JP2023118920A - 止血材 - Google Patents
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Abstract
【課題】止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた止血材を提供すること。【解決手段】本発明によって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックス上に共有結合により固定化して、それを必要とするヒト患者への投与に適切な改善された止血材を得ることができることが初めて示される。好ましい実施形態として、TRAP6、TRAP7またはTRAP8を合成ヒドロゲルマトリックス(例えば、ポリビニルアルコールベースのポリマー)に共有結合によりカップリングすることにより、相当な期間にわたって安全な局所的方法で血小板活性化のための活性を維持して、特に血小板凝集の誘導によって止血の改善を可能にする適切な止血材が提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、止血材、ならびにこのような材料を生産および使用するための方法に関する。
制御不能な出血は依然として、外傷性傷害および外科的傷害の主な死亡原因である[1]。したがって、出血を制御するための有効な治療アプローチの開発は、最重要の臨床的および社会的な価値である。過去数十年で、フィブリンベースの接着剤または封止剤[3a,b]、ゼオライト粉末[4a,b]、架橋ゼラチンマトリックス[5a,b]などを含む多くの止血製品[2]が開発されている。しかしながら、これらの各製品にはそれぞれ制限がある。フィブリン製品は、高コスト、短い保存期間および弱い機械的強度という欠点がある[6]。ゼオライト鉱物は重度の熱傷を引き起こす傾向があり、非分解性である[6]。架橋ゼラチンマトリックスは、高用量のトロンビンと組み合わせた場合にのみ、数分以内に出血を止めることができた[7]。しかしながら、トロンビンは、自己タンパク質分解性であるので、溶液中では不安定である。高濃度のトロンビンは、ヒトケラチノサイトのアポトーシスを誘導することが公知であり、創傷治癒の障害を引き起こし得る[8]。したがって、改善された安全性を有する代替止血材を設計する強い必要性が存在する。特に、高濃度トロンビンの使用を回避する有効な戦略を設計することが、望ましい解決策である。
トロンビンは、血液凝固(凝固)において重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである[9a,b]。重要な凝固プロテアーゼとして、トロンビンは、可溶性フィブリノゲンを、トランスグルタミナーゼ(FXIII)によって架橋されたフィブリンネットワークに変換する[10]。加えて、トロンビンは、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)を刺激することによって、血小板の最も強力な活性化因子である[11,12]。トロンビンによって活性化されると、血小板は、GP IIb/IIIa受容体の立体構造を物理的に変化させ、フィブリノゲンに対する高親和性結合部位を提供し、フィブリノゲン架橋血小板凝集を提供する。PAR-1およびPAR-4は両方ともヒト血小板上に存在するが、トロンビンによるヒト血小板の活性化は、PAR-1によって主に媒介される[13]。トロンビンによるPAR-1活性化の分子機構は、図7Aに示されている。PAR-1は血小板で高発現され[14a,b]、PAR-1活性化は、トロンビンによるPAR-1受容体の細胞外N末端ドメインの一部のタンパク質分解切断によって開始される。タンパク質分解は、細胞外ループ2内の受容体と相互作用してPAR-1活性化のシグナル伝達経路をトリガーする新たなN末端リガンドドメイン(SFLLRN(配列番号1)、別名トロンビン受容体アゴニストペプチド-6、TRAP6)を生成する。短いTRAP6ペプチド(SFLLRN)は、強力な血小板活性化因子として別個に働き、PAR-1シグナル伝達を介して血小板凝集を刺激することが証明されている[15]。Multiplate(登録商標)TRAP試験は、TRAP6によってトリガーされる血小板機能の定量的測定の、全血または多血小板血漿での標準的なインビトロアッセイになっている。TRAP試験は、フィブリン形成(他の方法では、サンプル中でトロンビン阻害剤を使用するので、トロンビンがアゴニストである場合にこれが起こる)をトリガーせずに、PAR-1シグナル伝達によって活性化される血小板機能の分析を可能にする。
国際公開第96/40033A1号には、εアミノカプロン酸およびトロンビン受容体活性化ペプチドを含む止血剤を有する止血材であって、前記薬剤がマトリックス上に物理的に(しかし非共有結合により)吸着されたマトリックスが得られるように、前記止血剤が止血マトリックス上にスプレーまたはコーティングされた止血材が開示されている。このようなパッチは、患者の出血部位に接触されると、それに提供された止血剤がパッチから容易に剥離するという欠点を有する。特に循環アンタゴニストが循環中に存在しないので、全身血栓症イベントを誘発する潜在的な危険性がある。
国際公開第03/057072A2号には、セルロースおよびそれに共有結合された多糖を含む止血組成物が開示されている。
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本発明の目的は、出血を制御するための改善された止血材であって、トロンビン受容体活性化剤を有する止血材を提供することである。
それゆえ、本発明は、止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた、止血材を提供する。
本発明によって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックス上に共有結合により固定化して、それを必要とするヒト患者への投与に適切な改善された止血材を得ることができることが初めて示される。好ましい実施形態として、TRAP6、TRAP7またはTRAP8を合成ヒドロゲルマトリックス(例えば、ポリビニルアルコールベースのポリマー)に共有結合によりカップリングすることにより、相当な期間にわたって安全な局所的方法で血小板活性化のための活性を維持して、特に血小板凝集の誘導によって止血の改善を可能にする適切な止血材が得られた。
本発明の生体適合性マトリックスは、特にヒト患者の創傷被覆または(例えば、器官内の)容積不足の充填のために、ヒト患者への投与に使用可能な任意のマトリックスであり得る。本発明によれば、このような目的のために先行技術で示唆されているマトリックス材料を使用することが好ましい。一般に、「生体適合性」マトリックスは、ヒト患者に投与され得るマトリックスであって、この投与および患者との接触の間にネガティブな効果を誘導しないマトリックスである。「生体適合性」マトリックスは、生存組織(例えば、創傷の表面に露出したヒト組織)を脅かし、汚染し、妨害し、または悪影響を与える材料または成分を含有しないマトリックスである。このようなマトリックスの例は、「古典的な」創傷被覆材、例えばパッチ、スポンジだけではなく、流動性または噴霧性マトリックス、粉末など、例えばFloSeal(商標)(架橋ゼラチンマトリックス)、Surgiflo(商標)(ウシゼラチンペースト)もある。パッチは、一般的な創傷被覆材にとって有利であるのに対して、最も顕著な流動性マトリックスである非物質性(non-material)止血薬は、液体/固体アプローチとは対照的に同じ相内に送達され得るか、または空洞をフレキシブルに充填し、もしくはフレキシブルな足場を提供するために使用され得る(「容積不足」)。マトリックスは、トロンビン受容体活性化剤が本発明のマトリックスに共有結合によりカップリングされ得るように、化学的に活性であるべきかまたは化学的に活性化されるべきである。例えば、マトリックスへのトロンビン受容体活性化剤の共有結合を可能にするために、マトリックスは、ヒドロキシル基、ビニル基、カルボキシル基またはアミノ基を有し得る。
好ましくは、マトリックスは、止血マトリックスである(すなわち、マトリックス材料自体が止血特性を既に有する)。このような材料は当技術分野で十分に利用可能であり、例えば、コラーゲン、ゼラチンまたはキトサンを含む。
好ましい生体適合性マトリックスは、生体材料、好ましくはタンパク質、バイオポリマーまたは多糖マトリックス、特にコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、デンプンまたはキトサンマトリックス;および合成ポリマー、好ましくはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)などからなる群より選択される。
好ましくは、本発明のマトリックスは、生分解性である(すなわち、それは、しばらくすると患者の体によって自然に吸収される)。いずれにせよ、材料(マトリックスを含む)は、生体適合性でなければならない(すなわち、材料が投与される患者に有害な効果を及ぼさない)。止血が体内で達成され(すなわち、手術の過程において)、その部位が手術後に閉鎖される状況では、このような生分解性材料が特に適切である。
したがって、マトリックスは、好ましくは、バイオポリマー、例えばタンパク質または多糖から選択される生体材料である。特に好ましいのは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、多糖、例えばヒアルロン酸、キトサンおよびそれらの誘導体、より好ましくはコラーゲンおよびキトサンからなる群より選択される生体材料、特に好ましくはコラーゲンである。本発明に使用されるこのようなコラーゲンマトリックスは、多孔性マトリックスまたは繊維性マトリックスおよび粒子に加工され得る液体材料、ペースト状材料、繊維材料または粉末コラーゲン材料からの材料を含む、ゲルを形成するために適切な任意のコラーゲンに由来し得る。スポンジまたはシートの生産のためのコラーゲンゲルの調製は、ゲル形成が起こるまで酸性化し、続いてpHを中和することを含み得る。ゲル形成能または溶解性を改善するために、乾燥時に安定なスポンジまたはシートを形成する特性が低下しない限り、コラーゲンは、(部分的に)加水分解または改変され得る。トロンビン受容体活性化剤をカップリングするために使用されるマトリックスは、バイオポリマー(すなわち。天然に存在するポリマー)もしくはその誘導体であり得るか、または合成ポリマーであり得る。本発明の止血材において有用なバイオポリマーの例としては、ポリペプチド、例えばコラーゲン、コラーゲン誘導体、例えばゼラチン、エラスチンおよびエラスチン誘導体ならびに多糖、例えばヒアルロン酸、デンプン、セルロースまたはその誘導体、例えば酸化セルロースが挙げられる。好ましくは、バイオポリマーはヒトバイオポリマーであり、個体から単離され得るか、または合成バイオポリマー、例えば組換え生産されたバイオポリマーであり得る。
様々な実施形態では、マトリックスは、組換えヒトポリマーを含む。特に、組換えヒトポリマーは、組換えヒトコラーゲン、例えば組換えヒトI型コラーゲン、組換えヒトIII型コラーゲンまたはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、マトリックスは、組換えヒトIII型コラーゲンを含む。別の実施形態では、マトリックスは、組換えヒトI型コラーゲンを含む。例えば、組換えヒトゼラチンは、組換えヒトIII型コラーゲンに由来し得る。さらに別の実施形態では、マトリックスは、組換えヒトI型コラーゲン由来の組換えゼラチンを含む。さらなる実施形態では、マトリックスは、コードするポリヌクレオチドの発現によって直接生産される組換えゼラチンを含む。
本発明においてマトリックスとして使用される多糖は、好ましくは、セルロース、アルキルセルロース、メチルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギン酸塩、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ-N-グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、ポリグルロン酸、前記多糖の誘導体またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本発明のマトリックスはまた、合成ポリマーをベースとするものであり得る。合成吸収性ポリマーは、脂肪族ポリエステルポリマー、脂肪族ポリエステルコポリマーまたはそれらの組み合わせであり得る。
本発明のマトリックスはまた、繊維から作製される織布または不織布の形態で提供され得る。このような繊維は、好ましくは、生体適合性および/または生分解性材料から作製される。止血用布地を提供するために、多くのこのような繊維がこれまでに使用されてきた。いくつかの実施形態では、このような不織布または織布は、ペクチン、アセチル化ペクチン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体などの1つまたはそれを超える多糖を含み得る。いくつかの実施形態では、ペクチンおよび/またはアセチル化ペクチンは、サトウダイコンに由来し得る。他の実施形態では、多糖は、非セルロースの多糖であり得る。織布または不織布はまた、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(t-カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリカプロラクトン、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸)、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-コ-3-ヒドロキシ吉草酸)、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、ゼラチン、フィブリノゲン、エラスチン、ポリエーテル、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリトリメチレンカーボネートなどを含む他の生分解性ポリマーを含む繊維を含み得る。加えて、綿、絹および羊毛などの天然タンパク質繊維も使用され得る。
本発明のマトリックス材料は、好ましくは、流動性止血薬のための粉末またはマトリックスを含む様々な形態の顆粒として提供され得る。例えば、顆粒は、1~1.000μm、好ましくは10~1.000μm、特に200~800μmの(平均粒子)サイズを有し得る。流動性止血薬として適切なマトリックスは、例えば、国際公開第98/08550A号または国際公開第2003/007845号Aに開示されている。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、マトリックス材料としてポリビニルアルコール(PVA)を使用する。PVAは、ポリ酢酸ビニルの部分的加水分解から生じる水溶性ポリマーである。本発明のマトリックスとして使用されるPVA系ヒドロゲルは、それらの優れた生体適合性(FDA承認)のために、組織工学および薬物送達システムにおいて広く使用されている[16a,b]。加えて、PVAヒドロゲルは、ほとんどの他の合成ヒドロゲルよりも比類なく強いことが周知である。
本発明は、止血に適切なマトリックスに共有結合されたトロンビン受容体活性化剤を使用する。トロンビン受容体活性化剤の好ましい実施形態は、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)である。TRAPは、トロンビン受容体の新たなN末端領域に対応する様々なアミノ酸長のペプチドのファミリーである。これらの合成ペプチドまたは組換えペプチドは、トロンビン受容体タンパク質の細胞外部分の活性化形態を模倣し、トロンビンアゴニストとして機能する。
米国特許第5,256,766号Aおよび国際公開第96/40033A1号には、例えば血友病の内部出血部位への局所適用における血液凝固を促進するために有用なTRAPまたは「アゴニスト」を含有する医薬化合物および止血パッチが記載されている。アゴニストは、線維芽細胞増殖およびそれと同時に血小板凝集を刺激するトロンビンの能力を模倣するものとして開示されている。したがって、TRAPは、止血および創傷治癒の促進において有用であり得る。TRAPの使用によって、トロンビンおよびフィブリノゲンなどの生物学的化合物を全く含まず、ウイルス汚染の付随する危険性を全く伴わないことを可能にする有効な止血材および止血包帯が提供され得る。
本発明の材料に組み込まれ得る代表的なTRAPとしては、トロンビン受容体を活性化することができるペプチド、例えば米国特許第5,256,766号において式AAx--AAy--(AAi)n--zで識別されるアゴニストが挙げられる。
開示されている他のTRAPであって、線維芽細胞を活性化し、創傷治癒に関与する他のTRAPとしては、ペプチドTRAP 508~530、アミノ酸AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV(配列番号2);およびTRAP 517~530、アミノ酸RGDACEGDSGGPFV(配列番号3)が挙げられる。さらなる適切なTRAPは、Carneyら、J.Clin Invest.89:14691477(1992);Furmanら、PNAS 95(1998),3082-3087およびCromackら、J.Surg.Res.53:117(1992)に開示されている。したがって、本発明において有用な適切なTRAPとしては、例えば、ペプチドSFLLRNPNDKYEPF(配列番号4)、SFLLRNPNDKYEP(配列番号5)、SFLLRNPNDKYE(配列番号6)、SFLLRNPNDKY(配列番号7)、SFLLRNPNDK(配列番号8)、SFLLRNPND(配列番号9)、SFLLRNPN(TRAP8(配列番号10))、SFLLRNP(TRAP7(配列番号11))、SFLLRN(TRAP6)、SFLLR、SFLLおよびSFLならびにそれらのアミド化形態が挙げられる。TRAPは小さいペプチドであるので、それらは、トロンビンなどの大型タンパク質性血小板活性化剤よりも安定である。TRAPの安定性は、冷凍せずに保存することを可能にする本材料の特性に寄与する。
好ましくは、TRAPをマトリックスに共有結合によりカップリングするために、トロンビン受容体活性化剤(好ましくは、TRAP)は、リンカーと共に提供される。好ましいリンカーは、アミノ酸(単一アミノ酸、例えばシステイン、アルギニン、リジン、セリン、グリシンなど(好ましくは、システイン)であるか、または例えば2~5個のアミノ酸残基を有する短いアミノ酸リンカーであって、好ましくは、システイン、アルギニン、リジン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびグリシンの群より選択されるアミノ酸を含む短いアミノ酸リンカーである。好ましいジペプチドリンカーは、Cys-Gly-(末端の「-」は、トロンビン受容体活性化剤に対する結合を示す)、-Gly-Cys、Cys-Arg-、-Arg-Cys、-Asn-Cys、Cys-Asn-、-Pro-Cys、Cys-Pro-であり得る;好ましいトリペプチドリンカーは、Cys-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Cys、-Pro-Asn-Cys、Cys-Asn-Pro-、Cys-Pro-Asn-、-Asn-Pro-Cysなどであり得るか、または担体もしくはマトリックスに対する医薬ペプチドカップリングについて公知の2~5個のアミノ酸残基を含む任意の他のペプチドリンカーであり得る。
特に好ましい実施形態によれば、本材料のトロンビン受容体活性化剤は、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合(配列番号12))、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合(配列番号13))、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合(配列番号14))またはそれらのアミド化形態およびまたはこのような因子の混合物である。
本発明の止血材は、止血材を必要とするヒト患者の処置に使用可能な任意の適切な形態(すなわち、流動可能形態もしくは噴霧可能形態;二次元形態(三次元拡大が他の二次元と比較して比較可能な程度に小さい場合(例えば、1/10または1/20未満));または三次元形態(例えば、スポンジ、ペースト、口腔インプラントなど))を有し得る。本発明の材料の好ましい二次元実施形態または三次元実施形態は、例えば、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、好ましくは(例えば、抜歯のための)シリンダーもしくはコーンであり得るか、またはフレキシブルもしくは非フレキシブルな足場、微粒子状材料もしくは粒状材料もしくはシートとして使用され得る。材料を創傷に適用して血小板凝集を達成したら、マトリックスが創傷から流体を吸収して、創傷からさらなる血液凝固成分を誘引することができることが特に好ましい。さらに、材料は、好ましくは可撓性であり、様々な形状を有する多様な組織および場所に適用するために適切である。
本発明の止血材のさらに好ましい実施形態は、さらなる成分、例えば抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、例えばアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞などを含む。しかしながら、好ましい実施形態では、材料が、止血材の保存性または投与に悪影響を及ぼし得る成分を含まない限り、本発明の材料は、このようなさらなる成分を有していてもよいし、または有していなくてもよい。したがって、本止血材は、好ましくは、いかなるタンパク質分解活性も本質的に含まず、特にプロテアーゼ活性を含まず、具体的にはトロンビン活性を含まない。フィブリン切断および血餅形成を促進するために、トロンビンが止血材に添加されることが多い;しかしながら、それは、止血材に対してタンパク質分解性であり得、特に、このような材料の生産および保管中に望ましくない可能性がある。本発明では、トロンビンまたは同程度の成分の添加または存在は必要ないので、止血材の止血特性に悪影響を及ぼさずに省略することができる。
好ましくは、本発明の止血材は、血液などの液体材料を吸い上げることができる状態で提供される。血液(ならびに血餅形成、出血終結および創傷閉鎖を促進するその中の成分)吸い上げる能力は、止血材の全体的な有効性を有意に増強する。例えば、本発明の止血材は、材料がさらなる液体材料を取り込む(すなわち、その浸漬体積未満の量の液体で浸漬される)ことを依然として可能にする乾燥形態または湿式形態で提供される。これにより、血液が止血材に流入および/またはそれを通過して、例えば、適用された材料の拡大体積または全体積(または事実上の全体積)での創傷閉鎖プロセスにおいて有用な血液成分を提供することが可能になる。
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の止血材を生産するための方法に関する。止血材を生産するためのこの方法は、トロンビン受容体活性化剤を止血マトリックスに共有結合によりカップリングする工程を特徴とする。
好ましくは、トロンビン受容体活性化剤は、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合)、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合)、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合)またはそれらのアミド化形態およびこれらの因子の混合物である。
当然のことながら、トロンビン受容体活性化剤は、生体適合性マトリックスに対する共有結合によるカップリング後にそのトロンビン受容体活性化活性を保持することが、本発明にとって重要である。いかなる生体分子も、生体適合性表面に単に結合してその生物機能性を保持し続けることはできない。本発明の生成過程において、本発明のトロンビン受容体活性化剤(例えば、TRAP6ペプチド)のC末端またはN末端を共有結合によりカップリングする従来の結合技術の使用は、通常、前記生物活性の喪失をもたらすことが判明した。したがって、(ペプチドである)トロンビン受容体活性化剤の完全な生物機能性を実際に保持する共有結合的固定アプローチの提供は自明ではなく、本明細書に含まれるこのような機能的実施形態を得るためには、本開示に依拠する必要がある。
例えば、ペプチドに関する伝統的なカップリング技術、例えば、EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド;C末端、AspおよびGluの反応)またはNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド;N末端、Lysの反応)を使用した技術の使用は、活性な固定化トロンビン受容体活性化剤をもたらさなかった(なぜならば、それらは通常、非特異的であり、酸性アミノ酸またはリジンと副反応する傾向があるためである(N末端に依拠するペプチドの不活性化など)[29],[30],[31])。システインおよび/またはマイケル付加を使用した技術もまた、アミン基との副反応の可能性により、機能喪失のリスクがある[32]。したがって、このような伝統的なカップリング技術は、活性の喪失をもたらす。ペプチド固定化のための様々な化学的アプローチが報告されているが[34]、これらの方法のほとんどは、C末端のカルボキシル基との反応(例えば、EDC)[29]、またはN末端の第1級アミンとの反応(例えば、NHS)[30],[31]、またはマレイミドもしくはビニルスルホン基に基づくマイケル付加を介したシステイン残基との反応に依拠する[32]。残念なことに、報告されているほとんどの反応は非特異的であり、酸性/塩基性アミノ酸(EDC/NHSの場合)またはアミン基(マイケル付加の場合)のいずれかと副反応する傾向があり、ペプチド活性の好ましくない喪失を誘発する。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルコンジュゲーションは、ペプチドのN末端と反応させることによって、生物活性ペプチド(例えば、細胞接着性RGD)をポリマー基質上に共有結合により固定化するための最も頻繁に使用されるアプローチである[35]。第1級アミンは、NHSエステルの最も反応性の基であるが、最近の研究では、他のペプチド残基(例えば、チロシン、セリン、トレオニンの場合には-OH、アルギニンの場合にはグアニジニウム)で一連の副反応が起こり得ることが実証されている[30],[31]。さらに、TRAP(SFLLRN-)の構造-機能関係に関する先の研究では、ペプチド活性を維持するためのN末端のアミノ酸の重要性が強調された[36]。これらの考察を考慮して、その生物活性を保持するためには、(TRAP6などのペプチドである)トロンビン受容体活性化剤のN末端との副反応を回避するペプチド固定化アプローチを開発することが、本発明にとって重要であることが見出された。
したがって、本発明は、固定化形態のトロンビン受容体活性化活性剤(thrombin receptor activating active agent)であって、保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤を提供する。これにより、ペプチド固定化のための従来の最先端アプローチによる提供が実行可能でないことが判明した。したがって、本発明はまた、例えば、PVAノルボルネン上へのシステイン含有TRAP6の光クリックコンジュゲーションなどのバイオ直交反応を使用することによって、N末端もしくはC末端または酸性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸との副反応のリスクを伴わない特異的カップリング技術(上記を参照のこと)の選択を提供し、非常に高度のコンジュゲーション効率(>95%)、部位特異性およびモジュール性を提供する。このコンジュゲーションアプローチが、ノルボルネン基を有する他の基質、例えば天然由来分子(ゼラチン、ヒアルロナン、アルギン酸など)および合成類似体、例えばPEGにも適用可能であることは明らかである。加えて、本発明の生体適合性固体マトリックスとして適用されるポリマー基質、例えばPVA基質のサイズ(数百の反復単位)は、短いTRAP6配列よりもはるかに大きいので、このポリマー結合トロンビン受容体活性化活性ペプチドコンジュゲートは、その可溶性形態よりも、PAR-1受容体シグナル伝達を介して血液細胞によって内在化される確率が低い。全体として、(例えば、TRAP6ペプチド固定化の場合には光クリックコンジュゲーションによって)保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤を生体適合性固体マトリックスにカップリングすることによる本発明のアプローチは、局所止血および他の医療用途のための重要な実用的価値を提供する。
この方法の好ましい実施形態によれば、止血マトリックスは、化学基(例えば、アルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジン)、好ましくは、バイオ直交反応(例えば、チオール-エン付加、アルキン-アジド付加環化、ディールス-アルダー反応、ヒドラジド-ヒドラジン反応)によるトロンビン受容体活性化剤の高い効率の共有結合を可能にする基で官能化される。
好ましくは、トロンビン受容体活性化剤は、バイオ直交基(例えば、アルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジン)で操作されるペプチド配列で、特に-SH基を有するシステイン部分で改変される。
本発明の方法の好ましい実施形態では、止血材は、エン基、例えばノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネート、メタクリレートなどで官能化される。
本発明の方法の特に有利な実施形態によれば、化学的カップリングは、光誘導性反応によって、特にラジカル媒介性チオール-(ノルボルネン-)エン光クリックケミストリー([18aに概説されている])または(他の)光誘発性クリックケミストリー([18bに概説されている])によって実施される。
本止血材は、本分野で実施される通常の工程によって、例えば、適切な滅菌工程およびパッケージング工程によって、市販品として完成され得る。例えば、本材料は、好ましくは、異なる吸収波長を有する光開始剤(例えば、Irgacure 184,2959)、好ましくは水溶性開始剤(Irgacure 2959)の助けを借りて、UV/可視光線照射(200~500nm)によって処理され得る。このような照射は、通常、1~60分間の照射時間で実施されるが、特定の方法に応じて、より長い照射時間も適用され得る。本発明の材料は、最終的には、使用まで無菌性を保持するように滅菌包装され、(例えば、特定の製品情報リーフレットを添加することによって)適切な容器(箱など)にパッケージングされ得る。
別の態様によれば、本発明はまた、手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するための本発明の止血材に関する。本発明の止血材は、血小板由来成長因子の放出を増加させるために、および創傷治癒を促進するために特に適切および有効である。
これにより、本発明の止血材は、吻合をシーリングするための、縫合線をシーリングするための、および切除部位における止血を保護するための優れたツールとなる。
本発明の別の態様によれば、本発明の止血材はまた、患者への材料の投与に必要な他の成分と組み合わせたキット形態で提供され得る。例えば、止血材が流動性乾燥形態(例えば、顆粒または粉末として)または流動性ペーストとして提供され得る場合、患者への投与の直前に添加され得る適切な緩衝溶液をこのような材料に提供することが好ましい。このような緩衝溶液は、通常、(緩衝液成分、例えばリン酸塩、炭酸塩、TRISなど、緩衝系の他に)二価金属イオン、好ましくはCa2+イオン、または他の機能性成分(マトリックス上またはマトリックス中にまだ存在しない場合)、例えば抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、例えばアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞などを含有する。キットは、止血材を投与するための、または止血材の投与を準備するための手段、例えばシリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションなどをさらに含有し得る。
したがって、本発明は、キット、好ましくは、手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するためのキットに関し、このキットは、
-本発明の止血材、および
-好ましくは、緩衝溶液、特にCa2+イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも1つの投与デバイス
を含む。
-本発明の止血材、および
-好ましくは、緩衝溶液、特にCa2+イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも1つの投与デバイス
を含む。
したがって、緩衝溶液は、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分をさらに含む。あるいは、このキットはまた、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含んでもよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた、止血材。
(項目2)
前記生体適合性マトリックスが止血マトリックスであり、生体材料、好ましくはタンパク質、バイオポリマーまたは多糖マトリックス、特にコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、デンプンまたはキトサンマトリックス;および合成ポリマー、好ましくはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールまたはポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)からなる群より選択される、項目1に記載の止血材。
(項目3)
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合)、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合)、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合)またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、項目1または2に記載の止血材。
(項目4)
前記マトリックスが、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、好ましくは抜歯のためのシリンダーもしくはコーン、微粒子状材料もしくは粒状材料またはシートである、項目1~3のいずれか一項に記載の止血材。
(項目5)
前記マトリックスがポリビニルアルコールを含む、項目1~4のいずれか一項に記載の止血材。
(項目6)
項目1~5のいずれか一項に記載の止血材を生産するための方法であって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングする、方法。
(項目7)
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合)、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合)、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合)またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記トロンビン受容体活性化剤に結合する官能基で前記生体適合性マトリックスを活性化する、項目6または7に記載の方法。
(項目9)
好ましくはバイオ直交基、例えばアルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジンを有するペプチド配列で、特に-SH基を有するシステイン部分で、前記トロンビン受容体活性化剤を活性化する、項目6~8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
エン基で、特にノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネートまたはメタクリレートで、前記生体適合性マトリックスを活性化する、項目6~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
光反応によって、好ましくは光誘発性クリックケミストリー(光誘発性バイオ直交反応)によって、特にチオール-ノルボルネン光クリックケミストリーによって、前記化学的カップリングを実施する、項目6~10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するための、項目1~5のいずれか一項に記載の止血材。
(項目13)
好ましくは、手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するためのキットであって、
-項目1~5のいずれか一項に記載の止血材、および
-好ましくは、緩衝溶液、特にCa2+イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも1つの投与デバイス
を含む、キット。
(項目14)
前記緩衝溶液が、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分をさらに含む、項目13に記載のキット。
(項目15)
抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含む、項目13に記載のキット。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた、止血材。
(項目2)
前記生体適合性マトリックスが止血マトリックスであり、生体材料、好ましくはタンパク質、バイオポリマーまたは多糖マトリックス、特にコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、デンプンまたはキトサンマトリックス;および合成ポリマー、好ましくはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールまたはポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)からなる群より選択される、項目1に記載の止血材。
(項目3)
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合)、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合)、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合)またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、項目1または2に記載の止血材。
(項目4)
前記マトリックスが、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、好ましくは抜歯のためのシリンダーもしくはコーン、微粒子状材料もしくは粒状材料またはシートである、項目1~3のいずれか一項に記載の止血材。
(項目5)
前記マトリックスがポリビニルアルコールを含む、項目1~4のいずれか一項に記載の止血材。
(項目6)
項目1~5のいずれか一項に記載の止血材を生産するための方法であって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングする、方法。
(項目7)
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)、好ましくはTRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、SLIGKV(PAR-2(ヒト)の場合)、TFRGAP(PAR-3(ヒト)の場合)、GYPGQV(PAR-4(ヒト)の場合)またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記トロンビン受容体活性化剤に結合する官能基で前記生体適合性マトリックスを活性化する、項目6または7に記載の方法。
(項目9)
好ましくはバイオ直交基、例えばアルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジンを有するペプチド配列で、特に-SH基を有するシステイン部分で、前記トロンビン受容体活性化剤を活性化する、項目6~8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
エン基で、特にノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネートまたはメタクリレートで、前記生体適合性マトリックスを活性化する、項目6~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
光反応によって、好ましくは光誘発性クリックケミストリー(光誘発性バイオ直交反応)によって、特にチオール-ノルボルネン光クリックケミストリーによって、前記化学的カップリングを実施する、項目6~10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するための、項目1~5のいずれか一項に記載の止血材。
(項目13)
好ましくは、手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するためのキットであって、
-項目1~5のいずれか一項に記載の止血材、および
-好ましくは、緩衝溶液、特にCa2+イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも1つの投与デバイス
を含む、キット。
(項目14)
前記緩衝溶液が、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分をさらに含む、項目13に記載のキット。
(項目15)
抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはECEA、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含む、項目13に記載のキット。
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに例証されるが、それに限定されない。
実施例:
局所止血を誘導する合成血小板活性化ヒドロゲルマトリックスの開発
本実施例は、止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性PVA-TRAP6コンジュゲートおよび不溶性(架橋)PVA-TRAP6ヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)によって、本発明を実証する。本研究では、出血管理のために、TRAP6などのTRAP血小板活性化ペプチドを合成ヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化することができる(図7B)ことが初めて実証される。ポリマーコンジュゲートTRAP6ペプチドは、止血を安全かつ局所的に促進しながら血小板活性化のそれらの活性を維持するので、血小板活性化剤の全身放出は起こらないという仮説を、この止血材を用いて試験した。止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性PVA-TRAP6コンジュゲートおよび不溶性(架橋)PVA-TRAP6ヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)を設計した。高い効率のチオール-ノルボルネン光クリックケミストリーを使用して、これらの新たなポリマー-ペプチドコンジュゲートを調製した。回転トロンボエラストグラフィー(ROTEM)、血小板凝集アッセイ(Multiplate)およびフローサイトメトリー(FACS)を使用して、これらの材料が血小板を活性化することができる程度を系統的に特性評価した。
局所止血を誘導する合成血小板活性化ヒドロゲルマトリックスの開発
本実施例は、止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性PVA-TRAP6コンジュゲートおよび不溶性(架橋)PVA-TRAP6ヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)によって、本発明を実証する。本研究では、出血管理のために、TRAP6などのTRAP血小板活性化ペプチドを合成ヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化することができる(図7B)ことが初めて実証される。ポリマーコンジュゲートTRAP6ペプチドは、止血を安全かつ局所的に促進しながら血小板活性化のそれらの活性を維持するので、血小板活性化剤の全身放出は起こらないという仮説を、この止血材を用いて試験した。止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性PVA-TRAP6コンジュゲートおよび不溶性(架橋)PVA-TRAP6ヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)を設計した。高い効率のチオール-ノルボルネン光クリックケミストリーを使用して、これらの新たなポリマー-ペプチドコンジュゲートを調製した。回転トロンボエラストグラフィー(ROTEM)、血小板凝集アッセイ(Multiplate)およびフローサイトメトリー(FACS)を使用して、これらの材料が血小板を活性化することができる程度を系統的に特性評価した。
いくつかの止血戦略は、フィブリノゲンおよびトロンビンなどの血液成分の使用に依拠しており、高コストおよび短い保存期間という欠点がある。本実施例では、迅速な局所止血のために、費用効果の高い合成生体材料を開発する。ポリビニルアルコール(PVA)ヒドロゲル中で、トロンビンを使用する代わりに、トロンビン受容体アゴニスト-ペプチド-6(TRAP6)を共有結合により操作する。最初に、光コンジュゲーションを介してシステイン含有TRAP6をPVA-ノルボルネン(PVA-NB)の骨格に共有結合することによって、可溶性PVA-TRAP6を調製した。C2C12筋芽細胞を使用した細胞傷害性研究では、PVA-NBおよびPVA-TRAP6が非毒性であることが示された。トロンボエラストグラフィーにより、TRAP6の止血活性はコンジュゲート形態で保持されており、等濃度の遊離TRAP6溶液と同程度であったことが明らかになった。0.1%PVA-TRAP6溶液は、凝固時間(CT)を生理学的CTの約45%まで短縮することができる。血小板凝集アッセイおよびFACSによって、高い血小板活性化効率をさらに確認した。潜在的な臨床用途では、局所的な血小板活性化および止血のために、TRAP6提示ヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)を開発した。光重合されたPVA-NBヒドロゲル微粒子(PVA-NB-P)をTRAP6で生体機能化することによって、PVA-TRAP6-Pを調製した。PVA-TRAP6-Pは、CTを約50%まで有効に短縮することができることが実証された。FACSにより、PVA-TRAP6-Pは、可溶性TRAP6対照と同程度に血小板を活性化することができることが示された。要するに、PVA-TRAP6-Pは、安全な止血および創傷治癒のための有望な生体材料クラスである。
1.実験セクション
1.1.材料および試薬。
すべての試薬をSigma-Aldrichから購入し、特に明記しない限り、そのまま使用した。
1.1.材料および試薬。
すべての試薬をSigma-Aldrichから購入し、特に明記しない限り、そのまま使用した。
1.2.PVA-ノルボルネン(PVA-NB)の合成。
三口フラスコ中で、10gのPVA(22kDa)および20mgのp-トルエンスルホン酸を、250mLの無水DMSOに、アルゴン雰囲気下、60℃で1時間かけて溶解した。第2のフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、2gのシス-5-ノルボルネン-エンド-2,3-ジカルボン酸無水物(-OH基に対して0.1当量)を、50mLの無水DMSOに溶解した。得られた溶液を、PVAを含有する第1のフラスコに滴下した。反応を50℃で12時間維持した。反応後、10mM NaHCO3溶液に対して24時間透析し、続いて脱イオン(DI)水に対して12時間透析することによって、粗生成物を精製した。凍結乾燥後、PVA-NBを95%の収率で無色固体として得た。1H-NMR(D2O):δ(ppm):6.2(2H,s,-CH=CH-),3.3(2H,s,-C=CCH-CH-),3.1(2H,s,-C=C-CH-CH-),1.3(2H,s,-CH2-).置換度(DS):7.5%.
三口フラスコ中で、10gのPVA(22kDa)および20mgのp-トルエンスルホン酸を、250mLの無水DMSOに、アルゴン雰囲気下、60℃で1時間かけて溶解した。第2のフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、2gのシス-5-ノルボルネン-エンド-2,3-ジカルボン酸無水物(-OH基に対して0.1当量)を、50mLの無水DMSOに溶解した。得られた溶液を、PVAを含有する第1のフラスコに滴下した。反応を50℃で12時間維持した。反応後、10mM NaHCO3溶液に対して24時間透析し、続いて脱イオン(DI)水に対して12時間透析することによって、粗生成物を精製した。凍結乾燥後、PVA-NBを95%の収率で無色固体として得た。1H-NMR(D2O):δ(ppm):6.2(2H,s,-CH=CH-),3.3(2H,s,-C=CCH-CH-),3.1(2H,s,-C=C-CH-CH-),1.3(2H,s,-CH2-).置換度(DS):7.5%.
1.3.PVA-TRAP6コンジュゲートの合成。
チオール-エン光クリックコンジュゲーションによってシステイン含有TRAP6ペプチド(N-C:SFLLRNPNC(配列番号15)、China Peptide Co.)をPVA-NBの骨格に共有結合することによって、PVA-TRAP6を調製した。具体的には、60mgのPVA-NBを0.5%Irgacure 2959(I2959,BASF)のPBS溶液に溶解して、5%の最終マクロマー濃度を得た。この溶液に、100mgのTRAP6-Cysペプチド(NB基に対して1.2当量)を添加した。得られた溶液をアルゴン下で撹拌し、フィルタUV光(320~500nm)を20mWcm-2で300秒間照射した。Omnicure S2000 lampから、UV光を誘導した。
チオール-エン光クリックコンジュゲーションによってシステイン含有TRAP6ペプチド(N-C:SFLLRNPNC(配列番号15)、China Peptide Co.)をPVA-NBの骨格に共有結合することによって、PVA-TRAP6を調製した。具体的には、60mgのPVA-NBを0.5%Irgacure 2959(I2959,BASF)のPBS溶液に溶解して、5%の最終マクロマー濃度を得た。この溶液に、100mgのTRAP6-Cysペプチド(NB基に対して1.2当量)を添加した。得られた溶液をアルゴン下で撹拌し、フィルタUV光(320~500nm)を20mWcm-2で300秒間照射した。Omnicure S2000 lampから、UV光を誘導した。
1.4.PVA-NBヒドロゲルの調製。
PVA-NB(DS-7.5%)を0.5%I2959溶液に溶解し、10%の最終濃度を達成した。次いで、この溶液のアリコートを適量のジチオスレイトール(DTT)と混合して、-SH/-NB比をそれぞれ0.4(I)、0.8(II)、1.0および1.2(III)とした。マルチウェルPDMSモールド(ウェル直径:6mm)中で光重合によって、ヒドロゲルペレットを調製した。具体的には、PDMSモールド(厚さ:1.5mm)によって隔てられた、2つのガラスカバースリップ間に200μLのマクロマー溶液をピペッティングし、次いで、フィルタUV光(20mWcm-2)に600秒間曝露した。スライドからペレットを剥がし、滅菌PBSで洗浄した。
PVA-NB(DS-7.5%)を0.5%I2959溶液に溶解し、10%の最終濃度を達成した。次いで、この溶液のアリコートを適量のジチオスレイトール(DTT)と混合して、-SH/-NB比をそれぞれ0.4(I)、0.8(II)、1.0および1.2(III)とした。マルチウェルPDMSモールド(ウェル直径:6mm)中で光重合によって、ヒドロゲルペレットを調製した。具体的には、PDMSモールド(厚さ:1.5mm)によって隔てられた、2つのガラスカバースリップ間に200μLのマクロマー溶液をピペッティングし、次いで、フィルタUV光(20mWcm-2)に600秒間曝露した。スライドからペレットを剥がし、滅菌PBSで洗浄した。
1.5.PVA-NBヒドロゲル微粒子(PVA-NB-P)の調製。
ヒドロゲル前駆体溶液(I~III)を上述のように調製し、モールドとして10mL円筒形ガラスバイアルを使用する以外は同じ条件で光重合した。光重合後、ヒドロゲルシリンダーを100mLビーカーに移し、未反応のポリマーおよびPIを除去するために、PBS(2回交換)で12時間洗浄した。その後、液体N2で膨潤ヒドロゲルを凍結し、凍結乾燥した。最後に、RETSCH Cryomill RS232を使用して、乾燥PVA-NBマトリックスを微粉末に粉砕した。
ヒドロゲル前駆体溶液(I~III)を上述のように調製し、モールドとして10mL円筒形ガラスバイアルを使用する以外は同じ条件で光重合した。光重合後、ヒドロゲルシリンダーを100mLビーカーに移し、未反応のポリマーおよびPIを除去するために、PBS(2回交換)で12時間洗浄した。その後、液体N2で膨潤ヒドロゲルを凍結し、凍結乾燥した。最後に、RETSCH Cryomill RS232を使用して、乾燥PVA-NBマトリックスを微粉末に粉砕した。
1.6.TRAP6提示PVAヒドロゲル微粒子(PVA-TRAP6-P)の調製。
TRAP6-CysペプチドをPVA-NB-P上の残存NB基に共有結合することによって、PVA-TRAP6-Pを調製した。具体的には、100mgのPVA-NBを0.1%可視光PI(LAP)[19]のPBS溶液に分散させて、最終ポリマー含量を5%とした。この懸濁液に、特定量のTRAP6-Cysペプチド(NB基に対して1.2当量)を添加した。得られた懸濁液をアルゴン下で撹拌し、UV光(365nm)を20mWcm-2で300秒間照射した。Omnicure LX400 LED lampから、UV光を誘導した。
TRAP6-CysペプチドをPVA-NB-P上の残存NB基に共有結合することによって、PVA-TRAP6-Pを調製した。具体的には、100mgのPVA-NBを0.1%可視光PI(LAP)[19]のPBS溶液に分散させて、最終ポリマー含量を5%とした。この懸濁液に、特定量のTRAP6-Cysペプチド(NB基に対して1.2当量)を添加した。得られた懸濁液をアルゴン下で撹拌し、UV光(365nm)を20mWcm-2で300秒間照射した。Omnicure LX400 LED lampから、UV光を誘導した。
1.7.光レオメトリー。
以前に報告されているように[27]、モジュラー光レオメーター(Anton Paar MCR-302)によって光レオメトリーを実施した。具体的には、光ガイド(Omnicure S2000)からガラスプレートの底部に、MCR302をフィルタUV光(320~500nm)と一体化した。具体的には、光重合中のヒドロゲル製剤の硬化動態のリアルタイムモニタリングのために、プレート間振動光レオメトリーを適用した。Ocean Optics USB 2000+分光計によって決定したところ、プレート表面の光強度は、約20mW・cm-2であった。照射時間の関数として、サンプルの貯蔵弾性率(G’)および損失弾性率(G’ ’)をモニタリングすることができた。G’およびG’ ’クロスオーバーの近傍において、ゲル点を決定した。
以前に報告されているように[27]、モジュラー光レオメーター(Anton Paar MCR-302)によって光レオメトリーを実施した。具体的には、光ガイド(Omnicure S2000)からガラスプレートの底部に、MCR302をフィルタUV光(320~500nm)と一体化した。具体的には、光重合中のヒドロゲル製剤の硬化動態のリアルタイムモニタリングのために、プレート間振動光レオメトリーを適用した。Ocean Optics USB 2000+分光計によって決定したところ、プレート表面の光強度は、約20mW・cm-2であった。照射時間の関数として、サンプルの貯蔵弾性率(G’)および損失弾性率(G’ ’)をモニタリングすることができた。G’およびG’ ’クロスオーバーの近傍において、ゲル点を決定した。
1.8.水分取り込み。
一般的なプロトコール[28]を使用して、PVA-NBヒドロゲルの質量膨脹比を試験した。ヒドロゲルペレット(n=3)を上述のように調製し、DI H2O中、室温で24時間膨潤させた。湿ったペレットを計量して平衡膨潤質量(Ms)を決定し、次いで、凍結乾燥して乾燥重量(Md)を求めた。平衡質量膨潤比(Qm)をMs/Mdとして計算した。
一般的なプロトコール[28]を使用して、PVA-NBヒドロゲルの質量膨脹比を試験した。ヒドロゲルペレット(n=3)を上述のように調製し、DI H2O中、室温で24時間膨潤させた。湿ったペレットを計量して平衡膨潤質量(Ms)を決定し、次いで、凍結乾燥して乾燥重量(Md)を求めた。平衡質量膨潤比(Qm)をMs/Mdとして計算した。
1.9.MTTアッセイ。
MTTアッセイによって、PVA、PVA-NBおよびPVA-TRAP6マクロマー溶液の細胞傷害性を評価した。5%ウシ胎仔血清(FCS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(すべてがSigma-Aldrich,Austria製)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、C2C12細胞を培養した。3つの濃度(5%、1%および0.1%)のマクロマー溶液をDMEM培養培地で調製した。次いで、200μLの培養培地中で、C2C12細胞を細胞5×103個/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。24時間インキュベート(37℃、5%CO2)した後、100μLの各マクロマー溶液を細胞に三連で添加した。24時間インキュベートした後、細胞を滅菌PBSで2回洗浄してから、100μLのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド(MTT)希釈標準溶液(PBS中5mg/mL)を添加した。1時間インキュベートした後、液体を廃棄し、100μlのDMSOを添加して、ホルマザン結晶を溶解した。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を540nmで測定した。
MTTアッセイによって、PVA、PVA-NBおよびPVA-TRAP6マクロマー溶液の細胞傷害性を評価した。5%ウシ胎仔血清(FCS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(すべてがSigma-Aldrich,Austria製)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、C2C12細胞を培養した。3つの濃度(5%、1%および0.1%)のマクロマー溶液をDMEM培養培地で調製した。次いで、200μLの培養培地中で、C2C12細胞を細胞5×103個/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。24時間インキュベート(37℃、5%CO2)した後、100μLの各マクロマー溶液を細胞に三連で添加した。24時間インキュベートした後、細胞を滅菌PBSで2回洗浄してから、100μLのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド(MTT)希釈標準溶液(PBS中5mg/mL)を添加した。1時間インキュベートした後、液体を廃棄し、100μlのDMSOを添加して、ホルマザン結晶を溶解した。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を540nmで測定した。
1.10.回転トロンボエラストメトリー(ROTEM)。
ROTEM(TEM Innovation,Germany)を適用して、血小板活性化ポリマーと全血との相互作用を経時的にモニタリングした。ROTEMシステムは振動センサーピンを含有しており、これを、血液サンプルを含有する温度制御キュベットに浸漬する。同じデバイスで、4回の測定を並行して実施することができる。一般に、再石灰化によって、クエン酸血サンプルの凝固を開始させる。統合コンピュータによって、フィブリン塊の形成動態を機械的にモニタリングし、典型的な曲線および数値パラメータに計算することができる。
ROTEM(TEM Innovation,Germany)を適用して、血小板活性化ポリマーと全血との相互作用を経時的にモニタリングした。ROTEMシステムは振動センサーピンを含有しており、これを、血液サンプルを含有する温度制御キュベットに浸漬する。同じデバイスで、4回の測定を並行して実施することができる。一般に、再石灰化によって、クエン酸血サンプルの凝固を開始させる。統合コンピュータによって、フィブリン塊の形成動態を機械的にモニタリングし、典型的な曲線および数値パラメータに計算することができる。
21ゲージの針を介して、正中静脈からの最小静止を使用して、3人の未治療健常ドナーから血液を収集した。最初の3mlを廃棄した後、血液を、0.3mlの緩衝3.2%クエン酸ナトリウムを含有する3.5mlチューブ(Vacuette;Greiner Bio-One)に収集した。分析前に、サンプルを37℃の予熱段階で少なくとも10分間維持し、3時間以内に処理した。20μlのCaCl2(star-TEM(登録商標)、200mM)を添加して再石灰化することによって、全血サンプルのROTEM分析を開始した。クエン酸塩添加血の再石灰化直後に、ポリマー溶液および/またはポリマー懸濁液をキュベットに直接添加し、以前に報告されているように[21]、上下に穏やかにピペッティングすることによって混合した。ROTEMキュベット当たりの最終反応体積は370μlであり、300μlのクエン酸塩添加全血、20μlのCaCl2および50μlのポリマー溶液またはポリマー懸濁液から構成されていた。
以下のROTEMパラメータはシグナルから計算したものであり、統計分析に含めた:凝固時間(CT)(秒)(sec)、すなわち、血餅が2mmの堅さに達するまでの待ち時間(これは、初期フィブリン形成の尺度である);血餅形成時間(CFT)(秒)、すなわち、血餅がCTから20mmの堅さ(firmness)に達するまでの待ち時間(これは、血小板機能およびフィブリノゲン品質を示す);α角(x軸と、CT点から始まる成形曲線の接線との間の角度(°))(これは、CFTと比較可能である);最大血餅堅さ(MCF)(mm)(血餅の絶対強度を示す曲線の最大振幅);およびA30(mm)、すなわち、30分後の血餅堅さ
1.11.Multiplate分析。
Multiplate試験の原理は、活性化により血小板は粘着性になるので、Multiplate試験キュベット中の金属センサーワイヤー上に付着および凝集する傾向があるという事実に基づいている。センサーワイヤーは、銀コーティングされた高導電性銅で作られている。活性化血小板がセンサーワイヤー上に付着および凝集するにつれて、ワイヤ間の電気抵抗が上昇し、これをリアルタイムでモニタリングすることができる。各測定のために、300μLの生理食塩水および300μLのヒルジン化全血をMultiplateキュベットに連続的に添加した。37℃で3分間インキュベートした後、20μLのサンプル溶液を添加し、それと同時に、プログラムがシグナルを収集し始めた。Multiplateデバイスは、並行して4回の測定を可能にする。各測定を重複して6分間実施した。
1.12.FACS分析。
2人の未治療健常ドナーの血液を収集し、クエン酸ナトリウムによって安定化した。110μLの全血(WB)に、20μLのPVA-TRAP6溶液(2mMおよび0.2mMのWB中で最終TRAP6濃度を得るために30mgmL-1および3mgmL-1)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。20μlのTRAP6-C溶液(14mgmL-1)および/または20μLのNaCl溶液(0.9%)をそれぞれ陽性対照および陰性対照として添加した。インキュベートした混合物を300μLの1%パラホルムアルデヒドと室温で15分間混合した。洗浄および遠心分離した後、CD41に対する20μLのフィコエリトリン(PE)標識モノクローナル抗体およびCD62Pに対する20μLのアロフィコシアニン(APC)標識モノクローナル抗体を使用して、二重免疫染色を実施した。アイソタイプ対照を、それぞれAPCまたはPE色素とコンジュゲートしたマウスIgG抗体と共にインキュベートした(すべての抗体は、BD Biosciences,Heidelberg,Germanyから購入した)。室温で30分間インキュベートした後、蛍光フローサイトメトリーを使用して、血小板の活性化状態を決定した。Uniphase Argon ion laser,488nm,20mW outputを備えるBeckmann Coulter Cytomics FC-500を使用して、血小板活性化マーカーCD62Pおよび構成的に存在する血小板マーカーCD41の発現を検出した。全体として、1サンプル当たり100000個の血小板を測定し、Cytomics CXPソフトウェアを用いて分析した。実験を2回反復した。
1.13.統計。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す。スチューデントt検定によって、統計的有意性を決定した(「*」、「**」、「***」は、それぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001を示す)。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す。スチューデントt検定によって、統計的有意性を決定した(「*」、「**」、「***」は、それぞれP<0.05、P<0.01、P<0.001を示す)。
2.結果および考察
2.1.材料の設計および合成
本研究では、以下の理由により、強力な血小板活性化ペプチド(TRAP6)の共有結合による固定化のための基質として、線状合成ポリマーポリビニルアルコール(PVA)を選択した。第1に、PVAは、優れた費用対効果および細胞適合性を有するFDA承認ポリマーであるので、多くの生物医学的用途にとって興味深い[17]。第2に、PVAにおける多数のヒドロキシル基の存在は、生物活性リガンドの調節可能な機能化および提示のための重要な自由度を提供するが、これは、アーム依存性ポリエチレングリコール(PEG)などの他の合成基質では利用可能ではない。
2.1.材料の設計および合成
本研究では、以下の理由により、強力な血小板活性化ペプチド(TRAP6)の共有結合による固定化のための基質として、線状合成ポリマーポリビニルアルコール(PVA)を選択した。第1に、PVAは、優れた費用対効果および細胞適合性を有するFDA承認ポリマーであるので、多くの生物医学的用途にとって興味深い[17]。第2に、PVAにおける多数のヒドロキシル基の存在は、生物活性リガンドの調節可能な機能化および提示のための重要な自由度を提供するが、これは、アーム依存性ポリエチレングリコール(PEG)などの他の合成基質では利用可能ではない。
TRAP6ペプチドをPVA上に導入するために、本発明者らは、コンジュゲーションアプローチとして、ロバストなチオール-エン光クリックケミストリーを選択した。一方、チオール-エン反応に向かう反応性が非常に高く、細胞傷害性が低いので[18,19]、エン官能基としてノルボルネン基を選択した。他方、TRAP6配列のN末端は、その血小板活性化能力に重要であることが認められているので[15]、本発明者らは、遊離チオール基を有するシステイン部分をTRAP6ペプチド配列(SFLLRNPNC)のC末端に操作した。
DMSO中、50℃で、12時間にわたるPVAとノルボルネン無水物との間の簡易エステル化反応によって、PVA-NBを合成した(図1A)。この改変アプローチの顕著な利点の1つは、改変後に、多数のカルボキシレート基をナトリウム塩形態に中和して、優れた水溶性を有する生成物を提供することができることである。中和のために10mM NaHCO3に対して、その後にH2Oに対して連続透析を行うことによって粗生成物を精製し、最後に凍結乾燥した(収率>95%)。合成を確認するために、1H-NMRを使用して、未改変PVAと比較してPVA-NBを分析した。図1B(下)に示されているように、未改変PVAのスペクトルは、それぞれ-CH-およびメチレン基に対応する4.0ppmおよび1.6ppmの2つの主要ピークを表す。PVA-NBのスペクトル(図1B、中央)は、それぞれ6.2ppm(s,2H、-CH=CH-)、3.3ppm(s,2H、-C=C-CH-CH-)、3.1ppm(s,2H、-C=C-CH-CH-)および1.3ppm(s,2H、-CH2-)における新たなピークを示す。シグナル(a、d、f)に対応する整数値を比較することによって、PVA-NBの置換度(DS)を決定した。反応物間の化学量論または反応時間のいずれかを変化させることによって、5%~50%の広範囲でDSを正確に制御することが可能であった(表S1)。PVA(22kDa)は、約500個の反復単位からなる線状ポリマーであるので、本発明者らは、最も低いDS(DS-7%)を有するPVA-NBを前駆体として選択し、システイン含有ペプチドとの光コンジュゲーションのための約35個の反応部位を得た。
システイン含有TRAP6ペプチドと、光開始剤(PI)であるI2959のPBS溶液中PVA-NBのNB基との光コンジュゲーションによって、PVA-TRAP6コンジュゲートを調製した。コンジュゲーション効率を確認するために、最初に、D2O中でNMRモデル反応を実施した。NMR反応に基づいて、図1B(上段)は、PVA-TRAP6コンジュゲートのスペクトルを表す。6.2ppmにおけるNBプロトンシグナル(a)の有意な減少は、コンジュゲーションの成功を示す。その上、PVA-TRAP6のスペクトルはまた、TRAP6配列におけるフェニルアラニン(PheまたはF)部分の芳香族プロトンに対応する7.4ppmにおける新たなピークを示す。
2.2.インビトロ細胞傷害性
生物医学的用途に関する調製材料の適用性を証明するために、C2C12筋芽細胞を使用したMTTアッセイによって、PVA、PVA-NBおよびPVA-TRAP6溶液のインビトロ生体適合性を調査した。MTTアッセイにより、PVAおよびPVA-NB(図1C)の溶液は、24時間および48時間インキュベートした後、様々な濃度(0.1、0.5、1%)で非毒性であったことが示された。PVA-TRAP6コンジュゲートでは、24時間インキュベートした後のC2C12細胞の代謝活性(図1D)は、1%PVA-TRAP6と混合した場合に有意に増加したが(P<0.001)、0.5%および0.1%PVA-TRAP6では増加しなかった。48時間インキュベートした後、3つの濃度すべての代謝活性は、対照と比較して有意に増加した(P<0.001)。他のグループによるいくつかの研究では、TRAP6などのPAR-1活性化ペプチドは、ヒト歯肉線維芽細胞、内皮細胞、腸上皮細胞およびヒト筋肉筋芽細胞を含む異なる細胞型からのサイトカイン放出を刺激することができることが示されている[20a,b,c]。したがって、本発明者らは、MTTアッセイ中のC2C12筋芽細胞の代謝活性の増加が、TRAP6誘導性PAR-1活性化に起因すると推定する。1%PVA-TRAP6溶液は5mMのTRAP6濃度を与えるのに対して、血小板活性化のための有効なTRAP6濃度は5~100μMの範囲内であることを考慮すると[12]、毒性結果は、PVA-TRAP6が、その有効範囲内で細胞適合性材料であることを示唆している。
生物医学的用途に関する調製材料の適用性を証明するために、C2C12筋芽細胞を使用したMTTアッセイによって、PVA、PVA-NBおよびPVA-TRAP6溶液のインビトロ生体適合性を調査した。MTTアッセイにより、PVAおよびPVA-NB(図1C)の溶液は、24時間および48時間インキュベートした後、様々な濃度(0.1、0.5、1%)で非毒性であったことが示された。PVA-TRAP6コンジュゲートでは、24時間インキュベートした後のC2C12細胞の代謝活性(図1D)は、1%PVA-TRAP6と混合した場合に有意に増加したが(P<0.001)、0.5%および0.1%PVA-TRAP6では増加しなかった。48時間インキュベートした後、3つの濃度すべての代謝活性は、対照と比較して有意に増加した(P<0.001)。他のグループによるいくつかの研究では、TRAP6などのPAR-1活性化ペプチドは、ヒト歯肉線維芽細胞、内皮細胞、腸上皮細胞およびヒト筋肉筋芽細胞を含む異なる細胞型からのサイトカイン放出を刺激することができることが示されている[20a,b,c]。したがって、本発明者らは、MTTアッセイ中のC2C12筋芽細胞の代謝活性の増加が、TRAP6誘導性PAR-1活性化に起因すると推定する。1%PVA-TRAP6溶液は5mMのTRAP6濃度を与えるのに対して、血小板活性化のための有効なTRAP6濃度は5~100μMの範囲内であることを考慮すると[12]、毒性結果は、PVA-TRAP6が、その有効範囲内で細胞適合性材料であることを示唆している。
2.3.止血活性
2.3.1.トロンボエラストメトリー
次に、本発明者らは、回転トロンボエラストメトリー(ROTEM)[21,22](これは、凝固中の血餅の粘弾性特性のインサイチュー特性評価を可能にする臨床診断ツールである)を使用して、TRAP6およびPVA-NBと比較して、PVA-TRAP6の止血有効性を研究した。図2Aは、再石灰化全血と混合した研究サンプルのROTEM曲線のプロットを示す。凝固時間(CT)は、血餅が2mmの堅さに達するまでの待ち時間を指し、最大血餅硬度(MCF)は、血餅の絶対強度を示す曲線の最大振幅を指す。
2.3.1.トロンボエラストメトリー
次に、本発明者らは、回転トロンボエラストメトリー(ROTEM)[21,22](これは、凝固中の血餅の粘弾性特性のインサイチュー特性評価を可能にする臨床診断ツールである)を使用して、TRAP6およびPVA-NBと比較して、PVA-TRAP6の止血有効性を研究した。図2Aは、再石灰化全血と混合した研究サンプルのROTEM曲線のプロットを示す。凝固時間(CT)は、血餅が2mmの堅さに達するまでの待ち時間を指し、最大血餅硬度(MCF)は、血餅の絶対強度を示す曲線の最大振幅を指す。
ROTEMの結果から、0.1mMのPVA-TRAP6のCTは0.1mMのTRAP6のものと全く同程度であったが、PVA-TRAP6のMCFはTRAP6対照のものと比べて相対的に小さかったことが観察された。より小さいMCFは、PVA-TRAP6(これは高分子コンジュゲート(65kDa)であり、TRAP6(1kDa)よりも有意に大きい)におけるコンジュゲーション後の血小板に対するTRAP6-のアクセシビリティの減少に起因する可能性がある。比較すると、PVA-NB対照(図2C)は、生理学的曲線(NaCl対照)に非常に類似した曲線を示し、PVA-NB骨格の止血活性を示さなかった。
PVA-TRAP6の止血活性は用量依存的であるか否かを試験するために、本発明者らは、ROTEMによって、3つのペプチド濃度(0.01、0.1、1mM)のTRAP6溶液と比較して、PVA-TRAP6溶液を試験した(図2B)。PVA-TRAP6の最適な止血濃度は0.1mMであったが、TRAP6対照については、選択範囲内で有意な用量影響はなかったことが見出された。これもやはり、血小板活性化について、TRAP6の飽和レベルに対するPVA-TRAP6およびTRAP6ペプチドの差示的分子構造の影響を示唆している可能性がある。
2.3.2.Multiplate分析
血小板活性化の程度を定量するために、本発明者らは、Multiplateアッセイを利用して、血小板凝集に対するPVA-TRAP6、TRAP6およびPVA-NBの影響を調査した。この方法の原理は、活性化により血小板は粘着性になるので、Multiplate試験キュベット中の金属センサーワイヤー上に付着および凝集する傾向があるという事実に基づいている。活性化血小板がセンサーワイヤー上に付着および凝集するにつれて、ワイヤ間の電気抵抗が上昇し、これを連続的にモニタリングすることができる。典型的なMultiplate曲線(図2D)は、血小板凝集の程度に対応する電子シグナルの蓄積を表す。Multiplateアッセイの1つの重要なパラメータは、凝集面積(ユニット)、すなわち凝集曲線下面積である。PVA-TRAP6(0.1mM)は、TRAP6(0.1mM)のものと同程度の凝集曲線(図2D)を誘導したが、PVA-NB対照は、無視可能な血小板凝集能力を示したことが観察された。TRAP6の凝集面積値(図2E)は147Uであったのに対して、PVA-TRAP6およびPVA-NBの面積値はそれぞれ130Uおよび2Uであった(p<0.001)。まとめると、Multiplateアッセイにより、血小板活性化について、PVA-TRAP6は高い効率を示したが、基質(PVA-NB)は示さなかったことが証明された。
血小板活性化の程度を定量するために、本発明者らは、Multiplateアッセイを利用して、血小板凝集に対するPVA-TRAP6、TRAP6およびPVA-NBの影響を調査した。この方法の原理は、活性化により血小板は粘着性になるので、Multiplate試験キュベット中の金属センサーワイヤー上に付着および凝集する傾向があるという事実に基づいている。活性化血小板がセンサーワイヤー上に付着および凝集するにつれて、ワイヤ間の電気抵抗が上昇し、これを連続的にモニタリングすることができる。典型的なMultiplate曲線(図2D)は、血小板凝集の程度に対応する電子シグナルの蓄積を表す。Multiplateアッセイの1つの重要なパラメータは、凝集面積(ユニット)、すなわち凝集曲線下面積である。PVA-TRAP6(0.1mM)は、TRAP6(0.1mM)のものと同程度の凝集曲線(図2D)を誘導したが、PVA-NB対照は、無視可能な血小板凝集能力を示したことが観察された。TRAP6の凝集面積値(図2E)は147Uであったのに対して、PVA-TRAP6およびPVA-NBの面積値はそれぞれ130Uおよび2Uであった(p<0.001)。まとめると、Multiplateアッセイにより、血小板活性化について、PVA-TRAP6は高い効率を示したが、基質(PVA-NB)は示さなかったことが証明された。
2.3.2.可溶性系のFACS
次に、本発明者らは、フローサイトメトリー(FACS)を利用して、血小板活性化の程度を定量した。GpIIIa(インテグリンβ3鎖)と非共有結合により会合してGpIIb/IIIa複合体を形成する血小板膜糖タンパク質GpIIbを認識する表面抗原CD41の構成的発現によって、血小板を他の血液細胞と区別することができる。重要なことに、CD62p(P-セレクチン)膜糖タンパク質は、活性化血小板上でのみ発現される。CD62pマーカーを使用して、研究材料(PVA-TRAP6、TRAP6、PVA-NBおよびNaCl)と共にインキュベートした後のヒト血小板における活性化の程度を識別した。これらの材料で15分間処理した血液サンプルにおけるCD41/CD62p共発現(図3A~C)の測定により、CD41p陽性細胞におけるCD62p発現に対するPVA-TRAP6(0.1mM)の効果は有意であった(約80%)ことが明らかになった。CD62p陽性細胞に関する活性化血小板表現型の割合は、TRAP6(0.1mM)で処理した対照サンプルと同じレベルにとどまった。対照的に、CD41陽性細胞におけるCD62p発現に対するPVA-NBの効果は有意ではなかった(<10%)(これは、0.9%NaClで処理した陰性対照サンプルと同じレベルであった)。全体として、FACS分析により、血小板活性化に関するPVA-TRAP6の高い効率がさらに確認された。
次に、本発明者らは、フローサイトメトリー(FACS)を利用して、血小板活性化の程度を定量した。GpIIIa(インテグリンβ3鎖)と非共有結合により会合してGpIIb/IIIa複合体を形成する血小板膜糖タンパク質GpIIbを認識する表面抗原CD41の構成的発現によって、血小板を他の血液細胞と区別することができる。重要なことに、CD62p(P-セレクチン)膜糖タンパク質は、活性化血小板上でのみ発現される。CD62pマーカーを使用して、研究材料(PVA-TRAP6、TRAP6、PVA-NBおよびNaCl)と共にインキュベートした後のヒト血小板における活性化の程度を識別した。これらの材料で15分間処理した血液サンプルにおけるCD41/CD62p共発現(図3A~C)の測定により、CD41p陽性細胞におけるCD62p発現に対するPVA-TRAP6(0.1mM)の効果は有意であった(約80%)ことが明らかになった。CD62p陽性細胞に関する活性化血小板表現型の割合は、TRAP6(0.1mM)で処理した対照サンプルと同じレベルにとどまった。対照的に、CD41陽性細胞におけるCD62p発現に対するPVA-NBの効果は有意ではなかった(<10%)(これは、0.9%NaClで処理した陰性対照サンプルと同じレベルであった)。全体として、FACS分析により、血小板活性化に関するPVA-TRAP6の高い効率がさらに確認された。
2.4.PVAヒドロゲルの調製および特性評価
国際公開第96/40033号などにおける可溶性形態または放出可能形態の血小板活性化PVA-TRAP6は、循環中の血栓症リスクを引き起こす可能性があるので、本発明者らは、局所止血のための不溶性PVA-TRAP6系をさらに開発し、それにより、TRAP6ペプチドを光架橋PVAヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化した。本発明者らは、PVAヒドロゲルマトリックスを作るアプローチとして、ラジカル媒介性チオール-NB光重合を選択した(図4A)。(メタ)アクリレートの従来の架橋化学反応とは対照的に、チオール-NB光重合は、ロバストな動態、優れた時空間制御および細胞適合性条件を含むいくつかの利点を提供する[19,23]。例えば、PEGベースのチオール-NBヒドロゲルは、高い生存率(>90%)を有する哺乳動物細胞のインサイチュー光カプセル化を可能にした[19]。本研究では、モデルの架橋剤(ジチオスレイトール、DTT)と組み合わせたPVA-NBマクロマーを、水溶性かつ生体適合性PIとしてのI2959の存在下で、UV照射によって光重合した。
国際公開第96/40033号などにおける可溶性形態または放出可能形態の血小板活性化PVA-TRAP6は、循環中の血栓症リスクを引き起こす可能性があるので、本発明者らは、局所止血のための不溶性PVA-TRAP6系をさらに開発し、それにより、TRAP6ペプチドを光架橋PVAヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化した。本発明者らは、PVAヒドロゲルマトリックスを作るアプローチとして、ラジカル媒介性チオール-NB光重合を選択した(図4A)。(メタ)アクリレートの従来の架橋化学反応とは対照的に、チオール-NB光重合は、ロバストな動態、優れた時空間制御および細胞適合性条件を含むいくつかの利点を提供する[19,23]。例えば、PEGベースのチオール-NBヒドロゲルは、高い生存率(>90%)を有する哺乳動物細胞のインサイチュー光カプセル化を可能にした[19]。本研究では、モデルの架橋剤(ジチオスレイトール、DTT)と組み合わせたPVA-NBマクロマーを、水溶性かつ生体適合性PIとしてのI2959の存在下で、UV照射によって光重合した。
2.4.1.光レオメトリー
本発明者らは、インサイチュー光レオメトリーを利用して、PVAヒドロゲルの光反応性および機械的特性を試験した。チオール対NB比を調整することによって、PVAヒドロゲルの化学的-物理的特性を容易に調整することができると仮説した。等しいマクロマー含量(10%)を有するがチオール対NB比(0.4、0.8、1.0、1.2)が異なる4つのPVA-NB/DTT製剤を、光レオメトリーでスクリーニングした(図4B)。60秒間のブランク期間(UVなし)後、UV照射により、PVAヒドロゲルの貯蔵弾性率(G’)は、G’-プラトーに達するまで、数秒間で異なる程度(8~120kPa)に増加した。光重合PVAヒドロゲルはすべて完全に透明であったことが見出された(図4C)。チオール対NB比を0.4から1.2に増加させることによって、G’-プラトー値(図4D)は、それぞれ8、22、120から45kPaに変化した。最も高いG’-プラトー値はヒドロゲル(III)の場合に得られ、チオール対NB比は1:1であったが、これは、最も高い架橋度を示している。特に、膨潤プロセスはヒドロゲルの貯蔵弾性率に影響を及ぼし得るので[24]、光レオメトリー測定からのこれらのG’プラトー値は、プレ膨潤状態のPVAヒドロゲルの一時的な貯蔵弾性率を表し得るに過ぎない。AFMナノインデンテーションなどの別のアプローチを使用することによって、膨潤PVAヒドロゲルの機械的特性に関するさらなる調査が必要である。
本発明者らは、インサイチュー光レオメトリーを利用して、PVAヒドロゲルの光反応性および機械的特性を試験した。チオール対NB比を調整することによって、PVAヒドロゲルの化学的-物理的特性を容易に調整することができると仮説した。等しいマクロマー含量(10%)を有するがチオール対NB比(0.4、0.8、1.0、1.2)が異なる4つのPVA-NB/DTT製剤を、光レオメトリーでスクリーニングした(図4B)。60秒間のブランク期間(UVなし)後、UV照射により、PVAヒドロゲルの貯蔵弾性率(G’)は、G’-プラトーに達するまで、数秒間で異なる程度(8~120kPa)に増加した。光重合PVAヒドロゲルはすべて完全に透明であったことが見出された(図4C)。チオール対NB比を0.4から1.2に増加させることによって、G’-プラトー値(図4D)は、それぞれ8、22、120から45kPaに変化した。最も高いG’-プラトー値はヒドロゲル(III)の場合に得られ、チオール対NB比は1:1であったが、これは、最も高い架橋度を示している。特に、膨潤プロセスはヒドロゲルの貯蔵弾性率に影響を及ぼし得るので[24]、光レオメトリー測定からのこれらのG’プラトー値は、プレ膨潤状態のPVAヒドロゲルの一時的な貯蔵弾性率を表し得るに過ぎない。AFMナノインデンテーションなどの別のアプローチを使用することによって、膨潤PVAヒドロゲルの機械的特性に関するさらなる調査が必要である。
2.4.2.水分取り込み
さらに、本発明者らは、PVAヒドロゲル(I~IV)の水分取り込み特性を分析した。光重合PVAヒドロゲルペレットをPBSに48時間浸漬して平衡湿潤重量(mwet)に達し、これを凍結乾燥後のポリマー乾燥重量(mdry)と比較し、平衡質量膨潤比(Qm)を求めた。図4Eに示されているように、ヒドロゲル(I~IV)のQm値は、130、45、10から17に変化した。G’-プラトー値と組み合わせると、これらのデータは、チオール対NB比が1:1(III)であった場合に、最も高い架橋度が得られたことを示唆している。この観察結果は、他のグループによるPEGベースのチオール-NBヒドロゲルに関する以前の研究[19,25]と相関する。例えば、Linらは、エステル結合が存在するので、チオール-NB光重合PEGヒドロゲルは加水分解により分解可能であることを実証した[25]。分解速度は、チオール対NB比およびマクロマー含量によって影響されるゲルの架橋密度に依存していた。示されているPVAヒドロゲルはまた、多くのエステル結合を有するので、本発明者らは、これらのヒドロゲルが加水分解により分解可能であると予想する。DTTの他に、別のジ-システインプロテアーゼ感受性ペプチドもまた、細胞リモデリングおよび創傷治癒を促進するために、酵素により切断可能な架橋剤として使用することができる。それにもかかわらず、示されているPVAヒドロゲルのインビトロおよびインビボにおける分解挙動に関するさらなる研究が必要である。
さらに、本発明者らは、PVAヒドロゲル(I~IV)の水分取り込み特性を分析した。光重合PVAヒドロゲルペレットをPBSに48時間浸漬して平衡湿潤重量(mwet)に達し、これを凍結乾燥後のポリマー乾燥重量(mdry)と比較し、平衡質量膨潤比(Qm)を求めた。図4Eに示されているように、ヒドロゲル(I~IV)のQm値は、130、45、10から17に変化した。G’-プラトー値と組み合わせると、これらのデータは、チオール対NB比が1:1(III)であった場合に、最も高い架橋度が得られたことを示唆している。この観察結果は、他のグループによるPEGベースのチオール-NBヒドロゲルに関する以前の研究[19,25]と相関する。例えば、Linらは、エステル結合が存在するので、チオール-NB光重合PEGヒドロゲルは加水分解により分解可能であることを実証した[25]。分解速度は、チオール対NB比およびマクロマー含量によって影響されるゲルの架橋密度に依存していた。示されているPVAヒドロゲルはまた、多くのエステル結合を有するので、本発明者らは、これらのヒドロゲルが加水分解により分解可能であると予想する。DTTの他に、別のジ-システインプロテアーゼ感受性ペプチドもまた、細胞リモデリングおよび創傷治癒を促進するために、酵素により切断可能な架橋剤として使用することができる。それにもかかわらず、示されているPVAヒドロゲルのインビトロおよびインビボにおける分解挙動に関するさらなる研究が必要である。
2.5.生体機能化
2.5.1.TRAP6機能化ヒドロゲル微粒子の調製
TRAP6機能化のための適切なヒドロゲルマトリックスを調製するために、光重合PVAヒドロゲル(I、-SH:-NB=0.4)を逐次的に凍結乾燥し、微小粒子に凍結粉砕した(図5A)。光重合後に過剰なNB基が存在するので、システイン含有TRAP6ペプチドとの光クリックコンジュゲーション(図5B)のために、これらの残存基を利用した。SEM分析(図5C)により、PVA-TRAP6-Pの長さスケールは5~50μmの範囲内であったことが明らかになった。PVA-TRAP6-Pの部分的な凝集はおそらく、NB基の電荷効果によるものであった。
2.5.1.TRAP6機能化ヒドロゲル微粒子の調製
TRAP6機能化のための適切なヒドロゲルマトリックスを調製するために、光重合PVAヒドロゲル(I、-SH:-NB=0.4)を逐次的に凍結乾燥し、微小粒子に凍結粉砕した(図5A)。光重合後に過剰なNB基が存在するので、システイン含有TRAP6ペプチドとの光クリックコンジュゲーション(図5B)のために、これらの残存基を利用した。SEM分析(図5C)により、PVA-TRAP6-Pの長さスケールは5~50μmの範囲内であったことが明らかになった。PVA-TRAP6-Pの部分的な凝集はおそらく、NB基の電荷効果によるものであった。
2.5.2.ROTEM分析
本発明者らは、ROTEMによって、PVA-NB-Pと比較して、PVA-TRAP6-Pの止血能力を試験した。試験前に、これらの微粒子を生理食塩水と慎重に混合して、注射可能なスラリーを形成した。図6A~Bに示されているように、PVA-TRAP6-Pを全血に添加すると、CTが生理学的CTの約50%まで有意に減少した。興味深いことに、PVA-NB-P対照もまた、CTが約70%まで減少した。負電荷表面が凝固に寄与することは公知であるので(すなわち、内因性経路)[26]、本発明者らは、PVA-NB-Pの観察された止血活性がNB基の電荷効果によるものであると推定する。
本発明者らは、ROTEMによって、PVA-NB-Pと比較して、PVA-TRAP6-Pの止血能力を試験した。試験前に、これらの微粒子を生理食塩水と慎重に混合して、注射可能なスラリーを形成した。図6A~Bに示されているように、PVA-TRAP6-Pを全血に添加すると、CTが生理学的CTの約50%まで有意に減少した。興味深いことに、PVA-NB-P対照もまた、CTが約70%まで減少した。負電荷表面が凝固に寄与することは公知であるので(すなわち、内因性経路)[26]、本発明者らは、PVA-NB-Pの観察された止血活性がNB基の電荷効果によるものであると推定する。
2.5.3.FACS分析
これらの微粒子状材料が血小板を活性化する能力を定量するために、本発明者らは、FACSによって、PVA-TRAP6-Pおよび/またはPVA-NB-Pと共にプレインキュベートした全血サンプルを分析した。FACS分析(図6C~F)により、PVA-TRAP6-Pの場合には、活性化血小板(CD41+/CD62p+)の割合は、陽性対照(0.1mM TRAP6)と同程度の約55%であったことが明らかになった。対照的に、PVA-NB-Pと共にインキュベートした血液サンプルは、最小量の活性化血小板(<10%)を示したに過ぎない。これらの結果は、TRAP6提示ヒドロゲルマトリックス(PVA-TRAP6-P)が、局所的に血小板を活性化する優れた効力を示すことを示している。
これらの微粒子状材料が血小板を活性化する能力を定量するために、本発明者らは、FACSによって、PVA-TRAP6-Pおよび/またはPVA-NB-Pと共にプレインキュベートした全血サンプルを分析した。FACS分析(図6C~F)により、PVA-TRAP6-Pの場合には、活性化血小板(CD41+/CD62p+)の割合は、陽性対照(0.1mM TRAP6)と同程度の約55%であったことが明らかになった。対照的に、PVA-NB-Pと共にインキュベートした血液サンプルは、最小量の活性化血小板(<10%)を示したに過ぎない。これらの結果は、TRAP6提示ヒドロゲルマトリックス(PVA-TRAP6-P)が、局所的に血小板を活性化する優れた効力を示すことを示している。
2.6.従来の固定化技術と、ペプチドトロンビン受容体活性化剤の活性を保存するカップリング技術との比較
適切な固定化技術を慎重に選択することの重要性を示すために、従来のペプチド固定化方法(例えば、NHSコンジュゲーション)と、本発明の過程で選択した方法、例えば光クリックコンジュゲーションとの比較を、ポリマー基質に対するTRAP6ペプチドの共有結合プロセスについて実施した。従来のペプチド固定化方法は、その生物活性の喪失をもたらすことが判明した。これは、トロンビン受容体活性化の欠如および血液凝固誘導の欠如をもたらし、得られた材料を局所止血に有用ではないものにする。
適切な固定化技術を慎重に選択することの重要性を示すために、従来のペプチド固定化方法(例えば、NHSコンジュゲーション)と、本発明の過程で選択した方法、例えば光クリックコンジュゲーションとの比較を、ポリマー基質に対するTRAP6ペプチドの共有結合プロセスについて実施した。従来のペプチド固定化方法は、その生物活性の喪失をもたらすことが判明した。これは、トロンビン受容体活性化の欠如および血液凝固誘導の欠如をもたらし、得られた材料を局所止血に有用ではないものにする。
NHSコンジュゲーションを介してポリマー-TRAP6を調製するために、末端NHS基(PEG-10k-NHS)を有するポリエチレングリコール(10kDa)をポリマー基質として使用した。N末端における反応を介してTRAP6をPEG-10k-NHSに連結し、未反応のNHS基をグリシンでブロッキングした。さらに、過剰なグリシンと反応したPEG-10k-NHSを陰性対照として調製した。蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した後、コンジュゲートを高収率で達成し、続いて、標準的な回転トロンボエラストメトリー(ROTEM)によって分析して、血液凝固に対するそれらの効果を研究した。異なるアプローチによって調製したポリマー-TRAP6コンジュゲートの生物活性を比較するために、特許請求の範囲に記載されている本発明者らのアプローチ(すなわち、光クリックコンジュゲーション)によって調製したPVA-TRAP6を陽性対照として含めた。サンプルは、1mM TRAP6、1mM PEG-TRAP6、1mM PEG-グリシン、1mM PVA-TRAP6および生理食塩水からなる。
図8に示されているように、非コンジュゲートTRAP6(1mM)は、生理食塩水対照と比較して、凝固時間(CT)および血餅形成時間(CFT)の有意な減少を誘導した。しかしながら、この効果は、従来のNHSコンジュゲーション手順を使用してTRAP6をPEG10kにコンジュゲートした場合には喪失した。PEG-グリシンコンジュゲート対照についても同様の効果を観察することができるが、これは、ポリマー骨格および調製手順の効果が最小であることを示している。それにもかかわらず、光クリックコンジュゲーションによって調製したPVA-TRAP6コンジュゲートは依然として、CTおよびCFTを有意に短縮することができたが、これは、TRAP6の生物活性が保持されていることを示している。要約すると、これらのデータは、伝統的なNHS固定化アプローチがTRAP6の生物活性を保持することができないことを示している。対照的に、チオール-ノルボルネン光クリックコンジュゲーションに基づく共有結合による固定化アプローチは、TRAP6ペプチドの完全な生物機能性をほとんど保持することができる。
血小板活性化に関するPVA-TRAP6コンジュゲートの能力をさらに実証するために、本発明者らは、標準的な血小板凝集アッセイ(Multiplate)およびフローサイトメトリー(FACS)によって、サンプルを試験した。図9Aに示されているように、等しいペプチド濃度では、PVA-TRAP6の総血小板凝集面積はTRAP6のものと同程度であるが、PVA-NB基質対照および生理食塩水対照は、無視可能なレベルの血小板凝集を示す。さらに、FACS結果(図9B)は、光クリックコンジュゲーションによって調製したPVA-TRAP6コンジュゲートが、血小板活性化(すなわち、CD41/CD62P共発現)を、TRAP6対照(1mM)と非常に類似のレベルまで誘導することができることを裏付けているが、PVA-NBおよび生理食塩水対照については、有意な血小板活性化を観察することができなかった。これらの知見は、PVAに共有結合により固定化する場合であっても、本発明者らのコンジュゲーションアプローチが実際に、TRAP6の生物活性を保持することができることを証明している。
ペプチド固定化のための最先端アプローチとは対照的に、本発明のアプローチは、例えば、PVAノルボルネン上へのシステイン含有TRAP6の光クリックコンジュゲーションなどのバイオ直交反応を使用することによって、N末端もしくはC末端または酸性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸との副反応のリスクを伴わない特異的カップリング技術に基づくものであり、非常に高度のコンジュゲーション効率(>95%)、部位特異性およびモジュール性を提供する。このコンジュゲーションアプローチは、ノルボルネン基を有する他の基質、例えば、天然由来分子(ゼラチン、ヒアルロナン、アルギン酸など)および合成類似体、例えばPEGにも適用可能である。加えて、PVA基質のサイズ(数百の反復単位)は、短いTRAP6配列よりもはるかに大きいので、ポリマー結合TRAP6コンジュゲートは、可溶性TRAP6ペプチドよりも、PAR-1受容体シグナル伝達を介して血液細胞によって内在化される確率が低い。全体として、(例えば、TRAP6ペプチド固定化の場合には光クリックコンジュゲーションによって)保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤(thrombin receptor activating active agent)をカップリングすることによる本発明のアプローチは、局所止血および他の医療用途のための重要な実用的価値を提供する。
3.結論
本研究では、本発明者らは、血小板を効率的に活性化して止血を局所的に促進することができる合成止血系を開発した。この系では、非常に強力なプロテアーゼであるトロンビンの使用が回避される。その代わりに、高い効率のチオール-ノルボルネン光コンジュゲーションを介して、細胞適合性PVAヒドロゲル上で、トロンビン受容体アゴニストペプチド(TRAP)を共有結合により操作した。示されているTRAP6機能化アプローチは、限定されないが、他の合成材料/ヒドロゲル、例えばPEGならびに天然由来ヒドロゲル、例えばゼラチンおよびヒアルロン酸にも適用可能である。生物学的観点から、活性化血小板は、細胞増殖を調節して血管形成(血管新生)において重要な役割を果たす血小板由来成長因子(PDNF)を放出することが公知である。したがって、本発明者らは、これらの血小板活性化ヒドロゲルマトリックスが、安全な止血のためだけではなく、組織再生および創傷治癒の潜在用途のための汎用的生体材料であると予想する。
本研究では、本発明者らは、血小板を効率的に活性化して止血を局所的に促進することができる合成止血系を開発した。この系では、非常に強力なプロテアーゼであるトロンビンの使用が回避される。その代わりに、高い効率のチオール-ノルボルネン光コンジュゲーションを介して、細胞適合性PVAヒドロゲル上で、トロンビン受容体アゴニストペプチド(TRAP)を共有結合により操作した。示されているTRAP6機能化アプローチは、限定されないが、他の合成材料/ヒドロゲル、例えばPEGならびに天然由来ヒドロゲル、例えばゼラチンおよびヒアルロン酸にも適用可能である。生物学的観点から、活性化血小板は、細胞増殖を調節して血管形成(血管新生)において重要な役割を果たす血小板由来成長因子(PDNF)を放出することが公知である。したがって、本発明者らは、これらの血小板活性化ヒドロゲルマトリックスが、安全な止血のためだけではなく、組織再生および創傷治癒の潜在用途のための汎用的生体材料であると予想する。
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Claims (14)
- 止血剤であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされており、該トロンビン受容体活性化剤が、該生体適合性マトリックスへの共有結合によるカップリング後にトロンビン受容体活性化活性を有し、該トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド(TRAP)である、止血剤。
- 前記生体適合性マトリックスが、止血マトリックスであり、前記生体適合性マトリックスが、生体材料および合成ポリマーからなる群から選択される、請求項1に記載の止血剤。
- 前記TRAPが、TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、またはそれらのアミド化形態もしくはそれらの混合物である、請求項1または2に記載の止血剤。
- 前記マトリックスが、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、微粒子状材料もしくは粒状材料またはシートである、請求項1~3のいずれか一項に記載の止血材。
- 前記マトリックスがポリビニルアルコールを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の止血材。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の止血材を生産するための方法であって、前記TRAPを生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングし;バイオ直交基を有するペプチド配列で該TRAPを活性化する、および/またはエン基で該生体適合性マトリックスを活性化する、方法。
- 前記TRAPが、TRAP8、TRAP7、TRAP6、TRAP1-41、またはそれらのアミド化形態もしくはそれらの混合物である、請求項6に記載の方法。
- バイオ直交基を有するペプチド配列で前記トロンビン受容体活性化剤を活性化し、該バイオ直交基が、アルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、またはヒドラジンである、請求項6または7に記載の方法。
- エン基で前記生体適合性マトリックスを活性化し、該エン基が、ノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネートまたはメタクリレートである、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。
- 光反応によって前記化学的カップリングを実施する、請求項6~9のいずれか一項に記載の方法。
- チオール-ノルボルネン光クリックケミストリーによって前記化学的カップリングを実施する、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。
- 手術において、ならびに/または傷害および/もしくは創傷の処置において使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載の止血材。
- -請求項1~5のいずれか一項に記載の止血材、および
-少なくとも1つの投与デバイス
を含む、キット。 - 抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含む、請求項13に記載のキット。
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