感器导线上。传感器导线由镀银的高导电铜制成。当被活化的血小板粘附并聚集在传感器导线上时，可以实时监测导线之间的电阻升高。对于每次测量，将300μL生理盐水和300μL水蛭素化(hirudinized)全血依次加入多板比色皿中。在37℃温育3分钟后，加入20μL样品溶液，同时程序开始收集信号。多板设备允许4次测量并行进行。每次测量进行6分钟并重复两次。
1.12.FACS分析
收集两名未服药且健康供者的血液并用柠檬酸钠稳定。向110μL全血(WB)中加入20μL的PVA-TRAP6溶液(30mg/mL和3mg/mL以使WB中TRAP6终浓度为2mM和0.2mM)，并在37℃温育15分钟。加入20微升TRAP6-C溶液(14mg/mL)和/或20微升NaCl溶液(0.9％)分别作为阳性对照和阴性对照。将温育的混合物与300μL的1％多聚甲醛在室温下混合15分钟。洗涤并离心后，使用20μL针对CD41的藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体和20μL针对CD62P的别藻蓝蛋白(APC)标记的单克隆抗体，进行双重免疫染色。将同种型对照样与分别结合了APC或PE染料的小鼠IgG抗体(所有抗体均购自BD生物科学，海德尔堡，德国)温育。在室温下温育30分钟后，使用荧光流式细胞术测定血小板的活化状态。使用配有单相氩离子激光器(488nm，20mW输出)的Beckmann Coulter Cytomics FC-500，检测血小板活化标志物CD62P和固有存在的血小板标志物CD41的表达。每个样品测量总共100 000个血小板，并用Cytomics CXP软件分析。实验重复两次。
1.13.统计(Statistics)
所有误差棒都代表标准偏差。统计显著性由学生t检验(student’s t-test)确定，其中'*'，'**'，'***'分别代表P<0.05、P<0.01、P<0.001。
2.结果与讨论
2.1.材料的设计和合成
在本研究中，基于以下原因，选择线状合成聚合物聚乙烯醇(PVA)作为共价固定有效的血小板活化肽(TRAP6)的底物。首先，PVA是FDA批准的具有优异成本效益和细胞相容性的聚合物，因此对于许多生物医学应用而言很有吸引力[17]。其次，PVA中存在的大量羟基为可调谐的(tunable)官能化和生物活性配体的呈现提供了显著的自由度，这在其他合成底物如臂依赖型聚乙二醇(PEG)中无法获得。
为了将TRAP6肽引入到PVA上，我们选择了稳定的巯基-烯光点击化学作为缀合方法。一方面，降冰片烯基由于其对巯基-烯反应的超高反应性以及低细胞毒性，被选作烯官能团[18,19]。另一方面，由于已知TRAP6序列的N端对其活化血小板的能力是关键的[15]，我们将具有游离巯基的半胱氨酸部分工程化到TRAP6肽序列(SFLLRNPNC)的C端。
通过PVA和降冰片烯酸酐在50℃下在DMSO中的12小时温和酯化反应，合成了PVA-NB(图1A)。这种修饰方法的一个显著优点是，修饰后大量羧酸酯基团可以被中和成钠盐的形式，从而使产品具有良好的水溶性。粗产物通过依次用10mM的中和用NaHCO3，然后用H2O透析来进行纯化，最后冻干(产率>95％)。为了证实该合成，使用1H-NMR分析比较PVA-NB和未修饰的PVA。如图1B(下部)所示，未修饰的PVA的谱图呈现出在4.0ppm和1.6ppm处的两个主峰，其分别对应-CH-和亚甲基。PVA-NB的光谱(图1B，中部)分别在6.2ppm(s，2H，-CH＝CH-)、3.3ppm(s，2H，-C＝C-CH-CH-)、3.1ppm(s，2H，-C＝C-CH-CH-)和1.3ppm(s，2H，-CH2-)处呈现新的峰。通过比较信号(a，d，f)对应的积分值来测定PVA-NB的取代度(DS)。通过改变反应物之间的化学计量或反应时间，可以在5％-50％的宽范围内精确控制DS(表S1)。由于PVA(22kDa)是由约500个重复单元组成的线型聚合物，因此我们选择具有最低DS(DS-7％)的PVA-NB作为前体，提供约35个反应位点用于与含半胱氨酸的肽进行光缀合。
在作为光引发剂(PI)的I2959的PBS溶液中，通过将含半胱氨酸的TRAP6肽与PVA-NB的NB基团进行光学缀合，来制备PVA-TRAP6缀合物。为了确认缀合效率，首先在D2O中进行NMR模型反应。基于NMR反应，图1B(上部)代表PVA-TRAP6缀合物的光谱。在6.2ppm处NB的质子信号(a)的显著降低表明缀合成功。此外，PVA-TRAP6的谱图也显示了7.4ppm处的新峰，其对应于TRAP6序列中苯丙氨酸(Phe或F)部分的芳族质子。
2.2.体外细胞毒性
为了证明所制备的材料在生物医学应用中的适用性，使用C2C12成肌细胞通过MTT实验研究了PVA、PVA-NB和PVA-TRAP6溶液的体外生物相容性。MTT实验显示，在温育24小时和48小时后，在不同浓度(0.1％、0.5％、1％)的PVA和PVA-NB(图1C)溶液是无毒的。对于PVA-TRAP6偶联物，温育24小时后，C2C12细胞(图1D)的代谢活性在与1％PVA-TRAP6混合时显著增加(P<0.001)，而与0.5％和0.1％PVA-TRAP6混合时则不增加。温育48小时后，与所有三种浓度混合的代谢活性与对照样相比均显著增加(P<0.001)。其他研究组的一些研究表明，PAR-1活化肽如TRAP6可以刺激细胞因子从不同类型细胞中释放，包括人类牙龈成纤维细胞、内皮细胞、肠上皮细胞和人肌成肌细胞[20a,b,c]。因此，我们推测，在MTT实验中C2C12成肌细胞的代谢活性增加归因于TRAP6诱导的PAR-1活化。鉴于1％的PVA-TRAP6溶液给出5mM的TRAP6-浓度，而用于血小板活化的有效TRAP6-浓度在5-100μM的范围内[12]，毒性结果表明，在PVA-TRAP6的有效范围内，其是细胞相容性材料。
2.3.止血活性
2.3.1.血栓弹力测定法
我们接下来使用旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)研究了PVA-TRAP6相比于TRAP6和PVA-NB的止血功效[21,22]，其是一种可在凝血过程中原位表征血凝块的粘弹性的临床诊断工具。图2A显示了与重新钙化的全血混合的研究样品的绘制的ROTEM曲线。凝血时间(CT)是指直至凝块达到2毫米硬度时的潜伏期，而最大凝块硬度(MCF)指的是曲线的最大幅度，其表示凝块的绝对强度。
根据ROTEM结果，观察到0.1mM的PVA-TRAP6的CT与0.1mM的TRAP6的CT非常相似，而PVA-TRAP6的MCF相对低于TRAP6对照组的MCF。较低的MCF可能是由于缀合到PVA-TRAP6(为大分子偶联物(65kDa)，并且显著大于TRAP6(1kDa))之后，TRAP6-对血小板的可及性降低。相比之下，PVA-NB对照组(图2C)呈现出与生理曲线(NaCl对照组)非常相似的曲线，显示PVA-NB骨架没有止血活性。
为了研究PVA-TRAP6的止血活性是否是剂量依赖性的，我们在ROTEM中测试比较了三种肽浓度(0.01、0.1、1mM)下的PVA-TRAP6溶液与TRAP6溶液(图2B)。发现PVA-TRAP6的最佳止血浓度为0.1mM，而在所选范围内剂量对TRAP6对照组没有显著影响。这可能再次暗示PVA-TRAP6和TRAP6肽中分子结构差异对用于血小板活化的TRAP6饱和水平的影响。
2.3.2.多板(Multiplate)分析
为了量化血小板活化的程度，我们利用多板实验来研究PVA-TRAP6、TRAP6和PVA-NB对血小板聚集的影响。该方法的原理基于这样的事实：血小板在活化时变粘，并因此倾向于粘附并聚集在多板测试比色皿中的金属传感器导线上。当激活的血小板粘附并聚集在传感器导线上时，可以连续监测导线之间的电阻上升。典型的多板曲线(图2D)表示与血小板聚集程度相对应的电子信号的累积。多板检测的一个关键参数是聚集面积(以单位表示)，即聚集曲线下方的面积。观察到PVA-TRAP6(0.1mM)诱导了与TRAP6(0.1mM)相当的聚集曲线(图2D)，而PVA-NB对照组显示可忽略的血小板聚集能力。TRAP6的聚集面积值(图2E)为147单位，而PVA-TRAP6和PVA-NB的面积值分别为130单位和2单位(p<0.001)。综上，多板实验证明，PVA-TRAP6在血小板活化方面表现出了高效率，而底物(PVA-NB)则没有。
2.3.2.可溶性系统的FACS
我们接下来利用流式细胞术(FACS)来量化血小板活化的程度。可以通过血小板的表面抗原CD41的固有表达来区别血小板与其他血细胞，表面抗原CD41识别血小板膜糖蛋白GpIIb，该血小板膜糖蛋白GpIIb与GpIIIa(整联蛋白β3链)非共价结合形成GpIIb/IIIa复合物。重要的是，CD62p(P-选择素)膜糖蛋白仅在活化的血小板上表达。用CD62p标记确定与所研究的材料(PVA-TRAP6、TRAP6、PVA-NB和NaCl)温育后人血小板的活化程度。测量用这些材料处理15分钟的血液样品中的CD41/CD62p共表达(图3A-C)显示，PVA-TRAP6(0.1mM)对CD41阳性细胞中CD62p的表达具有显著作用(约80％)。就CD62p阳性细胞而言，活化血小板表型的百分比保持在与用TRAP6(0.1mM)处理的对照组样品相同的水平。相比之下，PVA-NB对CD41阳性细胞中CD62p的表达没有显著影响(<10％)，这与用0.9％NaCl处理的阴性对照组样品处于相同水平。总之，FACS分析进一步证实了PVA-TRAP6用于血小板活化的高效率。
2.4.PVA水凝胶的制备与表征
由于可溶形式或可释放形式的血小板活化PVA-TRAP6(如WO 96/40033A1中的)有可能在循环中引起血栓形成风险，我们进一步发展了用于局部止血的不溶性PVA-TRAP6系统，其中TRAP6肽共价固定在光交联PVA水凝胶基质中。我们选择了自由基介导的巯基-NB光聚合作为生成PVA水凝胶基质的方法(图4A)。与(甲基)丙烯酸酯的常规交联化学相反，巯基-NB光聚合提供了几个优点，包括稳定的动力学、优异的时空控制和细胞相容性条件[19,23]。例如，基于PEG的巯基-NB水凝胶已经实现了具有高生存力(>90％)的哺乳动物细胞的原位光包囊化[19]。在本研究中，在作为水溶性和生物相容性PI的I2959存在下，PVA-NB大分子单体与模型交联剂(二硫苏糖醇，DTT)结合，在紫外光照射下进行光聚合。
2.4.1.光流变(Photo-rheometry)
我们利用原位光流变法，测试PVA水凝胶的光反应性和力学性能。据推测，可以通过调节巯基对NB的比率而容易地调节PVA水凝胶的化学物理性质。在光流变法中筛选了具有相同大分子单体含量(10％)但不同巯基对NB比率(0.4、0.8、1.0、1.2)的四种PVA-NB/DTT制剂(图4B)。经过60s的空白时间(无紫外线)后，紫外线照射后PVA水凝胶的储能模量(G')在数秒内以不同程度增加(8-120kPa)，直至达到G'-平台。发现，所有光聚合PVA水凝胶都是完全透明的(图4C)。通过将巯基对NB比率从0.4增加到1.2，G'-平台值(图4D)分别从8、22、120变为45kPa。水凝胶(III)获得了最高的G'-平台值，其中巯基对NB的比率为1：1，表明最高程度的交联。值得注意的是，因为溶胀过程能影响水凝胶的储能模量，所以这些来自光流变实验的G'-平台值只能代表在预溶胀状态下PVA水凝胶的暂时储能模量[24]。可通过使用诸如AFM纳米压痕等替代方法，进一步研究溶胀的PVA水凝胶的力学性能。
2.4.2.水吸收
我们进一步分析了PVA水凝胶(I-IV)的吸水性能。将光聚合的PVA水凝胶球粒在PBS中浸泡48h以达到平衡湿重(mwet)，将其与冻干后的聚合物干重(mdry)进行比较并给出平衡质量溶胀比(Qm)。如图4E所示，水凝胶(I-IV)的Qm值从130、45、10变为17。这些数据结合G'-平台值表明，当巯基对NB的比率为1：1(III)时获得最高的交联度。这一观察结果与其他研究组之前对基于PEG的巯基-NB水凝胶的研究相符[19,25]。例如，Lin等证明由于存在酯键，巯基-NB光聚合的PEG水凝胶是可水解降解的[25]。降解速率取决于凝胶交联密度，其由巯基对NB的比率和大分子单体含量决定。由于所提供的PVA水凝胶也具有许多酯键，我们预期这些水凝胶是可水解降解的。除了DTT之外，替代的二半胱氨酸蛋白酶敏感性肽也可以用作酶可分解的交联剂，以促进细胞重塑和伤口愈合。尽管如此，仍需要进一步研究所提出的PVA水凝胶在体外和体内的降解行为。
2.5.生物功能化
2.5.1.TRAP6官能化水凝胶颗粒的制备
为了制备合适的用于TRAP6官能化的水凝胶基质，将光聚合的PVA水凝胶(I，-SH：-NB＝0.4)依次冻干并冷冻研磨成细颗粒(图5A)。由于在光聚合后存在过量的NB基团，因此用这些残余基团与含半胱氨酸的TRAP6肽进行光点击缀合(图5B)。SEM分析(图5C)显示PVA-TRAP6-P的长度范围在5-50μm的范围内。推测PVA-TRAP6-P的部分团聚是由于NB基团的电荷效应。
2.5.2.ROTEM分析
我们用ROTEM测试了PVA-TRAP6-P与PVA-NB-P相比的止血能力。在测试之前，将这些颗粒小心地与盐水混合以形成可注射的浆液。如图6A-B所示，向全血中添加PVA-TRAP6-P引起CT显著降低至生理CT的约50％。有趣的是，PVA-NB-P对照组也引起CT下降至约70％。由于已知带负电荷的表面有助于凝固(即，内在途径)[26]，因此我们推测观察到的PVA-NB-P的止血活性是由NB基团的电荷效应引起的。
2.5.3.FACS分析
为了量化这些颗粒状物质活化血小板的能力，我们在FACS中分析了用PVA-TRAP6-P和/或PVA-NB-P预温育的全血样品。FACS分析(图6C-F)显示PVA-TRAP6-P的活化血小板百分比(CD41+/CD62p+)高达约55％，这与阳性对照组(0.1mM TRAP6)相当。相比之下，用PVA-NB-P温育的血液样品仅显示了最小量的活化血小板(<10％)。这些结果表明，TRAP6呈递水凝胶基质(PVA-TRAP6-P)以局部方式显示出活化血小板的良好潜力。
2.6.比较常规固定技术与保留肽凝血酶受体活性剂活性的结合技术
为了说明谨慎地选择合适的固定技术的重要性，对TRAP6肽与聚合物底物共价结合的过程中的常规肽固定方法(例如NHS缀合)和本发明过程中已经选择的方法(例如光点击缀合)进行了比较。事实证明，常规的肽固定方法会导致其生物活性的丧失。这导致凝血酶受体活化不足并且不诱导凝血，使得所得材料对局部止血无用。
为了通过NHS缀合制备聚合物-TRAP6，使用具有末端NHS基团的聚乙二醇(10kDa)(PEG-10k-NHS)作为聚合物底物。通过N-末端反应连接TRAP6与PEG-10k-NHS，用甘氨酸封闭未反应的NHS基团。此外，制备与过量甘氨酸反应的PEG-10k-NHS作为阴性对照组。在用蒸馏水透析并冻干后，以高产率获得缀合物，随后用标准旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)分析以研究它们对凝血的作用。为了比较通过不同方法制备的聚合物-TRAP6缀合物的生物活性，用通过我们所要求保护的方法(即光点击缀合法)而制备的PVA-TRAP6作为阳性对照样。样品由1mM的TRAP6、1mM的PEG-TRAP6、1mM的PEG-甘氨酸、1mM的PVA-TRAP6和盐水组成。
如图8所示，未缀合的TRAP6(1mM)与盐水对照组相比导致了凝血时间(CT)和凝块形成时间(CFT)的显著降低。然而，当使用传统的NHS缀合方法将TRAP6缀合至PEG10k时，这种效果消失。也可以在PEG-甘氨酸缀合物对照组观察到类似的效果，表明聚合物主链和制备方法具有最小的影响。然而，通过光点击缀合法制备的PVA-TRAP6缀合物仍然可以显著缩短CT和CFT，表明保留了TRAP6的生物活性。总之，这些数据表明传统的NHS固定方法不能保留TRAP6的生物活性。相比之下，基于巯基-降冰片烯光点击缀合的共价固定方法可以保留TRAP6肽的几乎全部生物功能。
为了进一步证明PVA-TRAP6缀合物用于血小板活化的能力，我们在标准血小板聚集测定法(多板)和流式细胞术(FACS)中测试了样品。如图9A所示，在相同的肽浓度下，PVA-TRAP6的总血小板聚集面积与TRAP6的总血小板聚集面积相当，而PVA-NB底物对照组和盐水对照组呈现可忽略不计的血小板聚集水平。此外，FACS结果(图9B)证实，通过光点击缀合制备的PVA-TRAP6缀合物可以诱导血小板活化(即CD41/CD62P共表达)至与TRAP6对照组(1mM)非常相似的水平，而在PVA-NB和盐水对照组没有观察到显著的血小板活化。这些发现证明，我们的缀合方法确实可以保留TRAP6的生物活性，即使它被共价固定在PVA上时也是如此。
与用于肽固定的现有技术方法相比，本发明的方法基于特定的结合技术而不存在与N-或C-端或酸性或碱性氨基酸发生副反应的风险，通过使用例如生物正交反应，例如含半胱氨酸的TRAP6在PVA降冰片烯上的光点击缀合，其提供非常高的缀合效率(>95％)、位点特异性和模块化。相同的缀合方法也适用于带有降冰片烯基团的其他底物，例如天然来源的分子(明胶、透明质酸、藻酸盐等)和合成的类似物如PEG。另外，由于PVA底物(数百个重复单位)的大小远远大于短TRAP6序列，故结合聚合物的TRAP6缀合物通过PAR-1受体信号传导而被血细胞内化的可能性低于可溶性TRAP6肽。总而言之，本发明的将活化凝血酶受体的活化剂结合而保留活性(例如通过用于TRAP6肽固定的光点击缀合)的方法，为局部止血以及其他医学应用提供了显著的实用价值。
3.结论
在本工作中，我们开发了一种合成的止血体系，其可以有效地活化血小板并以局部化的方式加速止血。在这个体系中避免了高效的蛋白酶、凝血酶的使用。相反，通过高效巯基-降冰片烯光缀合，凝血酶受体激动剂肽(TRAP)在细胞相容性PVA水凝胶上共价工程化(covalently engineered)。本发明的TRAP6功能化方法也是可适用的，但不限于其他合成材料/水凝胶(如PEG)以及天然来源的水凝胶(如明胶和透明质酸)。从生物学观点来看，已知活化血小板释放血小板衍生生长因子(PDNF)，其调节细胞增殖并在血管形成(血管生成)中起重要作用。因此，我们预计这些血小板活化水凝胶基质是可通用的生物材料，其不仅用于安全止血，还潜在应用于组织再生和伤口愈合。
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序列表
<110> 巴克斯特国际公司(Baxter International Inc.)
<120> 止血材料
<140> PCT/EP2016/070619
<141> 2016-09-01
<150> EP 15183295.3
<151> 2015-09-01
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 1
Ser Phe Leu Leu Arg Asn
1 5
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 2
Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val
20
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 3
Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 4
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 5
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 6
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 7
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 8
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 9
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 10
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 11
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 12
Ser Leu Ile Gly Lys Val
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 13
Thr Phe Arg Gly Ala Pro
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 14
Gly Tyr Pro Gly Gln Val
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 来源于天然蛋白质的合成肽
<400> 15
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Cys
1 5

Claims (31)

1.止血材料，其中，凝血酶受体活化剂与生物相容性基质共价结合，并且，凝血酶受体活化剂在与生物相容性基质共价结合后具有凝血酶受体活化活性，所述生物相容性基质是烯基改性的合成的聚合物，所述凝血酶受体活化剂是具有生物正交基团的凝血酶受体活化肽TRAP；
所述止血材料包含由所述生物正交基团和所述烯基之间的巯基-降冰片烯光引发的点击化学反应产生的共价键。
2.根据权利要求1所述的止血材料，其中，所述合成的聚合物是聚乙烯醇、聚乙二醇或聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
3.根据权利要求1所述的止血材料，其中，所述凝血酶受体活化剂是TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、用于人PAR-2的SLIGKV、用于人PAR-3的TFRGAP、用于人PAR-4的GYPGQV或其酰胺化形式，以及其混合物。
4.根据权利要求1所述的止血材料，其中，所述基质为海绵、织造或非织造的织物、预成型的形状体、颗粒或颗粒状材料或片材。
5.根据权利要求4所述的止血材料，其中，所述预成型的形状体为用于拔牙的圆柱体或圆锥体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的止血材料，其中，所述基质包含聚乙烯醇。
7.制备权利要求1至6中任一项所述的止血材料的方法，其中，将凝血酶受体活化剂与生物相容性基质共价结合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述凝血酶受体活化剂是凝血酶受体活化肽TRAP或其酰胺化形式，以及其混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述凝血酶受体活化剂是TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、用于人PAR-2的SLIGKV、用于人PAR-3的TFRGAP、用于人PAR-4的GYPGQV或其酰胺化形式，以及其混合物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，将所述生物相容性基质用官能团活化，以结合所述凝血酶受体活化剂。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述凝血酶受体活化剂被活化。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述凝血酶受体活化剂用具有生物正交基团的肽序列活化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述生物正交基团为烯基、巯基、炔基、叠氮基、氢化叠氮基或肼。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述凝血酶受体活化剂用具有-SH基团的半胱氨酸部分活化。
15.根据权利要求7所述的方法，其中，所述生物相容性基质用烯基活化。
16.根据权利要求7所述的方法，其中，所述生物相容性基质用降冰片烯、马来酰亚胺、烯丙基、乙烯基酯、丙烯酸酯、碳酸乙烯酯或甲基丙烯酸酯活化。
17.根据权利要求7至16中任一项所述的方法，其中，所述共价结合通过光反应进行。
18.根据权利要求7至16中任一项所述的方法，其中，所述共价结合通过光触发点击化学进行。
19.根据权利要求7至16中任一项所述的方法，其中，所述共价结合通过巯基-降冰片烯光点击化学进行。
20.权利要求1至6中任一项所述的止血材料在制备用于治疗损伤和/或创伤的试剂盒中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述试剂盒用于手术。
22.试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
-权利要求1至6中任一项所述的止血材料，和
-至少一种给药装置。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于治疗损伤和/或创伤。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于手术。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中，所述给药装置选自：注射器、试管、导管、钳子、剪刀、消毒垫或洗剂。
26.根据权利要求22所述的试剂盒，其中，所述给药装置是缓冲溶液。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中，所述缓冲溶液为含有Ca2+离子的缓冲溶液。
28.根据权利要求26或27所述的试剂盒，其中，所述缓冲溶液还包含选自以下物质的组分：抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂、生长因子、维生素、细胞，或其混合物。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述抗纤维蛋白溶解剂为抑肽酶。
30.根据权利要求22所述的试剂盒，还包括具有选自以下物质的组分的容器：抗菌剂、凝固活性剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗纤维蛋白溶解剂、生长因子、维生素、细胞，或其混合物。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，所述抗纤维蛋白溶解剂为抑肽酶。
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