KR102641229B1 - 지혈 물질 - Google Patents
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Abstract
트롬빈 수용체 활성화제가 생체적합성 매트릭스에 공유적으로 커플링되어 있는 지혈 물질이 개시된다.
Description
본 발명은 지혈 물질 및 이러한 물질을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
비제어된 출혈은 여전히 외상적 및 외과적 손상에서 사망의 주된 원인이다.[1] 따라서, 출혈을 제어하기 위한 효과적인 치료 접근법을 개발하는 것은 무엇보다 중요한 임상적 및 사회적 가치이다. 지난 수십년 간, 피브린-기재 접착제 또는 밀봉제,[3 a,b] 제올라이트 분말,[4 a,b] 가교된 젤라틴 매트릭스[5 a,b] 등을 비롯한 다수의 지혈 제품[2]이 개발되었다. 그러나, 이들 제품 각각은 그의 각각의 한계를 갖는다. 피브린 제품은 높은 비용, 짧은 저장-수명 및 약한 기계적 강도라는 문제가 있다.[6] 제올라이트 광물은 심각한 화상을 유발하는 경향이 있으며, 분해가능하지 않다.[6] 가교된 젤라틴 매트릭스는 고용량의 트롬빈과 조합되는 경우에만 수 분 내에 출혈을 정지시킬 수 있다.[7] 그러나, 트롬빈은 자가단백질분해로 인해 용액에서 불안정하다. 고도로 농축된 트롬빈은 인간 각질형성세포의 아폽토시스를 유도하는 것으로 공지되어 있으며, 상처 치유에서 손상을 유발할 수 있다.[8] 따라서, 개선된 안전성을 갖는 대안적인 지혈 물질을 설계할 강한 필요가 존재한다. 특히, 고도로 농축된 트롬빈의 사용을 회피하는 효과적인 전략을 설계하는 것은 바람직한 해결책이다.
트롬빈은 혈액 응고 (응고)에서 중요한 역할을 하는 세린 프로테아제이다.[9 a,b] 핵심적인 응고 프로테아제로서, 트롬빈은 가용성 피브리노겐을 트랜스글루타미나제 (FXIII)에 의해 가교된 피브린 망상체로 전환시킨다.[10] 또한, 트롬빈은 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)를 자극함으로써 혈소판의 가장 강력한 활성화제이다.[11, 12] 트롬빈에 의한 활성화 시, 혈소판은 GP IIb/IIIa 수용체의 형태를 물리적으로 변경시키고, 피브리노겐에 대한 고-활성 결합 부위를 제공하여, 피브리노겐-가교된 혈소판 응집을 제공한다. PAR-1 및 PAR-4 둘 다는 인간 혈소판 상에 존재하지만, 트롬빈에 의한 인간 혈소판의 활성화는 주로 PAR-1에 의해 매개된다.[13] 트롬빈에 의한 PAR-1 활성화의 분자 메커니즘을 도 7a에 나타낸다. PAR-1은 혈소판에서 고도로 발현되며,[14 a, b] PAR-1 활성화는 트롬빈에 의한 PAR-1 수용체의 세포외 N-말단 도메인의 일부의 단백질분해성 절단에 의해 개시된다. 단백질분해는 세포외 루프 2 내의 수용체와 상호작용하는 새로운 N-말단 리간드 도메인 (SFLLRN (서열식별번호: 1), 트롬빈 수용체 효능제 펩티드-6, TRAP6으로 공지됨)을 생성하며, PAR-1 활성화의 신호전달 경로를 촉발시킨다. 짧은 TRAP6 펩티드 (SFLLRN)는 별개로 강력한 혈소판 활성화제로서 작용할 수 있으며, PAR-1 신호전달을 통해 혈소판 응집을 자극한다.[15] 멀티플레이트 (Multiplate)® TRAP 시험은 TRAP6에 의해 촉발된 혈소판 기능의 정량적 측정을 위한 전혈에서의 또는 혈소판 풍부 혈장에서의 표준 시험관내 검정이 되었다. TRAP 시험은 샘플에서 트롬빈 억제제의 사용 때문에, 그렇지 않다면, 트롬빈이 효능제인 경우 발생하는 피브린 형성을 촉발시키지 않고 PAR-1 신호전달을 통해 활성화된 혈소판 기능의 분석을 허용한다.
WO 96/40033 A1에는 지혈제가 매트릭스 상에 물리적으로 (그러나 공유적으로는 아님) 흡착된 매트릭스를 얻도록, 지혈제가 지혈 매트릭스 상에 분무되거나 코팅된, 엡실론 아미노카프로산 및 트롬빈 수용체 활성화 펩티드를 포함하는 지혈제를 갖는 지혈 물질이 개시되어 있다. 이러한 패치는 그에 제공된 지혈제가 환자의 출혈 부위에 접촉하는 경우 패치로부터 쉽게 방출된다는 단점을 갖는다. 따라서, 특히 순환에서 순환하는 길항제가 없기 때문에, 전신적 혈전증 사건을 유도할 잠재적인 위험이 있다.
WO 03/057072 A2에는 셀룰로스 및 그에 공유적으로 연결된 폴리사카라이드를 포함하는 지혈 조성물이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 출혈을 제어하기 위한 트롬빈 수용체 활성화제를 갖는 개선된 지혈 물질을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 트롬빈 수용체 활성화제가 생체적합성 매트릭스에 공유적으로 커플링되어 있는 지혈 물질을 제공한다.
본 발명으로, 트롬빈 수용체 활성화제가 이를 필요로 하는 인간 환자에의 투여에 적합한 개선된 지혈 물질을 얻도록 생체적합성 매트릭스 상에 공유적으로 고정화될 수 있음이 최초로 제시된다. 바람직한 실시양태로서, 합성 히드로겔 매트릭스 (예를 들어 폴리비닐 알콜 기재 중합체)에의 TRAP6, TRAP7 또는 TRAP8의 공유 커플링은 특히 유도된 혈소판 응집을 통해 개선된 지혈을 가능하게 하도록, 상당한 기간에 걸쳐 안전하고 국소화된 방식으로 혈소판 활성화에 대한 활성을 유지하는 적합한 지혈 물질을 초래하였다.
본 발명에 따른 생체적합성 매트릭스는 인간 환자에게 투여되기 위해, 특히 인간 환자의 부피성 결함 (예를 들어 기관에서)의 상처 피복 또는 충전을 위해 사용가능한 임의의 매트릭스일 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 목적을 위해 종래 기술에서 제안되었던 매트릭스 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, "생체적합성" 매트릭스는 인간 환자에게 투여될 수 있으며, 이 투여의 과정에서 부정적인 효과를 유도하고 환자와 접촉하지 않는 매트릭스이다. "생체적합성" 매트릭스는 살아있는 조직 (예를 들어 상처에서 표면에 노출되는 인간 조직)을 위협하거나, 피독시키거나, 방해하거나, 유해하게 영향을 미치는 물질 또는 구성성분을 함유하지 않는 매트릭스이다. 이러한 매트릭스에 대한 예는 "고전적인" 상처 피복, 예컨대 패치, 스폰지, 뿐만 아니라 유동성 또는 분무가능한 매트릭스, 분말 등, 예컨대 플로실 (FloSeal)™ (가교된 젤라틴 매트릭스), 서지플로 (Surgiflo)™ (소 젤라틴 페이스트)이다. 패치는 일반적인 상처 피복에 유리한 반면, 가장 현저하게 유동성 매트릭스인 비-물질 지혈약은 액체/고체 접근법과는 반대로 동일한 상 내에서 전달될 수 있거나, 공동을 가요성 있게 충전하거나 가요성 스캐폴드 ("부피성 결함")를 제공하는데 사용될 수 있다. 매트릭스는 트롬빈 수용체 활성화제가 본 발명에 따른 매트릭스에 공유적으로 커플링될 수 있도록 화학적으로 활성이거나 화학적으로 활성화되어야 한다. 예를 들어, 매트릭스는 매트릭스에의 트롬빈 수용체 활성화제의 공유 부착을 허용하는 히드록실 기, 비닐 기, 카르복실 기, 또는 아미노 기를 가질 수 있다.
바람직하게는, 매트릭스는 지혈 매트릭스, 즉, 이미 지혈 특성을 갖는 매트릭스 물질이다. 이러한 물질은 관련 기술분야에서 널리 이용가능하며, 예를 들어 콜라겐, 젤라틴 또는 키토산을 포함한다.
바람직한 생체적합성 매트릭스는 생체물질, 바람직하게는 단백질, 생체중합체 또는 폴리사카라이드 매트릭스, 특히 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 전분 또는 키토산 매트릭스; 및 합성 중합체, 바람직하게는 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 매트릭스는 생체분해성이며, 즉, 이는 일정 시간 후에 환자의 신체에 의해 자연적으로 흡수된다. 어떻든, 물질 (매트릭스를 포함함)은 생체적합성이어야 하며, 즉, 물질이 투여되는 환자에게 유해한 효과를 갖지 않아야 한다. 이러한 생체분해성 물질은 구체적으로 지혈이 신체 내부에서, 즉, 수술의 과정에서 달성되고, 부위가 수술 후에 닫히는 상황에서 적합하다.
따라서, 매트릭스는 바람직하게는 생체중합체, 예컨대 단백질, 또는 폴리사카라이드로부터 선택되는 생체물질이다. 특히 바람직한 것은 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 폴리사카라이드, 예를 들어 히알루론산, 키토산, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체물질이고, 보다 바람직한 것은 콜라겐 및 키토산이고, 특히 바람직한 것은 콜라겐이다. 본 발명에 사용되는 이러한 콜라겐 매트릭스는 다공성 또는 섬유성 매트릭스 뿐만 아니라 입자로 프로세싱될 수 있는 액체, 페이스트성, 섬유성 또는 분말성 콜라겐성 물질로부터의 물질을 비롯한, 겔을 형성하기에 적합한 임의의 콜라겐으로부터 유래될 수 있다. 스폰지 또는 시트의 생성을 위한 콜라겐 겔의 제조는 겔 형성이 일어날 때까지 산성화 및 후속의 pH 중화를 포함할 수 있다. 겔 형성 능력 또는 용해도를 개선시키기 위해, 콜라겐은, 건조되는 경우 안정한 스폰지 또는 시트를 형성하는 특성이 감소되지 않는 한, (부분적으로) 가수분해되거나 변형될 수 있다. 트롬빈 수용체 활성화제를 커플링시키는데 사용되는 매트릭스는 생체중합체, 즉, 천연 발생 중합체 또는 그의 유도체일 수 있거나, 합성 중합체일 수 있다. 본 발명에 따른 지혈 물질에서 유용한 생체중합체의 예는 폴리펩티드, 예컨대 콜라겐, 콜라겐 유도체, 예컨대 젤라틴, 엘라스틴, 및 엘라스틴 유도체, 및 폴리사카라이드, 예컨대 히알루론산, 전분, 셀룰로스, 또는 그의 유도체, 예를 들어, 산화된 셀룰로스를 포함한다. 바람직하게는, 생체중합체는 인간 생체중합체이며, 이는 개체로부터 단리될 수 있거나, 합성 생체중합체, 예를 들어, 재조합적으로 생성된 생체중합체일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 매트릭스는 재조합 인간 중합체를 포함한다. 특히, 재조합 인간 중합체는 재조합 인간 콜라겐, 예컨대, 예를 들어, 재조합 인간 콜라겐 유형 I, 재조합 인간 콜라겐 유형 III, 또는 이들의 조합일 수 있다. 한 실시양태에서, 매트릭스는 재조합 인간 콜라겐 유형 III을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 매트릭스는 재조합 인간 콜라겐 유형 I을 포함한다. 예를 들어, 재조합 인간 젤라틴은 재조합 인간 콜라겐 유형 III으로부터 유래될 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 매트릭스는 재조합 인간 콜라겐 유형 I로부터 유래된 재조합 젤라틴을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 매트릭스는 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 직접적으로 생성되는 재조합 젤라틴을 포함한다.
본 발명에서 매트릭스로서 사용되는 폴리사카라이드는 바람직하게는 셀룰로스, 알킬 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 알킬히드록시알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 술페이트, 카르복시메틸 셀룰로스의 염, 카르복시메틸 셀룰로스, 카르복시에틸 셀룰로스, 키틴, 카르복시메틸 키틴, 히알루론산, 히알루론산의 염, 알기네이트, 알긴산, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 글리코겐, 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 쿠르들란, 펙틴, 풀루란, 크산탄, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 카르복시메틸 덱스트란, 카르복시메틸 키토산, 키토산, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파란, 헤파란 술페이트, 더마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 카라게난, 키토산, 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 폴리-N-글루코스아민, 폴리만누론산, 폴리글루쿠론산, 폴리굴루론산, 상기 폴리사카라이드의 유도체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 매트릭스는 또한 합성 중합체에 기재할 수 있다. 합성 흡수성 중합체는 지방족 폴리에스테르 중합체, 지방족 폴리에스테르 공중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 매트릭스는 또한 섬유로 제조된 직조물 또는 부직물의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 섬유는 바람직하게는 생체적합성 및/또는 생체분해성 물질로 제조된다. 다수의 이러한 섬유는 지혈 직물을 제공하기 위해 지금까지 사용되었다. 일부 실시양태에서, 이러한 부직 또는 직조 섬유는 1종 이상의 폴리사카라이드, 예컨대 펙틴, 아세틸화된 펙틴, 히알루론산 및 그의 유도체 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펙틴 및/또는 아세틸화된 펙틴은 사탕무로부터 유래될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 비-셀룰로스성 폴리사카라이드일 수 있다. 직조 또는 부직 섬유는 또한 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(t-카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리카프로락톤, 폴리(3-히드록시부티르산), 폴리(3-히드록시부티르산-코-3-히드록시 발레르산), 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브리노겐, 엘라스틴, 폴리에테르, 폴리무수물, 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리트리메틸렌 카르보네이트 등을 비롯한 다른 생체분해성 중합체를 포함하는 섬유를 포함할 수 있다. 또한, 천연 단백질 섬유, 예컨대 면, 견 및 모가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 매트릭스 물질은 바람직하게는 유동성 지혈약용 분말 또는 매트릭스를 비롯한 다양한 형태의 과립으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 과립은 1 내지 1,000 μm, 바람직하게는 10 내지 1,000 μm, 특히 200 내지 800 μm의 (중위 입자) 크기를 가질 수 있다. 유동성 지혈약으로서 적합한 매트릭스는 예를 들어 WO 98/08550 A 또는 WO 2003/007845 A에 개시되어 있다.
구체적으로 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명은 폴리비닐 알콜 (PVA)을 매트릭스 물질로서 사용한다. PVA는 폴리비닐 아세테이트의 부분적 가수분해로부터 기원한 수용성 중합체이다. 본 발명에 따른 매트릭스로서 사용되는 PVA-기재 히드로겔은 그들의 우수한 생체적합성 (FDA-승인됨) 때문에 조직 조작 및 약물 전달 시스템에서 폭넓게 사용되었다.[16 a,b] 또한, PVA 히드로겔은 대부분의 다른 합성 히드로겔보다 독특하게 더 강한 것으로 널리 공지되어 있다.
본 발명은 지혈적으로 적합한 매트릭스에 공유적으로 결합된 트롬빈 수용체 활성화제를 사용한다. 트롬빈 수용체 활성화제의 바람직한 실시양태는 트롬빈 수용체 활성화 펩티드 (TRAP)이다. TRAP는 트롬빈 수용체의 새로운 N-말단 영역에 상응하는 다양한 아미노산 길이의 펩티드의 패밀리이다. 이들 합성 또는 재조합 펩티드는 트롬빈 수용체 단백질의 세포외 부분의 활성화된 형태를 모방하며, 트롬빈 효능제로서 기능한다.
US 5,256,766 A 및 WO 96/40033 A1에는 예를 들어, 혈우병환자의 내부 출혈 부위에서의 국소화된 적용에서, 혈액 응고를 장려하는데 유용한 것으로서 TRAP 또는 "효능제"를 함유하는 제약 화합물 및 지혈 패치가 기재되어 있다. 효능제는 섬유모세포 증식, 및 부수적으로 혈소판 응집을 자극하는 트롬빈의 능력을 모방하는 것으로서 개시되어 있다. 따라서, TRAP는 지혈 및 상처 치유를 촉진시키는데 유용할 수 있다. TRAP의 사용으로, 생물학적 화합물, 예컨대 트롬빈 및 피브리노겐, 및 바이러스 오염의 수반되는 위험이 완전히 없을 수 있는 효과적인 지혈 물질 및 지혈 붕대가 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 물질 내로 혼입될 수 있는 대표적인 TRAP는 트롬빈 수용체를 활성화시킬 수 있는 펩티드, 예컨대 US 5,256,766 A에서 화학식 AAx --AAy --(AAi)n--z에 의해 확인되는 효능제를 포함한다.
섬유모세포를 활성화시키며, 상처 치유에 관여하는 것으로 개시된 다른 TRAP는 펩티드 TRAP 508-530, 아미노산 AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV (서열식별번호: 2); 및 TRAP 517-530, 아미노산 RGDACEGDSGGPFV (서열식별번호: 3)를 포함한다. 추가의 적합한 TRAP는 문헌 [Carney et al. J. Clin Invest. 89:14691477 (1992)]; [Furman et al. PNAS 95 (1998), 3082-3087] 및 [Cromack et al., J. Surg. Res.53: 117 (1992)]에 의해 개시되어 있다. 따라서, 본 발명에서 유용한 적합한 TRAP는 예를 들어, 펩티드 SFLLRNPNDKYEPF (서열식별번호: 4), SFLLRNPNDKYEP (서열식별번호: 5), SFLLRNPNDKYE (서열식별번호: 6), SFLLRNPNDKY (서열식별번호: 7), SFLLRNPNDK (서열식별번호: 8), SFLLRNPND (서열식별번호: 9), SFLLRNPN (TRAP8 (서열식별번호: 10)), SFLLRNP (TRAP7 (서열식별번호: 11)), SFLLRN (TRAP6), SFLLR, SFLL, 및 SFL, 및 그의 아미드화된 형태를 포함한다. TRAP는 작은 펩티드이기 때문에, 이들은 큰 단백질성 혈소판 활성화제, 예컨대 트롬빈보다 더 안정하다. TRAP의 안정성은 이를 냉장 없이 저장되도록 허용하는 본 물질의 특성에 기여한다.
바람직하게는, 트롬빈 수용체 활성화제 (바람직하게는 TRAP)는 TRAP를 매트릭스에 공유적으로 커플링시키도록 링커가 제공된다. 바람직한 링커는 아미노산 (단일 아미노산, 예컨대 시스테인, 아르기닌, 리신, 세린, 글리신 등 (바람직하게는 시스테인)), 또는 바람직하게는 시스테인, 아르기닌, 리신, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 글리신의 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는, 예를 들어 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 짧은 아미노산 링커이다. 바람직한 디펩티드성 링커는 Cys-Gly- (말단 "-"는 트롬빈 수용체 활성화제에의 결합을 지시함), -Gly-Cys, Cys-Arg-, -Arg-Cys, -Asn-Cys, Cys-Asn-, -Pro-Cys, Cys-Pro-일 수 있고; 바람직한 트리펩티드성 링커는 Cys-Gly-Gly-, -Gly-Gly-Cys, -Pro-Asn-Cys, Cys-Asn-Pro-, Cys-Pro-Asn-, -Asn-Pro-Cys 등, 또는 담체 또는 매트릭스에의 제약 펩티드 커플링에 대해 공지된 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 다른 펩티드성 링커일 수 있다.
구체적으로 바람직한 실시양태에 따르면, 본 물질의 트롬빈 수용체 활성화제는 트롬빈 수용체 활성화 펩티드 (TRAP), 바람직하게는 TRAP8, TRAP7, TRAP6, TRAP1-41, SLIGKV (PAR-2 (인간)에 대해 (서열식별번호:12)), TFRGAP (PAR-3 (인간)에 대해 (서열식별번호:13)), GYPGQV (PAR-4 (인간)에 대해 (서열식별번호:14)), 또는 그의 아미드화된 형태, 뿐만 아니라 이러한 작용제의 혼합물이다.
본 발명에 따른 지혈 물질은 지혈 물질을 필요로 하는 인간 환자의 치료에 사용가능한 임의의 적합한 형태를, 즉, 유동성 또는 분무가능한 형태로서; 2-차원 형태로서 (제3 차원 확장이 다른 2개의 차원과 비교하여 필적하게 작은 (예를 들어 1/10 또는 1/20 미만) 경우); 또는 3-차원 형태로서 (예를 들어 스폰지, 페이스트, 공동 삽입물 등) 가질 수 있다. 본 발명에 따른 물질의 바람직한 2- 또는 3-차원 실시양태는 예를 들어, 스폰지, 직물 또는 부직물, 바람직하게는 원통 또는 원뿔로서 (예를 들어 발치용) 또는 가요성 또는 비-가요성 스캐폴드로서 사용되는 것으로서 미리 형성된 형상, 미립자 또는 과립 물질 또는 시트일 수 있다. 일단 물질이 상처에 적용되어 혈소판 응집을 달성하면 상처로부터 추가의 혈액 응고 구성성분을 유인하도록 매트릭스가 상처로부터 유체를 흡수할 수 있는 경우가 구체적으로 바람직하다. 더욱이, 물질은 바람직하게는 가요성이며, 다양한 형상으로 다양한 조직 및 위치에 적용되기에 적합하다.
본 발명에 따른 지혈 물질의 추가의 바람직한 실시양태는 추가의 성분, 예컨대 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 예컨대 아프로티닌 또는 ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포 등을 포함한다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 물질은, 물질이 지혈 물질의 저장가능성 또는 투여에 부정적인 영향을 가질 수 있는 구성성분이 없다면, 이러한 추가의 성분을 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 본 지혈 물질은 바람직하게는 임의의 단백질 분해 활성이 본질적으로 없고, 특히 프로테아제 활성이 없고, 구체적으로 트롬빈 활성이 없다. 트롬빈은 피브린 절단 및 응고물 형성을 촉진시키기 위해 지혈 물질에 빈번히 첨가되지만; 그러나, 이는 또한 지혈 물질에 대해 단백질분해성일 수 있으며, 이는 특히 이러한 물질의 생성 및 저장 동안 원하지 않을 수 있다. 본 발명으로, 트롬빈 또는 필적하는 구성성분의 첨가 또는 존재는 요구되지 않으며, 따라서, 지혈 물질의 지혈 특성에 부정적인 영향 없이 생략될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 지혈 물질은 이것이 액체 물질, 예컨대 혈액을 빨아들일 수 있는 상태로 제공된다. 혈액 (및 응고물 형성, 출혈 종결 및 상처 폐쇄를 촉진시키는 그 안의 구성성분)을 빨아들이는 능력은 지혈 물질의 전반적인 효능을 상당히 향상시킨다. 예를 들어, 본 발명에 따른 지혈 물질은 물질이 추가의 액체 물질을 흡수하는 것을 여전히 허용하는 (즉, 여전히 그의 빨아들이는 능력 하에 있는 양으로 액체로 빨아들여지는) 건조 형태로 또는 습윤 형태로 제공된다. 이는 예를 들어 적용되는 물질의 확대된 부피로 또는 전체 (또는 사실상 전체) 부피로 상처 폐쇄 과정에서 유용한 혈액 구성성분을 제공하도록, 혈액 진입 및/또는 지혈 물질을 통한 통과를 허용한다.
추가의 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 지혈 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 지혈 물질을 제조하는 방법은 트롬빈 수용체 활성화제를 지혈 매트릭스에 공유적으로 커플링시키는 단계를 특징으로 한다.
바람직하게는, 트롬빈 수용체 활성화제는 트롬빈 수용체 활성화 펩티드 (TRAP), 바람직하게는 TRAP8, TRAP7, TRAP6, TRAP1-41, SLIGKV (PAR-2 (인간)에 대해), TFRGAP (PAR-3 (인간)에 대해), GYPGQV (PAR-4 (인간)에 대해), 또는 그의 아미드화된 형태, 뿐만 아니라 이들 작용제의 혼합물이다.
물론, 트롬빈 수용체 활성화제는 생체적합성 매트릭스에 공유 커플링된 후 그의 트롬빈 수용체 활성화 활성을 유지하는 것이 본 발명에 중요하다. 어떠한 생체분자도 생체적합성 표면에 단순히 결합하고, 여전히 그의 생체-기능성을 보유할 수 없다. 본 발명을 생성하는 과정에서, 본 발명에 따른 트롬빈 수용체 활성화제 (예를 들어 TRAP6 펩티드)의 C- 또는 N-말단을 공유적으로 커플링시키는 통상적인 결합 기술의 사용은 통상적으로 상기 생활성의 소실을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 정말 트롬빈 수용체 활성화제 (펩티드임)의 완전한 생체-기능성을 보유하는 공유 고정화 접근법의 제공은 사소하지 않으며, 본원에 함유된 이러한 기능적 실시양태를 얻기 위한 개시내용에 의존할 필요가 있다.
예를 들어, 펩티드에 대한 전통적인 커플링 기술, 예컨대 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; C-말단의 반응, Asp 및 Glu) 또는 NHS (N-히드록시숙신이미드; N-말단의 반응, Lys)를 사용하는 것들의 사용은 활성 고정화된 트롬빈 수용체 활성화제를 초래하지 않았다 (이들은 통상적으로 비-특이적이고, 산성 아미노산 또는 리신과의 부반응, N-말단에 의존하는 펩티드의 불활성화에의 경향 등이 있기 때문에 [29],[30],[31]). 시스테인 및/또는 마이클 첨가를 사용하는 기술은 또한 아민 기와의 가능한 부반응으로 인해 기능의 소실의 위험을 갖는다[32]. 따라서, 이러한 전통적인 커플링 기술은 활성의 소실을 초래한다. 펩티드 고정화에 대한 다양한 화학적 접근법이 보고되었지만[34], 이들 방법의 대부분은 C-말단에서 카르복실 기와의 (예를 들어 EDC)[29], 또는 N-말단에서 1차 아민과의 (예를 들어 NHS) [30],[31], 또는 말레이미드 또는 비닐 술폰 기에 기재한 마이클-첨가를 통한 시스테인 잔기와의[32] 반응에 의존한다. 불행하게도, 대부분의 보고된 반응은 비-특이적이며, 펩티드 활성의 바람직하지 않은 소실을 유도하는 산성/염기성 아미노산 (EDC/NHS에 대해)과의 또는 아민 기 (마이클 반응에 대해)와의 부반응에의 경향이 있다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 접합은 펩티드의 N-말단과의 반응을 통해 중합체 기질 상으로 생활성 펩티드 (예를 들어 세포-부착성 RGD)를 공유적으로 고정화하는 가장 자주 사용되는 접근법이다[35]. 1차 아민은 NHS 에스테르에 대해 가장 반응성 기이지만, 최근의 연구는 다른 펩티드 잔기 (예를 들어 티로신에 대해 -OH, 아르기닌에 대해 세린, 트레오닌, 구아니디늄)와의 일련의 부반응이 일어날 수 있음을 입증하였다[30],[31]. 더욱이, TRAP (SFLLRN-)의 구조-기능 관계에 대한 이전의 연구는 펩티드 활성을 유지하기 위한 N-말단에서의 아미노산의 중요성을 강조하였다[36]. 이들 고려사항을 염두에 두고, 그의 생활성을 보유하기 위해 트롬빈 수용체 활성화제 (펩티드, 예컨대 TRAP6임)의 N-말단과의 부반응을 회피하는 펩티드 고정화 접근법을 개발하는 것이 본 발명에 중요함이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 보유된 활성을 갖는 고정화된 형태의 트롬빈 수용체 활성화 활성제를 제공한다. 이는 펩티드 고정화에 대한 통상적인 최신 접근법에 의해 제공되는 것이 실현가능하지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 예를 들어 생물직교 반응, 예컨대 매우 높은 정도의 접합 효율 (>95%), 부위-특이성 및 모듈성을 제공하는, PVA 노르보르넨 상으로의 시스테인-함유 TRAP6의 광-클릭 접합을 사용함으로써 N- 또는 C-말단 또는 산성 또는 염기성 아미노산과의 부반응의 위험이 없는 특정 커플링 기술 (상기 언급됨)의 선택을 제공한다. 동일한 접합 접근법은 또한 노르보르넨 기를 갖는 다른 기질, 예컨대 천연-유래된 분자 (젤라틴, 히알루로난, 알기네이트 등) 및 합성 유사체, 예컨대 PEG에 대해 적용가능함이 명백하다. 또한, 중합체-결합된 트롬빈 수용체 활성화 활성 펩티드 접합체는 PAR-1 수용체 신호전달을 통한 그의 가용성 형태보다 혈액 세포에 의해 내재화될 가능성이 더 낮은데, 이는 본 발명에 대한 생체적합성 고체 매트릭스로서 적용되는 중합체 기질, 예컨대 PVA 기질 (수백개의 반복 유닛)의 크기가 짧은 TRAP6 서열보다 훨씬 더 크기 때문이다. 모두 합쳐, 생체적합성 고체 매트릭스에 대한 보유된 활성을 갖는 트롬빈 수용체 활성화 활성제의 커플링을 사용한 (예를 들어 TRAP6 펩티드 고정화를 위한 광-클릭 접합에 의한) 본 발명에 따른 접근법은 국소 지혈 뿐만 아니라 다른 의학적 적용을 위한 상당한 실제적 가치를 제공한다.
이 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 지혈 매트릭스는 화학기 (예를 들어, 알켄, 술프히드릴, 알킨, 아지도, 히드로아지드, 히드라진), 바람직하게는 생물직교 반응 (예를 들어, 티올-엔 첨가, 알킨-아지드 고리첨가, 디엘스-알더 반응, 히드라지드-히드라진 반응)을 통해 트롬빈 수용체 활성화제의 고-효율 공유 결합을 허용하는 기로 관능화된다.
바람직하게는, 트롬빈 수용체 활성화제는 생물직교 기 (예를 들어, 알켄, 술프히드릴, 알킨, 아지도, 히드로아지드, 히드라진)로, 특히 -SH 기를 갖는 시스테인 모이어티로 조작된 펩티드 서열로 변형된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 지혈 물질은 엔 기, 예컨대 노르보르넨, 말레이미드, 알릴, 비닐 에스테르, 아크릴레이트, 비닐 카르보네이트, 메타크릴레이트 등으로 관능화된다.
본 방법의 구체적으로 유리한 실시양태에 따르면, 화학적 커플링은 광-유도된 반응에 의해, 특히 라디칼-매개된 티올-(노르보른-)엔 광-클릭 화학 ([18a]에서 검토됨) 또는 (다른) 광-촉발된 클릭 화학 ([18b]에서 검토됨)에 의해 수행된다.
본 지혈 물질은 본 분야에서 수행되는 통상적인 단계에 의해, 예를 들어 적절한 멸균 및 패키징 단계에 의해 시판품으로서 마무리될 수 있다. 예를 들어, 본 물질은 UV/가시광 조사 (200 내지 500 nm)에 의해, 바람직하게는 상이한 흡수 파장을 갖는 광개시제 (예를 들어 이르가큐어 (Irgacure) 184, 2959), 바람직하게는 수용성 개시제 (이르가큐어 2959)의 도움으로 처리될 수 있다. 이러한 조사는 통상적으로 1 내지 60분의 조사 시간 동안 수행되지만, 또한 구체적인 방법에 따라 보다 긴 조사 시간이 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 물질은 마지막으로, 사용 시까지 멸균성을 보유하도록 멸균-포장되고, 적합한 용기 (박스 등) 내로 패키징될 수 있다 (예를 들어 구체적인 제품 정보 리플렛의 첨가에 의해).
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 수술에 및/또는 손상 및/또는 상처의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 지혈 물질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지혈 물질은 구체적으로 혈소판-유래된 성장 인자의 방출을 증가시키고, 상처 치유를 가속화하는데 적합하고 효과적이다.
이는 본 발명에 따른 지혈 물질을 문합의 밀봉에, 봉합선 밀봉에, 및 절제 부위에서 지혈을 보호하는데 탁월한 도구로 만든다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명에 따른 지혈 물질은 또한 환자에의 물질의 투여에 필요한 다른 구성성분과 조합된 키트 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 지혈 물질이 유동성 건조 형태로 (예를 들어 과립으로서 또는 분말로서) 또는 유동성 페이스트로서 제공될 수 있는 경우, 이러한 물질을 환자에의 투여 직전에 첨가될 수 있는 적합한 버퍼 용액과 함께 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 버퍼 용액은 통상적으로 (버퍼 구성성분, 예컨대 포스페이트, 카르보네이트, TRIS 등 버퍼 시스템 외에) 2가 금속 이온, 바람직하게는 Ca2+ 이온, 또는 다른 기능적 구성성분 (매트릭스 상에 또는 내에 이미 존재하지 않는 경우), 예컨대 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 예컨대 아프로티닌 또는 ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포 등을 함유한다. 키트는 지혈 물질을 투여하거나 준비 투여하기 위한 수단, 예컨대 시린지, 튜브, 카테터, 겸자, 가위, 멸균 패드 또는 로션 등을 추가로 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는, 바람직하게는 수술에 및/또는 손상 및/또는 상처의 치료에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다:
- 본 발명에 따른 지혈 물질 및
- 바람직하게는, 버퍼 용액, 특히 Ca2+ 이온을 함유하는 버퍼 용액, 시린지, 튜브, 카테터, 겸자, 가위, 멸균 패드 또는 로션의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 투여 디바이스.
바람직하게는, 버퍼 용액은 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 특히 아프로티닌 또는 ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 구성성분을 추가로 포함한다. 대안적으로, 키트는 또한 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 특히 아프로티닌 또는 ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 구성성분을 갖는 용기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시하지만, 그에 제한되지 않는다.
도 1은 하기를 제시한다: (a) PVA-NB 및 PVA-TRAP6의 합성 반응식 (무수 DMSO 중에서 50 ℃에서 12시간 동안 반응, TsOH: p-톨루엔술폰산, I2959: 이르가큐어 2959, 즉, 통상적으로 사용되는 수용성 PI의 것); (b) PVA, PVA-NB 및 PVA-TRAP6 접합체의 1H-NMR (D2O) 스펙트럼; 및 MTT 검정 (n>3)에 의해 조사된 다양한 중합체 농도 (1%, 0.5%, 및 0.1%)를 갖는 PVA-NB (c) 및 PVA-TRAP6 용액 (d)에의 24/48시간 노출 후의 C2C12 세포의 정규화된 생존율.
도 2는 하기를 제시한다: (a)-(c) 조사된 물질에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스의 ROTEM 특징화 (CT: 초로서의 응고 시간, 즉, 응고물이 2 mm의 견고도에 도달할 때까지의 잠복기; MCF: mm로서의 최대 응고물 견고도). (a) TRAP6 (0.1 mM), PVA-TRAP6 (0.1 mM TRAP6-), PVA-NB, 및 0.9% NaCl 대조군에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스를 제시하는 플롯팅된 ROTEM 곡선; (b) CT에 대한 다양한 투여량 (0.01, 0.1, 1 mM)에서의 비접합된- 및 접합된-TRAP6 (PVA-TRAP6)의 영향; 및 (c) 최적 TRAP6- 농도 (0.1 mM)에서의 TRAP6, PVA-TRAP6, 및 PVA-NB 사이의 CT에 대한 비교 분석. (d) TRAP6 (0.1 mM), PVA-TRAP6 (0.1 mM TRAP6), 및 PVA-NB에 대한 반응으로 혈소판 기능의 멀티플레이트 분석; 각각의 측정은 이중으로 수행하였음. (e) 멀티플레이트: 유닛으로서의 응집 면적에 있어서의 핵심적 파라미터의 비교.
도 3은 하기를 제시한다: (a) 15분 인큐베이션 후의 CD62p/CD42 공동-발현의 측정에 의해 측정된 TRAP6-매개된 혈소판 활성화의 FACS 분석. 실험은 이중으로 실행하였으며, 데이터는 CD62p 및 CD41 에피토프 둘 다에 대해 양성인 혈소판의 백분율 ±SD로서 제시됨. (b) 특이적 CD41 PE 및 CD62p APC 항체로 염색된 샘플의 값을 제시하는 히스토그램 플롯. (c) 15분 인큐베이션 후의 TRAP6 처리된 샘플, PVA-TRAP6 처리된 샘플, 및 PVA-NB 처리된 대조군의 CD62p 및 CD41의 발현에 대한 대표적인 도트-플롯.
도 4는 하기를 제시한다: (a) 라디칼-매개된 광-클릭 화학을 통한 PVA-NB의 디티오트레이톨 (DTT)과의 UV-광가교에 의한 PVA-NB 히드로겔의 제조를 제시하는 개략도. (b) 계내 진동형 광-유동측정법을 사용한 다양한 티올-대-NB 비 (0.4, 0.8, 1.0 및 1.2)를 갖는 PVA 히드로겔의 기계적 특징화: G'- 겔 저장 모듈러스, 10% PVA-NB, 0.5% I2959, 60초 지연, 광 강도: 20 mW cm-2; 50 μm 갭 두께, 10% 변형률, 10 Hz. (c) 광중합된 PVA-NB 히드로겔 펠릿의 대표 (스케일 바: 1 cm). (d) G'-플래토 값에 대한 티올-대-NB 비 (N)의 영향: N=0.4 (I), 0.8 (II), 1.0 (III), 1.2 (IV). (e) 48시간 동안 PBS에서 팽윤시킨 후의 PVA-NB 히드로겔 (I-IV)의 평형 질량 팽윤 비를 나타낸다.
도 5는 하기를 제시한다: (a) 순차적 동결건조 및 동결-밀링에 의한 PVA 히드로겔 (I, -SH:-NB=0.4) 미립자 (PVA-NB-P)의 제조의 개략도; (b) 광-촉발된 티올-NB 접합을 통한 시스테인-함유 TRAP6 펩티드로의 PVA-NB-P의 표면 관능화의 개략도, -SH:-NB=1.2, PBS 중 0.1% PI (Li-TPO), 20 mW cm-2; (c,d) PVA-TRAP6-P의 SEM 영상, 스케일 바: 100 μm (c), 10 μm (d)를 나타낸다.
도 6은 하기를 제시한다: (a)-(b) PVA-NB-P 및 PVA-TRAP6-P의 현탁액 (염수 중 10 중량%)에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스의 ROTEM 특징화. (a) PVA-NB-P 및 PVA-TRAP6-P 현탁액에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스를 제시하는 플롯팅된 ROTEM 곡선; (b) PVA-NB-P, PVA-TRAP6, 및 NaCl (대조군) 사이의 CT에 대한 비교 분석. (c)-(f) 미립자화된 중합체의 FACS 분석. (c) 15분 인큐베이션 후의 CD62p/CD41 공동-발현의 측정에 의해 측정된 TRAP6-매개된 혈소판 활성화의 FACS 분석. 실험은 상이한 공여자 (n=2)로부터의 혈액 샘플을 사용하여 2회 반복하였으며, 데이터는 CD62p 및 CD41 에피토프 둘 다에 대해 양성인 혈소판의 백분율 ±SD로서 제시됨. (d,e,f) 15분 인큐베이션 후의 PVA-NB-P 처리된 샘플 및 PVA-TRAP6-P 처리된 샘플 (양성 대조군: 0.1 mM TRAP6, 음성 대조군: NaCl)의 CD62p 및 CD41의 공동-발현에 대한 대표적인 도트-플롯을 나타낸다.
도 7은 하기를 제시한다: (a) 프로테아제 활성화된 수용체-1 (PAR-1) 활성화의 분자적 메커니즘. (b) TRAP6- 펩티드 모티프는 혈소판을 매우 국소화된 방식으로 활성화시킬 수 있는 합성 폴리비닐 알콜 (PVA) 히드로겔, 즉, TRAP6-제시 히드로겔 내에서 공유적으로 고정화된다.
도 8은 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM)에 의해 측정된 혈액 응고에 대한 TRAP6 (비-접합된, 1 mM) 및 중합체-TRAP6 접합체의 영향을 제시한다. a, 응고 시간 (CT); b, 응고물 형성 시간 (CFT). PEG-TRAP6은 PEG-10k-NHS를 TRAP6의 N-말단과 반응시킴으로써 제조된 반면, PVA-TRAP6은 광-클릭가능한 PVA 노르보르넨 (22 kDa)을 TRAP6 중의 시스테인 잔기 (SFLLRNPNC)와 반응시킴으로써 제조되었다. PEG-10k-글리신은 블랭크 중합체 대조군으로서 사용되었다. 모든 샘플은 삼중으로 측정하였다.
도 9는 1 mM TRAP6, 1 mM PVA-NB 및 염수와 비교하여 PVA-TRAP6 (1 mM)의 보유된 생-활성의 실험적 증거를 제시한다. a, 멀티플레이트-TRAP 방법에 의해 측정된 총 혈소판 응집 면적; b, 유동 세포측정법 (FACS)에 의해 측정된 혈소판 활성화로 인한 CD41/CD62P 공동-발현의 수준.
도 1은 하기를 제시한다: (a) PVA-NB 및 PVA-TRAP6의 합성 반응식 (무수 DMSO 중에서 50 ℃에서 12시간 동안 반응, TsOH: p-톨루엔술폰산, I2959: 이르가큐어 2959, 즉, 통상적으로 사용되는 수용성 PI의 것); (b) PVA, PVA-NB 및 PVA-TRAP6 접합체의 1H-NMR (D2O) 스펙트럼; 및 MTT 검정 (n>3)에 의해 조사된 다양한 중합체 농도 (1%, 0.5%, 및 0.1%)를 갖는 PVA-NB (c) 및 PVA-TRAP6 용액 (d)에의 24/48시간 노출 후의 C2C12 세포의 정규화된 생존율.
도 2는 하기를 제시한다: (a)-(c) 조사된 물질에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스의 ROTEM 특징화 (CT: 초로서의 응고 시간, 즉, 응고물이 2 mm의 견고도에 도달할 때까지의 잠복기; MCF: mm로서의 최대 응고물 견고도). (a) TRAP6 (0.1 mM), PVA-TRAP6 (0.1 mM TRAP6-), PVA-NB, 및 0.9% NaCl 대조군에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스를 제시하는 플롯팅된 ROTEM 곡선; (b) CT에 대한 다양한 투여량 (0.01, 0.1, 1 mM)에서의 비접합된- 및 접합된-TRAP6 (PVA-TRAP6)의 영향; 및 (c) 최적 TRAP6- 농도 (0.1 mM)에서의 TRAP6, PVA-TRAP6, 및 PVA-NB 사이의 CT에 대한 비교 분석. (d) TRAP6 (0.1 mM), PVA-TRAP6 (0.1 mM TRAP6), 및 PVA-NB에 대한 반응으로 혈소판 기능의 멀티플레이트 분석; 각각의 측정은 이중으로 수행하였음. (e) 멀티플레이트: 유닛으로서의 응집 면적에 있어서의 핵심적 파라미터의 비교.
도 3은 하기를 제시한다: (a) 15분 인큐베이션 후의 CD62p/CD42 공동-발현의 측정에 의해 측정된 TRAP6-매개된 혈소판 활성화의 FACS 분석. 실험은 이중으로 실행하였으며, 데이터는 CD62p 및 CD41 에피토프 둘 다에 대해 양성인 혈소판의 백분율 ±SD로서 제시됨. (b) 특이적 CD41 PE 및 CD62p APC 항체로 염색된 샘플의 값을 제시하는 히스토그램 플롯. (c) 15분 인큐베이션 후의 TRAP6 처리된 샘플, PVA-TRAP6 처리된 샘플, 및 PVA-NB 처리된 대조군의 CD62p 및 CD41의 발현에 대한 대표적인 도트-플롯.
도 4는 하기를 제시한다: (a) 라디칼-매개된 광-클릭 화학을 통한 PVA-NB의 디티오트레이톨 (DTT)과의 UV-광가교에 의한 PVA-NB 히드로겔의 제조를 제시하는 개략도. (b) 계내 진동형 광-유동측정법을 사용한 다양한 티올-대-NB 비 (0.4, 0.8, 1.0 및 1.2)를 갖는 PVA 히드로겔의 기계적 특징화: G'- 겔 저장 모듈러스, 10% PVA-NB, 0.5% I2959, 60초 지연, 광 강도: 20 mW cm-2; 50 μm 갭 두께, 10% 변형률, 10 Hz. (c) 광중합된 PVA-NB 히드로겔 펠릿의 대표 (스케일 바: 1 cm). (d) G'-플래토 값에 대한 티올-대-NB 비 (N)의 영향: N=0.4 (I), 0.8 (II), 1.0 (III), 1.2 (IV). (e) 48시간 동안 PBS에서 팽윤시킨 후의 PVA-NB 히드로겔 (I-IV)의 평형 질량 팽윤 비를 나타낸다.
도 5는 하기를 제시한다: (a) 순차적 동결건조 및 동결-밀링에 의한 PVA 히드로겔 (I, -SH:-NB=0.4) 미립자 (PVA-NB-P)의 제조의 개략도; (b) 광-촉발된 티올-NB 접합을 통한 시스테인-함유 TRAP6 펩티드로의 PVA-NB-P의 표면 관능화의 개략도, -SH:-NB=1.2, PBS 중 0.1% PI (Li-TPO), 20 mW cm-2; (c,d) PVA-TRAP6-P의 SEM 영상, 스케일 바: 100 μm (c), 10 μm (d)를 나타낸다.
도 6은 하기를 제시한다: (a)-(b) PVA-NB-P 및 PVA-TRAP6-P의 현탁액 (염수 중 10 중량%)에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스의 ROTEM 특징화. (a) PVA-NB-P 및 PVA-TRAP6-P 현탁액에 대한 반응으로 전혈의 응고 프로세스를 제시하는 플롯팅된 ROTEM 곡선; (b) PVA-NB-P, PVA-TRAP6, 및 NaCl (대조군) 사이의 CT에 대한 비교 분석. (c)-(f) 미립자화된 중합체의 FACS 분석. (c) 15분 인큐베이션 후의 CD62p/CD41 공동-발현의 측정에 의해 측정된 TRAP6-매개된 혈소판 활성화의 FACS 분석. 실험은 상이한 공여자 (n=2)로부터의 혈액 샘플을 사용하여 2회 반복하였으며, 데이터는 CD62p 및 CD41 에피토프 둘 다에 대해 양성인 혈소판의 백분율 ±SD로서 제시됨. (d,e,f) 15분 인큐베이션 후의 PVA-NB-P 처리된 샘플 및 PVA-TRAP6-P 처리된 샘플 (양성 대조군: 0.1 mM TRAP6, 음성 대조군: NaCl)의 CD62p 및 CD41의 공동-발현에 대한 대표적인 도트-플롯을 나타낸다.
도 7은 하기를 제시한다: (a) 프로테아제 활성화된 수용체-1 (PAR-1) 활성화의 분자적 메커니즘. (b) TRAP6- 펩티드 모티프는 혈소판을 매우 국소화된 방식으로 활성화시킬 수 있는 합성 폴리비닐 알콜 (PVA) 히드로겔, 즉, TRAP6-제시 히드로겔 내에서 공유적으로 고정화된다.
도 8은 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM)에 의해 측정된 혈액 응고에 대한 TRAP6 (비-접합된, 1 mM) 및 중합체-TRAP6 접합체의 영향을 제시한다. a, 응고 시간 (CT); b, 응고물 형성 시간 (CFT). PEG-TRAP6은 PEG-10k-NHS를 TRAP6의 N-말단과 반응시킴으로써 제조된 반면, PVA-TRAP6은 광-클릭가능한 PVA 노르보르넨 (22 kDa)을 TRAP6 중의 시스테인 잔기 (SFLLRNPNC)와 반응시킴으로써 제조되었다. PEG-10k-글리신은 블랭크 중합체 대조군으로서 사용되었다. 모든 샘플은 삼중으로 측정하였다.
도 9는 1 mM TRAP6, 1 mM PVA-NB 및 염수와 비교하여 PVA-TRAP6 (1 mM)의 보유된 생-활성의 실험적 증거를 제시한다. a, 멀티플레이트-TRAP 방법에 의해 측정된 총 혈소판 응집 면적; b, 유동 세포측정법 (FACS)에 의해 측정된 혈소판 활성화로 인한 CD41/CD62P 공동-발현의 수준.
실시예:
국소 지혈을 유도하는 합성 혈소판-활성화 히드로겔 매트릭스의 개발
본 실시예는 지혈의 안전하고 국소화된 가속화를 위한 모델 혈소판-활성화 중합체로서의 수용성 PVA-TRAP6 접합체 뿐만 아니라 불용성 (가교된) PVA-TRAP6 히드로겔 미립자 (PVA-TRAP6-P)에 의해 본 발명을 입증한다. 이 연구에서, TRAP 혈소판-활성화 펩티드, 예컨대 TRAP6은 출혈 제어를 위해 합성 히드로겔 매트릭스에서 공유적으로 고정화될 수 있음 (도 7b)이 처음으로 입증된다. 이 지혈 물질로, 중합체-접합된 TRAP6 펩티드가 안전하고, 국소화된 방식으로 지혈을 가속화하면서 혈소판 활성화에 대한 그들의 활성을 유지할 수 있고, 혈소판-활성화제의 전신적 방출은 일어날 수 없다는 가설을 시험하였다. 수용성 PVA-TRAP6 접합체를 지혈의 안전하고 국소화된 가속화를 위한 모델 혈소판-활성화 중합체 뿐만 아니라 불용성 (가교된) PVA-TRAP6 히드로겔 미립자 (PVA-TRAP6-P)로서 설계하였다. 이들 새로운 중합체-펩티드 접합체는 매우 효율적인 티올-노르보르넨 광-클릭 화학을 사용하여 제조되었다. 이들 물질이 혈소판을 활성화시킬 수 있는 정도를 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM), 혈소판 응집 검정 (멀티플레이트) 및 유동 세포측정법 (FACS)을 사용하여 체계적으로 특징화하였다.
몇몇 지혈 전략은 높은 비용 및 짧은 저장-수명이라는 문제가 있는 혈액 구성성분, 예컨대 피브리노겐 및 트롬빈의 사용에 의존한다. 본 실시예에서, 급속한 국소 지혈을 위한 비용-효율적인 합성 생체물질이 개발된다. 트롬빈을 사용하는 것 대신, 트롬빈-수용체-효능제-펩티드-6 (TRAP6)을 폴리비닐 알콜 (PVA) 히드로겔에서 공유적으로 조작한다. 가용성 PVA-TRAP6을 광-접합을 통한 PVA-노르보르넨 (PVA-NB)의 골격 상으로의 시스테인-함유 TRAP6의 공유 부착에 의해 첫번째로 제조하였다. C2C12 근모세포를 사용한 세포독성 연구는 PVA-NB 및 PVA-TRAP6이 비독성임을 지시하였다. 혈전탄성영상은 TRAP6의 지혈 활성이 접합된 형태에서 보유되었으며, 이는 동등한 농도를 갖는 유리 TRAP6 용액에 필적하였음을 밝혀내었다. 0.1% PVA-TRAP6 용액은 응고 시간 (CT)을 생리학적 CT의 ~45%로 단축시킬 수 있다. 높은 혈소판-활성화 효율을 혈소판 응집 검정 및 FACS에 의해 추가로 확인하였다. 잠재적인 임상적 적용을 위해, 국소 혈소판 활성화 및 지혈을 위한 TRAP6-제시 히드로겔 미립자 (PVA-TRAP6-P)를 개발하였다. PVA-TRAP6-P를 광중합된 PVA-NB 히드로겔 미립자 (PVA-NB-P)의 TRAP6으로의 생물관능화에 의해 제조하였다. PVA-TRAP6-P는 CT를 약 50%로 효과적으로 단축시킬 수 있음이 입증되었다. FACS는 PVA-TRAP6-P가 가용성 TRAP6 대조군과 필적하는 정도로 혈소판을 활성화시킬 수 있음을 제시하였다. 함께, PVA-TRAP6-P는 안전한 지혈 및 상처 치유를 위한 생체물질의 유망한 부류를 나타낸다.
1. 실험 섹션
1.1. 물질 및 시약.
모든 시약은 달리 언급되지 않는다면 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구입하였으며, 제공받은 대로 사용하였다.
1.2. PVA-노르보르넨 (PVA-NB)의 합성.
3-구 플라스크에서, PVA (22 kDa) 10 g 및 p-톨루엔술폰산 20 mg을 60 ℃에서 1시간 동안 아르곤 분위기 하에서 무수 DMSO 250 mL에 용해시켰다. 제2 플라스크에서, 아르곤 분위기 하에서 시스-5-노르보르넨-엔도-2,3-디카르복실산 무수물 2 g (-OH 기에 대해 0.1 당량)을 무수 DMSO 50 mL에 용해시켰다. 얻어진 용액을 PVA를 함유하는 제1 플라스크 내로 적가하였다. 반응을 50 ℃에서 12시간 동안 유지하였다. 반응 후, 조 생성을 24시간 동안 10 mM NaHCO3 용액에 대한, 및 이어서 12시간 동안 탈이온 (DI) 수에 대한 투석에 의해 정제하였다. 동결건조 후, PVA-NB를 무색 고체로서 95% 수율로 얻었다. 1H-NMR (D2O): δ (ppm): 6.2 (2H, s, -CH=CH-), 3.3 (2H, s, -C=CCH-CH-), 3.1 (2H, s, -C=C-CH-CH-), 1.3 (2H, s, -CH2-).
치환도 (DS): 7.5%.
1.3. PVA-TRAP6 접합체의 합성.
PVA-TRAP6을 티올-엔 광-클릭 접합을 통한 PVA-NB의 골격 상으로의 시스테인-함유 TRAP6 펩티드 (N-C: SFLLRNPNC (서열식별번호: 15), 차이나 펩티드 캄파니 (China Peptide Co.))의 공유 부착에 의해 제조하였다. 구체적으로, PVA-NB 60 mg을 0.5% 이르가큐어 2959 (I2959, 바스프 (BASF))의 PBS 용액에 용해시켜 5%의 최종 마크로머 농도를 얻었다. 이 용액에, TRAP6-Cys 펩티드 100 mg (NB 기에 대해 1.2 당량)을 첨가하였다. 얻어진 용액을 아르곤 하에서 교반하고, 여과된 UV-광 (320 내지 500 nm)으로 300초 동안 20 mW cm-2에서 조사하였다. UV-광은 옴니큐어 (Omnicure) S2000 램프로부터 가이드되었다.
1.4. PVA-NB 히드로겔의 제조.
PVA-NB (DS-7.5%)를 0.5% I2959 용액에 용해시켜, 최종 농도 10%를 달성하였다. 그 후, 이 용액의 분취액을 적절한 양의 디티오트레이톨 (DTT)과 혼합하여, 각각 0.4 (I), 0.8 (II), 1.0, 및 1.2 (III)로서의 -SH/-NB 비를 제공하였다. 히드로겔 펠릿을 다중-웰 PDMS 주형 (웰 직경: 6 mm)에서 광중합에 의해 제조하였다. 구체적으로, 마크로머 용액 200 μL를 PDMS 주형 (두께: 1.5 mm)에 의해 분리된 2개의 유리 커버슬립 사이에 피펫팅한 후, 여과된 UV 광 (20 mW cm-2)에 600초 동안 노출시켰다. 펠릿을 슬라이드로부터 떼고, 멸균 PBS로 세척하였다.
1.5. PVA-NB 히드로겔 미립자 (PVA-NB-P)의 제조.
히드로겔 전구체 용액 (I 내지 III)을 상기언급된 바와 같이 제조하고, 주형으로서 10 mL 원통형 유리 바이알을 사용한 것을 제외하고는 동일한 조건에서 광중합시켰다. 광중합 후, 히드로겔 원통을 100 mL 비커 내로 옮기고, 미반응된 중합체 및 PI를 제거하기 위해 PBS (2회 체인지)로 12시간 동안 세척하였다. 그 후, 팽윤된 히드로겔을 액체 N2로 동결시키고, 동결건조시켰다. 마지막으로, 건조 PVA-NB 매트릭스를 레취 크리오밀 (RETSCH Cryomill) RS232를 사용하여 미세 분말로 분쇄하였다.
1.6. TRAP6-제시 PVA 히드로겔 미립자 (PVA-TRAP6-P)의 제조.
PVA-TRAP6-P를 PVA-NB-P 상의 잔류 NB 기 상으로의 TRAP6-Cys 펩티드의 공유 부착에 의해 제조하였다. 구체적으로, PVA-NB 100 mg을 0.1% 가시광 PI (LAP)의 PBS 용액에 분산시켜[19] 5%의 최종 중합체 함량을 얻었다. 이 현탁액에, 특정량의 TRAP6-Cys 펩티드 (NB 기에 대해 1.2 당량)를 첨가하였다. 얻어진 현탁액을 아르곤 하에서 교반하고, UV-광 (365 nm)으로 300초 동안 20 mW cm-2에서 조사하였다. UV-광은 옴니큐어 LX400 LED 램프로부터 가이드되었다.
1.7. 광-유동측정법.
광-유동측정법을 모듈식 광-유량계 (안톤 파르 (Anton Paar) MCR-302) 상에서 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다.[27] 구체적으로, MCR302를 광 가이드 (옴니큐어 S2000)로부터 유리 플레이트의 바닥까지 여과된 UV-광 (320 내지 500 nm)과 통합하였다. 구체적으로, 플레이트-대-플레이트 진동형 광-유동측정법을 광중합 동안 히드로겔 제제의 경화 동역학의 실시간 모니터링을 위해 적용하였다. 플레이트 표면에서의 광 강도는 오션 옵틱스 (Ocean Optics) USB 2000+ 분광계에 의해 측정된 바로, ~20 mW·cm-2였다. 샘플의 저장 모듈러스 (G') 및 손실 모듈러스 (G") 둘 다는 조사 시간의 함수로서 모니터링될 수 있다. 겔화점을 G' 및 G" 교차점 부근에서 측정하였다.
1.8. 물-흡수.
PVA-NB 히드로겔의 질량 팽윤 비를 포괄적 프로토콜을 사용하여 시험하였다.[28] 히드로겔 펠릿 (n = 3)을 상기언급된 바와 같이 제조하고, 실온에서 24시간 동안 DI H2O에서 팽윤시켰다. 습윤된 펠릿을 칭량하여 평형 팽윤 질량 (Ms)을 측정한 후, 동결건조시켜 건조 질량 (Md)을 얻었다. 평형 질량 팽윤 비 (Qm)를 Ms/Md로서 계산하였다.
1.9. MTT 검정.
PVA, PVA-NB 및 PVA-TRAP6 마크로머 용액에 대한 세포독성을 MTT 검정을 통해 평가하였다. C2C12 세포를 5% 소 태아 혈청 (FCS), 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (모두 오스트리아의 시그마-알드리치로부터)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (DMEM)에서 배양하였다. 3종 농도 (5%, 1% 및 0.1%)를 갖는 마크로머 용액을 DMEM 배양 배지에서 제조하였다. 그 후, C2C12 세포를 200 μL의 배양 배지에서 웰 당 5x103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 (37 ℃, 5% CO2) 후, 각각의 마크로머 용액 100 μL를 세포에 삼중으로 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 후, 세포를 멸균 PBS로 2회 세척한 후, 100 μL 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 작업 용액 (PBS 중 5 mg/mL)을 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후, 액체를 따라내고, DMSO 100 μl를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 마지막으로, 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.
1.10. 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM).
ROTEM (티이엠 이노베이션 (TEM Innovation), 독일)을 적용하여 시간 경과에 따른 혈소판-활성화 중합체 및 전혈의 상호작용을 모니터링하였다. ROTEM 시스템은 혈액 샘플을 함유하는 온도-제어된 큐벳에 침지된 진동 센서 핀을 함유한다. 4회 측정을 동일한 디바이스에서 병행하여 수행하였다. 일반적으로, 시트르산첨가 혈액 샘플의 응고는 재-석회화에 의해 개시된다. 피브린 응고물의 형성 동역학은 기계적으로 모니터링되고, 통합된 컴퓨터에 의해 전형적 곡선 및 수치 파라미터로 계산될 수 있다.
혈액을 21-게이지 바늘을 통한 전주와 정맥으로부터의 최소 정체를 사용하여 3명의 비-매개되고 건강한 공여자로부터 수집하였다. 최초 3 ml를 따라낸 후, 혈액을 0.3 ml 버퍼링된 3.2% 시트르산나트륨을 함유하는 3.5 ml 튜브 (바퀘트 (Vacuette); 그라이너 바이오-원 (Greiner Bio-One))에서 수집하였다. 샘플을 분석 전에 37℃에서 적어도 10분 동안 예비-가온 단계에서 유지하고, 3시간 내에 프로세싱하였다. 전혈 샘플의 ROTEM 분석을 CaCl2 (스타-TEM®, 200 mM) 20 μl의 첨가로 재석회화에 의해 개시하였다. 중합체 용액 및/또는 중합체 현탁액을 시트르산첨가 혈액의 재석회화 직후 큐벳에 직접적으로 첨가하고, 이전에 보고된 바와 같이 상하로 부드럽게 피펫팅함으로써 혼합하였다.[21] ROTEM 큐벳 당 최종 반응 부피는 370 μl였으며, 300 μl의 시트르산첨가 전혈, 20 μl CaCl2 및 50 μl 중합체 용액 또는 중합체 현탁액으로 이루어졌다.
하기 ROTEM 파라미터를 신호로부터 계산하고, 통계적 분석에 포함시켰다: 초 (sec)로서의 응고 시간 (CT), 즉, 응고물이 2 mm의 견고도에 도달할 때까지의 잠복기, 초기 피브린 형성의 측정임; 초로서의 응고물 형성 시간 (CFT), 즉, CT로부터 응고물이 20 mm의 견고도에 도달할 때까지의 시간, 혈소판 기능 및 피브리노겐 품질을 지시함; α-각, x-축 및 CT 점으로부터 시작하는 형성 곡선의 탄젠트 사이의 각도 (°), CFT에 필적함; mm로서의 최대 응고물 견고도 (MCF), 곡선의 최대 진폭, 응고물의 절대 강도를 지시함; 및 A30 (mm), 즉, 30분 후의 응고물 견고도.
1.11. 멀티플레이트 분석.
멀티플레이트 시험의 원리는 혈소판이 활성화 시 점착성이 되고, 따라서 멀티플레이트 시험 큐벳에서 금속 센서 와이어 상에 부착하고 응집하는 경향이 있다는 사실에 기초한다. 센서 와이어는 은-코팅된 매우 전도성 구리로 제조된다. 활성화된 혈소판이 센서 와이어 상에 부착하고 응집함에 따라, 와이어 사이의 전기적 저항이 상승하며, 이는 실시간으로 모니터링될 수 있다. 각각의 측정에 대해, 염수 300 μL 및 히루딘화된 전혈 300 μL를 멀티플레이트 큐벳에 순차적으로 첨가하였다. 37 ℃에서 3분 인큐베이션 후, 샘플 용액 20 μL를 첨가하고, 동시에 프로그램을 시작하여 신호를 수집하였다. 멀티플레이트 디바이스는 4회 측정을 병행하여 허용한다. 각각의 측정을 6분 동안 및 이중으로 수행하였다.
1.12. FACS 분석.
2명의 비매개되고 건강한 공여자의 혈액을 수집하고, 시트르산나트륨에 의해 안정화시켰다. 전혈 (WB) 110 μL에, PVA-TRAP6 용액 20 μL (2 mM 및 0.2 mM의 WB 중의 최종 TRAP6 농도를 얻기 위해 30 mg mL-1 및 3 mg mL-1)를 첨가하고, 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TRAP6-C 용액 20 μL (14 mg mL-1) 및/또는 NaCl 용액 (0.9%) 20 μL를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 첨가하였다. 인큐베이션된 혼합물을 실온에서 15분 동안 1% 파라포름알데히드 300 μL와 혼합하였다. 세척 및 원심분리 후, 이중 면역-염색을 CD41에 대해 지정된 피코에리트린 (PE) 표지된 모노클로날 항체 20 μL 및 CD62P에 대해 지정된 알로피코시아닌 (APC) 표지된 모노클로날 항체 20 μL를 사용하여 수행하였다. 이소형 대조군을 각각 APC 또는 PE 염료와 접합된 마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션하였다 (모든 항체는 독일 하이델베르크의 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences)로부터 구입하였음). 실온에서 30분 인큐베이션 후, 혈소판의 활성화 상태를 형광 유동 세포측정법을 사용하여 측정하였다. 혈소판 활성화 마커 CD62P 및 구성적으로 존재하는 혈소판 마커 CD41의 발현을 유니페이즈 아르곤 (Uniphase Argon) 이온 레이저 (488 nm, 20 mW 출력)를 구비한 베크만 코울터 시토믹스 (Beckmann Coulter Cytomics) FC-500을 사용하여 검출하였다. 전체적으로 100,000 혈소판을 샘플 당 측정하고, 시토믹스 CXP 소프트웨어로 분석하였다. 실험을 2회 반복하였다.
1.13. 통계학.
모든 오차 바는 표준 편차를 지시한다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정에 의해 측정하였으며, 여기서, '*', '**', '***'는 각각 P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001을 지시한다.
2. 결과 & 논의
2.1. 물질 설계 및 합성
이 연구에서, 선형 합성 중합체 폴리비닐 알콜 (PVA)을 하기 이유로 인해 강력한 혈소판-활성화 펩티드 (TRAP6)의 공유 고정화에 대한 기질로서 선택하였다. 첫째로, PVA는 우수한 비용-효율성 및 세포적합성을 갖는 FDA-승인된 중합체이며, 따라서, 많은 생의학적 적용에 대해 흥미롭다.[17] 둘째로, PVA 중의 수많은 히드록실 기의 존재는 다른 합성 기질, 예컨대 아암-의존적 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로는 이용가능하지 않은 생활성 리간드의 조정가능한 관능화 및 제시에 대해 상당한 자유를 부여한다.
TRAP6 펩티드를 PVA 상으로 도입하기 위해, 본 발명자들은 왕성한 티올-엔 광-클릭 화학을 접합 접근법으로서 선택하였다. 한편으로, 노르보르넨 기는 티올-엔 반응을 향한 그의 극히 높은 반응성 뿐만 아니라 낮은 세포독성으로 인해 엔 관능성으로서 선택되었다.[18, 19] 다른 한편으로, 본 발명자들은 유리 티올 기를 갖는 시스테인 모이어티를 TRAP6 펩티드 서열의 C-말단 내로 조작하였는데 (SFLLRNPNC), 이는 TRAP6 서열의 N-말단이 혈소판을 활성화시키는 그의 능력에 대해 중요함이 수용되기 때문이다.[15]
PVA-NB를 DMSO 중에서 50 ℃에서 12시간 동안 PVA 및 노르보르넨 무수물 사이의 손쉬운 에스테르화 반응을 통해 합성하였다 (도 1a). 이 변형 접근법의 하나의 주목할 만한 이점은 변형 후 수많은 카르복실레이트 기가 나트륨 염 형태로 중화되어 양호한 수-용해도를 갖는 생성물을 제공할 수 있다는 점이다. 조 생성물을 중화를 위해 10 mM NaHCO3에 대한, 및 그 후 H2O에 대한 순차적 투석에 의해 정제하고, 마지막으로 동결건조시켰다 (>95% 수율). 합성을 확인하기 위해, PVA-NB를 비변형된 PVA와 비교하여 1H-NMR을 사용하여 분석하였다. 도 1b (하단)에 제시된 바와 같이, 비변형된 PVA의 스펙트럼은 4.0 ppm 및 1.6 ppm에서 2개의 주 피크를 나타내며, 이는 각각 -CH- 및 메틸렌 기에 상응한다. PVA-NB의 스펙트럼 (도 1b, 중간)은 각각 6.2 ppm (s, 2H, -CH=CH-), 3.3 ppm (s, 2H, -C=C-CH-CH-), 3.1 ppm (s, 2H, -C=C-CH-CH-) 및 1.3 ppm (s, 2H, -CH2-)에서 새로운 피크를 제시한다. PVA-NB의 치환도 (DS)를 신호 (a, d, f)에 상응하는 적분 값을 비교함으로써 측정하였다. 반응물 또는 반응 시간 사이의 화학량론을 변화시킴으로써, 5% 내지 50%의 폭넓은 범위에서 DS를 정확하게 제어하는 것이 실현가능하였다 (표 S1). PVA (22 kDa)는 ~500 반복 유닛으로 이루어진 선형 중합체이기 때문에, 본 발명자들은 전구체로서 최저 DS (DS-7%)를 갖는 PVA-NB를 선택하여, 시스테인-함유 펩티드와의 광-접합을 위한 ~35개의 반응 부위를 제공하였다.
PVA-TRAP6 접합체를 광개시제 (PI)로서 I2959의 PBS 용액 중 PVA-NB의 NB 기로의 시스테인-함유 TRAP6 펩티드의 광-접합에 의해 제조하였다. 접합 효율을 확인하기 위해, NMR 모델 반응을 먼저 D2O에서 수행하였다. NMR 반응에 기초하여, 도 1b (상단)는 PVA-TRAP6 접합체의 스펙트럼을 나타낸다. 6.2 ppm에서의 NB 양성자 신호 (a)의 상당한 감소는 접합의 성공을 지시한다. 그 외에, PVA-TRAP6의 스펙트럼은 또한 7.4 ppm에서 새로운 피크를 제시하며, 이는 TRAP6 서열에서 페닐알라닌 (Phe 또는 F) 모이어티의 방향족 양성자에 상응한다.
2.2. 시험관내 세포독성
생의학적 적용을 위한 제조된 물질의 적용가능성을 입증하기 위해, PVA, PVA-NB 및 PVA-TRAP6 용액의 시험관내 생체적합성을 C2C12 근모세포를 사용한 MTT 검정에 의해 조사하였다. MTT 검정은 PVA 및 PVA-NB (도 1c) 용액이 24시간 및 48시간 인큐베이션 후 다양한 농도 (0.1, 0.5, 1%)에서 비-독성이었음을 제시하였다. PVA-TRAP6 접합체에 대해, 24시간 인큐베이션 후의 C2C12 세포의 대사 활성 (도 1d)은 1% PVA-TRAP6과 혼합된 경우 유의하게 증가된 반면 (P < 0.001), 0.5% 및 0.1% PVA-TRAP6에 대해서는 증가되지 않았다. 48시간 인큐베이션 후, 모든 3종 농도에 대한 대사 활성은 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다 (P < 0.001). 다른 그룹에 의한 몇몇 연구는 PAR-1 활성화 펩티드, 예컨대 TRAP6이 인간 잇몸 섬유모세포, 내피 세포, 장 상피 세포, 및 인간 근육 근모세포를 비롯한 상이한 세포 유형으로부터 시토카인 방출을 자극할 수 있음을 제시하였다.[20 a,b,c] 따라서, 본 발명자들은 MTT 검정 동안 C2C12 근모세포의 증가된 대사 활성이 TRAP6-유도된 PAR-1 활성화에 기인한다고 추정한다. 1% PVA-TRAP6 용액이 5 mM의 TRAP6- 농도를 생성함을 고려하면, 혈소판 활성화를 위한 유효한 TRAP6- 농도는 5 내지 100 μM의 범위인 반면,[12] 독성 결과는 PVA-TRAP6이 그의 유효 범위 내에서 세포적합성 물질임을 시사한다.
2.3. 지혈 활성
2.3.1. 혈전탄성측정법
본 발명자들은 다음으로 응고 동안 혈전의 점탄성 특성의 계내 특징화를 허용하는 임상적 진단 도구인 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM)을 사용하여 PVA-TRAP6의 지혈 효능을 TRAP6 및 PVA-NB와 비교하여 연구하였다[21, 22]. 도 2a는 재석회화된 전혈과 혼합된 연구되는 샘플의 플롯팅된 ROTEM 곡선을 제시한다. 응고 시간 (CT)은 응고물이 2 mm의 견고도에 도달할 때까지의 잠복기를 지칭하는 반면, 최대 응고물 견고도 (MCF)는 응고물의 절대 강도를 지시하는 곡선의 최대 진폭을 지칭한다.
ROTEM 결과로부터, 0.1 mM에서의 PVA-TRAP6의 CT는 0.1 mM에서의 TRAP6의 그것에 매우 필적한 반면, PVA-TRAP6의 MCF는 TRAP6 대조군의 그것보다 상대적으로 적었음이 관찰되었다. 보다 낮은 MCF는 거대분자 접합체 (65 kDa)이고, TRAP6보다 유의하게 더 큰 (1 kDa) PVA-TRAP6에서의 접합 후 혈소판에의 TRAP6-의 감소된 접근성에 기인할 수 있다. 비교하면, PVA-NB 대조군 (도 2c)은 생리학적 곡선 (NaCl 대조군)과 매우 유사한 곡선을 제시하였으며, 이는 PVA-NB 골격의 지혈 활성이 없음을 제시한다.
PVA-TRAP6의 지혈 활성이 용량-의존적인지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 ROTEM에서 PVA-TRAP6 용액을 TRAP6 용액과 비교하여 3종 펩티드 농도 (0.01, 0.1, 1 mM)에서 시험하였다 (도 2b). PVA-TRAP6에 대한 최적 지혈 농도는 0.1 mM인 반면, 선택된 범위에서 TRAP6 대조군에 대한 유의한 용량 영향은 없었음이 밝혀졌다. 이는 다시 혈소판 활성화에 대한 TRAP6의 포화 수준에 대한 PVA-TRAP6 및 TRAP6 펩티드에서의 차등적 분자 구조의 영향을 시사할 수 있다.
2.3.2. 멀티플레이트 분석
혈소판 활성화의 정도를 정량화하기 위해, 본 발명자들은 멀티플레이트 검정을 이용하여 혈소판 응집에 대한 PVA-TRAP6, TRAP6 및 PVA-NB의 영향을 조사하였다. 이 방법의 원리는 혈소판이 활성화 시 점착성이 되고, 따라서 멀티플레이트 시험 큐벳에서 금속 센서 와이어 상에 부착하고 응집하는 경향이 있다는 사실에 기초한다. 활성화된 혈소판이 센서 와이어 상에 부착하고 응집함에 따라, 와이어 사이의 전기적 저항이 상승하고, 이는 연속적으로 모니터링될 수 있다. 전형적인 멀티플레이트 곡선 (도 2d)은 혈소판 응집의 정도에 상응하는 전기적 신호의 축적을 나타낸다. 멀티플레이트 검정의 하나의 핵심적 파라미터는 응집 면적 (유닛으로서), 즉, 응집 곡선 아래의 면적이다. PVA-TRAP6 (0.1 mM)은 TRAP6 (0.1 mM)의 그것에 필적한 응집 곡선을 유도한 반면 (도 2d), PVA-NB 대조군은 혈소판 응집의 무시가능한 능력을 나타내었음이 관찰되었다. TRAP6에 대한 응집 면적 값 (도 2e)은 147 U인 반면, PVA-TRAP6 및 PVA-NB에 대한 면적 값은 각각 130 U 및 2 U이었다 (p<0.001). 함께, 멀티플레이트 검정은 PVA-TRAP6이 혈소판 활성화에 대한 높은 효율을 제공한 반면, 기질 (PVA-NB)은 그렇지 않았음을 입증하였다.
2.3.2. 가용성 시스템의 FACS
본 발명자들은 다음으로 유동 세포측정법 (FACS)을 이용하여 혈소판 활성화의 정도를 정량화하였다. 혈소판은 GpIIIa (인테그린 베타 3 쇄)와 비-공유적으로 회합하여 GpIIb/IIIa 복합체를 형성하는 혈소판 막 당단백질 GpIIb를 인식하는 표면 항원 CD41의 구성적 발현에 의해 다른 혈액 세포로부터 구별될 수 있다. 중요하게, CD62p (P-셀렉틴) 막 당단백질은 활성화된 혈소판 상에 배타적으로 발현된다. CD62p 마커를 사용하여 연구되는 물질 (PVA-TRAP6, TRAP6, PVA-NB, 및 NaCl)과 함께 인큐베이션 후, 인간 혈소판에서의 활성화의 정도를 확인하였다. 15분 동안 이들 물질로 처리된 혈액 샘플에서의 CD41/CD62p 공동-발현의 측정 (도 3 a-c)은 CD41 양성 세포에서의 CD62p 발현에 대한 PVA-TRAP6 (0.1 mM)의 유의한 효과 (~80%)가 있었음을 밝혀내었다. CD62p 양성 세포의 관점에서 활성화된 혈소판 표현형의 백분율은 TRAP6 (0.1 mM)으로 처리된 대조군 샘플의 동일한 수준에서 머물렀다. 대조적으로, CD41 양성 세포에서의 CD62p 발현에 대한 PVA-NB의 유의한 효과는 없었으며 (<10%), 이는 0.9% NaCl로 처리된 음성 대조군 샘플의 동일한 수준에 있었다. 모두 합쳐, FACS 분석은 추가로 혈소판 활성화에 대한 PVA-TRAP6의 높은 효율을 확인시켜 주었다.
2.4. PVA 히드로겔의 제조 및 특징화
가용성 형태의 또는 방출성 형태의 혈소판-활성화 PVA-TRAP6은 WO 96/40033 A1에서와 같이 순환에서 혈전증 위험을 유발할 잠재성을 갖기 때문에, 본 발명자들은 추가로 그에 의해 TRAP6 펩티드가 광가교된 PVA 히드로겔 매트릭스에서 공유적으로 고정화된 국소화된 지혈을 위한 불용성 PVA-TRAP6 시스템을 개발하였다. 본 발명자들은 PVA 히드로겔 매트릭스를 생성하기 위한 접근법으로서 라디칼-매개된 티올-NB 광중합을 선택하였다 (도 4a). (메트)아크릴레이트의 통상적인 가교 화학과 대조적으로, 티올-NB 광중합은 왕성한 동역학, 우수한 시공간적 제어 및 세포적합성 상태를 비롯한 몇몇 이점을 제공한다.[19, 23] 예를 들어, PEG-기재 티올-NB 히드로겔은 포유동물 세포의 계내 광-캡슐화를 높은 생존율로 가능하게 하였다 (>90 %).[19] 이 연구에서, 모델 가교제 (디티오트레이톨, DTT)와 조합으로 PVA-NB 마크로머를 수용성 및 생체적합성 PI로서 I2959의 존재 하에서 UV 조사 하에서 광중합시켰다.
2.4.1.광-유동측정법
본 발명자들은 계내 광-유동측정법을 이용하여 PVA 히드로겔의 광-반응성 및 기계적 특성을 시험하였다. PVA 히드로겔의 화학-물리적 특성은 티올 대 NB 비를 조정함으로써 용이하게 조정될 수 있다고 가설화되었다. 동등한 마크로머 함량 (10%)을 갖지만 다양한 티올 대 NB 비 (0.4, 0.8, 1.0, 1.2)를 갖는 4종 PVA-NB/DTT 제제를 광-유동측정법에서 스크리닝하였다 (도 4b). 60초 블랭크 기간 (UV 없음) 후, UV 조사 시 PVA 히드로겔의 저장 모듈러스 (G')는 G'-플래토에 도달할 때까지 초로서 상이한 정도 (8 내지 120 kPa)로 증가하였다. 모든 광중합된 PVA 히드로겔은 전체적으로 투명한 것으로 밝혀졌다 (도 4c). 티올 대 NB 비를 0.4 내지 1.2로 증가시킴으로써, G'-플래토 값 (도 4d)은 각각 8, 22, 120 내지 45 kPa로 변화하였다. 최고 G'-플래토 값은 그에 의해 티올 대 NB 비가 1:1인 히드로겔 (III)에 대해 얻어졌으며, 이는 가장 높은 정도의 가교를 지시한다. 주목할 만하게는, 광-유동측정법 측정으로부터의 이들 G'-플래토 값은 단지 예비-팽윤된 상태의 PVA 히드로겔의 일시적 저장 모듈러스를 나타낼 수 있는데, 이는 팽윤 프로세스가 히드로겔의 저장 모듈러스에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.[24] 팽윤된 PVA 히드로겔의 기계적 특성에 대한 추가의 조사는 대안적 접근법, 예컨대 AFM 나노압입을 사용함으로써 보증된다.
2.4.2. 물-흡수
본 발명자들은 추가로 PVA 히드로겔 (I-IV)의 물-흡수 특성을 분석하였다. 광중합된 PVA 히드로겔 펠릿을 PBS에 48시간 동안 담가서 평형 습윤 중량 (mwet)에 도달하게 하고, 이를 동결건조 후의 중합체 건조 중량 (mdry)과 비교하고, 평형 질량 팽윤 비 (Qm)를 생성하였다. 도 4e에 제시된 바와 같이, 히드로겔 (I-IV)의 Qm 값은 130, 45, 10 내지 17로 변화하였다. G'-플래토 값과 조합으로, 이들 데이터는 티올 대 NB 비가 1:1인 경우 (III) 최고 가교도가 얻어졌음을 시사한다. 이 관찰은 다른 기에 의한 PEG-기재 티올-NB 히드로겔에 대한 이전의 연구와 상관된다.[19, 25] 예를 들어, 린 (Lin) 등은 티올-NB 광중합된 PEG 히드로겔이 에스테르 결합의 존재로 인해 가수분해적으로 분해가능함을 입증하였다.[25] 분해 속도는 티올 대 NB 비 및 마크로머 함량에 의해 나타내어진 겔 가교 밀도에 의존하였다. 제시된 PVA 히드로겔은 또한 다수의 에스테르 연결을 소유하기 때문에, 본 발명자들은 이들 히드로겔이 가수분해적으로 분해가능하다고 예상한다. DTT 외에, 대안적인 디-시스테인 프로테아제-민감성 펩티드는 또한 세포 재형성 및 상처 치유를 조성하기 위한 효소적으로 절단가능한 가교제로서 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 시험관내 및 생체내에서의 제시된 PVA 히드로겔의 분해 거동에 대한 추가의 조사가 필요하다.
2.5. 생물관능화
2.5.1. TRAP6-관능화된 히드로겔 미립자의 제조
TRAP6-관능화를 위한 적절한 히드로겔 매트릭스를 제조하기 위해, 광중합된 PVA 히드로겔 (I, -SH:-NB=0.4)을 순차적으로 동결건조시키고, 미세 미립자로 동결-밀링하였다 (도 5a). 과량의 NB 기가 광중합 후에 존재하였기 때문에, 이들 잔류 기를 시스테인-함유 TRAP6 펩티드로의 광-클릭 접합 (도 5b)에 이용하였다. SEM 분석 (도 5c)은 PVA-TRAP6-P의 길이 규모는 5 내지 50 μm의 범위였음을 밝혀내었다. PVA-TRAP6-P의 부분적 응집은 아마도 NB 기의 전하 효과로 인한 것이었다.
2.5.2. ROTEM 분석
본 발명자들은 ROTEM에서 PVA-TRAP6-P의 지혈 능력을 PVA-NB-P와 비교하여 시험하였다. 시험 전에, 이들 미립자를 염수와 주의깊게 혼합하여 주사가능한 슬러리를 형성하였다. 도 6 a-b에 제시된 바와 같이, 전혈 내로의 PVA-TRAP6-P의 첨가는 생리학적 CT의 ~50%로의 CT의 유의한 감소를 유도하였다. 흥미롭게도, PVA-NB-P 대조군은 또한 ~70%로의 CT의 감소를 유도하였다. 음으로 하전된 표면은 응고에 기여하는 것으로 공지되어 있기 때문에 (즉, 고유한 경로),[26] 본 발명자들은 PVA-NB-P의 관찰된 지혈 활성이 NB 기의 전하 효과로 인한 것이라고 추정한다.
2.5.3. FACS 분석
이들 미립자화된 물질이 혈소판을 활성화시키는 능력을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 PVA-TRAP6-P 및/또는 PVA-NB-P와 함께 예비-인큐베이션된 전혈 샘플을 FACS에서 분석하였다. FACS 분석 (도 6 c-f)은 PVA-TRAP6-P에 대한 활성화된 혈소판 (CD41+/CD62p+)의 백분율이 ~55%만큼 높았으며, 이는 양성 대조군 (0.1 mM TRAP6)에 필적함을 밝혀내었다. 대조적으로, PVA-NB-P와 함께 인큐베이션된 혈액 샘플은 단지 최소량의 활성화된 혈소판을 나타내었다 (<10%). 이들 결과는 TRAP6-제시 히드로겔 매트릭스 (PVA-TRAP6-P)가 국소화된 방식으로 혈소판을 활성화시키는 양호한 효능을 제공함을 제시한다.
2.6. 통상적인 고정화 기술과 펩티드성 트롬빈 수용체 활성화제의 활성을 보존하는 커플링 기술의 비교
적합한 고정화 기술을 성실하게 선택하는 것의 중요성을 제시하기 위해, 통상적인 펩티드 고정화 방법 (예를 들어 NHS 접합) 및 본 발명의 과정에서 선택된 방법, 예컨대 광-클릭 접합의 비교를 중합체 기질에의 TRAP6 펩티드의 공유 결합의 공정에 대해 수행하였다. 통상적인 펩티드 고정화 방법은 그의 생-활성의 소실을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 이는 트롬빈 수용체 활성화의 결여를 초래하고, 혈액 응고의 유도가 없으며, 이는 생성된 물질을 국소 지혈에 유용하지 않게 만든다.
NHS 접합을 통해 중합체-TRAP6을 제조하기 위해, 말단 NHS 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (10 kDa) (PEG-10k-NHS)을 중합체 기질로서 사용하였다. TRAP6을 N-말단에서의 반응을 통해 PEG-10k-NHS에 연결시키고, 미반응된 NHS 기를 글리신으로 차단하였다. 또한, 과량의 글리신과 반응한 PEG-10k-NHS를 음성 대조군으로서 제조하였다. 증류수에 대한 투석 및 동결건조 후, 접합체를 고 수율로 얻고, 이어서 표준 회전 혈전탄성측정법 (ROTEM)에서 분석하여 혈액 응고에 대한 그들의 효과를 연구하였다. 상이한 접근법에 의해 제조된 중합체-TRAP6 접합체의 생활성을 비교하기 위해, 본 발명자들이 청구하는 접근법 (즉, 광-클릭 접합)에 의해 제조된 PVA-TRAP6은 양성 대조군으로서 포함되었다. 샘플은 1 mM TRAP6, 1 mM PEG-TRAP6, 1 mM PEG-글리신, 1 mM PVA-TRAP6 및 염수로 이루어진다.
도 8에 제시된 바와 같이, 비-접합된 TRAP6 (1 mM)은 염수 대조군과 비교하여 응고 시간 (CT) 및 응고물 형성 시간 (CFT)의 유의한 감소를 유도하였다. 그러나, 이 효과는 TRAP6이 통상적인 NHS 접합 절차를 사용하여 PEG10k에 접합된 경우 소실되었다. 유사한 효과는 또한 PEG-글리신 접합체 대조군에 대해 관찰될 수 있으며, 이는 중합체 골격 및 제조 절차의 최소 효과를 제시한다. 그럼에도 불구하고, 광-클릭 접합에 의해 제조된 PVA-TRAP6 접합체는 여전히 CT 및 CFT를 유의하게 단축시킬 수 있었으며, 이는 TRAP6의 생활성이 보유됨을 제시한다. 요약하면, 이들 데이터는 전통적인 NHS 고정화 접근법이 TRAP6의 생활성을 보유하는데 실패함을 제시한다. 대조적으로, 티올-노르보르넨 광-클릭 접합에 기초한 공유 고정화 접근법은 TRAP6 펩티드의 거의 완전한 생체-기능성을 보유할 수 있다.
혈소판 활성화에 대한 PVA-TRAP6 접합체의 능력을 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은 표준 혈소판 응집 검정 (멀티플레이트) 및 유동 세포측정법 (FACS)에서 샘플을 시험하였다. 도 9a에 제시된 바와 같이, PVA-TRAP6의 총 혈소판 응집 면적은 동등한 펩티드 농도의 TRAP6의 그것에 필적하는 반면, PVA-NB 기질 대조군 및 염수 대조군은 무시가능한 수준의 혈소판 응집을 제시한다. 더욱이, FACS 결과 (도 9b)는 광-클릭 접합에 의해 제조된 PVA-TRAP6 접합체가 TRAP6 대조군 (1 mM)과 매우 유사한 수준으로 혈소판 활성화 (즉, CD41/CD62P 공동-발현)를 유도할 수 있는 반면, PVA-NB 및 염수 대조군에 대해서는 유의한 혈소판 활성화가 관찰될 수 없었음을 확인시켜 준다. 이들 발견은 본 발명자들의 접합 접근법이 정말로, 심지어 그것이 PVA에 공유적으로 고정화된 경우에도 TRAP6의 생활성을 보유할 수 있음을 입증한다.
펩티드 고정화에 대한 최신 접근법과 대조적으로, 본 발명의 접근법은 예를 들어 생물직교 반응, 예컨대 매우 높은 정도의 접합 효율 (>95%), 부위-특이성 및 모듈성을 제공하는, PVA 노르보르넨 상으로의 시스테인-함유 TRAP6의 광-클릭 접합을 사용함으로써 N- 또는 C-말단 또는 산성 또는 염기성 아미노산과의 부반응의 위험이 없는 특정 커플링 기술에 기초한다. 동일한 접합 접근법은 또한 노르보르넨 기를 함유하는 다른 기질, 예컨대 천연-유래된 분자 (젤라틴, 히알루로난, 알기네이트 등) 및 합성 유사체, 예컨대 PEG에 대해 적용가능하다. 또한, 중합체-결합된 TRAP6 접합체는 PAR-1 수용체 신호전달을 통한 가용성 TRAP6 펩티드보다 혈액 세포에 의해 내재화될 가능성이 보다 낮으며, 이는 PVA 기질의 크기 (수백개의 반복 유닛)가 짧은 TRAP6 서열보다 훨씬 더 크기 때문이다. 모두 합쳐, 보유된 활성을 갖는 트롬빈 수용체 활성화 활성제의 커플링을 사용한 (예를 들어 TRAP6 펩티드 고정화를 위한 광-클릭 접합에 의한) 본 발명에 따른 접근법은 국소 지혈 뿐만 아니라 다른 의학적 적용을 위한 상당한 실제적인 가치를 제공한다.
3. 결론
이 연구에서, 본 발명자들은 효율적으로 혈소판을 활성화시키고, 지혈을 국소화된 방식으로 가속화할 수 있는 합성 지혈 시스템을 개발하였다. 매우 강력한 프로테아제인 트롬빈의 사용은 이 시스템에서 회피된다. 대신, 트롬빈 수용체 효능제 펩티드 (TRAP)를 매우 효율적인 티올-노르보르넨 광-접합을 통해 세포적합성 PVA 히드로겔 상에 공유적으로 조작하였다. 제시된 TRAP6-관능화 접근법은 또한 다른 합성 물질/히드로겔, 예컨대 PEG 뿐만 아니라 천연-유래된 히드로겔, 예컨대 젤라틴 및 히알루론산에 적용가능하지만, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 관점에서, 활성화된 혈소판은 세포 증식을 조절하고, 혈관 형성 (혈관신생)에서 중요한 역할을 하는 혈소판-유래된 성장 인자 (PDNF)를 방출하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 이들 혈소판-활성화 히드로겔 매트릭스가 안전한 지혈을 위한 뿐만 아니라 조직 재생 및 상처 치유에서의 잠재적 적용을 위한 다용도 생체물질이라고 예상한다.
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Claims (15)
- 트롬빈 수용체 활성화제가 생체적합성 매트릭스에 공유적으로 커플링되어 있는 지혈 물질로서,
트롬빈 수용체 활성화제는 생체적합성 매트릭스에 대한 공유 커플링 후에 트롬빈 수용체 활성화 활성을 갖고,
트롬빈 수용체 활성화제는 아미노산 서열 SFLLRN을 갖는 펩티드인 TRAP6이고,
TRAP6는 시스테인-함유 TRAP6의 형태로, 생체적합성 매트릭스로서 노르보르넨 기를 포함하는 폴리비닐알콜(PVA) 상에 광-클릭 접합으로 접합되는 것인 지혈 물질. - 제1항에 있어서, 매트릭스가 스폰지, 직물, 부직물, 미리 형성된 형상, 미립자 물질, 과립 물질, 또는 시트인 지혈 물질.
- 제2항에 있어서, 매트릭스가 발치용 원통 또는 원뿔로서 미리 형성된 형상인 지혈 물질.
- 트롬빈 수용체 활성화제가 생체적합성 매트릭스에 공유적으로 커플링되어 있는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 지혈 물질을 제조하는 방법으로서,
트롬빈 수용체 활성화제는 생체적합성 매트릭스에 대한 공유 커플링 후에 트롬빈 수용체 활성화 활성을 갖고,
트롬빈 수용체 활성화제는 아미노산 서열 SFLLRN을 갖는 펩티드인 TRAP6이고,
TRAP6는 시스테인-함유 TRAP6의 형태로, 생체적합성 매트릭스로서 노르보르넨 기를 포함하는 폴리비닐알콜(PVA) 상에 광-클릭 접합으로 접합되는 것인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수술에, 및/또는 손상 및/또는 상처의 치료에 사용하기 위한 지혈 물질.
- 하기를 포함하는 키트:
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 지혈 물질 및
- 버퍼 용액, 시린지, 튜브, 카테터, 겸자, 가위, 멸균 패드 또는 로션의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 투여 디바이스. - 제6항에 있어서, 수술에, 및/또는 손상 및/또는 상처의 치료에 사용하기 위한 것인 키트.
- 제6항에 있어서, 버퍼 용액이 Ca2+ 이온을 함유하는 버퍼 용액인 키트.
- 제6항에 있어서, 버퍼 용액이 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 아프로티닌, ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 구성성분을 추가로 포함하는 것인 키트.
- 제6항에 있어서, 항박테리아제, 응고성 활성제, 면역억제제, 항염증제, 항피브린용해제, 아프로티닌, ECEA, 성장 인자, 비타민, 세포, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 구성성분을 갖는 용기를 추가로 포함하는 키트.
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