CN102369026B - Pcl/pga止血泡沫 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在N末端和C末端具有疏水氨基酸基团的胶原相关多肽(CRP)，以及其合成、使用方法和其组合物，所述多肽能够非共价自组装成胶原模拟三螺旋及其原纤。本发明还涉及新型止血泡沫基材、制造所述泡沫基材的方法、以及使用此类泡沫基材刺激哺乳动物中的止血的方法。

Description

PCL/PGA止血泡沫
技术领域
本发明涉及在N端和C端具有疏水氨基酸基团的胶原相关肽(CRP)并涉及胶原模拟三聚体及其原纤，及它们的合成、使用方法和组合物；以及止血泡沫基材、此类基材的制造方法和刺激止血的方法。
背景技术
胶原是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，其广泛分布在身体内，并且其绳状三螺旋和组装的原纤的刚度使其可以起到基本的结构作用，有助于为组织提供机械强度。最丰富的纤维胶原(I型、II型和III型)出现在皮肤、骨骼、软骨、腱、韧带、血管和眼睛的玻璃状液内。更复杂的非纤维胶原(例如IV型和VI型)形成二维和三维网络，用来支撑身体的间质组织，并且是可以附接上皮细胞层和内皮细胞层的基膜的基本组分。
通常，纤维胶原含有三条独立的肽链，它们彼此缠绕在一起，形成三螺旋(Rich A and Crick FHC，J.Mol.Biol.，1961，3，483-506(Rich A和CrickFHC，《分子生物学杂志》，1961年第3卷第483-506页))。胶原三螺旋的几何约束和稳定性要求每三个氨基酸中有一个甘氨酸(Gly或G)，从而形成重复的-GXY-序列，其中X和Y通常分别表示脯氨酸(Pro或P)和羟脯氨酸(Hyp或O)。胶原三螺旋的长度通常在300nm以上，并且具有1000个以上的氨基酸。通过此类胶原三螺旋的组装所得到的原纤长度超过1μm。
在未受损的健康组织内，胶原支撑血管壁及其周围组织，并且被内皮细胞层隐蔽，不能与在血流内流动的调节血小板凝聚过程的血小板接触。然而，由于病变血管壁内的机械创伤或动脉粥样硬化斑块破裂而对血管壁造成的损伤会去除内皮细胞层，让胶原与血小板和其他血浆蛋白相互作用，从而活化血小板，使其聚集和附着。这些过程对于血小板凝聚响应是必需的，并且为本领域所熟知。
三螺旋构型
因为胶原具有奇特的结构特征和生物重要性，所以这类蛋白质长期以来都让科学家们着迷。通过使用合成的胶原相关肽已经促进了对胶原三螺旋的结构、稳定性和功能的研究(Feng Y，Melacini G，Taulane JP and GoodmanM，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，10351-10358(Feng Y、Melacini G、TaulaneJP和Goodman M，《美国化学会志》，1996年第118卷第10351-10358页)；Fields GB and Prockop DJ，Biopolymers 1996，40，345-357and referencescited therein(Fields GB和Prockop DJ，《生物聚合物》，1996年第40卷第345-357页及其中引用的参考文献)；Holmgren SK，Taylor KM，Bretscher LEand Raines RT，Nature 1998，392，666-667(Holmgren SK、Taylor KM、Bretscher LE和Raines RT，《自然》，1998年第392卷第666-667页)；Jenkins CL and Raines RT，Nat.Prod.Rep.2002，19，49-59(Jenkins CL和Raines RT，《天然产物报告》，2002年第19卷第49-59页)；以及ShahNK，Ramshaw JAM，Kirkpatrick A，Shah C and Brodsky，B.Biochemistry 1996，35，10262-10268(Shah NK、Ramshaw JAM、Kirkpatrick A、Shah C和Brodsky，B.，《生物化学》，1996年第35卷第10262-10268页))。例如，使用具有特定识别基序的合成三螺旋肽使得可以深入研究胶原的受体结合性质。另外，胶原的三螺旋构象可以是其被血小板和其他胶原受体识别的先决条件。此外，某些三螺旋序列可以直接与血小板受体如GpVI直接相互作用，其中包括重复的三联体甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(GPO)序列。对于简单的胶原相关肽，(GPO)10序列形成解链温度为58-70℃的热稳定的三螺旋。羟脯氨酸氨基酸通过促进水介导的氢键的形成和通过提供立体电子效应而使三螺旋结构稳定。
此外，国际公开号WO07/052067描述了一系列短的三螺旋胶原肽，其涵盖III型胶原域，并且具有基于对血小板的血管性血友病因子的A3区的亲和力的血小板粘附活性。国际公开号WO07/017671描述了含有GPO重复序列的三聚肽，该三聚肽在肽之间不交联的情况下能够活化血小板。国际公开号WO06/098326描述了一种由POG多肽和磷酸钙化合物制备的合成胶原膜。日本专利公开2005206542描述了含有多肽序列Pro-X-Gly和Y-Z-Gly的胶原组织结构(其中X和Z表示脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)，Y表示具有羧基的氨基酸残基)。日本专利公开2005126360描述了用于抑制胶原酶的通过固态合成制成的含有多肽序列Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly(其中Y表示Gln、Asn、Leu、Ile、Val或Ala；Z表示Ile或Leu)的化妆品和食物组合物。美国专利公开2003/162941(相当于JP 2003321500)描述了具有序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)的三螺旋结构的胶原多肽。美国专利5,973,112(相当于WO99/10381)描述了序列Xaa-Xbb-Gly(其中Xaa表示氨基酸残基；Xbb表示4(R)-氟-L-脯氨酸(Flp)、4(S)-氟-L-脯氨酸、4，4-二氟脯氨酸或乙酰基、甲磺酰基或三氟甲基改性的羟脯氨酸)的三肽胶原模拟物。胶原模拟物(Pro-Flp-Gly)10显示具有相对于胶原相关三螺旋Pro-Pro-Gly和Pro-Hyp-Gly而言增加的稳定性。
自组装
已经采用若干种策略以在分离的胶原配体序列中引发三螺旋结构的形成(如与国际专利公开WO98/007752相当的美国专利6,096,863及其参考文献中所讨论的)。通过向胶原序列的两端添加多个Gly-Pro-Hyp重复序列，可以引发在分离的胶原序列中形成三螺旋结构。然而，即使50％以上的肽序列由Gly-Pro-Hyp重复序列组成，所得三螺旋也可能不具有足以在生理条件下存活的足够的热稳定性。虽然通过在三条肽链的C端区之间引入共价键可以实现三螺旋结构的基本稳定，但所得“支化的”三螺旋肽化合物较大的尺寸(90-125个氨基酸残基)使其难以进行合成和纯化(如美国专利6,096,863及其参考文献中所讨论的)。虽然寡聚的CRP通过树枝状聚合物组装或共价交联可以在不固定化的情况下有效引发血小板聚集，但较无序的CRP(例如具有(POG)10序列的那些)缺乏这种性质(Rao GHR，Fields CG，White JG and Fields GB，J.Biol.Chem.1994，269，13899-13903(Rao GHR、Fields CG、White JG和Fields GB，《生物化学杂志》，1994年第269卷第13899-13903页)；Morton LF，Hargreaves PG，Farndale RW，Young RD andBarnes MJ，Biochem.J.1995，306，337-344(Morton LF、Hargreaves PG、Farndale RW、Young RD和Barnes MJ，《生物化学杂志》，1995年第306卷第337-344页)；Knight CG，Morton LF，Onley DJ，Peachey AR，Ichinohe T，Okuma M，Farndale RW and Barnes MJ.Cardiovasc.Res.1999，41，450-457(Knight CG、Morton LF、Onley DJ、Peachey AR、Ichinohe T、Okuma M、Farndale RW和Barnes MJ，《心血管研究》，1999年第41卷第450-457页))。能够自组装的CRP的可得性和有效性一直依赖于其制备的容易性、CRP结构的简单性和稳定性以及聚集活性的可能性。虽然合成可能是有挑战性的和相对复杂的，但已经通过采用半胱氨酸结自组装共价连接的三股实体获得了基于微米级CRP的材料(Koide T，Homma DL，Asada S andKitagawa K，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，5230-5233(Koide T、HommaDL、Asada S和Kitagawa K，《生物有机化学与医药化学通讯》，2005年第15卷第5230-5233页)；Kotch F and Raines RT，Proc.Natl.Acad.Sci USA2006，103，3028-3033(Kotch F和Raines RT，《美国科学院院刊》，2006年第103卷第3028-3033页))。
因此，仍然需要简化的方法，以用于构建有利于肽对齐以及原纤引发和增长的胶原样结构基序。具体地讲，需要的是相对较短的单股CRP，这种CRP容易合成，并且能够非共价自组装成具有胶原模拟性质的三聚体。本领域还需要新型基材和用于刺激止血的新型方法，其中该新型基材具有增强的止血性质或止血活性，因而可以刺激止血。
发明内容
本发明总体上涉及一种能够非共价自组装成具有胶原模拟性质的三聚体的胶原相关多肽(CRP)。
该CRP在N端和C端的每一端具有合成或天然的疏水氨基酸，其中所述氨基酸能够引发原纤增长以形成胶原样原纤。
本发明还涉及式(I)的CRP：
B-(Z)m-X
其中
Z为选自下列的三联体：Gly-Pro-J、Pro-J-Gly和J-Gly-Pro；
对于每个三联体Z，J独立地选自Hyp、fPro、mPro和Pro；
m为选自8、9、10、11、12、13、14或15的整数；
例如，如果Z为Gly-Pro-J且m为8，则8个J取代基中的每一个独立地选自Hyp、fPro、mPro和Pro；并且，
B和X独立地选自F5-Phe、Phe(任选地在苯基上被氟、氯、溴、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)、Tyr、3，4-(OH)2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile和Val。
本文所述CRP可用于构造可用来引发血小板聚集并用来治疗和诊断出血性疾病的合成胶原。本发明的CRP还可用于作为止血剂的组合物中。
本发明的另一个方面是新型止血泡沫基材和制造此类泡沫基材的新型方法，下文将对此进行进一步描述。本发明的又一个方面是如下文所述利用本发明的新型泡沫基材刺激止血的新型方法。
附图说明
图1为剂量-响应曲线，示出了具有SEQ ID 25、SEQ ID 26、SEQ ID27、SEQ ID 28、SEQ ID 34和SEQ ID 35的CRP与胶原相比在刺激血小板聚集方面的活性。
具体实施方式
本发明总体上涉及一种能够非共价自组装成具有胶原模拟性质的三聚体的CRP。
该CRP在N端和C端的每一端具有合成或天然的疏水氨基酸，其中所述氨基酸能够引发原纤增长以形成胶原样原纤。
本发明还涉及式(I)的CRP：
B-(Z)m-X
其中
Z为选自下列的三联体：Gly-Pro-J、Pro-J-Gly和J-Gly-Pro；
对于每个三联体Z，J独立地选自Hyp、fPro、mPro和Pro；
m为选自8、9、10、11、12、13、14或15的整数；
例如，如果Z为Gly-Pro-J且m为8，则8个J取代基中的每一个独立地选自Hyp、fPro、mPro和Pro；并且，
B和X独立地选自F5-Phe、Phe(任选地在苯基上被氟、氯、溴、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)、Tyr、3，4-(OH)2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile和Val。
本发明的CRP能够非共价自组装成三聚体。所得CRP三聚体还能够通过非共价、芳环堆积和有序疏水相互作用更高阶地自组装成胶原样原纤。
本发明的一个实施例包括具有多个本发明的CRP的胶原样纤维状物质。
本发明的实施例包括具有多个本发明的CRP的胶原样纤维状物质，其中CRP以多个CRP三聚体形式存在于胶原样纤维状物质中。
在本发明的一个实施例中，CRP三聚体为同型三聚体，其中3个CRP为相同的。
在本发明的一个实施例中，CRP三聚体为异型三聚体，其中3个CRP为不同的。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中Z为选自Gly-Pro-J、Pro-J-Gly和J-Gly-Pro的三联体，其中J在至少4个连续三联体Z中为Hyp。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中对于每个三联体Z，J独立地选自Hyp、fPro和Pro。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中对于每个三联体Z，J独立地选自Hyp和Pro。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中m为10。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中B和X独立地选自F5-Phe、Phe(任选地在苯基上被氟、氯、溴、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)、Tyr、3，4-(OH)2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile和Val。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中B和X独立地选自F5-Phe、Phe和Leu。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中B选自F5-Phe、Phe(任选地在苯基上被氟、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)、Tyr、3，4-(OH)2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg和Leu。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中B选自F5-Phe、Phe(任选地在苯基上被氟、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)和Leu。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中B选自F5-Phe、Phe和Leu。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中X选自Phe(任选地在苯基上被氟、氯、溴、羟基、甲基或CF3一取代或二取代)、Tyr、3，4-(OH)2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile和Val。
本发明的一个实施例为式(I)的CRP，其中X为Phe。
本发明的一个实施例为选自下列的式(I)的CRP：
SEQ ID 1：B-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)n-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 2：B-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)p-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；
SEQ ID 3：B-(Gly-Pro-Hyp)12-(Gly-Pro-J)q-X，其中q为选自0、1、2或3的整数；
SEQ ID 4：B-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)n-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 5：B-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)p-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；
SEQ ID 6：B-(Pro-Hyp-Gly)12-(Pro-J-Gly)q-X，其中q为选自0、1、2或3的整数；
SEQ ID 7：B-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)n-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 8：B-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)p-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；或
SEQ ID 9：B-(Hyp-Gly-Pro)12-(J-Gly-Pro)q-X，其中q为选自0、1、2或3的整数。
在另外的实施例中，式(I)的CRP选自：
SEQ ID 10：B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 11：B-(Gly-Pro-J)p-(Gly-Pro-Hyp)8-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；
SEQ ID 12：B-(Gly-Pro-J)q-(Gly-Pro-Hyp)12-X，其中q为选自0、1、2或3的整数；
SEQ ID 13：B-(Pro-J-Gly)n-(Pro-Hyp-Gly)4-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 14：B-(Pro-J-Gly)p-(Pro-Hyp-Gly)8-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；
SEQ ID 15：B-(Pro-J-Gly)q-(Pro-Hyp-Gly)12-X，其中q为选自0、1、2或3的整数；
SEQ ID 16：B-(J-Gly-Pro)n-(Hyp-Gly-Pro)4-X，其中n为选自4、5、6、7、8、9、10或11的整数；
SEQ ID 17：B-(J-Gly-Pro)p-(Hyp-Gly-Pro)8-X，其中p为选自0、1、2、3、4、5、6或7的整数；或
SEQ ID 18：B-(J-Gly-Pro)q-(Hyp-Gly-Pro)12-X，其中q为选自0、1、2或3的整数。
在另外其他的实施例中，式(I)的CRP选自：
SEQ ID 19：B-(Gly-Pro-J)r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)s-X，其中r和s各自为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数，并且其中(Gly-Pro-J)r、(Gly-Pro-J)s和(Gly-Pro-Hyp)4的组合不超过(Z)15；
SEQ ID 20：B-(Gly-Pro-J)t-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)u-X，其中t和u各自为选自1、2、3、4、5或6的整数，并且其中(Gly-Pro-J)t、(Gly-Pro-J)u和(Gly-Pro-Hyp)8的组合不超过(Z)15；
SEQ ID 21：B-(Pro-J-Gly)r-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)s-X，其中r和s各自为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数，并且其中(Pro-J-Gly)r、(Pro-J-Gly)s和(Gly-Pro-Hyp)4的组合不超过(Z)15；
SEQ ID 22：B-(Pro-J-Gly)t-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)u-X，其中t和u各自为选自1、2、3、4、5或6的整数，并且其中(Pro-J-Gly)t、(Pro-J-Gly)u和(Gly-Pro-Hyp)8的组合不超过(Z)15；
SEQ ID 23：B-(J-Gly-Pro)r-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)s-X，其中r和s各自为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数，并且其中(J-Gly-Pro)r、(J-Gly-Pro)s和(Gly-Pro-Hyp)4的组合不超过(Z)15；或
SEQ ID 24：B-(J-Gly-Pro)t-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)u-X，其中t和u各自为选自1、2、3、4、5或6的整数，并且其中(J-Gly-Pro)t、(J-Gly-Pro)u和(Gly-Pro-Hyp)8的组合不超过(Z)15。
在某些实施例中，式(I)的CRP选自：
SEQ ID 25：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe；
SEQ ID 26：Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe；
SEQ ID 27：Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe；
SEQ ID 31：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe；
SEQ ID 32：Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe；和
SEQ ID 33：Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe。
在本发明的讨论中，某些其他多肽序列包括：
比较SEQ ID 28：Gly-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly；
比较SEQ ID 29：Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly；
参考SEQ ID 30：(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-Gly)5；
参考SEQ ID 34：(Pro-Hyp-Gly)10；和
比较SEQ ID 35：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Ph。
以举例的方式，具有SEQ ID 25的式(I)的CRP具有下列结构：
本发明还涉及一种形成胶原样纤维状物质的方法，该方法包括以下步骤：选择多个式(I)的CRP；在有利于引发和增长多个三聚体、超分子复合物和胶原样原纤的形成的含水条件下混合所述多个CRP。
在该方法的一个实施例中，多个CRP三聚体选自多个同型三聚体、异型三聚体或它们的混合物。
在该方法的一个实施例中，胶原样纤维状物质选自多个超分子复合物或胶原样原纤。
在该方法的一个实施例中，有利的含水条件还包括将多个胶原相关肽在温度小于约50℃的水中或含水盐溶液中混合。
在该方法的一个实施例中，含水盐溶液选自缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水、Hepes缓冲盐水以及它们的混合物。
在该方法的一个实施例中，含水盐溶液为PBS。
定义
就本发明的实施例而言，在本领域技术人员的知识范围内，在本说明书全文中给出的下列定义和其他定义不应被理解为是对本发明范围的限制。
术语“三联体”是指如具有三个氨基酸Gly、Pro和J的组Gly-Pro-J、具有三个氨基酸Pro、J和Gly的组Pro-J-Gly、以及具有三个氨基酸J、Gly和Pro的组J-Gly-Pro所限定的三个氨基酸的组。
术语“同型三聚体”是指由三个相同的式(I)的CRP形成的三螺旋。
术语“异型三聚体”是指由式(I)的CRP形成的三螺旋。
术语“三聚体”是指由三个式(I)的CRP形成的三螺旋。
术语“超分子复合物”是指各种形式的组装的CRP三聚体，包括胶原样原纤和纤维状结构。
术语“Ala”或“A”是指氨基酸丙氨酸；“Cha”是指模拟氨基酸环己基-丙氨酸；“Chg”是指模拟氨基酸环己基-甘氨酸；“F5-Phe”是指模拟氨基酸1，2，3，4，5-F5-苯基-丙氨酸；“fPro”是指模拟氨基酸(4R)-氟脯氨酸；“Gly”或“G”是指氨基酸甘氨酸；“Hyp”或“O”是指模拟氨基酸(4R)-羟脯氨酸；“Met”是指氨基酸甲硫氨酸；“mPro”是指模拟氨基酸(4S)-甲基脯氨酸；“Phe”或“F”是指氨基酸苯基丙氨酸；“Pro”或“P”是指氨基酸脯氨酸；“Tyr”是指氨基酸酪氨酸。
发明讨论
已经描述了某些自组装单体，其中通过固态X射线显示，间位取代的亚苯基二草氨酸二乙酯单体通过氢键合(端对端)自组装成螺旋链，相邻的螺旋通过π堆积作用侧对侧对齐(Blay G，Fernandez I，Pedro JR，Ruiz-GarciaR，Munoz MC，Cano J and Carrasco R，Eur.J.Org.Chem.2003，1627-1630(Blay G、Fernandez I、Pedro JR、Ruiz-Garcia R、Munoz MC、Cano J和Carrasco R，《欧洲有机化学杂志》，2003年第1627-1630页))。本发明的发明人对于自组装CRP三聚体的初步设计涉及在(GPO)10序列的N端和C端上附接苯基草氨酸酯酰胺基团，以有利于通过氢键合进行端对端组装。
然而，由于苯和六氟苯之间较强的非共价芳环堆积相互作用(HunterCA and Sanders JKM，J.Am.Chem.Soc.1990，112，5525-5534(Hunter CA和Sanders JKM，《美国化学会志》，1990年第112卷第5525-5534页)；Gdaniec M，Jankowski W，Milewska MJ andT，Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，3903-3906(also，Ref 9 and 10 cited therein)(Gdaniec M、JankowskiW、Milewska MJ和T，《德国应用化学》，2003年第42卷第3903-3906页，以及其中所引用的参考文献9和10)；以及Lozman OR，Bushby RJ and Vinter JG，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.22001，1446-1453(Lozman OR、Bushby RJ和Vinter JG，《英国化学会志普尔金会刊2》，2001年第1446-1453页))，本发明的发明人假设芳环堆积(端对端和侧对侧)和有序疏水相互作用将使本发明的CRP三聚体还能够高阶自组装成胶原样原纤和纤维。
因此，氢键合自组装设计演变为本发明的设计，其中芳族基团和疏水基团之间的相互作用被用来通过π堆积和有序疏水相互作用进行端对端自组装。本发明的直链CRP的序列能够通过非共价方式自组装成三聚体，并且随后自组装成超分子复合物和原纤。其他人已指出，胶原序列包括专门含有芳族和疏水氨基酸残基如Tyr、Phe和Leu的端肽区。此类芳族和疏水残基对于三螺旋自组装的重要性已经被指出(Helseth DL，Jr.and Veis A，J.Biol.Chem.，1981，256，7118-7128(Helseth DL，Jr.和Veis A，《生物化学杂志》，1981年第256卷第7118-7128页)；Prockop DJ and Fertala A，J.Biol.Chem.1998，273，15598-15604(Prockop DJ和Fertala A，《生物化学杂志》，1998年第273卷第15598-15604页)；以及Traub W，FEBS Letters1978，92，114-120(Traub W，《欧洲生物化学学会联盟通讯》，1978年第92卷第114-120页))。
因此，研究了通过本发明的CRP三聚体(例如，通过具有序列SEQ ID25：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe的CRP三聚体)引发原纤增长的可能性。如下文实例3所示，利用计算机分子建模评价了两个具有SEQ ID 25的首尾相连CRP三聚体之间的界面。利用XED(扩展电子分布(extended electrondistribution))力场将两个三螺旋朝彼此拉近。当三螺旋彼此靠近时，苯基/五氟苯基对采取面对面(FTF)取向，产生-55.2千卡/摩尔的总界面结合能。当把芳环设置为边对面取向时，重新最小化的组装回复为面对面取向。
还对具有序列SEQ ID 26：Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe和SEQ ID 27：Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe的类似CRP三聚体的界面进行了研究。比较而言，在SEQ ID 26的情况中，观察到较低的界面能(总能量为-49.2千卡/摩尔)，而未观察到对称的FTF相互作用。对于SEQ ID 27，出现额外的结合能下降(总能量为-32.5千卡/摩尔)。具有SEQ ID 25的CRP三聚体的相对两端之间较强的相互作用以及具有SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP三聚体的相对两端之间的相互作用支持了发明人的以下假设：由于CRP三聚体之间的芳环堆积和有序的疏水相互作用，本发明的CRP三聚体有可能引发原纤增长。
虽然建模工作研究了用于引发原纤增长的CRP三聚体端对端界面，但本发明的范围旨在包括其他可能的界面，例如交错界面，其中疏水相互作用在CRP三聚体内不同位置处以端对端取向在CRP之间发生，并在疏水相互作用允许的情况下与相邻CRP三聚体发生侧对侧相互作用，胶原端肽就属于这种情况。
CRP构型
除了上述非限制性实施例之外，本发明还涵盖由任意组合的序列组成的由式(I)表示的CRP及其同型三聚体和异型三聚体。
本文所述的CRP的总长度可以在从26个氨基酸至最多47个氨基酸的范围内。在本发明的一个实施例中，CRP的总长度可以为最多32个氨基酸。
本文所述的CRP可以被聚合或连接到肽基或非肽基耦合伙伴，例如但不限于效应分子、标签、标记物、药物、毒素、载体或转运分子或靶向分子(如抗体或其结合片段或其他配体)。用于将CRP多肽耦合到肽基和非肽基耦合伙伴的技术是本领域熟知的。
在一些实施例中，本文所述的CRP可以涂布到固体表面或不溶性载体上。载体可以为粒状或固体形式，包括例如板、试管、小珠、小球、过滤器、织物、聚合物或膜。用于将CRP多肽固定到固体表面或不溶性载体的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施例中，载体可以为蛋白质，例如血浆蛋白或组织蛋白，例如免疫球蛋白或纤连蛋白。在其他实施例中，载体可以是合成的，并且可以是例如生物相容性、可生物降解的聚合物。合适的聚合物包括聚乙二醇、聚乙交酯、聚丙交酯、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈和聚氨酯。本发明的另一个方面提供包含连接到惰性聚合物的本文所述多肽的缀合物。
在CRP一端包含反应性基团使得可以化学耦合到惰性载体，从而可以将所得产物递送到病理性损伤处(如慢性伤口或急性外伤性创伤部位)，而不进入血流。
本发明的CRP可以完全或部分地通过化学合成生成，例如，按照成熟、标准的液相或优选地固相肽合成方法生成，这些方法的一般性描述广泛可得(参见例如J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd edition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)(J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》，第二版，Pierce Chemical Company(Rockford，Illinois)，1984年)；M.Bodanzsky and A.Eodanzsky，ThePractice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984)(M.Bodanzsky和A.Eodanzsky，《肽合成实践》，Springer Verlag，New York，1984年)；J.H.Jones，The Chemical Synthesis of Peptides.Oxford University Press，Oxford 1991(J.H.Jones，《肽的化学合成》，Oxford University Press，Oxford，1991年)；Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，FosterCity，California(《应用生物系统430A用户手册》，ABI Inc.(Foster City，California))；G.A.Grant，(Ed.)Synthetic Peptides，A User′s Guide.W.H.Freeman&Co.，New York 1992(G.A.Grant(编辑)，《合成肽：用户指南》，W.H.Freeman&Co.，New York，1992年)；E.Atherton and R.C.Sheppard，Solid Phase PeptideSynthesis，A Practical Approach.IRL Press 1989(E.Atherton和R.C.Sheppard，《固相肽合成：实践方法》，IRL Press，1989年)；以及G.E.Fields，(Ed.)Solid-Phase Peptide Synthesis(Methods inEnzymology Vol.289).Academic Press，New York and London 1997(G.E.Fields(编辑)，“固相肽合成”(《酶学方法》第289卷)，AcademicPress，New York和London，1997年))，或者也可以通过液相方法或固相、液相和溶液化学的任意组合在溶液中制备。
CRP结构改性
本文所述的CRP可以例如通过加入一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸盐和/或其他此类分子进行化学改性，其中所述一个或多个分子并不自然连接到野生型胶原蛋白。合适的CRP的化学改性物及通过化学合成制备CRP的方法是本领域的技术人员熟知的，并且也涵盖在本发明的范围内。在CRP上的几个位点处可以存在相同或不同程度的同类改性。此外，改性可以发生在CRP序列内的任何位置处，包括在CRP主链上、在任何氨基酸侧链上和氨基末端或羧基末端处。因此，给定的CRP可以包含许多类型的改性。
如上所述，本文所述的CRP可以被结构改性。结构改性的CRP在三维形状和生物活性方面与本文所述的CRP基本类似，并且优选地具有与CRP序列中的活性基团的三维排列非常相似的活性化学部分之空间排列。此外，还可以通过用具有相似结构的其他化学基团取代氨基酸的化学基团来进行改性。
另外，本文所述的CRP可以被结构改性，以包含一个或多个D-氨基酸。例如，CRP可以是对映体，其中在CRP的氨基酸序列中的一个或多个L-氨基酸残基被取代为对应的D-氨基酸残基或反向D多肽，其中反向D多肽是由D-氨基酸按与上述L-氨基酸序列相比相反的顺序排列而组成的多肽(Smith CS，et al.，Drug Development Res.，1988，15，pp.371-379(Smith CS等人，《药物开发研究》，1988年第15卷第371-379页))。制备合适的结构改性多肽的方法是本领域熟知的。
CRP组合物
本发明的CRP可以被分离和/或纯化，随后根据需要使用。在本发明的一个实施例中，CRP可以用于组合物，例如药物组合物或适合作为医疗器械使用的组合物，该组合物可以包含一种或多种任选组分，包括但不限于一种或多种本领域已知的赋形剂。除了此类非限制性实施例之外，本发明还涵盖在这些组合物中的由任意组合的序列组成的由式(I)表示的CRP及其同型三聚体和异型三聚体。
已描述了某些用于各种药物组合物、医疗器械和组合产品的多肽。例如，国际专利公开WO07/044026描述了一种用于修复受损软骨的胶原模拟肽-聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶支架。美国专利公开US2006/073207描述了用于多种医学应用的牛胶原/弹性蛋白/肝素钠无定形凝聚层组合物。美国专利公开US2005/147690描述了一种具有嵌入胶原/弹性蛋白/肝素的表面的改进型聚氨酯薄膜，作为血管移植物使用。日本专利公开2005060550描述了用于粘附到包含多肽序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)的基材的组合物，该多肽序列具有三螺旋结构和100,000-600,000的分子量。日本专利公开2005060315描述了包含多肽序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)和维生素C的药物组合物，该多肽序列具有三螺旋结构和100,000-600,000的分子量。日本专利公开2005060314描述了包含多肽序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)的化妆品组合物，该多肽序列具有三螺旋结构和100,000-600,000的分子量。日本专利公开2005058499描述了一种用具有三螺旋结构和100,000-600,000的分子量的多肽序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)浸渍的非织造织物组合物，该多肽可以被胶原酶降解。日本专利公开2005058106描述了包含具有三螺旋结构和100,000-600,000的分子量的多肽序列Pro-Y-Gly(其中Y表示Pro或Hyp)的可食用组合物，该多肽可以被胶原酶降解。日本专利公开2005053878描述了具有序列Pro-X-Gly和Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly(其中X表示Pro或Hyp；Y表示Gln、Asn、Leu、Ile、Val或Ala；Z表示Ile或Leu)且可以被胶原酶降解的多肽，所述序列具有三螺旋结构和70,000-600,000的分子量。国际专利公开WO98/52620描述了具有序列Gly-Pro-Nleu的生物聚合物化合物，其共价结合到生物相容性本体材料的一个或多个表面上，以用作假体植入物。美国专利6,096,863描述了通过固相合成制备的具有亲脂部分和肽部分的肽-两亲体复合物，其中肽部分具有胶原样序列R2O2C(CH2)2CH(CO2R1)NHCO(CH2)2CO(Gly-Pro-Hyp)0-4-[肽]-(Gly-Pro-Hyp)0-4，其中R1和R2各自独立地为1至20烃基。美国专利6,096,710和6,329,506描述了三螺旋合成胶原衍生物，其具有重复的氨基酸三联体Gly-Xp-Pro、Gly-Pro-Yp、Gly-Pro-Hyp和Gly-Pro-Pro，其中Xp和Yp为选自N-取代氨基酸的拟肽残基。
本发明在多个方面不仅延伸至本文所述的CRP(其任选地连接到其他分子、肽、多肽和特异性结合成员)，还包括药物组合物、药物、药品、医疗器械或其部件、或包含此类CRP的其他组合物。此类药物组合物、药物、药品、医疗器械或其部件或其他组合物可以用于多种目的，包括但不限于诊断、治疗和/或预防目的。
本发明还延伸至此类CRP在制造这些组合物中的用途以及制备这些组合物的方法，该方法包括将此类CRP与所需的任选赋形剂和其他任选成分混合。合适的赋形剂的例子包括但不限于本领域熟知的任何介质、载体、缓冲剂、稳定剂等。
在组合物为药物组合物的实施例中，除了此类CRP之外，组合物可以包含第二药物活性剂，其中所得组合产物可以进一步与赋形剂(例如本领域熟知的作为药用赋形剂的那些)混合。这类合适的赋形剂的例子在(例如)Handbook of Pharmaceutical Excipients，(Fifth Edition，October 2005，Pharmaceutical Press，Eds.Rowe RC，Sheskey PJ and Weller P)(Rowe RC、Sheskey PJ和Weller P(编辑)，《药物赋形剂手册》第五版，2005年10月，Pharmaceutical Press)中有公开。此类材料应无毒，并且应不干扰此类CRP或第二药物活性剂的功效。本发明的这些组合物可以以局部方式施用到所需部位，或者可以以使得CRP或第二药物活性剂靶向特定的细胞或组织的某种方式递送。合适的第二药物活性剂包括但不限于止血剂(例如凝血酶、纤维蛋白原、ADP、ATP、钙、镁、TXA2、血清素、肾上腺素、血小板因子4、因子V、因子XI、PAI-1、血小板反应蛋白等以及它们的组合)、抗感染药物(例如抗体、抗原、抗生素、抗病毒剂等以及它们的组合)、镇痛药和镇痛药组合、或抗炎剂(例如抗组胺剂等)。
在此类组合物的一种广泛的用途中，组合物可以作为止血剂(例如作为药用制剂或作为伤口敷料的组分)局部涂敷到伤口部位。该组合物可以单独施用，或根据要治疗的病症与其他治疗物基本上同时组合或依次组合施用。此类CRP(无论是单独地、还是在包含此类CRP的制品或装置(包括伤口敷料)中)可以在试剂盒内提供，例如密封在将内容物与外部环境隔绝的合适的容器内。此类试剂盒可包括使用说明。
在一个实施例中，通过局部涂敷到本来会导致致命失血的伤口处，本文所述的CRP可用于在急性创伤中(例如在道路交通事故或战场受伤之后)刺激止血。一种在此类伤口部位刺激止血的方法可以包括用由本文所述CRP构成的组合物接触该部位，其中组合物可以任选地包含基材，使得CRP以足够引发和保持止血的量存在于基材表面。
在另一个实施例中，本文所述的CRP可以用于在诸如溃疡的慢性创伤中刺激止血。不希望受与所提出的机制相关的理论的约束，但我们认为CRP可以首先起到促进细胞附着的作用，然后活化的血小板颗粒内容物的释放可以刺激来自血流和来自受损组织附近的有助于愈合过程的细胞的迁移。一种在个人的此类慢性伤口部位刺激止血的方法可以包括用由本文所述CRP构成的组合物接触该部位，其中组合物可以任选地包含基材，使得CRP以足够引发止血的量存在于基材表面。
本文所述的本发明此类CRP可以在多种实验室或临床环境下广泛用作有价值的试剂，包括用于诊断出血性疾病。例如，本文所述的此类CRP可以用于构造合成胶原，然后可以将合成胶原用于引发血小板聚集。又如，此类CRP可以用于研究或筛选抑制血小板聚集和激活和/或血液凝结的测试化合物。再如，此类CRP可以用作研究血小板活化和/或聚集的试剂。一种活化和/或聚集血小板的方法可以包括用本文所述的此类CRP处理血小板。
在一个实施例中，可以在存在血浆的情况下于体外处理血小板。可以例如在存在或不存在所关注的因子、试剂、测试组合物或物质的情况下，采用本领域所期望的合适的对照测试，测量或确定被处理的血小板(即接触本文所述的此类CRP之后的血小板)的活性。因子对血小板活化和/或聚集的作用可以通过这样的方法确定，该方法包括用本文所述的此类CRP处理血小板，然后确定该因子对血小板活化和/或聚集的作用。血小板活化和/或聚集可以在存在或不存在该因子的情况下或者以不同浓度的该因子进行确定。
在本发明的另一个实施例中，本发明的此类CRP还可以用于血小板疾病的诊断，例如，常规地使用提取自动物组织的胶原原纤维作为血小板聚集仪内的试剂的诊断，或者使用固定化胶原制剂作为血小板功能分析仪或其他仪器内的试剂的诊断。例如，通过确定用本文所述的此类CRP处理的样本中的血小板的活化和/或聚集，此类CRP可以用来研究血小板活性或功能或者诊断血小板活性功能障碍。例如，可以使本文所述的此类CRP接触得自人体的血液样本，然后可以按照本领域熟知的方法确定血小板的聚集。
在本发明的另一个实施例中，本发明的此类CRP可以作为生物活性表面涂层使用，所述涂层除了用来直接稳固细胞附着之外，还用来(例如)通过促进其他生物活性分子的产生和释放来局部聚集和活化血小板。一种方法可以(例如)包括用本文所述的此类CRP接触血小板，该CRP可以在存在血浆的情况下在固体或半固体载体上固定化，以在所述载体处或附近聚集和/或活化血小板。
本发明的CRP也可以广泛用于治疗出血性疾病。
在一个其中本文所述的此类CRP被吸附在固体或半固体载体(例如惰性聚合物载体)上或以其他方式包含在该载体之内或之上的实施例中，所得载体可用于在血小板不足的情况下充当血小板输注的附助物或替代物，这种血小板不足可能是由于自身免疫性血小板减少症或由于骨髓治疗性消融(例如在癌症治疗中)所引起，也可能是由于其他原因导致的出血性疾病(例如血小板无力症)所引起。在这个实施例中，被吸附在固体或半固体载体上或以其他方式包含在该载体之内或之上的此类CRP可以施用到有需要的个体，例如，施用到可能患有血小板不足和/或如上所述医学病症的个体。
被吸附在固体或半固体载体上或以其他方式包含在该载体之内或之上的本文所述的此类CRP也可以用于在主动脉瘤内引发血栓形成。例如，此类CRP可以涂布到栓塞线圈外部上，以固定组织和/或防止被扩大的动脉的进一步扩张。在这个实施例中，通过用本文所述的此类CRP接触个体的受损血管组织，可以在血管组织内引起血栓形成，其中所述CRP被吸附在固体或半固体载体(例如惰性聚合物载体)上或以其他方式包含在该载体之内或之上。合适的惰性聚合物载体的例子包括但不限于支架、栓塞线圈等。此类个体可能遭遇动脉或其他血管扩张和/或主动脉瘤之类的医学问题。在一个实施例中，载体可以是由蛋白质、聚乙二醇或脂质体构成的惰性聚合物载体，该载体涂布有吸附到该载体的本发明CRP。
本文所述的本发明此类CRP可进一步用于包含化学限定的三维聚合物基质的组合物，该聚合物基质添加有用于胚胎干细胞定向分化的所述胶原相关肽。国际专利公开WO07/075807描述了一种包含化学限定的三维聚合物基质的组合物，所述聚合物基质添加有能促进胚胎干细胞定向分化的IV型胶原多肽，为了所有目的将该专利以引用方式全文并入本文中。
本发明的又一个实施例涉及一种用于治疗有需要的受试者中的止血病症的方法，该方法包括施用包含本发明的CRP的组合物，所述组合物可以包含但不限于本文所述的此类CRP。该多肽组合物在施用过程中可以任选地包括基材。此类组合物通常可以按照足以显示对受试者的有益效果的方案施用。实际施用量和施用的速度与时间进程将取决于若干因素，例如所治疗的疾病或病症的性质和严重程度。该组合物可以单独施用或与其他治疗的辅助治疗剂同时或依次组合施用，视所治疗的疾病或病症而定。
根据这个用于治疗止血病症的方法，本文所述的CRP组合物可以单独使用，或与赋形剂或其他任选成分组合使用，以用于止血。在另一个实施例中，此类CRP可以与合适的基材组合以用作止血剂。止血剂CRP组合物可以为多种形式，包括但不限于粉末、纤维、薄膜或泡沫。
含有CRP的泡沫可以通过诸如冻干或超临界溶剂发泡的方法制备。这些方法的细节是本领域熟知的，公开于例如：S.Matsuda，Polymer J.，1991，23(5)，435-444(S.Matsuda，《聚合物杂志》，1991年第23卷第5期，第435-444页)(冻干)和欧洲专利申请EP 464,163 B1(超临界溶剂发泡)。通常，含有本发明的CRP的冻干泡沫可通过以下方法制备：首先在足以进行溶解的温度下，将CRP和本领域已知的任何任选成分(例如增塑剂)溶解于合适的溶剂中；然后将含有CRP的溶液倾注到模具中。按含CRP的溶液的总重量计，存在于含CRP的溶液中的CRP的量可以在约0.1mg/mL至约10mg/mL的范围内，或在约0.1mg/mL至约1mg/mL的范围内，或为约0.3mg/mL。合适的增塑剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、甘油一醋酸酯、甘油二醋酸酯、甘油三醋酸酯以及它们的混合物，并且按含的CRP的泡沫的最终干重计，所述增塑剂的用量可以在约0.5％至约15％的范围内，或在约1％至约5％的范围内。为了使对CRP的可能的有害影响最小化，溶解温度应不超过约50℃。溶解可以在有利的含水条件下进行，包括但不限于在水中或含水盐溶液中进行，所述含水盐溶液例如缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水、Hepes缓冲盐水以及它们的混合物。
在一个实施例中，溶剂可以被缓冲至约6至约8的pH范围。在用所需量的溶液填充模具之后，接着将模具转移到冻干机，冻干机将冷冻并接着真空干燥所述溶液，以除去所得泡沫中的溶剂。虽然所得泡沫的厚度可以根据(例如)模具中的溶液量、溶液中的CRP浓度等而变化，但所得泡沫的厚度通常可在约0.5mm至约10mm的范围内或在约1mm至约5mm的范围内，并且孔尺寸通常在约1微米至约500微米的范围内。该泡沫可以制备成多种尺寸，所述尺寸可适用于解决出血部位的止血难题。
含CRP的薄膜可以通过(例如)从合适的溶剂浇注薄膜的方法制备。该方法的细节是本领域所熟知的，已经公开于(例如)以下文献中：Bagrodia S and Wilkes GL，“Effects of Solvent Casting Copolymer Materials AsRelated to Mechanical Properties，”J Biomed Mater Res.，1976(Jan)，10(1)，101-11(Bagrodia S和Wilkes GL，“溶剂浇注共聚物材料与机械性能有关的作用”，《生物医学材料研究杂志》，1976年1月，第10卷第1期第101-111页)。根据这个实施例，本发明的CRP以及本领域已知的任何任选成分(例如增塑剂)可以溶解于足量的含水溶剂中。按溶液的总重量计，存在于溶液中的CRP的量可以在约0.1mg/mL至约10mg/mL的范围内，或在约0.1mg/mL至约1mg/mL的范围内，或为约0.3mg/mL。合适的增塑剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、甘油一醋酸酯、甘油二醋酸酯、甘油三醋酸酯以及它们的混合物，并且按含的CRP薄膜的最终干重计，所述增塑剂的用量可以在约0.5％至约15％的范围内，或在约1％至约5％的范围内。
合适的含水溶剂的例子包括但不限于水、可混溶有机溶剂、醇或它们的混合物。合适的可混溶有机溶剂和醇的例子包括但不限于丙酮、乙醇、异丙醇、丙醇、甲醇等以及它们的混合物。为了使对CRP的可能的有害影响最小化，溶解温度应不超过约50℃。然后可以加入含CRP的溶液，例如逐滴加入或以其他方式浇注适量的溶液，以覆盖浇注基材上所需的表面积。
合适的浇注基材的例子包括那些含有将会容易使含CRP的薄膜释放的材料的基材，并且可以包括但不限于那些由玻璃、金属、涂特氟隆的容器等制成的基材。此类基材的尺寸和形状可以根据组合物的需要而变化。然后可以通过蒸发或风干除去含CRP的溶液中的溶剂，然后任选地可以通过多种方法(例如通过真空干燥)干燥所得的薄膜，以除去任何残余溶剂。如果需要较厚的薄膜，则可以通过在之前浇注的薄膜的上表面顶部上浇注一层或多层的含CRP的溶液来重复该过程。虽然所得薄膜的厚度可以根据(例如)倾注到浇注基材上的溶液量、溶液中CRP的浓度等而变化，但每个薄膜层的厚度通常可以在约50微米至约150微米的范围内。如上文对于泡沫所提出的，薄膜也可以制备成多种尺寸。
通过使用本领域熟知的方法人工或机械研磨或粉碎由本发明的CRP构成的纤维、薄膜或泡沫，可以获得含CRP的粉末。用于将CRP纤维、薄膜或泡沫研磨或粉碎成粉末的示例性技术包括但不限于使用研钵和研杵、旋转型刀片或诸如球磨机的冲击式研磨机的那些技术。用于将CRP研磨成粉末的这些和其他方式可以在室温下实现，或者对于低温研磨过程来说，可以在低于CRP凝固点的温度下进行。所得含CRP的粉末可以任选地进行筛分，以获得粒度在约1微米至约2000微米的范围内、或在约10微米至约500微米的范围内的粉末。
含CRP的粉末、薄膜和/或泡沫可以作为止血剂直接施用到出血部位，以增强或引起止血。作为另外一种选择，本文所述的CRP可以与基材组分组合施用，并且在这类实施例中，在下文将CRP称为CRP止血剂组分。基材可以是适于植入人体的基材，或者也可以是非可植入的基材。
合适的可植入基材的例子包括但不限于：医疗器械，例如缝合锚钉、缝线、缝钉、外科平头钉、夹子、板、螺钉和薄膜；组织工程支架，例如非织造毡、织造网或织物；泡沫；以及粉末。这些可植入基材可以由适于植入身体的任何材料构成，所述材料包括但不限于：生物相容性、可生物吸收的聚合物，例如，脂族聚酯、聚氨基酸(例如多聚L-赖氨酸和多聚谷氨酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯(例如具有1至10个碳原子的烷基长度的那些)、聚氧杂酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚胺基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酯酰胺、含胺基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子(包括生物聚合物，例如胶原、弹性蛋白和明胶；以及多糖，例如淀粉、藻酸盐、果胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素的盐、氧化再生纤维素等)，和它们的共聚物与共混物；以及不可吸收的材料，包括但不限于棉、亚麻布、丝绸、尼龙(例如尼龙6-6)和芳族聚酰胺(例如可以商品名“KEVLAR”或“NOMEX”从E.I.du Pont de Nemours and Company商购获得的那些)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯)、氟聚合物(例如聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯共聚物(FEP)和聚偏氟乙烯(PFA))、聚烯烃(例如聚乙烯和聚丙烯)、聚氨酯、以及它们的组合。
本文所用的“可生物吸收的”应指在暴露于身体组织时在相对短的时间内容易通过酶促反应或水解反应降解的材料。“降解”应指材料分解成基本上可以被身体代谢或排出的小片段。完全的生物吸收应在约12个月内发生，然而生物吸收也可以在例如约9个月、约6个月或约3个月或更短时间内完成。
出于本发明的目的，聚(亚胺基碳酸酯)应理解为包括Kemnitzer和Kohn在“Handbook of Biodegradable Polymers”(《生物可降解聚合物手册》)，Domb等人编辑，Hardwood Academic Press，第251-272页，1997年中描述的那些聚合物。出于本发明的目的，共聚(醚-酯)应理解为包括Cohn和Younes在“Journal of Biomaterials Research”(《生物材料研究杂志》)，第22卷，第993-1009页，1988年中以及Cohn在“PolymerPreprints”(《聚合物预印本》)(ACS Division of Polymer Chemistry(美国化学会：高分子化学专业委员会))，第30卷第1期，第498页，1989年中描述的那些共聚酯-醚(如PEO/PLA)。出于本发明的目的，聚亚烷基草酸酯包括美国专利No.4,208,511、4,141,087、4,130,639、4,140,678、4,105,034和4,205,399中描述的那些。出于本发明的目的，酪氨酸衍生的聚碳酸酯应理解为包括Pulapura等人在Biopolymers(《生物聚合物》)第32卷第4期第411-417页中，以及Ertel等人在J.Biomed.Mater.Res.(《生物医学材料研究杂志》)1994年第28卷第919-930页中描述的那些聚合物。出于本发明的目的，聚磷腈、基于二阶、三阶和更高阶混合单体的由L-丙交酯、D，L-丙交酯、乳酸、乙交酯、乙醇酸、对二氧杂环己酮、三亚甲基碳酸酯和ε-己内酯制成的聚合物应理解为包括Allcock在The Encyclopediaof Polymer Science(《聚合物科学百科全书》)第13卷，第31-41页，Wiley Intersciences，John Wiley & Sons，1988年中，以及Vandorpe等人在“Handbook of Biodegradable Polymers”(《生物可降解聚合物手册》)，Domb等人编辑，Hardwood Academic Press，第161-182页，1997年中有所描述的那些。出于本发明的目的，聚酯酰胺应理解为包括在美国专利申请No.20060188547和美国专利No.5,919,893中所描述的那些聚合物。聚酸酐包括衍生自HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH(其中m是在2至8范围内的整数)形式的二元酸的那些，以及所述二元酸与具有最多12个碳原子的脂族α-ω二元酸的共聚物。聚氧杂酯、聚氧杂酰胺以及包含胺和/或酰氨基的聚氧杂酯在以下美国专利中的一个或多个中有描述：美国专利No.5,464,929、5,595,751、5,597,579、5,607,687、5,618,552、5,620,698、5,645,850、5,648,088、5,698,213、5,700,583和5,859,150。出于本发明的目的，聚原酸酯应理解为包括Heller在“Handbook of BiodegradablePolymers”(《生物可降解聚合物手册》)，Domb等人编辑，HardwoodAcademic Press，第99-118页，1997年中所描述的那些聚合物。出于本发明的目的，聚氨酯应理解为包括在美国专利No.6,326,410、6019996、5571529和4,960,594中所描述的那些聚合物。
出于本发明的目的，脂族聚酯应理解为包括但不限于下列物质的均聚物和共聚物：丙交酯(包括乳酸D-丙交酯、L-丙交酯和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物(例如在美国专利No.5,412,068中所描述的那些)、δ-戊内酯、β-丁内酯、γ-丁内酯、ε-癸内酯、羟基丁酸酯、羧基戊酸酯、1，4-二氧环庚烷-2-酮(包括其二聚体1，5，8，12-四氧杂环十四烷-7，14-二酮)、1，5-二氧环庚烷-2-酮、6，6-二甲基-1，4-二氧杂环己烷-2-酮以及它们的组合。
在一个实施例中，脂族聚酯为弹性体共聚物。“弹性体共聚物”被定义为这样一种材料：其在室温下可以反复拉伸至其初始长度的至少约两倍，并且一旦立即释放应力就将大致恢复到其初始长度。合适的可生物吸收、生物相容性弹性体包括但不限于选自下列的那些：ε-己内酯和乙交酯的弹性体共聚物(例如ε-己内酯和乙交酯的摩尔比在约30∶70至约70∶30、或在约35∶65至约65∶35、或在约45∶55至35∶65的范围内的那些)；ε-己内酯和包括L-丙交酯、D-丙交酯及其共混物在内的丙交酯的弹性体共聚物或乳酸共聚物(例如ε-己内酯和丙交酯的摩尔比在约35∶65至约65∶35、或约45∶55至30∶70的范围内的那些)；对二氧杂环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)和包括L-丙交酯、D-丙交酯和乳酸在内的丙交酯的弹性体共聚物(例如对二氧杂环己酮和丙交酯的摩尔比在约40∶60至约60∶40的范围内的那些)；ε-己内酯和对二氧杂环己酮的弹性体共聚物(例如ε-己内酯和对二氧杂环己酮的摩尔比在约30∶70至约70∶30的范围内的那些)；对二氧杂环己酮和三亚甲基碳酸酯的弹性体共聚物(例如对二氧杂环己酮和三亚甲基碳酸酯的摩尔比在约30∶70至约70∶30的范围内的那些)；三亚甲基碳酸酯和乙交酯的弹性体共聚物(例如三亚甲基碳酸酯和乙交酯的摩尔比在约30∶70至约70∶30的范围内的那些)；三亚甲基碳酸酯和包括L-丙交酯、D-丙交酯及其共混物在内的丙交酯的弹性体共聚物或乳酸共聚物(例如三亚甲基碳酸酯和丙交酯的摩尔比在约30∶70至约70∶30的范围内的那些)，以及它们的共混物。在另一个实施例中，弹性体共聚物为ε-己内酯和乙交酯的摩尔比在约35∶65至约65∶35的范围内的ε-己内酯和乙交酯。在又一个实施例中，弹性体共聚物为具有约35∶65的摩尔比的ε-己内酯和乙交酯。
合适的非可植入基材的例子包括但不限于绷带和伤口敷料。本文所用的“绷带”应指用于绑扎或包裹患病或受伤的身体部位的一块布或其他材料。绷带要么直接紧贴伤口放置，要么用于将伤口敷料固定到伤口。本文所用的“伤口敷料”应指直接紧贴伤口放置并用于以下目的的一块布或材料：保护伤口；促进愈合；和/或提供、保持或除去水分，并且其任选地使用绷带保持就位。
非可植入基材可以为多种形式，包括但不限于织物、泡沫、纱布、薄膜、胶布绷带、水胶体、凝胶以及它们的组合。这些非可植入基材可以由任何适于施加(不植入)到身体的材料构成，这些基材包括但不限于：生物相容性、可生物吸收的聚合物，例如，脂族聚酯、聚氨基酸(例如多聚L-赖氨酸和多聚谷氨酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯(例如含有具有从1至10个碳原子的烷基的那些)、聚氧杂酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚胺基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酯酰胺、含胺基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子(包括生物聚合物，例如胶原、弹性蛋白和明胶；以及多糖，例如淀粉、藻酸盐、果胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素的盐、氧化再生纤维素等)、和它们的共聚物与共混物；以及非可生物吸收的材料，包括棉、亚麻布、丝绸、尼龙(例如尼龙6-6)和芳族聚酰胺(例如可以商品名“KEVLAR”或“NOMEX”从E.I.du Pont de Nemours andCompany商购获得的那些)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯)、含氟聚合物(例如聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯共聚物(FEP)和聚偏氟乙烯(PFA))、聚烯烃(例如聚乙烯和聚丙烯)、聚氨酯、以及它们的组合。这些材料的定义如上所述。
CRP止血剂组分可以通过常规涂布技术(例如浸涂、喷涂、冻干涂布和静电涂布技术)施加到这些基材的表面。这些涂布方法的细节是本领域熟知的，在(例如)下列文献中有公开：美国专利No.6,669,980；Yun JH，etal.，40(3)ASAIO J.M，401-5(Jul.-Sep.1994)(Yun JH等人，《美国人造体内器官学会志》，1994年7-9月，第40卷第3期第401-405页)；和KrogarsK，et al，Eur J Pharm Sci.，2002(Oct.)，17(1-2)，23-30(Krogars K等人，《欧洲药学杂志》，2002年10月，第17卷第1-2期第23-30页)。通常，可以制备含有所需量的CRP止血剂组分的溶液，并通过所选涂布技术将其施加到所需基材的表面。然后，可以通过常规干燥方法干燥所述基材，这些方法包括但不限于风干、在真空烘箱内进行真空干燥或冷冻干燥。CRP应以实现所需止血性质(例如血液凝固、血小板聚集等)所必需的量使用，但通常出于涂布基材的目的，存在于基材中的CRP的量在约0.01mg/cm2至约1mg/cm2的范围内、或约0.1mg/cm2至约0.5mg/cm2的范围内，或约0.4mg/cm2的范围内。
在其中基材为可注射或可喷射的凝胶或形成凝胶的液体的另一个实施例中，可以将可为粉末或胶原样纤维状物质的形式的CRP止血剂组分通过本领域已知的常规混合技术与可注射或可喷射的凝胶或液体进行组合。可注射或可喷射的凝胶或形成凝胶的液体可以由含水盐溶液和胶凝材料构成。
合适的含水盐溶液的例子包括但不限于生理缓冲溶液、盐水、水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、PBS、Tris缓冲盐水、Hepes缓冲盐水、以及它们的混合物。在一个实施例中，含水盐溶液可以为磷酸盐缓冲溶液或PBS。
合适的胶凝材料的例子包括但不限于：蛋白质，例如胶原、弹性蛋白、凝血酶、纤连蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和去端肽胶原(atelocollagen)；多糖，例如淀粉、果胶、纤维素、烷基纤维素(如甲基纤维素)、烷基羟烷基纤维素(如乙基羟基乙基纤维素)、羟烷基纤维素(如羟乙基纤维素)、硫酸纤维素、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲壳质、羧甲基甲壳质、透明质酸、透明质酸的盐、海藻酸盐、交联海藻酸盐、藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖(curdlan)、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、角叉菜胶、脱乙酰壳多糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸)、以及衍生物；聚核苷酸，例如核糖核酸、脱氧核糖核酸；以及其他，例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚氧化烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、单硬脂酰甘油co-琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)、以及它们的共聚物和组合。
在定义本文所述纤维素材料时，除非对具体的实施例另外指出，否则术语“烷基”是指可以为包含约1个至约7个碳原子的直链或支链的烃链，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、2，3-二甲基丁基、新己基或庚基。
在一个实施例中，胶凝材料由多糖构成。在另一个实施例中，胶凝材料由羧甲基纤维素钠构成。
可注射或可喷射凝胶或液体可以通过将有效量的胶凝材料溶于含水盐溶液中形成初始凝胶来制备。
胶凝材料的“有效量”被定义为为了让可注射或可喷射凝胶或液体注入到受影响区域中或喷射到受影响区域上并在施加后基本上保留在原处所充分必需的胶凝材料的量。虽然胶凝材料的有效量将根据(例如)所选胶凝材料、所需CRP的量等而变化，但本领域的技术人员无需进行过多的实验就可以容易地确定胶凝材料的有效量。在其中胶凝材料为羧甲基纤维素钠的一个实施例中，按溶液的总重量计，胶凝材料的存在量可以在约0.1％至约5％的范围内或约0.5％至约3％的范围内。
然后，可以通过本领域已知的任何常规混合技术将CRP止血剂组分与初始凝胶进行组合，所述技术包括但不限于用刮刀人工混合、磁搅拌、或使用电机和旋转的桨叶或刀片的机械混合。为了使对CRP的可能的有害影响最小化，混合温度应不超过约50℃。CRP止血剂以在施加到出血部位时可有效引发止血的量存在于所得凝胶中，并且通常按最终凝胶的总重量计在约0.1mg/mL至约10mg/mL的范围内、或约0.1mg/mL至约1mg/mL的范围内，或为约0.3mg/mL。在一个实施例中，可注射或可喷射的凝胶或液体在注射前可以为凝胶形式，而在一个另选的实施例中，可注射或可喷射的凝胶或液体在注射前可以为液体形式，但在施用到所需位置之后为凝胶形式并且能够基本上保持就位。
在其中CRP止血剂组分为粉末形式的实施例中，CRP可以与本领域已知的任何合适粉末载体进行组合。在一个实施例中，载体可以使用(例如)以下文献中公开的方法喷涂到粉末粒子上：Maa YF，et al.，SJ Curr PharmBiotechnol.，2000(Nov.)，1(3)，283-302(Maa YF等人，《当代药物生物技术》，2000年11月，第1卷第3期第283-302页)。按粉末的总重量计，存在于粉末中的CRP止血剂组分的量可以在约0.5％至约100％的范围内或约2％至约10％的范围内。
合适的粉末载体的例子包括但不限于：多糖，例如淀粉、果胶、纤维素、烷基纤维素(如甲基纤维素)、烷基羟烷基纤维素(如乙基羟基乙基纤维素)、羟烷基纤维素(如羟乙基纤维素)、硫酸纤维素、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲壳质、羧甲基甲壳质、透明质酸、透明质酸的盐、海藻酸盐、交联海藻酸盐、藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、卡拉胶、脱乙酰壳多糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸、甘露糖醇、多孔熔岩、聚酯、以及它们的共聚物和混合物。
一般CRP合成
本发明的CRP可以通过多种固相或溶液技术制备。例如，虽然CRP可以通过其他方法(如溶液法)制备然后附接到支承材料以进行后续耦合，但优选的是使用标准固相有机合成技术，例如固相多肽合成(SPPS)技术。也就是说，可以合成本发明的CRP，随后将其附接到支承材料，与多种试剂耦合，然后利用多种技术将其从支承材料移除。然而优选地，CRP在支承材料上合成，与试剂耦合，然后利用多种技术从支承材料移除。
对于CRP(寡肽、多肽或蛋白质)的制备，固相肽合成涉及共价附接步骤(即锚定)，该步骤将新生CRP链连接到含有用于附接的合适官能团的支承材料(典型地为不溶性聚合物支承体)。随后，通过一系列添加(脱保护/耦合)循环让锚定的CRP延伸，这些循环涉及在C至N方向逐步添加N-保护的和侧链保护的氨基酸。一旦完成链组装，即可移除保护基团，并将CRP从支承体上切割下来。在一些情况下，在移除保护基团之前将其他基团添加到CRP。
典型地，通过使用柄(handle)将初始氨基酸残基附接到官能化的支承材料来开始SPPS。柄(即连接基)是一种双功能的间隔臂，其一端整合了可顺利切割的保护基团的特征，另一端是可被活化以允许连接到官能化支承材料的官能团，常常为羧基。已知的柄包括酸不稳定性对烷氧基苄基(PAB)柄、光不稳定性邻硝基苄酯柄和如Albericio等人在J.Org.Chem.(《有机化学杂志》)1990年第55卷第3730-3743页及其引用的参考文献中所描述的柄，以及在美国专利No.5,117,009(Barany)和5,196,566(Barany等人)中描述的柄。
例如，如果支承材料用氨基官能团单体制备，则适当的柄通常在单个步骤中定量地耦合到氨基官能化的支承体上，以便为多肽链组装提供具有良好限定的结构的一般起点。将柄保护基团移除，并将N′-保护的第一氨基酸的C末端残基定量地耦合到柄。一旦将柄耦合到支承材料，并将初始氨基酸连接到柄，即可进行一般合成循环。合成循环通常由将支承材料上的氨基酸的N-保护氨基的脱保护、洗涤和中和步骤(根据需要)组成，然后与下一个N-保护氨基酸的羧基活化形式反应。该循环重复进行，以形成目标CRP。利用官能化不溶性支承材料进行固相肽合成的方法是熟知的。
当采用SPPS技术在支承材料上合成CRP时，Fmoc方法涉及到使用温和的正交技术，该技术采用碱不稳定性9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团。Fmoc氨基酸可使用芴甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)、芴甲氧羰酰氯或[4-(9-芴甲氧羰基氧基)苯基]二甲基锍硫酸甲酯(Fmoc-ODSP)进行制备。Fmoc基团可使用哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮溶液或使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的DMF溶液移除。在移除Fmoc之后，被支承树脂的被释放N1-胺是游离的，现成可供立即附接脂质的准备，而不需要插入中和步骤。然后所需CRP的固定化疏水类似物可通过(例如)使用三氟乙酸(TFA)在室温下移除。此类Fmoc固相多肽合成方法是本领域的技术人员所熟知的。
可使用多种支承材料制备本发明的复合物。它们可以是无机或有机材料，并且可以为多种形式(如膜、粒子、球形小珠、纤维、凝胶、玻璃等)。例子包括多孔玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基丙烯酰胺、棉、纸张等等。官能化聚苯乙烯，如氨基官能化聚苯乙烯、氨基甲基聚苯乙烯、氨基酰基聚苯乙烯、对甲基二苯甲基胺聚苯乙烯或聚乙二醇-聚苯乙烯树脂也可用于此目的。
具体CRP合成
据信，本领域的技术人员可以根据本文的描述最大程度地利用本发明。以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开内容的其余部分。
材料和方法：Fmoc-氨基酸、HBTU/HOBT、DIEA、NMP和DCM购自Applied Biosystems，Inc。哌啶购自Sigma-Aldrich。Fmoc-Gly-Wang树脂购自Bachem，Fmoc-Phe-Wang树脂购自Novabiochem。MALDI-TOF质谱分析在M-Scan Inc.使用Applied Biosystems Voyager-DE PRO Biospectrometry工作站并结合延时引出激光解吸质谱仪(Delayed Extraction laser-desorption massspectrometer)、以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质进行。氨基酸分析采用Beckman 6300锂基氨基酸分析仪(Beckman 6300Li-based amino acidanalyzer)，在U.C.Davis的Molecular Structural Facility进行。获得的CRP为＞90％纯，并且考虑多肽内容物以制备每个实验的溶液。另外，CRP浓度通过测量在214(在PBS中ε＝6.0×104M-1cm-1)或215nm(在水中ε＝6.5×104M- 1cm-1)处的吸收而确定。所有用于电子显微镜实验的多肽的过滤均使用得自Whatman的Nuclepore过滤器(0.4μm；聚碳酸酯膜)进行，其余的过滤使用得自Pall的Acrodisc针式过滤器(0.45μm；聚四氟乙烯膜)完成。
除非另有规定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域普通技术人员公知的相同含义。用于本发明说明书的缩写如下：
实例1
SEQ ID 25：(F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
比较SEQ ID 29：Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly
比较SEQ ID 35：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe
具有SEQ ID 25的CRP和具有SEQ ID 29和SEQ ID 35的比较多肽通过标准FastMoc化学合成、并通过反相HPLC进行纯化和表征。
具有SEQ ID 25的CRP在ABI 431合成仪上使用FastMoc化学(0.1mmol尺度)和Fmoc-Phe-Wang树脂(0.74mmol/g，100-200目)合成。用TFA/三异丙基硅烷/水(95∶2.5∶2.5)将CRP从树脂上切割下来，持续2小时。HPLC纯化在Phenomenex C-18反相色谱柱(25×5cm)上进行，使用10-95％B(A：0.2％TFA/H2O；B：0.16％TFA/MeCN)的线性梯度以50mL/min的流速纯化60分钟。获得的CRP为白色粉末，总产率为32％。对于SEQ ID 25：(F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe：C138H185F5N32O43(MALDI-TOF-MS(M+Na)+)的计算值为3096.3；测量值为3096.8。具有SEQ ID 35：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe的比较多肽按与具有SEQ ID 25：(F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe的CRP类似的方式合成。
具有SEQ ID 29：Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly的比较多肽在ABI 433A合成仪上使用FastMoc化学(0.1mmol尺度)和Fmoc-Gly-Wang树脂(0.7mmol/g，100-200目)合成。用95％的TFA将比较多肽从树脂上切割下来，持续2小时。HPLC纯化在两根Vydac C-18反相色谱柱(25×2.5cm)中进行，使用0-100％B的分级梯度(A：0.1％TFA/H2O；B：含0.1％TFA的80％MeCN/H2O)以6mL/min的流速纯化90分钟。获得的比较多肽为白色粉末，总产率为34％。对于SEQ ID 29：Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly：C124H177N31O43(MALDI-TOF-MS(M+Na)+)的计算值为2811.3；测量值为2812.2。
圆二向色性(CD)光谱
将具有SEQ ID 25的CRP的溶液、以及具有SEQ ID 29和SEQ ID 35的比较多肽的溶液(0.25mM和0.013mM的水溶液)在4℃下保存24小时，然后监测三聚体的形成。在25℃下、于Jasco J-710仪器上使用光程为0.1cm的样品池，以100nm/min的扫描速度通过平均10或20次扫描的信号测量CD光谱。通过CD光谱(θmax＝225nm)发现，具有SEQ ID 25的CRP和具有SEQ ID 29的比较多肽呈三螺旋结构。CD解链曲线在配备有Peltier温度控制系统的Aviv 215光度计上获得。从20至100℃以1℃/min的速率监测在225nm处的椭圆度，增量为3℃，平衡时间为5分钟，光程为0.1cm。
具有SEQ ID 25的CRP同型三聚体经确定具有约57℃的Tm。具有SEQ ID 25的CRP三聚体的结果通过温度依赖性1H NMR研究进行确认，其中脯氨酸的δ-H(初始的δ为3.0-3.5ppm)的特征低场位移出现在约55℃至约65℃(具有平衡)。因此，具有SEQ ID 25的CRP三聚体在室温之上是稳定的。比较而言，具有SEQ ID 25的CRP三聚体的热稳定性略高于最近描述的胶原模拟化合物的热稳定性(Tm＝47℃)，其中后者具有三条通过一对二硫键共价连接的肽链(Kotch F and Raines RT，Proc.Natl.Acad.Sci USA2006，103，3028-3033(Kotch F和Raines RT，《美国科学院院刊》，2006年第103卷第3028-3033页))。与具有SEQ ID 29(Tm为70℃)的参考多肽三聚体相比，具有SEQ ID 25的CRP三聚体的解链温度较低可能归因于在具有SEQ ID 25的CRP三聚体的末端由于苯基和五氟苯基而造成的某些结构破坏(“磨损”)。
动态光散射(DLS)
DLS测量在配备有633nm激光器(He-Ne，4.0mW)和173°背向散射检测的Malvern Zetasizer Zen 1600仪器上完成。将具有SEQ ID 25的CRP和具有SEQ ID 29的参考多肽的溶液(0.5mg/mL的水溶液)在70℃下加热10分钟，然后用0.45μm过滤器趁热过滤，并在溶液达到室温(时间＝0)时和24小时后于塑料比色皿(1.0cm)中进行测量。
DLS测量用于确定具有SEQ ID 25的CRP和具有SEQ ID 29的比较多肽在25℃的水中形成的超分子复合物的大小。具有SEQ ID 25的CRP的新鲜溶液包含大小为3nm和190nm的两种物质，它们在24小时后聚集成为大小近似1000nm的聚集体材料。与此相反，具有SEQ ID 29的比较多肽显示具有大小为约4nm和100nm的两种物质，它们在相同的时间内没有增大。这些结果表明，假设的苯基-五氟苯基芳环堆积机制有助于具有SEQ ID 25的CRP形成超分子复合物。
透射电子显微镜(TEM)
具有SEQ ID 25的CRP的超分子复合物的大小和形态也通过用TEMPhilips EM 300采集的TEM图象进行评估。将具有SEQ ID 25的CRP的水溶液(0.05mg/mL)通过0.4μm过滤器过滤，然后沉积在包覆有碳膜的铜网格上。将溶液在40℃下干燥，然后记录80kV下的图象。将鼠科动物动脉用2％戊二醛染色，并置于用于TEM的环氧树脂块内。使用金刚石切片工具切割环氧树脂块内的动脉，得到其薄片(大小约200-500nm)。将切片安装在铜网格上，并记录60kV下的图象。在每个实验中，观察μm长的复合原纤维(平均直径：0.26μm)，该复合原纤维与存在于鼠科动物主动脉组织中的胶原原纤维(平均直径：0.05μm)类似。具有SEQ ID 25的CRP的原纤维尺寸需要至少100个具有SEQ ID 25的CRP三聚体在每个方向上进行的端对端(长度方向)和侧对侧(侧向)组装的组合。
质子核磁共振光谱
具有SEQ ID 25的CRP(1mM的D2O溶液，在4℃下温育24小时)的质子核磁共振光谱在配备有三重共振(1H、13C、15N)、三轴和梯度探针的DMX-600核磁共振仪(Bruker Biospin，Inc.(Billerica，MA 01821-3991))上收集。使用一维NOESY来收集数据，其中在循环延迟和混合时间期间进行预饱和。温度以10℃的增量升高，然后在15分钟的平衡后测量光谱。
实例2
SEQ ID 25：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
SEQ ID 26：Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
SEQ ID 27：Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
SEQ ID 28：Gly-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly。
具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP和具有SEQ ID 28的比较多肽通过标准FastMoc化学进行合成、通过反相HPLC进行纯化并进行表征。
肽合成
具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP和具有SEQ ID 28的比较多肽在ABI 431合成仪上采用FastMoc化学(0.1mmol尺度)和Fmoc-Phe-Wang树脂(0.74mmol/g，100-200目)或Fmoc-Gly-Wang树脂(0.66mmol/g，100-200目)进行合成。用TFA/三异丙基硅烷/水(95∶2.5∶2.5)将CRP和多肽从树脂上切割下来，持续2小时。纯化通过RP-HPLC(Zorbax 300SB-C18，21.2×150mm，60℃)进行，使用5-95％B(A：0.05％TFA/水；B：0.05％TFA/MeCN)的线性梯度以20mL/min的流速纯化15分钟。通过LC/MS分析流份，具体是在连接到Finnigan LCQ检测器的Agilent 1100上、使用Zorbax 300 SB-C18柱(3.5μm 4.6×150mm)在60℃和5-95％B(A：0.02％甲酸/水；B：0.02％甲酸/MeCN)的线性梯度下以1mL/min的流速分析20分钟。
如表1所示，将包含纯(＞90％)物质的流份合并，然后冻干，得到白色粉末状的肽。肽的含量通过测量215nm下的吸收并使用对参考多肽SEQ ID34：(Pro-Hyp-Gly)10(供应商：Peptides International)测得的消光系数(ε＝6.5×104M-1cm-1)来确定。MS计算值和测量值均使用MALDI-TOF-MS(M+Na)+来确定。
表1
CRP分析
CD光谱：将具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP和具有SEQ ID 28的比较多肽的溶液(0.25mM和0.013mM的水溶液)在4℃下保存24小时，并且监测三螺旋的形成。在25℃下、于Jasco J-710仪器上使用光程为0.1cm的样品池，以100nm/min的扫描速度通过平均10或20次扫描的信号测量CD光谱。CD解链曲线在配备有Peltier温度控制系统的Aviv215光度计上获得。从20至100℃以1℃/min的速率监测在225nm处的椭圆度，增量为3℃，平衡时间为5分钟，光程为0.1cm。
三种CRP(0.25mM的水溶液)在25℃下的CD光谱表现出胶原三螺旋特有的225nm(θmax)带。还通过监测从20至100℃时(增量为3℃，平衡时间为5分钟)225nm处的椭圆度，对由具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQID 27的CRP形成的三螺旋的热稳定性进行了对比研究。这三种CRP的解链温度非常类似(在56-59℃的范围内)，表明它们都形成了稳定的三聚体，与它们的N-末端处的结构差异无关。
实例3
SEQ ID 31：F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
SEQ ID 32：Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
SEQ ID 33：Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
如下面更完整地描述，由具有SEQ ID 30：(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-Gly)5的胶原样多肽三聚体的X射线结构构建出本发明的CRP三聚体的模型结构(Bella J，Eaton M，Brodsky B and Berman HM，Science1994，266，75-81(Bella J、Eaton M、Brodsky B和Berman HM，《科学》，1994年，第266卷第75-81页))。使具有SEQ ID 30的胶原样多肽三聚体发生突变，以在N-末端(Pro位置)掺入F5Phe并在C-末端(Gly位置)掺入Phe，从而提供具有SEQ ID 31(类似SEQ ID 25，但缺少一个GPO重复序列)的CRP。具有SEQ ID 32和SEQ ID 33的多肽分别使用Phe和Leu类似地制备。
计算化学
将具有SEQ ID 30的胶原样多肽的晶体结构用作建模的起点。由于这个结构包含中心丙氨酸残基，因此首先将该残基突变为甘氨酸。然后将式(I)的CRP的B和X单元各一个加到具有SEQ ID 30的三螺旋的每股螺旋的N-末端和C-末端。在C-末端，SEQ ID 30的Gly残基被Phe取代(对于SEQID 31、SEQ ID 32和SEQ ID 33)。在N-末端，Pro-Hyp片段被单个F5Phe(SEQ ID 31)、Phe(SEQ ID 32)和Leu(SEQ ID 33)取代。
由于序列的性质，具有SEQ ID 31、SEQ ID 32和SEQ ID 33的每个CRP其所包含的GPO基序的重复序列少一个(与SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27相比)，但它们适于对SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27进行分子建模。使用约束主链、OPLS-AA力场(Jorgensen WL and Tirado-Rives J，J.Am.Chem.Soc.1988，110，1657-1666(Jorgensen WL和Tirado-Rives J，《美国化学会志》，1988年，第110卷第1657-1666页))、GB/SA水(Qui D，Shenkin PS，Hollinger FP and Still CW，J.Phys.Chem.A.，1997，101，3005-3014(Qui D、Shenkin PS、Hollinger FP和Still CW，《物理化学杂志A辑》，1997年，第101卷第3005-3014页))，并使用Macromodel 9.0(MacroModel 9.0，2005年，Inc.(1500SW First Ave.，Suite1180，Portland，OR 97201))将每个CRP三聚体最小化，以缓解改性所引起的任何张力。然后将每个CRP三聚体与相同序列的CRP三聚体配对，该配对通过沿着三聚体的中心轴将两个三聚体单元对齐而进行。在这个步骤中，注意提供疏水识别单元的粗略对齐。
使用XED力场对每个具有SEQ ID 31、SEQ ID 32或SEQ ID 33的对齐CRP三聚体对进行自组装和纤维增长的评估，其中每个对齐的三聚体对被最小化至＜0.01rms(无约束的共轭梯度；Hunter CA，Sanders JKM，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，5525-5534(Hunter CA、Sanders JKM，《美国化学会志》，1990年，第112卷第5525-5534页)；Vinter JG，J.Comp.-Aid.Mol.Design，1994，8，653-668(Vinter JG，《计算机辅助分子设计杂志》，1994年，第8期第653-668页)；Vinter JG，J.Comp.-Aid.Mol.Design，1996，10，417-426(Vinter JG，《计算机辅助分子设计杂志》，1996年，第10期第417-426页)；Chessari G，Hunter CA，Low CMR，Packer MJ，Vinter JG andZonta C，Chem.Eur.J.，2002，8，2860-2867(Chessari G、Hunter CA、LowCMR、Packer MJ、Vinter JG和Zonta C，《欧洲化学杂志》，2002年，第8卷第2860-2867页))。将所有羧酸离子和铵离子以1/8全电荷带电，以说明部分溶剂化效应。在最小化后，计算两个三螺旋单元之间的相互作用能(IE)，该相互作用能由库仑作用能部分和范德华作用能部分组成。这个能量包括每个三螺旋单元之间的所有分子间关系(intermolecular terms)。相同三螺旋束的各股螺旋之间的分子内关系和能量不包括在其中。识别元件的若干组合的结果总结于表2中。
具有SEQ ID 31的对齐CRP三聚体对的建模界面能在(表2，项目1)中示出。三个芳族环对呈面对面取向，并且观察到一个氢键位于界面处。通过使芳族环对重新取向为边对面排列并接着进行重新最小化，对结构进行了测试(表2，项目2)。所得的界面结构回复到具有相似界面能的面对面相互作用。具有SEQ ID 32的CRP三聚体对的界面显示出边对面相互作用(表2，项目3)或移位的成角度的面对面相互作用。具有SEQ ID 33的CRP三聚体对的总界面能较低(表2，项目4)。
表2
三聚体对的相互作用能计算值(kcal/mol)
1SEQ ID 31的Phe-五氟苯丙氨酸(从面对面取向开始)模型；
2SEQ ID 31的Phe-五氟苯丙氨酸(从T形取向开始)模型，使返回面对面取向最小化；
3使通向边对面取向最小化。
如表2所示出，具有SEQ ID 31、SEQ ID 32和SEQ ID 33的多肽具有进行不同程度的端对端组装所需的结构要求。类似地，具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的多肽也会具有进行类似端对端组装所需的结构要求。
实例4
血小板聚集研究
采用人血小板聚集测定法评估具有SEQ ID 25的CRP在模拟胶原生物学功能方面的能力。得自健康志愿者的人富血小板血浆(PRP)浓缩物购自Biological Specialties，Inc.(Colmar，PA)。PRP的保存期不超过5小时，因为保存24小时的PRP对胶原和具有SEQ ID 25的CRP的响应衰减很大。将PRP在730g下离心15分钟。将所得的血小板颗粒在含有1U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶(V级，Sigma-Aldrich)的CGS缓冲液(13mM柠檬酸钠、30mM葡萄糖、120mM NaCl，pH 6.5)中洗涤两次，然后重新悬浮于Tyrode缓冲液(140mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO3、0.76mMNa2HPO4、5.5mM右旋糖、5.0mM Hepes、0.2％BSA，pH 7.4)中。将“经洗涤的”血小板稀释至3×108血小板/mL，并且在使用前于37℃下保存45分钟以上。
为进行测定，将105μL洗涤的血小板、2mM CaCl2和2.5mM纤维蛋白原加到96孔的微量滴定板。通过加入一系列浓度的天然胶原原纤维(马I型；与人胶原序列具有92％的同一性；Chrono-log Corp.(Havertown，PA))或测试肽来引发血小板聚集。将缓冲液加入一组对照孔。不断搅动测定板，并在加入化合物溶液后0和5分钟间歇地将其置于微板读板机(Softmax，Molecular Devices(Menlo Park，CA))中读取光密度(650nm)。按0时刻和5分钟测量之间的光密度减少量计算聚集，以聚集百分比表示。
用于血小板聚集研究的肽的制备条件在表3中示出。将肽溶解于PBS(pH 7)或水(最终pH为5)中至2mg/mL的浓度。将一些样品在水浴(70℃)中加热10分钟，然后通过0.45μm过滤器过滤，并在4℃下温育24小时或7天。过滤前后在215nm下的紫外测量值显示肽无损失。将具有SEQID 25的CRP于PBS(pH 7)或水中的测试溶液温育24小时或7天(4℃)，同时将其他样品变性(H+F)并在4℃下重新退火。
表3
制备肽的条件以及血小板聚集研究的结果
*H+F表示在70℃下加热10分钟，然后通过0.45μm过滤器过滤
具有SEQ ID 25的CRP的不同溶液引起了血小板聚集，但是更短的温育时间和“H+F”样品表现出降低的效价。具有SEQ ID 25的CRP(未经处理，在PBS中老化7天；EC50＝0.37μg/mL)与马I型胶原(EC50＝0.25μg/mL)几乎等效，然而具有SEQ ID 34(Pro-Hyp-Gly)10的30mer参考多肽不能使血小板聚集。SEQ ID 34(Pro-Hyp-Gly)10的肽购自PeptidesInternational，Inc.。
这些结果表明，具有SEQ ID 25的CRP三聚体可以随时间推移自组装为适当长度和构象的聚集体，以满足血小板识别(大概在血小板胶原受体处)所需的结构要求。此外，观察到具有SEQ ID 25的短(8nm)CRP通过非共价方式自组装成CRP三聚体，然后自组装成具有胶原模拟性质的胶原样原纤。值得注意的是，如CD、DLS和TEM数据所确定，形成了微米长度、包含三螺旋的复合原纤。另外，具有SEQ ID 25的CRP三聚体充当类似功能性蛋白的物质，能够像胶原那样引发血小板聚集。式(I)的CRP的芳族-芳族和疏水-疏水识别基序提供了胶原模拟肽自组装的直接途径，并且提供了能够组装成具有生物功能的纤维状结构的CRP三聚体。
实例5
使用整联蛋白GPIIb/IIIa拮抗剂依拉非班(elarofiban)获得了由胶原或具有SEQ ID 25的CRP三聚体诱导的对血小板聚集的抑制(Hoekstra WJ，et al.J.Med.Chem.1999，42，5254-5265(Hoekstra WJ等人，《药物化学杂志》，1999年，第42卷第5254-5265页))。由具有SEQ ID 25的CRP三聚体和胶原诱导的血小板聚集被GPIIb/IIIa抑制剂依拉非班所抑制。
在加入具有SEQ ID 25的CRP三聚体和胶原之前，将洗涤的血小板与不同剂量(10、100和1000nM)的依拉非班温育5分钟。观察到剂量依赖性的血小板聚集抑制。这些数据表明，胶原及具有SEQ ID 25的CRP三聚体是通过触发GPIIb/IIIa信号转导来激活血小板聚集。
实例6
通过实例4中所述的方法进行由胶原或具有SEQ ID 25、SEQ ID 26、SEQ ID 27、SEQ ID 28和SEQ ID 34的CRP三聚体诱导的血小板聚集。根据本发明的实施例，图1示出具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP三聚体刺激了不同程度的血小板聚集，其中具有SEQ ID 25的CRP三聚体和具有SEQ ID 26的CRP三聚体的效力更强。具有SEQ ID 28、SEQID 34和SEQ ID 35的参考多肽不能有效刺激血小板聚集。图1胶原和具有SEQ ID 25、SEQ ID 26和SEQ ID 27的CRP三聚体获得的EC50值(±SEM)(μg/mL)在表4中示出。
表4
EC 50 值(±SEM)(μg/mL)
实例7
脾损伤模型中的涂布CRP和涂布PBS对照物的PCL/PGA泡沫
步骤A：CRP悬浮液
如下制备测试悬浮液：将具有SEQ ID 25的CRP溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中，使得浓度为0.33mg CRP/mL PBS，然后在4℃下温育该悬浮液7天。
步骤B：PCL/PGA基材泡沫的制备
通过将50克3重量％的35/65(摩尔/摩尔)PCL/PGA于1，4-二氧杂环己烷中的溶液在4.5″×4.5″的铝模具中冻干，制备出3mm厚的聚(ε-己内酯-co-乙交酯)(“PCL/PGA泡沫”)，所述冻干是在冷冻干燥器(FTSSystems，TD3B2T5100型)中于约5至约-5℃的温度条件下进行约3小时。将所得的PCL/PGA泡沫从模具中移出，然后切成若干个2″×2″的正方形。
步骤C：涂布多肽的泡沫的制备
将根据上述步骤B中示出的程序制备的PCL/PGA正方形泡沫置于2″×2″的铝模具中。搅拌根据上述步骤A中示出的程序制备的CRP悬浮液直到其看起来均匀为止，然后将7mL悬浮液倾倒进模具中，以基本上覆盖泡沫的顶部表面。然后将模具置于冷冻干燥器(FTS Systems，TD3B2T5100型)中，预冷至-50℃，然后在-25℃下冻干约44小时。
步骤D：涂布PBS的对照泡沫的制备
如下制备涂布PBS的泡沫：将7mL PBS加到装有根据上述步骤B示出的程序制备的3mm厚PCL/PGA泡沫的2″×2″模具，以基本上覆盖泡沫的顶部表面。将模具置于冷冻干燥器(FTS Systems，TD3B2T5100型)中，预冷至-50℃，然后在-25℃下冻干约44小时。
随后将涂布CRP的泡沫和涂布PBS的对照泡沫切成若干个2cm×3cm的小片用于后续的测试。
脾损伤模型
在猪的脾上产生两道线性裂口(每道裂口长1cm、深0.3cm)。让伤口出血约3至5秒，然后用手将根据步骤C制备的涂布CRP的泡沫片施加到一道伤口的表面(测试组1)，接着用手将根据步骤D制备的涂布PBS的对照泡沫片施加到另一道伤口的表面(测试组2)。然后向每个测试部位施加类似的向下压力，维持30秒。移除涂布的泡沫片后，目视评估每道相应的伤口，确定是否实现止血。如有必要，间隔30秒使用相似类型的干净涂布泡沫片，分别对每道伤口再次施加压力。每道伤口实现止血(停止出血)的时间在下表5中示出。
表5
止血时间(秒)
结果表明，与对照泡沫相比，涂布CRP的泡沫可用于以更短的时间实现止血。
实例8
35/65PCL/PGA泡沫的制备
制备了大约3mm厚的聚(ε-己内酯-co-乙交酯)(PCL/PGA)泡沫。如下制备3重量％的35/65(摩尔/摩尔)PCL/PGA于1，4-二氧杂环己烷中的溶液：将21克聚合物溶于70℃的679克1，4-二氧杂环己烷中，磁力搅拌4小时。溶液用玻璃烧结漏斗过滤后，倾倒进模具中。然后将60ml 3重量％的35/65(摩尔/摩尔)PCL/PGA于1，4-二氧杂环己烷中的溶液在4.5″×4.5″的铝模具中冻干以制备泡沫。将模具置于冷冻干燥器(FTS Systems，TD3B2T5100型(Stone Ridge，NY))中，预冷至-41℃，然后在约5至-5℃的温度条件下冻干约23小时。然后在相同的模具中于室温下用60ml水浸泡所得的PCL/PGA泡沫，再将其置于冻干机(FTS Systems，TD3B2T5100型(StoneRidge，NY))中，预冷至-50℃，然后在-25℃下冻干约44小时。
实例9
35/65PCL/PGA在猪肝脏切除出血模型中的止血活性
使用猪肝脏切除出血模型测试了35/65PCL/PGA泡沫的止血活性。给猪肌内注射Telazol(5mg/kg IM)、赛拉嗪(5mg/kg IM)和甘罗溴铵(0.011mg/kgIM)。当动物达到足够的麻醉水平时，将静脉导管置于耳缘静脉中。插入气管内导管并连接到兽用麻醉机上。用于该制备和外科手术的其余部分的麻醉通过以1-2升/分钟的流速半封闭式回路吸入异氟烷和氧气来维持。辅助通气通过机械通风装置来实现，该装置设置为8-12次呼吸/分钟，并且一次换气量为大约10毫升/千克体重。稳定的麻醉水平通过用被调整为达到下列生理目标的通气和麻醉参数来维持：核心温度为37.0-39.0℃，PCO2为38-42mm Hg。麻醉深度通过对下颌骨肌肉紧张度(jaw tone)和捏夹脚趾反射进行评估来检验。将眼用软膏施用于麻醉动物的双眼。施用多巴酚丁胺(10-12.5μg/kg/min)来维持心输出量，从而维持MAP(60mm Hg)。
从剑突至正好位于耻骨联合头侧的点作腹部中线切口。使用常规止血夹和电烙术来控制皮肤出血。通过中线进入腹腔，并检查腹部器官是否存在既往疾病或现有疾病进程或其他异常的迹象。用毛巾包住小肠并让其缩回。
找到肝脏，然后用盐水浸泡的纱布和/或腹部手术巾保持湿润。使用解剖刀片、外科器械和烧灼器进行边缘切除(大约1-10cm，取决于目标器官)。施用实例8中制备的PCL/PGA泡沫并评估止血效果。使用4×4的8层折叠纱布(HENRY SCHEIN Inc.(Melville，NY 11747，USA))和商购的氧化再生纤维素止血剂作为对照物。通过施用测试制品后停止出血所需的时间长度来测量止血活性。测试制品的大小足够覆盖出血部位。测试了六个PCL/PGA泡沫样品、三份氧化再生纤维素止血剂和一个纱布样品。PCL/PGA泡沫实现止血的平均时间为45秒。纱布需要超过10分钟、氧化再生纤维素止血剂需要超过4.5分钟才能完全止住出血。这些结果表明PCL/PGA泡沫可用于实现止血。
实例10
35/65PCL/PGA在猪肾脏出血模型中的止血作用
使用实例9中所述的同一只猪来测试施行部分肾切除术后的止血活性。采用钝性分离法将肾脏从后腹腔中取出。该手术的进行无需闭合肾血管。施行半肾切除术，然后将测试制品施用到新产生的伤口部位，接着施用纱布并手压闭合。施用实例8中制备的PCL/PGA泡沫并评估止血效果。将商购的氧化再生纤维素止血剂用作对照物。测试了两个PCL/PGA泡沫样品和两份氧化再生纤维素止血剂。PCL/PGA泡沫实现止血的平均时间为1分钟。对照样品实现完全止血的平均时间为4.2分钟。这些结果表明PCL/PGA泡沫可用于实现止血。
本发明的新型泡沫止血基材、其制造方法和刺激止血的方法在上述实例和上述具体实施方式中进行了描述。
尽管上述说明书教导了本发明的原理，以示例为目的提供了实例，但应该理解本发明的实施涵盖落入所附的权利要求及它们的等同形式的范围内的所有通常的变型形式、改变形式和/或修改形式。同时，上述说明书所公开的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全文均据此并出于所有目的以引用方式并入本文。

Claims (4)

1.一种制备止血泡沫基材的方法，所述方法包括以下步骤：
制备3重量%的35/65（摩尔/摩尔）PCL/PGA于1,4-二氧杂环己烷中的溶液；
将所述溶液倾入模具中；
将所述模具中的所述溶液冻干；
将水溶液加到所述模具中的泡沫；
让所述泡沫在室温下浸泡于所述水溶液中达充分有效的一段时间；以及
将所述水溶液中的所述泡沫冻干。
2.一种根据权利要求1所述的方法制备的止血泡沫基材。
3.根据权利要求2所述的止血泡沫基材，所述基材包含35/65（摩尔/摩尔）的PCL/PGA。
4.由根据权利要求1所述的制备止血泡沫基材的方法制备的止血泡沫基材在制备医疗产品中的用途，所述医疗产品用于通过将所述泡沫基材施用于哺乳动物的出血部位来增强哺乳动物中的止血。
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