CN100543033C - 一种半程电荷匹配九肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种半程电荷匹配九肽，命名为PX₇P，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。实验表明，本发明所述半程电荷匹配九肽可用于制备疏水药物载体。实验还表明，本发明所述半程电荷匹配九肽具有止血功能，可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂制成适于临床使用的止血药物。

Description

一种半程电荷匹配九肽及其应用

技术领域

本发明属于自组装短肽领域，特别涉及一种半程电荷匹配短肽及其应用。

背景技术

自组装短肽中，一些具有经典β折叠结构的短肽能聚合成纤维，形成水凝胶，有着广泛的应用前景。围绕着能聚合成纤维、形成水凝胶的自组装短肽的设计、制备及应用，已有不少的研究成果和专利产生(见US 5670483；WO 2005/014615 A2；Xiaojun，Z.&Shuguang，Z.(2006)Self-Assembling Nanopeptides Become a New Type of Biomaterial；RonitSneer，M.J.W.，KristianKjaer，David A.Tirrell，Hanna Rapaport(2004)ChemPhysChem 5，747-750.)，但现有技术公开的能聚合成纤维、形成水凝胶的自组装短肽在结构上具有全程电荷匹配，即为全程电荷匹配的短肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半程电荷匹配九肽，以增加自组装短肽的类型，促进自组装短肽的应用。

本发明所述半程电荷匹配九肽，命名为PX₇P，分子量为1142.3，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。其中，带电的E和K的引入是为了产生电荷匹配形成反平行缠绕。

实验表明，本发明所述半程电荷匹配九肽可用于制备疏水药物载体。实验还表明，本发明所述半程电荷匹配九肽具有止血功能，可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂制成适于临床使用的止血药物。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了新型结构的自组装短肽，增加了自组装短肽的类型。

2、提供了一种新型的疏水药物载体和止血药物，具有明显的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是本发明所述半程电荷匹配九肽(未端基保护)的测序图谱，图中，a为空白对照图谱，b为标准图谱，每个峰代表着不同的氨基酸，c、d、e、f、g、h、i、j、k是样品测序的9个氨基酸的图谱，图中的dptu峰是反应留下的副产物峰，每一张氨基酸图谱是对一个氨基酸测定的结果。

图2是本发明所述半程电荷匹配九肽的三维分子模型示意图，图中，碳原子为白色，氧原子为红色，氮原子为蓝色，氢原子为灰色；在这个构型中，所有的疏水苯丙氨酸侧链都朝向一个方向，而且丝氨酸、赖氨酸和谷氨酸残基侧链都朝向另一个方向，这样产生两个不同的面。

图3是本发明所述半程电荷匹配九肽(200μM)的圆二色性(CD)谱图，从图中可见，在200nm处有一最小峰，在189nm处有一最大峰，显示出一个β转角结构。

图4是本发明所述半程电荷匹配九肽的傅立叶红外(FTIR)谱图，经去卷积计算后得到，从图中可见，在大约1633cm^-1处有一显著峰，这主要由β折叠结构引起，在1670cm^-1and 1695cm^-1处的两个峰说明含有β转角结构。

图5是本发明所述半程电荷匹配九肽(1％)在25℃的频率扫描图(1Pa的剪切应力)，图中，■代表储能模量，●代表耗散模量，从图中可见，在整个频率范围内耗散模量都小于储能模量，说明本发明所述半程电荷匹配九肽可以形成水凝胶。

图6是本发明所述半程电荷匹配九肽形成的水凝胶在停止对水凝胶网络结构破坏处理(以1000％的应变在6Hz下处理180s)后以水凝胶的恢复模量作为时间的函数的扫描图，图中，■代表储能模量，●代表耗散模量，该图表明，本发明所述半程电荷匹配九肽形成的自组装水凝胶在停止对其施加剪切应力后，通过分子自组装过程能够迅速的恢复其流变性能。

图7是本发明所述半程电荷匹配九肽在云母上的原子力显微镜(AFM)下的形态图，其中，(a)浓度1mg/ml的半程电荷匹配九肽溶于水，图像中显示出网状分支纤维结构，所述纤维由球状聚集体沿线状紧密排列构成；(b)图为(a)图的放大图，观测到球状聚集体和交叉排列形式；(c)图为(b)图的放大图。

图8是不同浓度的本发明所述半程电荷匹配九肽的原子力显微镜(AFM)下的形态图，其中，(a)图和(b)图是1mg/ml时的图像，显示出一种球状结构的纤维，背景是许多小纤维；(b)图为(a)图的放大图，显示出背景的清晰细节，即小纤维和小的球状结构；(c)图和(d)图是浓度为0.5mg/ml时的图片，显示出沿着纤维排布的球状结构；(e)图和(f)图是浓度为0.3mg/ml时的图片，显示出许多小纤维和由小纤维扭结在一起的较宽的纤维；(g)图和(h)图是浓度为0.1mg/ml时的图片，显示出许多小纤维和较宽的小纤维。

图9是本发明所述半程电荷匹配九肽在0.2mg/ml时的电子显微镜(TEM)图像，图中，(a)图是在较低放大率(25,000)时显示出高浓度的纤维网络；(b)图是在较高的放大率(60,000)时的单根纤维，可以看出由原纤维扭结而成的纤维。

图10左边小瓶内为芘的水溶液([PY]＝2.47×10^-3M)，从图中可以看到芘难溶于水；右边小瓶内为芘和肽的混合液([PY]＝2.47×10^-3M，[PX₇P]＝4.38×10^-4M＝0.5mg/ml)，从图中可以看到肽芘形成了悬浮液。

图11是待测样品的静态荧光发射光谱图，其中，(a)图是芘微晶固体(固体测量法)的静态荧光发射光谱图；(b)图是芘与蛋黄卵磷脂(EPC)囊泡的混合溶液([PY]＝1.58×10^-4M，[EPC]＝2.18×10^-4M)的静态荧光发射光谱图；(c)图是九肽-芘混合体系([PY]＝2.47×10^-3M，[PX₇P]＝4.38×10^-4M)的静态荧光发射光谱图；(d)图是九肽-芘体系与蛋黄卵磷脂(EPC)囊泡的混合溶液([PY]＝4.12×10^-5M，[PX₇P]＝6.84×10^-6M，[EPC]＝2.18×10^-4M)的静态荧光发射光谱图；激发波长为336nm。

具体实施方式

实施例1：半程电荷匹配九肽的制备

1、材料

Fmoc-Pro(芴甲氧羰酰基脯氨酸)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基谷氨酸-γ-叔丁酯)、Fmoc-Phe(芴甲氧羰酰基苯丙氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(芴甲氧羰酰基赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-Cys(Trt)-OH(芴甲氧羰酰基半胱氨酸-S-三苯甲硫醚)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(芴甲氧羰酰基丝氨酸叔丁醚)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)购自四川盛鑫生物药业有限公司生产；NMM(N-甲基吗啉)和DMF(N、N-二甲基甲酰胺)购自成都傲飞生物化学品有限公司生产。

2、制备方法

(1)称取0.65mmol/gFmoc-Pro(芴甲氧羰酰基脯氨酸)树脂1g于肽合成器皿中，用10ml DMF(N、N-二甲基甲酰胺)溶涨树脂30分钟，抽滤，再用30mlDMF分三次洗涤树脂，每次洗涤时间为2分钟，抽滤干洗涤液，向合成器皿中加入5ml20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用40mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

Fmoc-Glu(OtBu)-OH          952mg

HBTU                       985mg

HOBT                       351mg

NMM                        396μl

DMF                      1.5ml

上述原料加完后，震荡反应30分钟，反应结束后，用40mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(2)向合成器皿中加入5ml20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用40mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

(a)Fmoc-Phe              1006mg

(b)HBTU                  985mg

(c)HOBT                  351mg

(d)NMM                   396μl

(e)DMF                   1.5ml

上述原料加完后，震荡反应30分钟，反应结束后，用40mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

变换步骤(2)中的(a)原料，(b)(c)(d)(e)原料及加入量不变，重复步骤(2)的操作；步骤(2)中的(a)原料应分别依次变换为Fmoc-Lys(Boc)-OH(1217mg)、Fmoc-Phe(1006mg)、Fmoc-Cys(Trt)-OH(1524mg)、Fmoc-Phe(1006mg)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(996mg)、Fmoc-Pro(876mg)。即每重复一次步骤(2)的操作，变换一种(a)原料，直至将上述6种(a)原料都使用一次为止。

最后一个Pro合成结束后，脱出Fmoc-保护基，洗涤干净，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥12小时，加入TFA(三氟乙酸)裂解液，裂解2小时，抽滤，收集滤液，再向滤液中加乙醚，沉淀出白色固体，抽滤出固体，再经HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥即得本发明所述半程电荷匹配九肽PX₇P，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

实施例2：半程电荷匹配九肽的测序

将实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P(未加端基保护)采用Edman降解法(埃德曼降解法)测序，测序结果见图1，N-端测序结果：1.P 2.S 3.F 4.C 5.F 6.K 7.F 8.E 9.P，主要序列为：PSFCF KFEP。

实施例3：半程电荷匹配九肽的三维分子模型绘制

对实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P采用ChemSketch软件基于能量最小化原理绘制三维分子模型示意图，该分子模型的尺寸是约3.1nm长、1.2nm高、0.4nm宽，如图2所示。

实施例4：半程电荷匹配九肽的圆二色性(CD)和傅立叶红外光谱(FTIR)检测

1、圆二色性(CD)光谱检测

CD光谱采用AVIV400型光谱仪(AVIV Associates，Lakewood，NJ)在25℃下进行采集，使用2mm光程的石英比色池。数据采集的波谱范围为185nm～260nm，步长为1nm。数据值是以1s在1nm的带宽范围内的平均值记，所有的数据都通过减去背景进行修正，并且以平均残基摩尔椭圆率[θ]进行表示，其单位是[deg.cm².dmol^-1]。样品为实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P，浓度大约是200μM，用milli-Q纯水配制，保存在4℃条件下过夜。

检测结果见图3，图中在200nm处出现最大的负峰([θ]₂₀₀＝-17000degcm²dmol^-1)，在189nm处出现了最大的正峰([θ]₁₈₉＝13000degcm²dmol^-1)，这些表明了β转角结构的存在。

2、傅立叶红外光谱(FTIR)检测

FTIR光谱采用Perkin EImer Spectrum One FTIR光谱仪在氮气气氛下以4cm-1的波数分辨率进行测试。将实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P溶液(10mg/ml，～10ul)滴于ZnSe晶片上，并且在室温下晾干。背景吸收已从观测吸收强度结果中减去。应用傅立叶去卷积和二次卷积方法对1600cm-1～1700cm-1(酰胺I带)范围内的样品组成的波数、峰位和宽度进行处理。光谱数据通过Origin 7.0软件包(Origin Lab Corporation，Northampton，MA)进行分析。

检测结果见图4，图中可以看到三个不同的峰，分别出现在1633、1670及1695cm^-1，最低峰位1633cm^-1是由于分子间的聚集形成的β折叠引起的，而1670cm^-1和1695cm^-1的出峰说明了β转角结构的存在。

实施例5：半程电荷匹配九肽的流变性质检测

流变性质检测实验采用配有锥板系统(cone：diameter，2cm；angle，1°，truncation，51μm)的流变仪(HAAKE Rheostress I)在25℃下进行测试。将100μl实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P溶液(1％w/v)置于平板上，然后降低锥体，除去多余的溶液，使锥体尖部与平板的间隙为51mm。应力扫描在从0.1Pa到10Pa的范围测试样品，以确定样品的线性粘弹性区域(LVE)。从LVE中选择1Pa的恒定剪切应力，在从100rad/s到0.1rad/s的范围进行频率扫描。频率扫描结果见图5，从图5可以看出，在整个测试频率范围内样品的储能模量(G′，表示材料的弹性响应)大于耗散模量(G”，表示材料粘性响应)，说明这种材料可以形成水凝胶。

在剪切恢复(Shear recovery)测试中，首先以1000％的应变在6Hz频率下处理180s来对水凝胶的网络结构进行破坏。然后以1Pa的恒定剪切应力和6rad/s的恒定频率进行时间扫描，进行30min。温度控制是通过温度调节循环水浴(HAAKE Phoenix II)进行控制的。实验结果见图6，图6表明，实施例1制备的半程电荷匹配九肽在停止对其施加剪切应力后，通过分子自组装过程能够迅速的恢复其力学性能。

实施例6：半程电荷匹配九肽的形态检测

1、原子力显微镜(AFM)检测

应用AFM观测实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P聚集体的纳米结构。将PX₇P溶液(1％w/v)用Milli-Q纯水稀释到各种待观测浓度(1mg/ml、0.5mg/ml、0.3mg/ml、0.1mg/ml)。在扫描图像前，分别将5μl不同浓度的PX₇P溶液置于新揭开的云母片上，静置30s使样品黏附于云母表面，然后用200μl纯水冲洗。将制备好的样品盖以培养皿以避免污染，等到样品完全干燥后进行观测。

AFM扫描在室温下采用SPI4000 Probe Station and SPA-400 SPM Unit(SeikoInstruments Inc.，Chiba，Japan)以敲击模式进行。全部图像都是采用的针尖曲率半径为10nm，弹性系数12.00N/m，共振频率127.00kHz的Olympus Si-DF20悬臂。扫描器的最大扫描范围是20×20μm²，所有的图像的分辨率都是512×512像素。每个样品的图像的扫描尺寸分别采用5×5μm²，2×2μm²，和1×1μm²。

原子力显微镜(AFM)下的形态图见图7、图8。从图7可以看出，本发明所述半程电荷匹配九肽PX₇P可形成纳米纤维(见图7a、b、c)，并且纤维形态与全程电荷匹配短肽RADA16-I有很大的不同。PX₇P的纤维宽86.51±10.61nm，高5.72±1.25nm，并由许多珠状颗粒线性排列聚集而成。另外，纤维并不像RADA16-I那么直，而是形成了网状分枝结构。从图8可以看出，随着浓度变化，PX₇P的形态也随之改变；在1mg/ml的图中，发现许多纤维上明显排列着大小不一的小球，在背景中也有许多的小纤维和小球，但有些纤维上没有小球排列，大纤维一般宽73.52nm、高4.61nm，而小纤维一般宽23.7nm、高1.0nm；0.5mg/ml的图与1mg/ml的图相比有如下不同：①纤维上没有那么多的小球，②各种纤维网状结构更加明显；0.3mg/ml的图与1mg/ml的图相比区别更大，小球变得比较少，一些粗纤维(有的宽达80nm)分解为若干细纤维，细纤维的平均宽度约为21.49nm，有的甚至不到10nm；0.1mg/ml的图中，粗纤维已经分解为小纤维，有的小纤维还扭转在一起。

2、电子显微镜(TEM)检测

应用HITACHI H-600电子显微镜在100kv的加速电压下观测实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P。PX₇P被稀释成0.2mg/ml，铜网表明覆以聚乙烯醇缩甲醛(PVFM)膜。将一滴PX₇P溶液置于一干净表面，用铜网接触液滴15s，然后用滤纸将多余的液体吸干，再用铜网接触磷钨酸溶液(1％ w/v in water)15s，将铜网吸干并在室温下逐步干燥。

电子显微镜(TEM)下的形态图见图9，其中，(a)图是低放大倍数(25,000)下的电镜图，显示PX₇P形成了密集的网状结构，(b)图是高放大倍数(60,000)下的电镜图，显示出由原纤维扭结而成的纤维，这一结果与原子力显微镜(AFM)下的形态图是很好的呼应。

实施例7：半程电荷匹配九肽在制备疏水药物载体中的应用

本实施例采用芘(PY)作为疏水药物模型(芘的疏水性见图10左边小瓶)，以蛋黄卵磷脂(EPC)脂质体作为接受体，为传递系统提供了和所模拟的目的载体很接近的条件。蛋黄卵磷脂(EPC)购自Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd公司，芘购自Sigma公司，使用前用乙醇进行了两次重结晶。

1、蛋黄卵磷脂(EPC)脂质体溶液制备

将溶解于氯仿的蛋黄卵磷脂(EPC)溶液50ml加到1L的圆底烧瓶中，氯仿用旋转蒸发器蒸发掉，在圆底烧瓶内壁留下一层蛋黄卵磷脂(EPC)薄膜。室温下，将蛋黄卵磷脂(EPC)薄膜分散在310ml缓冲溶液中，缓冲溶液包含25mM的Tris/乙酸(pH＝7.0)和0.2mM的EDTA。然后氮气充入下在超声波细胞破碎仪上于0℃左右超声25min～30min，继后7000rpms离心1小时，收集上清液储存在4℃备用。蛋黄卵磷脂(EPC)脂质体溶液的浓度约为2.18×10^-4M。

2、肽-芘混悬液制备

将实施例1制备的半程电荷匹配九肽PX₇P和芘(PY)放入装有磁力转子的小瓶中，然后加水，水的加入量使PX₇P的终浓度为0.5mg/ml(4.38×10^-4M)、芘(PY)的终浓度为2.47×10^-3M；将上述小瓶放置在磁力搅拌器上持续搅拌直至达到平衡(溶液的荧光光谱不再随时间变化时则为达到了平衡，大约需72小时)，平衡达到后测定。所配制的肽-芘混悬液见图10右边小瓶。

3、芘的EPC溶液的制备

将一定量芘(PY)在小瓶中溶解于四氢呋喃中，挥去有机溶剂四氢呋喃，形成的芘(PY)薄膜用步骤1制备的EPC脂质体溶液溶解，得到芘的浓度为1.58×10^-4M的溶液，放置1h后测定。

4、肽-芘混悬液与EPC脂质体的混合液的制备

将50μl步骤2制备的肽-芘混悬液置于荧光比色杯底部，放入磁力转子，再加入3ml步骤1制备的EPC脂质体溶液，然后用一个内置于荧光分光光度计内的小型磁力搅拌器搅拌，搅拌4h后进行测定。

5、稳态荧光发射光谱的测定

肽-芘混悬液、芘的EPC溶液以及肽-芘混悬液与EPC脂质体的混合液的发射光谱由液体比色杯测得。实验时，3ml溶液加入1cm正方形石英荧光比色杯，溶液用一个内置于荧光分光光度计内的小型磁力搅拌器搅拌。

晶体芘的发射光谱由具有前面板的固体支架测得。

6、测定结果与结论

测定结果见图11，图11显示，当芘被自组装肽包埋的时候会以微小晶体形式存在，芘—肽混悬液与EPC脂质体混合时，芘从包埋它的自组装短肽包裹中释放到EPC双分子层膜中，并以分子的形式分散在EPC膜中。因此，本发明所述半程电荷匹配短肽PX₇P可以作为疏水药物的载体。

实施例8：半程电荷匹配九肽在制备止血药物中的应用

本实施例中，实验用动物为重量在190g到300g之间的雌性SD大鼠，所有动物均由四川大学华西临床医学院动物实验中心提供。

实验大鼠按照不同的止血方式分为以下三组：

(1)纱布组(n＝10，空白组)：部分肝脏被切除，伤口自然流血10秒后用纱布覆盖于伤口表面，轻轻按压20秒后，观察伤口表面流血情况。如在10秒内仍然继续出血，则继续上述步骤直至止血完成为止。如果总时间超出10分钟，则视为止血失败。

(2)1％ w/v壳聚糖组(n＝10，对照组)：部分肝脏被切除，伤口自然流血10秒后用100μl注射器取50μl 1％壳聚糖注入伤口内，观察出血情况，期间用纱布吸取伤口周围渗出的血液直至止血完成。

(3)1％ w/v PX₇P组(n＝10，实验组)：PX₇P为实施例1制备的半程电荷匹配九肽，部分肝脏被切除，伤口自然流血10秒后用100μl注射器取50μl 1％PX₇P注入伤口内，观察出血情况，期间用纱布吸取伤口周围渗出的血液直至止血完成。

大鼠肝脏使用不同止血材料的出血时间见表1。

表1 大鼠中不同止血剂的止血效果

注：***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05。数据表明，不同止血材料所对应的止血时间的不同具有统计学意义，置信度为95％。

从表1的实验数据可知，在所有的实验组中，1％PX₇P的止血时间最短。1％PX₇P组的平均时间是纱布组的13％(P<0.001)，壳聚糖组的19％(P<0.001)。因此，1％PX₇P比其它止血剂效果更好，本发明所述半程电荷匹配九肽PX₇P具有止血功能，可在制备止血药物中的应用。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>一种半程电荷匹配九肽及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.2

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<222>(1).....(9)

<223>端基保护

<400>1

Claims (3)

1、一种半程电荷匹配九肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

2、权利要求1所述半程电荷匹配九肽在制备疏水药物载体中的应用。

3、权利要求1所述半程电荷匹配九肽在制备止血药物中的应用。

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