CN103665110B - 半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用。其氨基酸序列的通式如下：Ac-Pro-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH₂其中X、Y为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，氨基酸残基的数目固定为9个。本发明所述的半程电荷互补型手性短肽的二级结构稳定性较强，受外界环境因素影响不大，可通过加入NaCl或是改变NaCl的含量来调控手性短肽的自组装形貌，又可通过自组装形成纳米纤维水凝胶，对出血创面具有快速止血的作用。该材料制备工艺简单可行，成本较低，其应用丰富了纳米生物医药材料的种类。

Description

半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用

技术领域

本发明涉及自组装纳米生物医药材料领域，具体涉及一类半程电荷互补型手性自组装短肽及其快速止血的应用。

背景技术

源于自组装现象广泛存在于自然界中，近年来利用氨基酸残基序列设计自组装多肽纳米材料逐渐成为热门研究领域。通过合理设计多肽链的氨基酸残基序列，多肽分子可利用静电作用、疏水作用、氢键作用和π-π堆积作用等非共价键作用力自发或触发性地自组装形成结构与形态特异的自组装体。由于D-型氨基酸具有良好的生物相容性且不易被自然存在的氨基酸分解酶降解，因此，利用D-型氨基酸自组装构建各种功能性材料有着巨大的应用前景。近年来院前伤口止血问题成为急救医学界关注的重点，而由氨基酸组成的多肽不同于传统止血材料，它在人体内不易发生排斥或免疫反应，从而有望替代传统止血材料，达到快速止血的作用。目前，国内外已有少部分具有止血活性的短肽被报道，但也是仅限于全程电荷互补型短肽或是全L型氨基酸组成的易降解、较不稳定的短肽。

发明内容

本发明目的在于提供一类半程电荷互补型手性自组装短肽，该类短肽自组装形成相互交织的纳米纤维网状结构，不但可丰富以氨基酸残基构建自组装短肽的种类，而且增加了自组装短肽的应用价值。

本发明的另一目的在于提供所述半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料的应用。

本发明设计出一类能自组装的半程电荷互补型手性短肽，此手性短肽的组成氨基酸残基均为全D型氨基酸，它们的二级结构相对稳定，不易受外界环境改变的影响，并且此肽具有显著的快速止血活性。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一类半程电荷互补型手性自组装短肽，其氨基酸序列的通式如下：Ac-Pro-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH₂，其中Ac为乙酰化N端，NH₂为酰胺化C端，X、Y为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，含有且仅含有9个氨基酸残基。

优选地，所述带正电荷的氨基酸为His、Arg或Lys。

所述带负电荷的氨基酸为Glu或Asp。

所述半程电荷互补型手性自组装短肽的序列为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6任意一种所示。

该SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6分别对应如下6种：

①D-P9-1：Ac-Pro^D-Glu^D-Phe^D-Arg^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂

②D-P9-2：Ac-Pro^D-Glu^D-Phe^D-His^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂

③D-P9-3：Ac-Pro^D-Glu^D-Phe^D-Lys^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂

④D-P9-4：Ac-Pro^D-Asp^D-Phe^D-Arg^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂

⑤D-P9-5：Ac-Pro^D-Asp^D-Phe^D-His^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂

⑥D-P9-6：Ac-Pro^D-Asp^D-Phe^D-Lys^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂；

所述半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料的应用。

本发明手性短肽自组装原理是利用其肽键间的氢键相互作用以及氨基酸残基之间的氢键相互作用、静电相互作用，疏水相互作用以及π-π堆积作用等非共价键作用力自发组合形成一类结构明确，构造稳定，并且具有某种特殊理化性质和功能的分子聚集体或超分子结构。带电荷氨基酸的引入是为了产生电荷互补形成反向平行缠绕。

本发明半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料，止血时间快，SD大鼠肾脏创面平均止血时间在6s～10s范围内；SD大鼠肝脏创面平均止血时间则在9～15s范围内。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益之处：

1.提供了一类新型的半程电荷互补手性自组装短肽，丰富了自组装短肽纳米材料的种类，所述的手性短肽二级结构稳定，不易受外界环境改变的影响。

2.本发明所述半程电荷互补型手性短肽自组装纳米形貌可通过加入NaCl和改变NaCl的含量进行调控，可形成结构新颖的纳米形貌，有助于纳米形貌的可控性研究。

3.本发明所述半程电荷互补型手性短肽通过自组装可形成交织的纳米纤维网状结构，用于出血创面后可立即自组装形成透明水凝胶，良好地覆盖于伤口表面，起到快速止血和加速伤口愈合的作用。

4.本发明所述半程电荷互补型手性短肽组成成分为氨基酸残基，在体内不易发生排斥或免疫反应，组织相容性好；此外，D型氨基酸残基组成的短肽不易被体内蛋白酶水解，延长了其作用时间。

5.本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽纳米材料生产工艺简单可行、成本相对较低，不但可丰富以氨基酸残基构建自组装短肽的种类，而且增加了自组装短肽的应用价值。

附图说明

图1是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的高效液相色谱（HPLC）图。

图2是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的质谱（MS）图。

图3是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的三维分子结构模型示意图，采用的是HyperChem7.5软件基于能量最低原则绘制。

图4是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25℃下不同浓度超纯水溶液中的CD谱图。

图5是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25℃下不同浓度NaCl溶液中的CD谱图。

图6是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25℃下超纯水和80mM NaCl溶液中的临界胶束浓度拟合图。

图7是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在超纯水溶液中的原子力学显微镜（AFM）纳米形貌图，其中半程电荷互补型手性短肽D-P9-1样品的浓度分别为a.0.6mM；b.1.2mM；c.1.8mM；d.2.4mM；e.6.1mM；f.12.2mM。

图8是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在不同浓度（a、c：0mM；b、d：80mM；e.100mM）NaCl溶液中的AFM纳米形貌图，其中半程电荷互补型手性短肽D-P9-1样品的浓度分别为a、c：0.2mM；b、d、e：1.25mM。

图9是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1和②D-P9-2样品用于SD大鼠肾脏和肝脏止血模型实验图：A.肾脏空白对照；B.手性短肽①D-P9-1作用于肾脏创面；C.手性短肽②D-P9-2作用于肾脏创面；D.肝脏空白对照；E.手性短肽①D-P9-1作用于肝脏创面；F.手性短肽②D-P9-2作用于肝脏创面。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

当X为Glu，Y为Arg时，半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1序列如下：

D-P9-1：Ac-Pro^D-Glu^D-Phe^D-Arg^D-Phe^D-Asn^D-Phe^D-Gln^D-Pro^D-NH₂。半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的合成：Ac为乙酰化N端，NH₂为酰胺化C端

1.材料

Fmoc-Pro-OH(N-芴甲氧羰基-脯氨酸)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(N-芴甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)、Fmoc-Phe-OH(N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(N-芴甲氧羰基-N-三苯甲基-天冬酰胺)、Fmoc-Gln-OH(N-芴甲氧羰酰基-谷氨酰胺)、Rink Amide-MBHA Resin（树脂）。

HBTU（O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂）和HOBT（1-羟基苯并三氮唑）购自上海科肽生化有限公司。哌啶、醋酸酐、DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、TFA（三氟乙酸）、NMM（N-甲基吗啉）、乙醚、甲醇和DCM（二氯甲烷）购自天津市富宇精细化工有限公司。

2.制备方法

采用Fmoc（芴甲氧羰基）保护的固相合成法，其工艺步骤如下：

（1）称取20g0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin于肽合成仪中，取200ml DMF溶胀树脂30min，抽滤，再次取用300ml DMF洗涤树脂，分3次进行，每次洗涤时间为2min，抽滤出洗涤液后向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF（V：V）震荡反应30min，反应结束后，再次抽滤出反应液，用400ml DMF分4次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成仪中加入以下原料：

上所述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300ml DMF分4次洗涤树脂，每次洗涤时间2min，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。

（2）向肽合成仪中加入5ml20%哌啶/DMF（V：V）震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分4次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阳性，向肽合成仪中加入以下原料：

上述原料加完后，震荡反应40min，反应结束后，用40ml DMF分4次洗涤树脂，每次洗涤时间为2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

（3）变换步骤（2）中的a原料，其他原料及加入量不变，重复步骤（2）的操作；a原料依次替换为Fmoc-Phe-OH(15.48g)、Fmoc-Asn-OH(23.85g)、Fmoc-Phe-OH(15.48g)、Fmoc-Arg-OH(25.93g)、Fmoc-Phe-OH(15.48g)、Fmoc-Glu-OH(17.01g)、Fmoc-Pro-OH(13.49g)。即每重复一次步骤（2）的操作，变换一种a原料，直至将上述7种原料都使用一次为止；

（4）再重复一次（1）（2）（3）步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；最后一个Pro合成结束后，脱出Fmoc-保护基，加入20%哌啶/DMF（V：V）反应30min，洗净树脂，加入160ml50%醋酸酐/DMF（V：V）反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂8次，除去DMF。氮气吹干后，用TFA（三氟乙酸）/DCM强酸裂解液（体积比1:1），裂解3h，将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即为多肽的粗品。粗品经高效液相色谱法纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标手性短肽①D-P9-1。

3.本发明所述其他的②～⑥半程电荷互补型手性自组装短肽纳米材料可以通过替换上述1中的氨基酸残基，按照上述2所述制备方法合成纯化得到。在此过程中不同的合成实验参数如下表1所示：

表1

同理，分别将合成短肽从树脂上裂解下来后，需同时脱去所保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即为多肽的粗品。粗品经高效液相色谱法纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标手性短肽②D-P9-2；③D-P9-3；④D-P9-4；⑤D-P9-5和⑥D-P9-6。

实施例2

本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

将实施例1制备的半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1采用高效液相色谱检测，检测结果见图1，根据图1中的结果确定其纯度达到95.5%。

将实施例1制备的半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1采用质谱检测，检测结果见图2，结果显示其分子量为1222.38。

将实施例1制备的半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1采用HyperChem7.5分子模拟软件基于能量最低原则绘制三维分子模型示意图，所绘制的示意图如图3所示，通过该图3可知手性短肽D-P9-1氨基酸残基的空间分布。

实施例3

利用圆二色光谱仪检测本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的二级结构

1.利用圆二色性检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在不同肽浓度溶液中的二级结构变化

测试样品制备：取储存于4℃的半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1用Milli-Q超纯水制备成浓度分别为：0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.5mg/ml和1.0mg/ml的测试样品溶液。

实验操作和仪器参数设置：CD光谱采用Applied photophysics CD光谱仪，实验过程中使用1mm石英比色皿，测试前需使用少量测试样品润洗石英比色皿以减少实验误差，精密量取300μl待测样品于比色皿中进行CD扫描，记录样品在190～250nm波长范围之间，波长带宽为1.0nm，波长步长为1.0nm，采集数值时间间隔为1s的CD谱图。测试样品之前先空扫比色皿以检测CD信号的稳定性，并且扫描同一条件下只含缓冲液的CD信号作为样品背景信号，实验中所有检测样品均需除去此背景信号进行校正。测试使用3次重复扫描，结果取其平均值。

测定结果如图4所示，表明本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的二级结构随着肽溶液浓度的升高没有明显的变化，只是椭圆率不断升高，说明所述手性短肽①D-P9-1的二级结构含量有所增加。

2.利用圆二色性检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在不同NaCl浓度溶液中的二级结构变化

实验操作和仪器参数设置如本实施例中的1.0，将配制测试样品的Milli-Q超纯水换成不同浓度的NaCl溶液（0mM，20mM，30mM，60mM，100mM和200mM），手性自组装短肽①D-P9-1的浓度为0.6mM。

测定结果如图5所示，表明本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的二级结构随着NaCl溶液浓度的升高并没有明显的变化，但在190nm至200nm波长处的CD光谱线重叠性较差，呈现出分散状态，原因是Cl离子也可吸收圆二色光谱仪发出的偏正光，使结果产生干扰现象。

实施例4

利用芘荧光光谱法检测本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的临界胶束浓度（CMC值）

1.利用芘荧光光谱法检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在超纯水溶液中的CMC值

（1）测试样品制备：取用本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1母液（6mM）配制一系列浓度从0.001mM到5mM的D-P9-1溶液；然后，将5μl2mM的芘溶液加入D-P9-1溶液中，补加Milli-Q超纯水至4ml；最后，将配制好的芘-肽混合液充分振摇后（超声处理30min），在室温下放置4h，溶液稳定后进行荧光分析。

（2）实验仪器参数设置：实验采用日本日立公司的F-4500型荧光分光光度计进行测量。荧光扫描的激发波长为334nm,激发狭缝设置为5.0nm,发射狭缝设置为2.5nm,扫描速度为240nm/min，延迟时间1s，电压400V。所有光谱的收集范围为：360nm～440nm。记录芘荧光光谱中的第一个电子振动峰(373nm)I₁与第三个电子振动峰(384nm)I₃的荧光强度，用I₁/I₃对肽溶液浓度作图即可得D-P9-1溶液的CMC值。

芘荧光光谱法检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在超纯水溶液中的CMC值见图6（含实心圆点直线部分），结果表明D-P9-1芘溶液荧光强度（I₁/I₃）与肽溶液浓度（0.001～5mM）之间的函数关系属于非线性关系，分别由两条直线相交而成，在低浓度时，D-P9-1的荧光强度I₁/I₃比值几乎无显著变化，仅随着肽浓度的上升微弱下降，表明此时芘探针正处于亲水环境中；当浓度不断升高，D-P9-1的荧光强度I₁/I₃比值出现一个拐点，由拐点开始比值急剧下降，此现象表明D-P9-1开始在溶液中自组装形成特定的疏水区域，芘探针被疏水区域包裹，因此荧光强度I₁/I₃比值出现降低现象，随着肽溶液浓度的不断增高，D-P9-1自组装体也随之增多，更多的芘探针被疏水环境所包裹，因此出现了荧光强度I₁/I₃比值急剧下降的现象。而图中出现的拐点就是D-P9-1的在溶液中的CMC值，由图可知D-P9-1在超纯水溶液中的CMC值为0.4mM。

2.利用芘荧光光谱法检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在80mM NaCl溶液中的CMC值

实验操作如本实施例中的1.0，只是将配制测试样品的Milli-Q超纯水换成浓度为80mM的NaCl溶液。

芘荧光光谱法检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在80mMNaCl溶液中的CMC值见图6（含实心方块直线部分），结果表明D-P9-1在80mM NaCl溶液中的CMC值为0.125mM比其在水溶液中的CMC值低，表明NaCl的加入可加速D-P9-1形成自组装体，从而降低D-P9-1的CMC值。

实施例5

利用原子力学显微镜检测本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的纳米形貌

1.利用原子力学显微镜检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在超纯水溶液中形成的纳米形貌

（1）测试样品制备：取储存于4℃的半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1用Milli-Q超纯水制备成浓度分别为：0.6mM，1.2mM，1.8mM，2.4mM，6.1mM和12.2mM的测试样品溶液。用移液枪吸取10μl测试样品溶液，将溶液均匀涂布于新鲜剥离的云母片上，静置60s以上，使样品充分吸附在云母片基底上，接着用100μl Milli-Q超纯水冲洗云母片表面2次，以除去未吸附的测试样品，冲洗后的测试样品置于有盖培养皿（避免污染）中自然干燥。

（2）实验仪器参数设置：实验采用Veeco公司的RTESP型硅探针，共振频率267～373kHz，扫描速率1.00～1.50Hz，扫描角度0.00°，扫描范围为5×5μm，弹性系数20～80N/m，积分增益0.20，比例增益0.30。所得图像分辨率为512×512像素，每个样品需至少选5处进行扫描，以校正实验误差。

原子力学显微镜检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的形貌图见图7，结果表明本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1可自组装形成纳米纤维，随着肽溶液浓度的不断增高，纳米纤维数目逐渐增多，且纳米纤维之间相互交织最终形成纳米纤维网状结构。

2.利用原子力学显微镜检测半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在不同NaCl溶液中形成的纳米形貌

实验操作如本实施例中的步骤1，只是将配制测试样品的Milli-Q超纯水换成不同浓度的NaCl溶液（0mM，80mM和100mM），手性自组装短肽①D-P9-1的浓度分别为0.2mM和1.25mM。

原子力学显微镜检测半程电荷互补型手性自组装短肽①的形貌图见图8，对比可知，NaCl的加入可使半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1在低浓度（0.2mM）下即可自组装形成纳米结构，随着NaCl含量（80mM→100mM）的增加，半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1可自组装形成结构新颖的“Y-型尾巴”纳米形貌，纳米纤维与空白对照相比明显变粗。由此可知，通过改变肽溶液浓度或是加入不同浓度的NaCl可对本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的纳米形貌进行调控。

实施例6

本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1；②D-P9-2；③D-P9-3；④D-P9-4；⑤D-P9-5和⑥D-P9-6的快速止血应用

1.实验动物

在本实施例中，实验动物是健康成年Sprague-Dawley大鼠（以下简称SD大鼠）36只，均由广州中医药大学实验动物中心提供，体重约190g～220g，雌雄不拘。实验前单笼喂养，自由饮水进食，一周后进入实验。在止血实验中涉及有关于动物道德伦理均遵循广州中医药大学动物实验中心颁布的相关法律法规。

2.实验方法

36只SD大鼠在实验前一天开始禁食，但允许自由饮水。将实验SD大鼠随机分成6组，每组6只：空白对照组、1%壳聚糖对照组、手性短肽①D-P9-1组。

3.止血模型

按照不同的出血创面分为以下两种止血模型：

（1）肾脏止血模型：按照常规动物实验外科手术要求进行实验操作，用10%水合氯醛作为麻醉剂，腹腔注射（0.3ml/100g），待SD大鼠完全失去知觉后，将其固定在手术台上，打开腹腔，暴露肾脏，在肾脏上任取一处进行针刺实验。空白对照组（n=6）：待伤口自然流血，肉眼观察，并记录自然止血的时间T₁；1%壳聚糖对照组（n=6）：待伤口自然流血约3s后，用移液枪将25μl的1%壳聚糖溶液注入肾脏的伤口创面，肉眼观察，直到止血为止，并记录止血时间T₂；手性短肽①D-P9-1溶液组（n=6）：待伤口自然流血约3s后，用移液枪将25μl的1%手性短肽①D-P9-1（10mg/ml）溶液注入肾脏的伤口创面，肉眼观察，直到止血为止，并记录止血时间T₃。

（2）肝脏止血模型：按照常规动物实验外科手术要求进行实验操作，用10%水合氯醛作为麻醉剂，腹腔注射（0.3ml/100g），待SD大鼠完全失去知觉后，将其固定在手术台上，打开腹腔，暴露肝脏，在每只SD大鼠的最大肝叶部位，用手术刀划一道伤口，伤口大小取：长度1cm，宽度0.1～0.2cm，深度0.2～0.4cm。空白对照组（n=6）：待伤口自然流血，肉眼观察，并记录自然止血的时间T₁；1%壳聚糖对照组（n=6）：待伤口自然流血约10s后，用移液枪50μl的1%壳聚糖溶液注入肾脏的伤口创面，肉眼观察，直到止血为止，并记录止血时间T₂；手性短肽①D-P9-1溶液组（n=6）：待伤口自然流血约10s后，用移液枪将50μl的1%手性短肽①D-P9-1（10mg/ml）溶液注入肝脏的伤口创面，肉眼观察，直到止血为止，并记录止血时间T₃。

SD大鼠肾脏和肝脏止血实验结果如图9所示，表明本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1和②D-P9-2溶液注射在SD大鼠肾脏或肝脏出血创面时，可立即自组装形成纳米纤维水凝胶，覆盖出血表面，与1%壳聚糖对照组相比，止血作用迅速，止血活性明显。

4.实验结果

本实施例根据止血时间（T）来判断本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1的快速止血作用。SD大鼠肾脏或肝脏止血模型的平均止血时间如下表1和表2：

表1SD大鼠肾脏止血模型不同分组的平均止血时间

表2SD大鼠肝脏止血模型不同分组的平均止血时间

结果表明（见表1和表2），1%（w/v）本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1溶液组与1%壳聚糖生物止血材料对照组相比，产生的止血作用尤为显著，能有效缩短止血时间，因此，该半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1可进一步发展成为一种适用于临床使用的新型快速止血材料。

同理，分别将所述半程电荷互补型手性自组装短肽②D-P9-2；③D-P9-3；④D-P9-4；⑤D-P9-5和⑥D-P9-6的1%（W/V）超纯水溶液作用于SD大鼠肾脏和肝脏止血模型，止血实验操作如本实施例步骤3，仅将手性自组装短肽①D-P9-1溶液组分别换成手性自组装短肽②D-P9-2；③D-P9-3；④D-P9-4；⑤D-P9-5和⑥D-P9-6的1%（W/V）超纯水溶液，空白对照组和1%壳聚糖对照组不变。半程电荷互补型手性自组装短肽②D-P9-2、③D-P9-3、④D-P9-4、⑤D-P9-5和⑥D-P9-6溶液组SD大鼠肾脏创面平均止血时间均在6s～10s范围内；SD大鼠肝脏止血模型的平均止血时间则在9～15s范围内。

结果表明：1%（w/v）本发明半程电荷互补型手性自组装短肽②～⑥溶液组与1%壳聚糖生物止血材料对照组相比，产生的止血作用尤为显著，能有效缩短止血时间，因此，本发明半程电荷互补型手性自组装短肽①D-P9-1、②D-P9-2、③D-P9-3、④D-P9-4、⑤D-P9-5和⑥D-P9-6可进一步发展成为一种适用于临床使用的新型快速止血材料。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变，修饰，替代，组合和简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>  华南理工大学

<120>  半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用

<130>  1

<160>  6

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐1

<400>  1

Pro Glu Phe Arg Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

<210>  2

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐2

<400>  2

Pro Glu Phe His Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

<210>  3

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐3

<400>  3

Pro Glu Phe Lys Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

<210>  4

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐4

<400>  4

Pro Asp Phe Arg Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

<210>  5

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐5

<400>  5

Pro Asp Phe His Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

<210>  6

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  D‐P9‐6

<400>  6

Pro Asp Phe Lys Phe Asn Phe Gln Pro

1               5

Claims (2)

1.一类半程电荷互补型手性自组装短肽，其特征在于，氨基酸序列的通式如下：Ac-Pro-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH₂，其中Ac为乙酰化N端，NH₂为酰胺化C端，X、Y为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，含有且仅含有9个氨基酸残基；

所述半程电荷互补型手性自组装短肽的序列为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6任意一种所示。

2.根据权利要求1所述半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料的应用。