CN109562199A - 具有自组装肽水凝胶的止血粉末 - Google Patents

Abstract

与自组装肽水凝胶一起协同使用止血粉末，以在靶位点处促进止血。公开了用于止血的相关方法、试剂盒和装置。

Description

具有自组装肽水凝胶的止血粉末

技术领域

一个或多个方面涉及用于各种医学应用、研究应用和工业应用的与自组装肽水凝胶连同使用的止血粉末。

背景技术

止血通常涉及防止受试者机体的血管和器官的失血。在手术、医学治疗和伤口愈合期间，该过程在阻止血流或以其它方式控制血流方面起重要作用。虽然止血是涉及凝固的天然生物过程，但可应用各种化学因素、机械因素和物理因素以实现或促进止血。

发明内容

根据一个或多个方面，用于止血的试剂盒可包含：包含自组装肽的溶液，所述自组装肽以有效量和有效浓度包含约7个氨基酸至32个氨基酸，以用于在生理条件下形成水凝胶来促进止血；以及止血粉末，所述止血粉末能混溶于所述溶液中。

在一些方面，所述自组装肽可选自于由RADA16、IEIK13和KLD12所组成的组。止血粉末可包含微球和/或微纤维。所述止血粉末可包含生物可吸收材料。所述止血粉末可包含胶原蛋白、明胶、壳聚糖、多糖、淀粉、透明质酸、丝素蛋白或氧化再生纤维素。在一些方面，所述止血粉末可包含合成生物材料。所述合成生物材料可选自于由聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、(PLGA)-聚(乙二醇)-嵌段-共聚物和(PLGA-b-PEG)所组成的组。

在一些方面，所述试剂盒可进一步包含注射器系统，所述注射器系统用于混合所述溶液和所述止血粉末。所述试剂盒可进一步包含说明书，所述说明书用于将所述溶液和所述止血粉末给予至靶位点。所述说明书可提供以按重量计每1g止血粉末约0.1mL至20mL溶液的比例来对所述溶液和所述止血粉末进行混合的指导。在一些非限制性方面，所述说明书可提供以按重量计每1g止血粉末约0.5mL至7mL溶液的比例来对所述溶液和所述止血粉末进行混合的指导。所述说明书可提供将所述溶液和所述止血粉末的混合物过量地施用至靶位点、然后用纱布覆盖所述靶位点的指导。所述说明书仍可提供向所述纱布施加触压的进一步指导。

在一些方面，所述试剂盒可进一步包含如下中的至少一种：鲁尔锁注射器(luer-lock syringe)、递送喷嘴、瓶、铺展器(spreader)、容器和纱布。递送喷嘴的内径可为约0.5mm至约10mm，且喷嘴的长度可为约0.5cm至约30cm。喷嘴可为柔性的。

根据一个或多个方面，宏观支架可基本上由止血粉末和多个自组装肽组成，每个自组装肽以有效量包含约7个氨基酸至约32个氨基酸，以在靶区域处促进止血。

在一些实施方式中，所述试剂盒和/或宏观支架向具有WHO出血量表上的2分以上的出血评分的靶区域提供止血。在一些实施方式中，所述试剂盒和/或宏观支架可在2分钟以内向靶区域提供止血。具体而言，所述试剂盒和/或宏观支架可在2分钟以内将WHO出血量表上的靶区域的出血评分降低至0分。在一些实施方式中，例如，当施用本文公开的自组装肽和止血粉末的混合物时，所述试剂盒和/或宏观支架可在2分钟以内对具有WHO出血量表上的3分或4分的初始出血评分的靶区域提供止血。

这些示例性方面和实施方式的其它方面、实施方式和优点将在下文详细讨论。此外，将理解的是，上述信息和以下的详细描述仅仅是各方面和实施方式的说明性示例，并且旨在提供概述或框架以用于理解所要求保护的方面和实施方式的性质和特性。附图被包括在内以对各方面和实施方式提供说明和进一步的理解，并且被并入且构成本申请文件的一部分。附图与申请文件的其余部分共同用于解释所描述的和所要求保护的方面和实施方式的原理和操作。

附图说明

附图并不旨在按比例描绘。为清楚起见，可能未标记每个要素。在附图中：

图1包括根据一个实施方式使用具有自组装肽水凝胶的止血粉末的方法的6幅图像；

图2为根据另一个实施方式的连同止血粉末的凝胶形成的视图。

图3为根据另一个实施方式的连同止血粉末的凝胶形成的替代视图。

图4为明胶粉末和盐水的储能模量/损耗模量的图表。

图5为自组装肽水凝胶的储能模量/损耗模量的图表。

图6为根据一些实施方式的明胶粉末和自组装肽水凝胶的混合物的储能模量/损耗模量的图表。

图7为根据一些实施方式的本文所述的各种混合物的储能模量的替代图表。

图8为根据另一个实施方式的连同止血粉末的凝胶形成的视图。

图9为根据另一个实施方式的连同止血粉末的凝胶形成的替代视图。

图10包括根据本文所述的实施方式用止血粉末和/或自组装肽处理的伤口缺损位点的3幅图像；

图11为根据本文所述的一些实施方式的用止血粉末和盐水、凝血酶或自组装肽水凝胶处理的样品的出血程度(出血评分)随时间变化的图表；以及

图12为根据本文所述的一些实施方式的在用止血粉末和盐水、凝血酶或自组装肽水凝胶处理的样品中实现的止血成功率(％)随时间变化的图表。

具体实施方式

根据一个或多个实施方式，自组装肽水凝胶可用作用于止血的支架。例如，可从3-D Matrix有限公司商购获得的肽水凝胶(下文称为)是一种合成的具有精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的重复序列的16-氨基酸多肽或RADARADARADARADA(RADA16)。已知在生理条件下自组装形成水凝胶，并且可用于各种生物医学应用。根据本文描述的各种实施方式，可用于止血。是也可从3-DMatrix有限公司商购获得的合成的肽水凝胶。其它相关的非限制性合成肽序列可由具有赖氨酸、亮氨酸和天冬氨酸(Lys-Leu-Asp(KLD))的重复序列的自组装肽表示，并且此类肽序列由(KLD)p表示，其中p＝2-50，如KLD12。其它相关的非限制性合成肽序列可由具有异亮氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和赖氨酸(Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK))的重复序列的自组装肽表示，并且此类肽序列由(IEIK)p表示，其中p＝2-50，如IEIK13。其它实施方式可以涉及其它自组装肽。在一些非限制性实施方式中，可应用肽水凝胶(例如，名称为“SELF-ASSEMBLINGPEPTIDE COMPOSITIONS”的国际专利申请公开号WO2015/138514中公开的并转让给3-DMatrix有限公司的肽水凝胶，通过引用将其整体并入本文以用于所有目的)。

本文公开的实施方式可包括一些肽组合物(并且特别是自组装肽试剂的一些组合物)以及与其相关的技术。在一些实施方式中，此类组合物可为溶液或包含溶液。在一些实施方式中，此类组合物可为凝胶或包含凝胶。在一些实施方式中，此类组合物可为固体(例如干燥/冻干的)肽或包含固体(例如干燥/冻干的)肽。例如，特定的肽组合物(即具有特定浓度、离子强度、pH、粘度和/或其它特征的肽组合物)具有有用和/或令人惊讶的属性(例如，凝胶化或自组装动力学(例如凝胶化速率和/或肽自组装的速率和可逆性)、硬度(例如通过储能模量所评估的)、和/或其它机械性质)。

在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽是自组装肽。在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽是两亲性肽。在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列的特征在于交替排列的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的至少一段(例如，具有至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个等的氨基酸)。根据一个或多个实施方式，肽组合物可包含具有约6个至约200个氨基酸残基的两亲性多肽。在一些实施方式中，肽可具有处于约6个至约20个氨基酸的范围内的长度，并具有交替排列的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽具有包含Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)的一个或多个重复的氨基酸序列。在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽具有包含序列Lys-Leu-Asp-Leu(KLDL)的重复单元的氨基酸序列、或具有由该重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方式中，所提供的组合物中包含的肽具有包含序列Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)的重复单元的氨基酸序列、或具有由该重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽可为IEIK13、KLD12或RADA16。在一些实施方式中，相对于具有不同(例如，较低)的pH水平和/或离子强度的适当的参考组合物，此类肽的组合物可具有增强的性质。

在一些实施方式中，增加的离子强度可有利地影响肽组合物的硬度和/或凝胶化动力学，使其适合于更广范围的应用。在一些实施方式中，增加的离子强度可为生理离子强度，可在将肽组合物置于体内时发生。在一些实施方式中，肽组合物的离子强度可为约0.0001M至约1.5M。在一些实施方式中，肽组合物的离子强度可通过混合普通盐来调节，所述普通盐例如NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、CaSO₄、DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，10×)。在一些实施方式中，肽组合物的离子强度可通过混合普通盐来调节，其中，一种或多种普通盐由一种或多种成盐阳离子和一种或多种成盐阴离子组成，其中所述成盐阳离子选自于由铵、钙、铁、镁、钾、吡啶鎓、季铵和钠所组成的组，其中所述成盐阴离子选自于由乙酸根、碳酸根、氯离子、柠檬酸根、氰根离子、氟离子、硝酸根、亚硝酸根和磷酸根所组成的组。

根据一个或多个方面，一些肽组合物(包括但不限于IEIK13、KLD12和RADA16)的性质可通过如下而增强：将它们的pH水平维持在约3.5以下，并且同时将它们的盐浓度维持在低于其临界离子强度水平(即，没有沉淀)。在一些实施方式中，肽组合物可具有处于约2.5至约4.0范围内的pH、或处于约3.0至约4.0范围内的pH。在一些实施方式中，所提供的组合物具有处于或高于约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5或更高的pH。在一些实施方式中，所提供的组合物具有处于或低于约4.3、约4.2、约4.1、约4.0、约3.9、约3.7、约3.6、约3.5、约3.4或更低的pH。在一些实施方式中，可用选自于由氢氧化钠或氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、硫化钠、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)和PBS(磷酸盐缓冲盐水)所组成的组中的溶液来实现肽组合物的pH。

在一些实施方式中，肽组合物可为溶液、凝胶或它们的任意组合。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度为至少0.05％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1.0％或更高。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度为低于5％、低于4.5％、低于4％、低于3.5％、低于3％或更低。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度处于约0.5％至约3％的范围内。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度处于约0.5％至约2.5％的范围内。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度处于约1％至约3％的范围内。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度处于约1％至约2.5％的范围内。在一些实施方式中，肽组合物中的肽浓度为约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％或更高。在一些特定的实施方式中，当肽是RADA16时，肽组合物中的肽浓度处于约0.05％至约10％的范围内。

在一些实施方式中，肽组合物可具有处于约1Pa·S至约10000Pa·S范围内的粘度。在一些实施方式中，肽组合物可具有处于约50Pa至约2500Pa范围内的储能模量。

本文所使用的术语“肽”是指通常相对短的多肽，例如，长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸。

本文所使用的术语“多肽”是指氨基酸的任意聚合链。在一些实施方式中，多肽具有自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽具有经工程化的氨基酸序列，所述氨基酸序列通过人工作用设计和/或产生。在一些实施方式中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方式中，多肽可仅包含天然氨基酸或仅包含非天然氨基酸、或者仅由天然氨基酸组成或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施方式中，多肽可包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方式中，多肽可仅包含D-氨基酸。在一些实施方式中，多肽可仅包含L-氨基酸。在一些实施方式中，多肽可在多肽的N-末端、在多肽的C-末端或它们的任意组合处包含一个或多个侧基或其它修饰(例如修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链)。在一些实施方式中，此类侧基或修饰可选自于由以下所组成的组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括它们的组合。在一些实施方式中，多肽可为环状的、和/或可包含环状部分。在一些实施方式中，多肽不是环状的、和/或不包含任何环状部分。在一些实施方式中，多肽是线性的。在一些实施方式中，多肽可为订书多肽(stapledpolypeptide)或包含订书多肽。

在一些实施方式中，可将术语“多肽”附在参考多肽的名称、活性或结构之后。在这种情况下，其在本文中用于指共享相关活性或结构的多肽，并因此可将其认为是多肽的相同类别或家族的成员。对于每个这样的类别而言，本说明书提供和/或本领域技术人员将意识到其氨基酸序列和/或功能已知的类别中的示例性多肽。在一些实施方式中，此类示例性多肽是多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方式中，多肽类别或家族的成员显示出与该类别的参考多肽的显著的序列同源性或同一性、与该类别的参考多肽共享共同序列基序(例如，特征性序列元件)和/或共享共同活性(在一些实施方式中，处于可比较的水平或处于指定的范围内)。在一些实施方式中，多肽类别或家族的成员显示出与该类别内的所有多肽的显著的序列同源性或同一性、与该类别内的所有多肽共享共同序列基序、和/或共享共同活性。

例如，在一些实施方式中，成员多肽显示出与参考多肽的序列同源性或同一性的总体程度为至少约30％-40％，并且通常为大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，和/或包含显示出非常高的序列同一性(通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的至少一个区域(例如保守区域，其在一些实施方式中可为特征性序列元件或包含特征性序列元件)。此类保守区域通常涵盖至少3个-4个并且通常多达20个以上的氨基酸。在一些实施方式中，保守区域涵盖具有至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个以上的连续氨基酸的至少一段。在一些实施方式中，有用的多肽可包含亲本多肽的片段或由亲本多肽的片段组成。在一些实施方式中，有用的多肽可包含多个片段或由多个片段组成，比起在感兴趣的多肽中被发现的，每个片段在相同的亲本多肽中以相对于彼此不同的空间排列而被发现(例如在亲本中直接连接的片段可在感兴趣的多肽中空间上分离的或反之亦然，和/或片段可以在感兴趣的多肽中以与亲本中不同的顺序存在)，以便使得感兴趣的多肽是其亲本多肽的衍生物。

术语“自组装”在本文中用于指在适当条件下可自发地自我结合成结构的一些多肽。例如，使含有它们的溶液(例如水性溶液)发展出凝胶特性。在一些实施方式中，组合物内的单个自组装多肽之间的相互作用是可逆的，使得组合物可在凝胶状态和溶液状态之间可逆地转变。在一些实施方式中，自组装(和/或解组装)响应于一种或多种环境触发物(例如pH、温度、离子强度、同渗容摩(osmolarity)、同渗重摩(osmolality)、施加的压力、施加的剪切应力等的一种或多种中的变化)。在一些实施方式中，当多肽处于经组装的状态时，自组装多肽的组合物的特征在于可检测的β-折叠结构。

根据一个或多个实施方式，自组装肽水凝胶可与止血粉末一起用作用于止血的支架。根据一个或多个方面，通过将各种止血粉末与自组装肽水凝胶连同使用，可增强各种止血敷料的止血性质。根据一个或多个进一步的方面，通过将自组装肽水凝胶与各种止血粉末连同使用，可增强自组装肽水凝胶的止血性质。因此，本文所述的各种实施方式指向通过同时使用用于止血的自组装肽水凝胶和止血粉末而展现出的协同作用。

在本文公开的一些实施方式中，当施用自组装肽水凝胶溶液和止血粉末的混合物时，与止血粉末一起使用的自组装肽水凝胶可向经历重度出血的靶区域提供止血。例如，可用纱布将混合物施用至伤口，同时向伤口上的纱布的顶部施加触压。

止血是伤口愈合的第一阶段。如本文所公开的，“止血”用于指出血的减少。例如，止血可指开放性伤口的出血减少。在一些实施方式中，将止血定义为出血的完全停止。在一些实施方式中，将止血定义为出血的显著停止。通常，止血是指开放性伤口的出血在视觉上显著减少。

根据一些实施方式，如本文所公开的，与止血粉末一起使用的自组装肽水凝胶可用于停止重度出血。例如，本文公开的实施方式可停止具有世界卫生组织(WHO)出血量表上的2分以上的级别的出血。WHO出血量表是经临床研究者评估的5分量表，0分＝无出血、1分＝有瘀斑、2分＝轻度失血、3分＝大量失血、以及4分＝衰竭性失血。本文公开的实施方式可用于处理被分类为产生轻度失血(WHO量表上的2分)、大量失血(WHO量表上的3分)或衰竭性失血(WHO量表上的4分)的伤口。

根据一些实施方式，当出血为WHO量表上的1分以下时，实现止血。例如，当在视觉上将出血确定为WHO出血量表上的1分、0.5分或0分时，可实现止血。例如，在本文公开的一些实施方式中，在向靶区域处的纱布的顶部施加所述混合物和触压时，与止血粉末一起使用的自组装肽水凝胶可将靶区域的出血减少至WHO出血量表上的0.5分以下的出血评分。例如，在向靶区域施加所述混合物和触压2分钟之后，与止血粉末一起使用的自组装肽水凝胶可将靶区域的出血减少至WHO出血量表上的0分的出血评分。

根据一个或多个非限制性实施方式，自组装肽水凝胶可为IEIK13、KLD12或RADA16。自组装肽能够以有效量和有效浓度包含约7个氨基酸至32个氨基酸，以用于在生理条件下形成水凝胶来促进止血。在一些具体的实施方式中，自组装肽可包含在疏水性氨基酸和亲水性氨基酸之间交替排列的约12个氨基酸至约16个氨基酸。肽水凝胶可在与血液接触时胶凝，以通过出血位点的机械阻断来停止和/或控制出血。当胶凝时，得到的肽水凝胶可基本上是透明的，以便允许靶区域的无阻碍观察。通常，肽水凝胶可被刻画为非生物来源的、生物相容的和可吸收的。自组装肽水凝胶能够以不同浓度存在于溶液中。例如，在一些非限制性实施方式中，可使用2.5％肽水凝胶溶液。在其它非限制性实施方式中，可使用1.3％肽水凝胶溶液。在至少一些实施方式中，溶液可基本上不含细胞和/或药物。在其它实施方式中，溶液可包含一种或多种治疗剂以促进止血。如本文进一步描述的，可对溶液进行配制，以影响其硬度和/或凝胶化动力学、或为预期应用提供合适的环境。

通常，自组装肽水凝胶可单独用于处理WHO出血量表上的1分以下的级别的出血。当向伤口或治疗位点直接施用基本上不含药剂并且在未与止血粉末混合的情况下使用的自组装肽水凝胶时，该肽水凝胶可能无法有效地实现重度出血伤口位点的止血。例如，自组装肽水凝胶(无任何其它物质)可能无法停止WHO出血量表上的3分或4分的级别的重度出血。因此，尽管自组装肽水凝胶可用作用于止血的支架，并且可能能够实现一些伤口的止血，但肽水凝胶通常可能无法实现分类为具有大量失血或衰竭性失血(WHO量表上的3分或4分)的伤口的止血。本文公开的以可混溶的混合物组合自组装肽水凝胶和止血粉末的实施方式可协同地实现具有WHO出血量表上的2分以上的失血的伤口的止血。

根据一个或多个实施方式，可至少部分地基于预期应用中涉及的细胞或组织的类型来选择溶液的目标pH水平和/或张力水平。例如，可将肽水凝胶的pH水平调节至至多约3.0的水平(例如至多约3.4或3.5的水平)，以用于通过提供更温和、不太严苛的环境来改善细胞存活力。就张力而言，可对肽水凝胶溶液的张力进行调节，以便紧密地匹配靶细胞类型和/或靶物种的血浆同渗重摩。例如，可基于任何给定的细胞类型的血浆同渗重摩来调节肽水凝胶溶液的张力。张力水平可取决于所涉及的物种的类型和/或细胞或组织的类型而变化。在一些非限制性实施方式中，目标张力的范围可为约260mOsm/L至约360mOsm/L。

通常，可如本文所述对许多治疗位点进行处理。治疗位点可指受伤位点。治疗位点可为外部或内部位点。外部治疗位点包括经历WHO出血量表上的2分以上的级别的失血的开放性伤口或者表面和/或外部出血位点。外部治疗位点可包括切断术位点或创伤位点。内部位点可包括经历WHO出血量表上的2分以上的级别的失血的、在暴露的组织上产生的手术切口。内部位点可包括用于手术治疗目的的手术切口、或已被至少部分地暴露以用于治疗的内部出血位点。在一些实施方式中，内部位点包括通过内窥镜和/或腹腔镜操作处理的治疗位点。

根据一个或多个实施方式，止血粉末通常能混溶于溶液中。止血粉末可包括微球和/或微纤维。在一些实施方式中，止血粉末可由生物可吸收材料制成。例如，止血粉末可包含胶原蛋白、明胶、壳聚糖、多糖、淀粉、透明质酸、丝素蛋白或氧化再生纤维素。在一些实施方式中，止血粉末可为合成生物材料。例如，止血粉末可包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、(PLGA)-聚(乙二醇)-嵌段-共聚物、或(PLGA-b-PEG)。根据一个或多个实施方式，止血粉末可为可从Ethicon商购获得的止血粉末、可从Baxter商购获得的止血粉末、可从Pfizer商购获得的止血粉末、可从Medafor商购获得的止血粉末、或可从Integra商购获得的止血粉末。

止血粉末通常能停止来自大伤口的大的血流。例如，当在伤口位点上的纱布上施加触压时，止血粉末可在施用的数分钟内停止从大动脉和静脉的出血。当在没有自组装肽水凝胶的情况下施用时，本文公开的止血粉末可在约5分钟至约8分钟内从重度出血的伤口(WHO量表上的3分或4分)实现止血。当与自组装肽水凝胶一起使用时，如本文所述，止血粉末和水凝胶可在约5分钟以内从类似的重度出血的伤口实现止血。具体而言，本文公开的实施方式可在2分钟以内向具有WHO出血量表上的3分或4分的出血评分的靶区域提供止血。通常，可将止血粉末和自组装肽以混合物与例如施加至伤口上的纱布的顶部的触压一起施加到靶区域。

如上所述，肽水凝胶和止血粉末可根据各种实施方式连同使用。与替代方法(例如涉及单独施用的方法)相比，这一组合可有利地赋予肽水凝胶溶液向靶位置(例如伤口区域或手术位点)的相对快速且容易的递送。这一组合还可有利地赋予就手或手指压力的施用而言的辅助，可将其施加在所施用的粉末的顶部以暂时控制血流，转而可在出血的伤口表面的附近实现自组装肽水凝胶的稳定凝胶化而不会被血流妨碍。该组合还可有利地在粉末颗粒间的空隙中提供储集空间，该空间可含有肽溶液，以便使其被手或手指挤压时允许储存的肽溶液释放到伤口上。肽水凝胶可同时保留在储集空间中以覆盖靶区域。肽水凝胶溶液的粘度也可有利地赋予粘性性质，这可使止血粉末更稳定地保持在靶区域上的适当位置。

根据一个或多个实施方式，肽溶液和止血粉末能够以按重量计每1g止血粉末约0.1mL至20mL溶液的比例使用。例如，肽溶液和止血粉末能够以按重量计每1g止血粉末约0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL、17.5mL、18mL、19mL或20mL溶液的比例使用。根据一个或多个具体的非限制性实施方式，肽溶液和止血粉末能够以按重量计每1g止血粉末约0.5mL至7mL溶液的比例使用。能够以超过治疗位点的体积需要的体积在试剂盒中提供肽水凝胶溶液和/或止血粉末。

根据一个或多个实施方式，止血粉末和肽溶液可作为单个装置组合和提供在一起。所述装置可包含溶液和可混溶于所述溶液中的止血粉末。所述溶液可包含自组装肽。所述自组装肽能够以有效量和有效浓度包含约7个氨基酸至32个氨基酸，以用于在生理条件下形成水凝胶来促进止血。可对所述装置进行预包装，以在靶区域处使用。包装可包括用于将装置给予至靶区域以用于止血的说明书。例如，所述说明书可提供用于将所述溶液和所述止血粉末的混合物过量地施用至靶位点、然后用纱布覆盖所述靶位点的指导。说明书可进一步涉及用于将触压施加至靶区域处的所施加的装置的顶部、或施加至覆盖所述装置的纱布的指导。

根据一个或多个其它实施方式，可替代地提供用于止血的试剂盒。试剂盒可包含止血粉末和肽水凝胶溶液两者。这两个组件可一起包装在试剂盒中。还可提供使用说明书。在与靶区域有关的使用之前或期间，说明书可就如何将肽水凝胶溶液以预定的比例混合至止血粉末提供指导。试剂盒可包含一种或多种进一步的组件，以在使用之前或期间便于止血粉末和肽水凝胶溶液的组合。例如，此类组件可包括用于组合和递送自组装肽水凝胶和粉末的装置。根据一个或多个实施方式，所述装置可包含：含有自组装肽溶液的注射器，例如具有阳鲁尔锁(male luer-lock)或阴鲁尔锁(female luer-lock)的注射器；以及含有止血粉的另一注射器，例如具有阳鲁尔锁或阴鲁尔锁的另一注射器。然后，可将两个注射器用它们的鲁尔锁连接，用于通过来回多次推动各自的柱塞来混合两种材料直到稠度基本一致。根据一个或多个实施方式，所述装置可包含喷嘴以将肽溶液和止血粉末的混合物递送至靶区域。根据一个或多个非限制性实施方式，所述喷嘴的内径可为0.5mm至10mm，且所述喷嘴的长度可为0.5cm至30cm。根据一个或多个实施方式，所述喷嘴可为柔性的，以被弯曲来将材料施用至各种位置。根据一个或多个实施方式，所述试剂盒可包含纱布或其它保护性覆盖物，所述纱布或其它保护性覆盖物可用于覆盖在靶区域处施用的混合物(例如在手指或手压力的施加期间)。所述试剂盒可包含说明书，所述说明书用于将止血粉末和肽水凝胶的混合物给予至靶区域以用于止血。说明书可进一步涉及用于在靶区域处施加触压的指导。

在其它实施方式中，可将止血粉末和肽水凝胶溶液彼此分开包装和提供。各自可作为单独的产品进行包装，然后在使用之前或期间将其组合。一个或两个单独包装的组件可包括说明书，所述说明书用于将止血粉末和肽水凝胶给予至靶区域以用于止血。说明书可进一步涉及用于将触压施加至靶区域处的所施加的混合物的顶部的指导。一个或两个单独包装的组件还可任选地包括额外的组件(例如，如上所述的组件，包括但不限于一个或多个注射器和喷嘴)，以便于同时使用。

根据一个或多个非限制性实施方式，宏观支架可基本上由止血粉末和多个自组装肽组成，每个自组装肽以有效量包含约7个氨基酸至约32个氨基酸，以在靶区域处促进止血。

从以下的非限制性实施例将更充分地理解这些和其它实施方式的功能和益处。所述的实施例本质上旨在说明而并不会被认为限制了本文所讨论的实施方式的范围。

实施例

实施例1

参照如本文所讨论的图1，本实施例说明了一些止血粉末与一些自组装肽水凝胶的用途。在(1)中，提供了处于具有阴鲁尔锁的注射器中的可吸收明胶粉末(Ethicon)和处于具有阳鲁尔锁的另一注射器中的自组装肽在(2)中，将两个注射器连接，并通过前后推动(例如6次)它们的柱塞来进行混合。在(3)中，在靶位点处观察到出血，从靶位点除去血液，并将明胶粉末和的混合物施用至靶位点。在(4)中，在靶位点处提供过量的混合物。在(5)中，通过手指或手在混合物上施加压力直至实现止血。在施加压力之前，可使用纱布来覆盖材料和伤口。在(6)中，实现了止血。

实施例2

证明了当与止血粉末连同使用时的肽水凝胶凝胶化的能力。当与止血粉末一起使用时，进行刚果红测定以确定盐水缓冲溶液(pH 7.4)中的肽溶液的凝胶形成。

将纯的自组装肽溶液以及肽溶液/止血粉末(Ethicon)混合物涂布在载玻片上。30秒后，在凝胶等分试样的周围和顶部加入处于盐水缓冲溶液(pH 7.4)中的1％刚果红溶液，然后在检查前擦去过量的刚果红溶液。凝胶形成的可视化确定凝胶化的成功或失败。如图2所示，即使在与止血粉末混合时，自组装肽溶液也胶凝至与在纯的肽溶液中所观察到的类似的程度。在(1)和(2)中，分别示出了在刚果红测定之前和之后的自组装肽溶液在(3)和(4)中，分别示出了在刚果红测定之前和之后以2比1(v/w)的比例与可吸收明胶粉末(Ethicon)混合的在(5)和(6)中，分别示出了在刚果红测定之前和之后以5比1(v/w)的比例与可吸收明胶粉末(Ethicon)混合的

因此，如图2所示，当与止血粉末以2比1的比例混合以及当与止血粉末以5比1的比例混合时，RADA16 2.5％能够凝胶化。凝胶化的自组装肽和止血粉末组合可能能够在出血伤口上促进止血。

实施例3

证明了当与止血粉末连同使用时的肽水凝胶凝胶化的能力。当与止血粉末一起使用时，进行刚果红测定以确定盐水缓冲溶液(pH 7.4)中的肽溶液的凝胶形成。

将纯的自组装肽溶液(在pH 3.0下的IEIK13 1.3％)以及肽溶液/止血粉末(Ethicon)混合物涂布在载玻片上。30秒后，在凝胶等分试样的周围和顶部加入处于盐水缓冲溶液(pH 4.7)中的1％刚果红溶液，然后在检查前擦去过量的刚果红溶液。凝胶形成的可视化确定凝胶化的成功或失败。如图8所示，即使在与止血粉末混合时，自组装肽溶液也胶凝至与在纯的肽溶液中所观察到的类似的程度。在(1)和(2)中，分别示出了在刚果红测定之前和之后的自组装肽溶液(在pH 3.0下的IEIK13 1.3％)。在(3)和(4)中，分别示出了在刚果红测定之前和之后，以2比1(v/w)的比例与可吸收明胶粉末(Ethicon)混合的pH 3.0的IEIK13 1.3％。图8中的网格间隔为1cm。

因此，如图8所示，当与止血粉末以2比1的比例混合时，IEIK13 1.3％(pH 3.0)能够凝胶化。如用RADA16 2.5％所观察到的，预期当与止血粉末以5比1的比例混合时，IEIK131.3％(pH 3.0)能够凝胶化。凝胶化的自组装肽和止血粉末组合可能能够在出血伤口上促进止血。

实施例4

证明了与盐水相比的自组装肽溶液和明胶粉末以各种混合比例的均匀混合。将明胶粉末分别与盐水和RADA16 2.5％溶液混合以确定它们的表观混溶性。将明胶粉末置于鲁尔锁注射器中，并将盐水或RADA16 2.5％溶液置于另一鲁尔锁注射器中。将注射器连接，以通过前后移动柱塞混合两个注射器的内容物，例如前后移动6次直到稠度均匀。将混合物涂布在载玻片上。图3展现了处于不同混合比例的明胶粉末和盐水混合物(上部图像)以及明胶粉末和RADA16 2.5％混合物的图像。如图3所示，将RADA16和明胶粉末以各种混合比例进行均匀混合，而当明胶粉末含量较低时，盐水和明胶粉末未良好地混合。

因此，如图3所示，当与止血粉末组合时，RADA16 2.5％能够均匀混合。均匀混合和凝胶化的自组装肽和止血粉末组合可能能够在出血伤口上促进止血。

实施例5

证明了与盐水相比的自组装肽溶液和明胶粉末以各种混合比例的均匀混合。将明胶粉末与IEIK13 1.3％(pH 3.0)溶液混合以确定其表观混溶性。将明胶粉末置于鲁尔锁注射器中，并将IEIK13 1.3％(pH 3.0)置于另一鲁尔锁注射器中。将注射器连接，以通过前后移动柱塞将两个注射器的内容物混合，例如前后移动6次直到稠度均匀。将混合物涂布在载玻片上。图9展现了处于各种混合比例的明胶粉末和IEIK13混合物的图像。如图9所示，将IEIK13和明胶粉末以各种混合比例进行均匀混合。相比较地，如图3所示，当明胶粉末含量较低时，盐水和明胶粉末良好地混合。

因此，如图9所示，当与止血粉末组合时，IEIK13 1.3％(pH 3.0)能够均匀混合。均匀混合和凝胶化的自组装肽和止血粉末组合可能能够在出血伤口上促进止血。

实施例6

使用具有20mm板的流变仪(DHR-1，TA Instruments)评价具有盐水的明胶粉末、自组装肽和具有自组装肽的明胶粉末的流变学性质。将样品置于流变仪板上，并用以1000μm的测量几何间隙放置的板在25℃下对模量进行测量。在25℃下在2分钟的弛豫时间后进行测量。频率扫描测试以1rad/sec～10rad/sec的振荡应力(应变为0.01)进行。

对纯的RADA16 2.5％以2:1(w/v)的比例与盐水混合的明胶粉末和以各种混合比例与RADA16 2.5％混合的明胶粉末全部进行测试。在没有DMEM处理的情况下进行这些样品的频率测试后，将这些样品用DMEM处理20分钟。图4-图6中示出了在DMEM处理之前和之后，这些样品的储能模量和损耗模量图。图4展现了在DMEM处理之前和之后以2:1(w/v)的比例与盐水混合的明胶粉末的流变学。图5展现了在DMEM处理之前和之后RADA16 2.5％溶液的流变学。图6展现了在DMEM处理之前和之后以1:5(w/v)的比例与RADA16 2.5％混合的明胶粉末的流变学。

如图4和图5所示，如的说明书中所述，作为对照对RADA16 2.5％溶液以及比例为2:1(w/v)的明胶粉末和盐水进行测试。如图6所示，在对以1:5的比例与RADA162.5％混合的明胶粉末进行测试后，在DMEM处理后与盐水混合的明胶粉末的模量没有变化。然而，如在纯的RADA16 2.5％中所示，在DMEM处理后，与RADA16 2.5％混合的明胶粉末的模量增加。因此，即使在与明胶粉末混合时，RADA16也形成凝胶。

图7展现了流变学数据，该数据显示在DMEM处理之前和之后以不同比例具有自组装肽的明胶粉末的储能模量。在凝胶化之前，与RADA162.5％混合的明胶粉末的模量随着更多的明胶粉末而增加。然而，当将它们用DMEM处理时，与RADA16 2.5％混合的明胶粉末的模量随着更多的RADA16 2.5％而更显著地增加。随着增加的RADA 16 2.5％含量，DMEM处理时的模量方面的变化更为显著。以2:1(w/v)的比例具有RADA16 2.5％的明胶粉末的模量比以2:1(w/v)的比例具有盐水的明胶粉末的模量高2.8倍。

实施例7

以下对比实施例说明了当与自组装肽水凝胶一起使用时的明胶粉末的增强的止血功效。具体而言，对比实施例进一步说明了具有凝血酶溶液的明胶粉末与具有自组装肽溶液的明胶粉末之间的有效性的相似性。

进行研究以评价止血剂在猪的器官损伤模型中的功效。对每个动物模型进行中线剖腹手术。将肝脏暴露并分离。使用穿过三个肝叶的钻孔活检产生多个出血缺损(bleedingdefect)。使用8mm活检钻孔仪器产生深度为约2mm-5mm的圆形缺损。在活检钻孔之后和测试样品施用之前，所有肝脏位点产生可接受的出血评分(WHO出血量表上的3分-4分)。

用明胶粉末(Ethicon)制备测试样品。将明胶粉末与2mL或4mL的RADA16 2.5％手术止血剂混合。还通过将明胶粉末与2mL的凝血酶溶液混合来制备测试样品。凝血酶在临床上被用作手术止血剂。通常，可连同其它止血剂(例如可吸收的海绵、胶原蛋白、纤维素和纤维蛋白原)使用凝血酶。然而，由于凝血酶可与人凝血因子交叉反应(如果是外源的)，或者凝血酶可传播血源性病原体并且在可用性方面受到限制(如果是人源的)，凝血酶是不适宜的试剂。因此，存在对止血溶液的需要，该溶液安全地用于外科手术中并且也被广泛获得。

在盐水湿润的纱布上将实验的止血样品施用至每个伤口位点。将明胶粉末与2mL盐水混合来制备对照止血样品，并将对照止血样品与测试样品(在盐水湿润的纱布上)类似地施用至伤口位点。如图10所示，以足以覆盖每个伤口的整个缺损位点的体积施用测试样品。在(1)中，将和盐水对照样品施用至肝脏活检缺损。在(2)中，将和凝血酶测试样品施用至肝脏活检缺损。在(3)中，将和测试样品施用至肝脏活检缺损。

在盐水湿润的纱布上将每个测试样品随着压力施加至肝脏伤口位点约2分钟。紧接在2分钟的压力施用期后、在施用后5分钟和施用后8分钟对肝损伤进行出血评分。结果总结在图11的图表中。在用测试样品和对照样品处理的不同位点之间，初始出血评分(时间＝0)未发现显著差异。具体而言，将所有样品的初始出血确定为WHO出血量表上的3分或4分。

在随着直接压力施用物品2分钟后，在所有测试物品制剂位点中的出血减少。与+盐水的测试物品相比，在物品施用后2分钟和5分钟，用+凝血酶和处理的测试物品产生较低的出血评分。在施用后2分钟和施用后8分钟，测试样品之间未发现显著差异。在测试的所有时间点，+凝血酶和之间未发现显著差异。在经处理的8个位点中，+凝血酶和在施用后8分钟表现为无出血，而+盐水在施用后8分钟显示1个出血位点。值得注意的是，在施用后5分钟，相对于+盐水的止血效果，的止血效果优越性尤其显著(p<0.05)。具体而言，5分钟后，用+盐水处理的位点表现出WHO出血量表上的0.25分的平均出血，而用处理的位点表现出WHO出血量表上的0分的平均出血。

数据显示在测试的所有时间点，相对于 +凝血酶均无显著的优势性。具体而言，即使在测试的所有时间点，用+凝血酶处理的每个位点均表现出WHO出血量表上的0分的平均出血，2分钟后，用处理的位点表现出WHO出血量表上的仅0.13分的平均出血，并且5分钟和8分钟后，位点表现出WHO出血量表上的0分的平均出血。

表1中总结了+盐水的出血评分，表2中总结了和凝血酶的出血评分，并且表3中总结了的出血评分。

表1：+盐水样品的出血评分。

表2：+凝血酶样品的出血评分。

表3：样品的出血评分。

图12的图表示出了施用后的止血成功率(％)。8分钟后的所有+凝血酶和样品的出血评分为0分(100％止血成功率)。与+盐水(分别为50％和87.5％)相比，在施用后5分钟和8分钟，样品显示出更高的止血成功率(各自为100％)。具体而言，在施用后5分钟和8分钟，与在5分钟时用+盐水实现了止血的8个缺损位点中的4个、以及在5分钟时用+盐水实现了止血的8个缺损位点中的7个相比，用和处理的8个缺损位点中的8个实现了止血。两个群体比例的Z评分测试证明了相对于+盐水的显著优越性。由于各样品在施用后5分钟和8分钟均表现出100％的止血成功率，+凝血酶相对于没有显著优越性。

如上文实施例2-实施例5中所示，由于IEIK13 1.3％(pH 3.0)和RADA16 2.5％的相似凝胶化机制，预期IEIK13 1.3％(pH 3.0)自组装肽水凝胶具有类似的结果。

因此，自组装肽水凝胶可与明胶粉末一起使用。自组装粉末能够将明胶粉末的止血功效增强至与不利的且不能广泛获得的凝血酶类似的程度。进一步，与将粉末与盐水组合相比，自组装肽能够增强明胶粉末的止血功效。

应当理解的是，在申请中，本文讨论的方法和装置的实施方式不限于在本说明书中阐述的组件的排列和构造的细节或者在附图中说明的组件的排列和构造的细节。所述方法和装置能够在其它实施方式中实施并且可以各种方式被实践或施行。本文提供了具体实施的示例以仅用于说明目的而并非旨在限制。此外，本文使用的措辞和术语是为描述的目的，而不应被视为限制。本文中使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变形意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及额外的项目。提及“或”可被解释为包含性的，从而使得使用“或”描述的任何术语可指示单个、多于一个和全部所描述的术语中的任一者。对前和后、左和右、顶部和底部、上和下，以及垂直和水平的任何提及都是为了方便描述而不是将本装置和方法或其组件限制在任何一个位置或任何一个空间方向上。

由此已经描述了至少一个示例的多个方面，应当理解的是，本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。例如，本文公开的示例也可在其它情况下使用。此类改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在落入本文讨论的示例的范围内。因此，以上描述仅作为示例。

Claims (20)

1.用于止血的试剂盒，所述试剂盒包含：

包含自组装肽的溶液，所述自组装肽以有效量和有效浓度包含约7个氨基酸至32个氨基酸，以用于在生理条件下形成水凝胶来促进止血；以及

止血粉末，所述止血粉末能混溶于所述溶液中以形成能够在伤口上促进止血的混合物，所述伤口具有如世界卫生组织(WHO)出血量表上评估的2分以上的初始出血评分。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述混合物能够在具有如世界卫生组织(WHO)出血量表上评估的3分以上的初始出血评分的伤口上促进止血。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述自组装肽选自于由RADA16和IEIK13所组成的组。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述自组装肽包含KLD12。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述止血粉末包含微球和/或微纤维。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述止血粉末包含生物可吸收材料。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述止血粉末包含胶原蛋白、明胶、壳聚糖、多糖、淀粉、透明质酸、丝素蛋白或氧化再生纤维素。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述止血粉末包含合成生物材料。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述合成生物材料选自于由聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、(PLGA)-聚(乙二醇)-嵌段-共聚物和PLGA-b-PEG所组成的组。

10.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含注射器系统，所述注射器系统用于混合所述溶液和所述止血粉末。

11.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含说明书，所述说明书用于将所述溶液和所述止血粉末给予至靶位点。

12.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述说明书提供了以按重量计每1g止血粉末约0.1mL至20mL溶液的比例来对所述溶液和所述止血粉末进行混合的指导。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中，所述说明书提供了以按重量计每1g止血粉末约0.5mL至7mL溶液的比例来对所述溶液和所述止血粉末进行混合的指导。

14.如权利要求11所述的试剂盒，其中，所述说明书提供了将所述溶液和所述止血粉末的混合物过量地施用至所述靶位点、然后用纱布覆盖所述靶位点的指导。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述说明书提供了向所述纱布施加触压的进一步指导。

16.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含如下中的至少一种：阳鲁尔锁注射器、阴鲁尔锁注射器、递送喷嘴、瓶、铺展器、容器和纱布。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述递送喷嘴的内径为约0.5mm至约10mm，并且所述喷嘴的长度为约0.5cm至约30cm。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中，所述喷嘴是柔性的。

19.一种宏观支架，所述宏观支架基本上由止血粉末和多个自组装肽组成，每个所述自组装肽以有效量包含约7个氨基酸至约32个氨基酸，以在靶区域处促进止血。

20.如权利要求19所述的宏观支架，其中，所述自组装肽选自于由RADA16和IEIK13所组成的组。