CN117126244A - 一种固相片段缩合制备自组装肽rada16的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，属于多肽的合成领域。本发明通过固相合成法制备肽片段和肽树脂，并将肽片段和肽树脂偶联得到自组装肽RADA16。本发明制得的RADA16粗品的纯度可达到80％以上，降低了分离纯化难度，操作简便，原料易得。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学材料制备领域，具体涉及一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法。
背景技术
自组装技术是一种新型的生物纳米技术，其中自组装多肽是研究的一个热点。自组装多肽被应用于多种领域，包括三维细胞培养、药物释放和药物递送、组织修复、止血等。离子互补型自组装多肽在生理盐溶液条件下可通过非共价键作用自发形成具有亲水面和疏水面的β-折叠结构，最终自组装形成含水量超过99％的纳米纤维水凝胶。这种多肽自组装形成的水凝胶生物相容性良好，在医学、生命科学领域具有良好的应用潜力。
自组装肽RADA16是一种人工合成的十六肽，具有独特的氨基酸序列(Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2)，最早由美国麻省理工学院和香港大学的Ellis-Behnke小组发现可用作止血剂。目前，RADA16已在欧盟获批上市，商品名PuraStat，用于当结扎术或常规手段无效或无法开展时的下列外科手术止血：1.血管或实体器官实质渗出性出血；2.血管吻合渗出性出血；3.胃肠道小血管和毛细血管的渗出性。
多肽的合成方法主要分为固相合成法(SPSS)和液相合成法(LPSS)。过去，多肽的合成是在溶液中进行，反应步骤较多，且由于中间体要按步骤释放，合成过程中可能会产生异构体，提纯困难。自1963年Merrifield首次提出固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相合成法已成为多肽合成中的一个常用技术。固相合成法具有反应速度快、副产物少、易于自动化等优点。多肽固相合成从C端向N端延伸的原理为：将目标肽链的首个氨基酸的羧基与固相载体以共价键结合，然后下一个氨基保护的氨基酸在缩合试剂作用下与之发生缩合反应，如此反复直至目标肽链连接完成。最后将该肽链切割下来，纯化得到所需多肽。
Paradis-Bas M,et al,Eur.J.Org.Chem.,2003,26,5871-5878，在方案1中公开了一种RADA16的制备方法，其中三次将片段F1 Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-OH偶联到结合树脂的片段H-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH-Rink ChemMatrix Resin上，该方法称为“固相片段缩合”，所得粗品的纯度为41％。
在方案2中，公开了另一种RADA16的制备方法，首先通过固相合成法制备两个八聚体片段F2 Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-OH和片段F3H-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(tBu)-Ala-NH2，接着在溶液中将F2和F3进行片段缩合，最后整体脱保护得到RADA16，所得粗品的纯度为58％，但同时也观察到了一定量的Ala消旋现象。
WO2017018835A1报道了与上述方案2相似的制备方法，将固相合成法与液相合成法相结合，所得RADA16粗品的纯度为74.3％。
WO2017092689A1公开了一种通过液相多肽合成法制得RADA16的方法，所得粗品的纯度最高可达到58％，但步骤较多，比较繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简单、产品纯度高的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法。
本发明的第一方面，提供了一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，包括如下步骤：
(1)固相合成法制备全保护肽片段A，所述全保护肽片段A具有RADA16序列中从位置1到位置K的氨基酸单元的序列；其中，位置1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(2)固相合成法制备全保护肽树脂B，所述全保护肽树脂B具有RADA16序列中从位置K+1到位置16的氨基酸单元的序列；其中，位置K+1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下，采用固相合成法将全保护肽片段A与全保护肽树脂B偶联得到全保护16肽树脂；
(4)使用乙酰化试剂在全保护16肽树脂的N-末端形成乙酰基基团；
(5)使用裂解液脱去侧链保护基和固相载体树脂得到RADA16粗肽；
(6)将RADA16粗肽纯化；
其中，RADA16序列为16个氨基酸单元长度，RADA16序列从N-末端到C-末端的顺序为：Ac-Arg1-Ala2-Asp3-Ala4-Arg5-Ala6-Asp7-Ala8-Arg9-Ala10-Asp11-Ala12-Arg13-Ala14-Asp15-Ala16-NH2；
其中，所述K是大于1，小于15的整数。
在一些实施方案中，步骤(1)包括如下步骤：
(1a)在缩合剂作用下，将全保护肽片段A肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到NH2-AA-树脂；按照全保护肽片段A肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-AA-树脂上，得到全保护肽树脂A1；
(1b)使用裂解液裂解全保护肽树脂A1得到全保护肽片段A。
在一些实施方案中，步骤(2)包括如下步骤：
在缩合剂作用下，将全保护肽树脂B肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Ala-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ala-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到NH2-Ala-树脂；按照全保护肽树脂B肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-Ala-树脂，得到全保护肽树脂B。
在一些实施方案中，所述K选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14中的任意一个数值；优选地，所述K选自5、6和8中的任意一个数值；更优选地，所述K为6。
在一些实施方案中，所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相载体为2-CTC树脂或Rink Amide MBHA Resin树脂；优选地，所述2-CTC树脂取代度为0.8～1.2mmol/g，所述Rink Amide MBHA Resin树脂取代度为0.4～0.7mmol/g；更优选地，所述2-CTC树脂取代度为1.0mmol/g，所述Rink Amide MBHA Resin树脂取代度为0.5mmol/g。
在一些实施方案中，所述脱除Fmoc保护基的试剂为10％～20％的哌啶/DMF溶液；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂为15％的哌啶/DMF溶液。
在一些实施方案中，所述缩合剂选自DIEA、DIC、HOAT、HOBT、PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU、HCTU中的一种或多种。例如，所述缩合剂选自DIEA、HOAT/DIC、HOBT/DIC、PyAOP/DIEA、PyBOP/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/DIEA、HCTU/DIEA、HOAT/DIC/DIEA、HOBT/DIC/DIEA中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为DIEA或HOBT/DIC。
在一些实施方案中，所述缩合剂为DIEA，待偶联的氨基酸与缩合剂DIEA的摩尔比为1:2～1:6，优选摩尔比为1:3。
在一些实施方案中，所述缩合剂为HOBT/DIC，其中，HOBT和DIC按摩尔比1:1组合，待偶联的氨基酸或与缩合剂HOBT/DIC的摩尔比为1:1～1:3，优选摩尔比为1:1.1。
在一些实施方案中，步骤(3)中所用缩合剂为HOBT/DIC，全保护肽片段A与全保护肽树脂B的摩尔比为5:1～1:1，优选地为3:1；全保护肽片段A与缩合剂的摩尔比为1:1～1:3，优选地为1:1.1。
在一些实施方案中，上述缩合反应所用溶剂选自DCM、DMF、DMSO中的一种或多种，优选DMF。
在一些实施方案中，所述裂解液是由TFEA和DCM组成的混合溶液；优选地，所述裂解液是由体积比为10～30:70～90的TFEA和DCM组成的混合溶液；更优选地，所述裂解液是由体积比为20:80的TFEA和DCM组成的混合溶液。
在一些实施方案中，所述裂解液是由TFA、Tis、EDT、苯酚和水中2种或2种以上组成的混合溶液，包括但不限于以下裂解配方：TFA/Tis/EDT/苯酚/水、TFA/EDT/苯酚/水、TFA/Tis/苯酚/水、TFA/Tis/EDT/苯酚、TFA/Tis/EDT/水、TFA/Tis/水、TFA/EDT/苯酚、TFA/Tis/EDT、TFA/EDT/苯酚、TFA/EDT/水、TFA/苯酚/水、TFA/水等。
优选地，所述裂解液是由体积比为80～98:1～10:1～10的TFA、Tis和水组成的混合溶液；更优选地，所述裂解液是由体积比为95:2.5:2.5的TFA、Tis和水组成的混合溶液。
在一些实施方案中，所述乙酰化试剂为乙酸酐和吡啶；其中，乙酸酐和哌啶的摩尔比为3:1.1。
本发明的第二方面，提供了一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，包括如下步骤：
(1)固相合成法制备全保护肽片段C，所述全保护肽片段C具有RADA16序列中从位置1到位置K的氨基酸单元的序列；其中，位置1的氨基酸单元N端为乙酰基基团；
(2)固相合成法制备全保护肽树脂D，所述全保护肽树脂D具有RADA16序列中从位置K+1到位置16的氨基酸单元的序列；其中，位置K+1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下，采用固相合成法将全保护肽片段C与全保护肽树脂D偶联得到全保护16肽树脂；
(4)用裂解液脱去侧链保护基和固相载体树脂得到RADA16粗肽；
(5)将RADA16粗肽纯化；
其中，RADA16序列为16个氨基酸单元长度，RADA16序列从N-末端到C-末端的顺序为：Ac-Arg1-Ala2-Asp3-Ala4-Arg5-Ala6-Asp7-Ala8-Arg9-Ala10-Asp11-Ala12-Arg13-Ala14-Asp15-Ala16-NH2；
其中，所述K是大于1，小于15的整数。
在一些实施方案中步骤(1)包括如下步骤：
(1a)在缩合剂作用下，将全保护肽片段C肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到NH2-AA-树脂；按照全保护肽片段C肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-AA-树脂上，得到N端为Fmoc保护基的全保护肽树脂C1；
(1b)使用乙酰化试剂在全保护肽树脂C1的N-末端形成乙酰基基团得到全保护肽树脂C2；
(1c)使用裂解液裂解全保护肽树脂C2得到全保护肽片段C。
在一些实施方案中，步骤(2)包括如下步骤：
在缩合剂作用下，将全保护肽树脂D肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Ala-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ala-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到NH2-Ala-树脂；按照全保护肽树脂D肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到NH2-Ala-树脂，得到全保护肽树脂D。
在一些实施方案中，所述K选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14中的任意一个数值；优选地，所述K选自5、6和8中的任意一个数值；更优选地，所述K为6。
在一些实施方案中，所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相载体为2-CTC树脂或Rink Amide MBHA Resin树脂；优选地，所述2-CTC树脂取代度为0.8～1.2mmol/g，所述Rink Amide MBHA Resin树脂取代度为0.4～0.7mmol/g；更优选地，所述2-CTC树脂取代度为1.0mmol/g，所述Rink Amide MBHA Resin树脂取代度为0.5mmol/g。
在一些实施方案中，所述脱除Fmoc保护基的试剂为10％～20％的哌啶/DMF溶液；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂为15％的哌啶/DMF溶液。
在一些实施方案中，所述缩合剂选自DIEA、DIC、HOAT、HOBT、PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU、HCTU中的一种或多种。例如，所述缩合剂选自DIEA、HOAT/DIC、HOBT/DIC、PyAOP/DIEA、PyBOP/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/DIEA、HCTU/DIEA、HOAT/DIC/DIEA、HOBT/DIC/DIEA中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为DIEA或HOBT/DIC。
在一些实施方案中，所述缩合剂为DIEA，待偶联的氨基酸与缩合剂DIEA的摩尔比为1:2～1:6，优选摩尔比为1:3。
在一些实施方案中，所述缩合剂为HOBT/DIC，其中，HOBT和DIC按摩尔比1:1组合，待偶联的氨基酸或与缩合剂HOBT/DIC的摩尔比为1:1～1:3，优选摩尔比为1:1.1。
在一些实施方案中，步骤(3)中所用缩合剂为HOBT/DIC，全保护肽片段C与全保护肽树脂D的摩尔比为5:1～1:1，优选地为3:1；全保护肽片段C与缩合剂的摩尔比为1:1～1:3，优选地为1:1.1。
在一些实施方案中，上述缩合反应所用溶剂选自DCM、DMF、DMSO中的一种或多种，优选DMF。
在一些实施方案中，所述裂解液是由TFEA和DCM组成的混合溶液；优选地，所述裂解液是由体积比为10～30:70～90的TFEA和DCM组成的混合溶液；更优选地，所述裂解液是由体积比为20:80的TFEA和DCM组成的混合溶液。
在一些实施方案中，所述裂解液是由TFA、Tis、EDT、苯酚和水中2种或2种以上组成的混合溶液，包括但不限于以下裂解配方：TFA/Tis/EDT/苯酚/水、TFA/EDT/苯酚/水、TFA/Tis/苯酚/水、TFA/Tis/EDT/苯酚、TFA/Tis/EDT/水、TFA/Tis/水、TFA/EDT/苯酚、TFA/Tis/EDT、TFA/EDT/苯酚、TFA/EDT/水、TFA/苯酚/水、TFA/水等。
优选地，所述裂解液是由体积比为80～98:1～10:1～10的TFA、Tis和水组成的混合溶液；更优选地，所述裂解液是由体积比为95:2.5:2.5的TFA、Tis和水组成的混合溶液。
在一些实施方案中，所述乙酰化试剂为乙酸酐和吡啶；其中，乙酸酐和哌啶的摩尔比为3:1.1。
本发明获得的RADA16粗肽，可以通过HPLC进一步纯化，以获得具有足够纯度的自组装肽RADA16。
有益效果：
(1)本发明通过固相合成法制备肽片段和肽树脂，并将肽片段和肽树脂偶联即可制得自组装肽RADA16。与现有技术相比，本发明制得的RADA16粗品的纯度可达到80％以上，降低了分离纯化难度，操作简便，原料易得。
(2)本发明还避免了现有技术中液相合成法存在的氨基酸消旋现象。
(3)同时，与固相逐步缩合法相比，采用片段缩合避免了合成后期所需氨基酸和缩合剂的用量增加的情况，有效降低了成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，对本发明所做的等同替换或相应改进，仍属于本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
对照例1 RADA16的合成(固相逐步缩合)
对照例1-1 Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取200g Rink Amide MBHA Resin(0.5mmol/g)倒入反应釜，加入2000mLDCM溶胀0.5h，抽滤；加入DMF 1600mL洗涤一次(1min，120r/min)，抽滤；
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)、HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，加入600mL DMF超声溶解后，加入DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-2 Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)、HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，加入600mL DMF超声溶解后，加入DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-3 Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照对照例1-2所述方法逐步合成Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)。
对照例1-4 Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(194.63g，0.3mol，3eq)、HOBT(44.59g，0.33mol，3.3eq)，加入1200mL 50％DMSO/DMF超声溶解后，加入DIC(41.65g，0.33mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应3h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-5 Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(93.4g，0.3mol，3eq)、HOBT(44.59g，0.33mol，3.3eq)，加入1200mL 50％DMSO/DMF超声溶解后，加入DIC(41.65g，0.33mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤各3次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-6 Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(123.44g，0.3mol，3eq)、HOAT(44.92g，0.33mol，3.3eq)，加入1200mL DMF超声溶解后，加入DIC(41.65g，0.33mol，3.3eq)、DIEA(14.22g，0.11mol，1.1eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-7 Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(93.4g，0.3mol，3eq)、HOAT(44.92g，0.33mol，3.3eq)，加入1200mL DMF超声溶解后，加入DIC(41.65g，0.33mol，3.3eq)、DIEA(14.22g，0.11mol，1.1eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-8 Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(194.63g，0.3mol，3eq)、HOBT(44.59g，0.33mol，3.3eq)，加入600mL 50％DMSO/DMF超声溶解后，加入DIC(41.65g，0.33mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，补加DIEA(14.22g，0.11mol，1.1eq)，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤6次(1min，120r/min)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
对照例1-9 Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取1600mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(1200mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(30.63g，0.3mol，3eq)、吡啶(23.7g，0.3mol，3eq)，加入1200mLDMF摇匀后倒入反应釜，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：量取1200mL DMF、DCM交替洗涤各3次(1min，120r/min)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(1600mL/次，10min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
对照例1-10 RADA16粗肽的合成
配置1150mL裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至600mL；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的2.5L甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入1L甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度67.461％。
由此可见，当采用固相逐步缩合法制备自组装肽RADA16时，缩合至11肽后所需要的氨基酸和缩合剂的用量将逐步增加。
实施例1 RADA16的合成(“8+8”片段缩合—含Fmoc保护基的8肽片段与8肽树脂缩合)
实施例1-1 8肽片段的制备
a.Fmoc-Ala-CTC树脂的制备
溶胀：称取100g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(1.0mmol/g)倒入反应釜，加入800mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)、DIEA(77.55g，0.6mol，6eq)，加入600mL DCM超声溶解，将溶解液倒入反应釜，反应2h，抽滤；使用DCM洗涤3次(600mL/次，1min/次)，抽滤；
封头：配置封头液800mL(DCM/甲醇/DIEA＝16：3：1)，倒入反应釜封头0.5h，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤6次(600mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-CTC树脂。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取800mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取800mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(600mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)、HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，加入600mL DMF超声溶解后，加入DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(600mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(800mL/次，5min/次)，抽滤；将Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
d.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH肽片段的制备
配置800mL 20％TFEA/DCM裂解液，将干燥后Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂倒入裂解液，裂解3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至400mL，将旋蒸液缓慢滴加至1.2L甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入600mL甲基叔丁基醚中，打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入30℃真空干燥箱，干燥12h，得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH肽片段，纯度97.78％，无需进一步纯化。
实施例1-2 8肽树脂的制备
a.Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取10g Rink Amide MBHA Resin(0.5mmol/g)倒入反应釜，加入80mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin制备
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide Resin，纯度90.566％，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)。
实施例1-3“8+8”片段缩合：Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照实施例1-2所述方法制得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH(25.03g，0.015mol，3eq)、HOBT(2.23g，0.0165mol，3.3q)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(2.08g，0.0165mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应3h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度66.855％。
实施例1-4 RADA16粗肽的合成
a.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照实施例1-3所述方法制得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(1.53g，0.015mol，3eq)、吡啶(0.435g，5.5mmol，1.1eq)，加入60mL DMF；将活化液倒入反应釜，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
b.RADA16粗肽的合成
配置300mL裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至150mL；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的1.5L甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入0.5L甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度63.276％。
实施例2 RADA16的合成(“8+8”片段缩合—乙酰化的8肽片段与8肽树脂缩合)
实施例2-1 8肽片段的制备
a.Fmoc-Ala-CTC树脂的制备
溶胀：称取100g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(1.0mmol/g)倒入反应釜，加入800mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)、DIEA(77.55g，0.6mol，6eq)，加入600mL DCM超声溶解，将溶解液倒入反应釜，反应2h，抽滤；使用DCM洗涤3次(600mL/次，1min/次)，抽滤；
封头：配置封头液800mL(DCM/甲醇/DIEA＝16：3：1)，倒入反应釜封头0.5h，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤6次(600mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-CTC树脂。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取800mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取800mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(600mL/次，1min/次)。
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)、HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，加入600mL DMF超声溶解后，加入DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(600mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(82.29g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(62.27g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(129.75g，0.2mol，2eq)，HOBT(29.73g，0.22mol，2.2eq)，DIC(27.77g，0.22mol，2.2eq)。
d.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取800mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取800mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(600mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(30.63g，0.3mol，3eq)、吡啶(8.7g，0.11mol，1.1eq)，加入600mLDMF；将活化液倒入反应釜，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(600mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(800mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
e.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH肽片段的制备
配置800mL 20％TFEA/DCM裂解液，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-CTC树脂倒入裂解液，裂解3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至400mL，将旋蒸液缓慢滴加至1.2L甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入600mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入30℃真空干燥箱，干燥12h，得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH肽片段，纯度95.582％，无需进一步纯化。
实施例2-2 8肽树脂的制备
a.Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取10g Rink Amide MBHA Resin(0.5mmol/g)倒入反应釜，加入80mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin制备
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
e.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide Resin，纯度90.566％，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)。
实施例2-3“8+8”片段缩合：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink AmideMBHA Resin的制备
按照实施例2-2所述方法制得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应釜脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-OH(22.32g，0.015mol，3eq)、HOBT(2.23g，0.0165mol，3.3eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(2.08g，0.0165mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应釜，反应3h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度66.855％。
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
实施例2-4 RADA16粗肽的合成
配置0.3L裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至150mL；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的1.5L甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入0.5L甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度23.7％。
实施例3 RADA16的合成(“11+5”片段缩合—含Fmoc的5肽片段与11肽树脂缩合)
实施例3-1 5肽片段的制备
a.Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备
溶胀：称取15g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(1.0mmol/g)倒入反应瓶，加入150mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(19.46g，0.03mol，2eq)、DIEA(11.63g，0.09mol，6eq)，加入90mL DCM超声溶解，将溶解液倒入反应瓶，反应2h，抽滤；使用DCM洗涤3次(90mL/次，1min/次)，抽滤；
封头：配置封头液120mL(DCM/甲醇/DIEA＝16：3：1)，倒入反应瓶封头0.5h，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤6次(90mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂。
b.Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取120mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取120mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(90mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(9.34g，0.03mol，2eq)、HOBT(4.5g，0.033mol，2.2eq)，加入90mL DMF超声溶解后，加入DIC(4.17g，0.033mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(90mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂，各步所需试剂如下：
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(12.34g，0.03mol，2eq)，HOBT(4.5g，0.033mol，2.2eq)，DIC(4.17g，0.033mol，2.2eq；
Fmoc-Ala-OH(9.34g，0.03mol，2eq)，HOBT(4.5g，0.033mol，2.2eq)，DIC(4.17g，0.033mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(19.46g，0.03mol，2eq)，HOBT(4.5g，0.033mol，2.2eq)，DIC(4.17g，0.033mol，2.2eq)；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(120mL/次，5min/次)，抽滤；将Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
d.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-OH肽片段的制备
配置150mL 20％TFEA/DCM裂解液，将干燥后Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-CTC树脂倒入裂解液，裂解3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半，将旋蒸液缓慢滴加至225mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入100mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-OH肽片段，纯度88.445％，无需进一步纯化。
实施例3-2 11肽树脂的制备
a.Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取10g Rink Amide MBHA Resin(0.5mmol/g)倒入反应瓶，加入80mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)、HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
c.Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度89.153％，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.49g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(4.12g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(3.11g，0.01mol，2eq)，HOBT(1.49g，0.011mol，2.2eq)，DIC(1.39g，0.011mol，2.2eq)。
实施例3-3“11+5”片段缩合：Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照实施例3-2所述方法制得Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-OH(20.55g，0.015mol，3eq)、HOBT(2.23g，0.0165mol，3.3eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(2.08g，0.0165mol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应4～8h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度44.381％。
实施例3-4 RADA16粗肽的合成
a.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照实施例3-3所述方法制得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(1.53g，0.015mol，3eq)、DIEA(0.71g，5.5mmol，1.1eq)，加入6mLDMF；将活化液倒入反应瓶，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
b.RADA16粗肽的合成
配置280mL裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半体积；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的450mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入300mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度42.94％。
实施例4 RADA16的合成(“10+6”片段缩合—含Fmoc的6肽片段与10肽树脂的缩合)
实施例4-1 6肽片段的制备
a.Fmoc-Ala-CTC树脂的制备
溶胀：称取10g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(1.0mmol/g)倒入反应瓶，加入100mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(6.23g，0.02mol，2eq)、DIEA(7.76g，0.06mol，6eq)，加入60mL DCM超声溶解，将溶解液倒入反应瓶，反应2h，抽滤；使用DCM洗涤3次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
封头：配置封头液80mL(DCM/甲醇/DIEA＝16：3：1)，倒入反应瓶封头0.5h，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-CTC树脂。
b.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取80mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取80mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(60mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(12.98g，0.02mol，2eq)、HOBT(2.97g，0.022mol，2.2eq)，加入60mL DMF超声溶解后，加入DIC(2.78g，0.022mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(6.23g，0.02mol，2eq)，HOBT(2.97g，0.022mol，2.2eq)，DIC(2.78g，0.022mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(8.23g，0.02mol，2eq)，HOBT(2.97g，0.022mol，2.2eq)，DIC(2.78g，0.022mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(6.23g，0.02mol，2eq)，HOBT(2.97g，0.022mol，2.2eq)，DIC(2.78g，0.022mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(12.98g，0.02mol，2eq)，HOBT(2.97g，0.022mol，2.2eq)，DIC(2.78g，0.022mol，2.2eq)；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次，5min/次)，抽滤；将Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
d.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH肽片段的制备
配置180mL 20％TFEA/DCM裂解液，将干燥后Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂倒入裂解液，裂解3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半，将旋蒸液缓慢滴加至270mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入130mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH肽片段，纯度98.682％，无需进一步纯化。
实施例4-2 10肽树脂的制备
a.Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取1g Rink Amide MBHA Resin(0.54mmol/g)倒入反应瓶，加入8mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)、HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)、HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
c.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度89.153％，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.7g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.7g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
实施例4-3“10+6”片段缩合：Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照实施例4-2所述方法制得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH(2.33g，1.62mmol，3eq)、HOBT(0.24g，1.782mmol，3.3eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.23g，1.782mmol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1～3h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度84.816％。
实施例4-4 RADA16粗肽的合成
a.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照实施例4-3所述方法制得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(0.17g，1.62mmol，3eq)、DIEA(0.08g，0.594mmol，1.1eq)，加入6mL DMF；将活化液倒入反应瓶，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次、5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
b.RADA16粗肽的合成
配置28mL裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半体积；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的45mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入30mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度81.755％。
实施例5RADA16的合成(“10+6”片段缩合—乙酰化的的6肽片段与10肽树脂缩合)
实施例5-1 6肽片段的制备
a.Fmoc-Ala-CTC树脂的制备
溶胀：称取25g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(1.0mmol/g)倒入反应瓶，加入250mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(15.57g，0.05mol，2eq)、DIEA(19.39g，0.15mol，6eq)，加入150mL DCM超声溶解，将溶解液倒入反应瓶，反应2h，抽滤；使用DCM洗涤3次(150mL/次，1min/次)，抽滤；
封头：配置封头液200mL(DCM/甲醇/DIEA＝16：3：1)，倒入反应瓶封头0.5h，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤6次(60mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-CTC树脂。
b.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取200mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取200mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(150mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(32.44g，0.05mol，2eq)、HOBT(7.43g，0.055mol，2.2eq)，加入150mL DMF超声溶解后，加入DIC(6.94g，0.055mol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(150mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂。
c.Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(15.57g，0.05mol，2eq)，HOBT(7.43g，0.055mol，2.2eq)，DIC(6.94g，0.055mol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(20.57g，0.05mol，2eq)，HOBT(7.43g，0.055mol，2.2eq)，DIC(6.94g，0.055mol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(15.57g，0.05mol，2eq)，HOBT(7.43g，0.055mol，2.2eq)，DIC(6.94g，0.055mol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(32.44g，0.05mol，2eq)，HOBT(7.43g，0.055mol，2.2eq)，DIC(6.94g，0.055mol，2.2eq)。
d.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂的制备
脱帽、洗涤：量取200mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取200mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(150mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取乙酸酐(7.66g，0.075mol，3eq)、DIEA(3.6g，0.028mol，1.1eq)，加入150mL DMF；将活化液倒入反应瓶，反应0.5h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(150mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂。
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(200mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
e.Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH肽片段的制备
配置360mL 20％TFEA/DCM裂解液，将干燥后Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-CTC树脂倒入裂解液，裂解3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半，将旋蒸液缓慢滴加至540mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入270mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH肽片段，纯度96.903％，无需进一步纯化。
实施例5-2 10肽树脂的制备
a.Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
溶胀：称取1g Rink Amide MBHA Resin(0.54mmol/g)倒入反应瓶，加入8mL DCM溶胀0.5h，抽滤；
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)、HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
b.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)、HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin。
c.Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin的制备
按照步骤b所述方法逐步合成Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin，纯度89.896％，各步所需试剂如下：
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.7g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.7g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
Fmoc-Ala-OH(0.34g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.45g，1.08mmol，2eq)，HOBT(0.16g，1.188mmol，2.2eq)，DIC(0.15g，1.188mmol，2.2eq)。
实施例5-3“10+6”片段缩合：Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA Resin的制备
按照实施例5-2所述方法制得Ac-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin后；
脱帽、洗涤：量取8mL 15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽5min，抽滤；再次量取8mL15％哌啶/DMF倒入反应瓶脱帽15min，抽滤；使用DCM、DMF交替洗涤8次(6mL/次，1min/次)，抽滤；
缩合：称取Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-OH(2.02g，1.62mmol，3eq)、HOBT(0.24g，1.782mmol，3.3eq)，加入6mL DMF超声溶解后，加入DIC(0.23g，1.782mmol，3.3eq)活化0.5h；将活化液倒入反应瓶，反应1～3h，抽滤；
缩合后洗涤：使用DCM、DMF交替洗涤6次(6mL/次，1min/次)，抽滤；得Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin；
收缩、干燥：使用甲醇洗涤3次(80mL/次，5min/次)，抽滤；将Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin放入35℃真空干燥箱，干燥12h。
实施例5-4 RADA16粗肽的合成
配置12mL裂解液(TFA/Tis/水＝95％/2.5％/2.5％)，将干燥后Ac-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Rink Amide MBHA Resin倒入裂解液，裂解1～3h；抽滤，收集滤液。将滤液35℃下旋转蒸发至一半体积；将旋蒸液缓慢滴加至0±5℃温度下的30mL甲基叔丁基醚中，打浆0.5h后抽滤，收集滤饼；将滤饼倒入15mL甲基叔丁基醚中打浆洗涤15min后抽滤，收集滤饼，重复打浆洗涤2次；将滤饼放入35℃真空干燥箱，干燥12h，得RADA16粗肽，纯度62.611％。
综上所述，实施例1-5筛选了5种不同的片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，结果显示：当采用含Fmoc的6肽片段与10肽树脂的缩合制备RADA16时，所制得的RADA16粗品纯度可以达到81.755％。
实施例6 RADA16粗肽的纯化
对实施例1-5制得的RADA16粗肽进行纯化，具体步骤如下：
流动相A配制：30.0g/L氯化铵+0.3％盐酸水溶液，梯度运行至40.01min换成0.15％盐酸水溶液。
纯化水配制：纯化水不低于50L，不高于储罐的液位100L。
流动相B配制：四氢呋喃，抽滤至储罐
流动相控温：冰机控制温度在10±8℃。
设备：DAC-300制备液相系统(配套的制备柱填料：粒径10μm，C18，100A，Daisogel，12.0±0.5kg装料量；保护柱：粒径50μm，C18，120A，Daisogel，1.2±0.3kg装料量)。
换盐富集色谱条件：波长214mm，梯度运行流速1.8L/min。
制备柱冲洗：用甲醇:纯化水＝90:10冲洗15±5min。
制备色谱柱平衡：用纯化水:四氢呋喃＝96:4平衡制备色谱柱，平衡过程中设定流速为1.8L/min，平衡8.5±1.5min，放置备用。
样品预处理：取500g粗品在搅拌中加入4L磷酸中，超声溶解。溶清后，中速滤纸过滤。
进样：将粗品溶液加入4倍体积的纯化水，搅拌均匀，进样。进样完毕，用2.5±1.0L纯化水对半兑换盐用A相置换进样管路。
梯度洗脱：设置检测波长为214nm，1.8L/min梯度流速。按照下表参数设置洗脱程序：
梯度运行至40.01min时，流动相A换成0.15％盐酸水溶液。梯度运行后，目标组份会在60.00-90.00min出现，分段收集，每个组份收集时间2.0±1.5min。所收集转盐富集液进行2～8℃保存。
转盐富集液检测：取样1.0～2.0mL，进样1微升，进行有关物质检测。等待检测的结果期间，转盐富集液的浓缩过程可以正常开展。
浓缩：将合格收集液在35℃水浴下进行浓缩，收集液浓缩至80％±5％体积后进行冻干。
Claims (10)
1.一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)固相合成法制备全保护肽片段A，所述全保护肽片段A具有RADA16序列中从位置1到位置K的氨基酸单元的序列；其中，位置1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(2)固相合成法制备全保护肽树脂B，所述全保护肽树脂B具有RADA16序列中从位置K+1到位置16的氨基酸单元的序列；其中，位置K+1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下，采用固相合成法将全保护肽片段A与全保护肽树脂B偶联得到全保护16肽树脂；
(4)使用乙酰化试剂在全保护16肽树脂的N-末端形成乙酰基基团；
(5)使用裂解液脱去侧链保护基和固相载体树脂得到RADA16粗肽；
(6)将RADA16粗肽纯化；
其中，RADA16序列为16个氨基酸单元长度，RADA16序列从N-末端到C-末端的顺序为：Ac-Arg1-Ala2-Asp3-Ala4-Arg5-Ala6-Asp7-Ala8-Arg9-Ala10-Asp11-Ala12-Arg13-Ala14-Asp15-Ala16-NH2；
其中，所述K是大于1，小于15的整数。
2.如权利要求1所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，
所述步骤(1)包括如下步骤：
(1a)在缩合剂作用下，将全保护肽片段A肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到NH2-AA-树脂；按照全保护肽片段A肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-AA-树脂上，得到全保护肽树脂A1；
(1b)使用裂解液裂解全保护肽树脂A1得到全保护肽片段A；
所述步骤(2)包括如下步骤：
在缩合剂作用下，将全保护肽树脂B肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Ala-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ala-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到NH2-Ala-树脂；按照全保护肽树脂B肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-Ala-树脂，得到全保护肽树脂B。
3.一种固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)固相合成法制备全保护肽片段C，所述全保护肽片段C具有RADA16序列中从位置1到位置K的氨基酸单元的序列；其中，位置1的氨基酸单元N端为乙酰基基团；
(2)固相合成法制备全保护肽树脂D，所述全保护肽树脂D具有RADA16序列中从位置K+1到位置16的氨基酸单元的序列；其中，位置K+1的氨基酸单元N端为Fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下，采用固相合成法将全保护肽片段C与全保护肽树脂D偶联得到全保护16肽树脂；
(4)用裂解液脱去侧链保护基和固相载体树脂得到RADA16粗肽；
(5)将RADA16粗肽纯化；
其中，RADA16序列为16个氨基酸单元长度，RADA16序列从N-末端到C-末端的顺序为：Ac-Arg1-Ala2-Asp3-Ala4-Arg5-Ala6-Asp7-Ala8-Arg9-Ala10-Asp11-Ala12-Arg13-Ala14-Asp15-Ala16-NH2；
其中，所述K是大于1，小于15的整数。
4.如权利要求3所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，
所述步骤(1)包括如下步骤：
(1a)在缩合剂作用下，将全保护肽片段C肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-AA-OH与树脂偶联得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到NH2-AA-树脂；按照全保护肽片段C肽序列从C-末端到N-末端依次将侧链保护的氨基酸的C端偶联到NH2-AA-树脂上，得到N端为Fmoc保护基的全保护肽树脂C1；
(1b)使用乙酰化试剂在全保护肽树脂C1的N-末端形成乙酰基基团得到全保护肽树脂C2；
(1c)使用裂解液裂解全保护肽树脂C2得到全保护肽片段C；
所述步骤(2)包括如下步骤：
在缩合剂作用下，将全保护肽树脂D肽序列C-末端的第一个氨基酸原料Fmoc-Ala-OH与树脂偶联得到Fmoc-Ala-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到NH2-Ala-树脂；按照全保护肽树脂D肽序列从C-末端到N-末端依次将保护氨基酸的C端偶联到NH2-Ala-树脂，得到全保护肽树脂D。
5.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述K选自5、6和8中的任意一个数值；优选地，所述K为6。
6.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于：所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相载体为2-CTC树脂或Rink Amide MBHAResin树脂；优选地，所述2-CTC树脂取代度为0.8～1.2mmol/g，所述Rink Amide MBHAResin树脂取代度为0.4～0.7mmol/g；更优选地，所述2-CTC树脂取代度为1.0mmol/g，所述Rink Amide MBHA Resin树脂取代度为0.5mmol/g。
7.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述缩合剂选自DIEA、DIC、HOAT、HOBT、PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU、HCTU中的一种或多种；优选地，所述缩合剂选自DIEA、HOAT/DIC、HOBT/DIC、PyAOP/DIEA、PyBOP/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/DIEA、HCTU/DIEA、HOAT/DIC/DIEA、HOBT/DIC/DIEA中的一种或多种；更优选地，所述缩合剂为DIEA，待偶联的氨基酸与缩合剂DIEA的摩尔比为1:3；或者所述缩合剂为HOBT/DIC，其中，HOBT和DIC按摩尔比1:1组合，待偶联的氨基酸或与缩合剂HOBT/DIC的摩尔比为1:1.1。
8.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述裂解液是由TFEA和DCM组成的混合溶液；或者所述裂解液是由TFA、Tis、EDT、苯酚和水中2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述裂解液是由体积比为10～30:70～90的TFEA和DCM组成的混合溶液；或者所述裂解液是由体积比为80～98:1～10:1～10的TFA、Tis和水组成的混合溶液；更优选地，所述裂解液是由体积比为20:80的TFEA和DCM组成的混合溶液；或者所述裂解液是由体积比为95:2.5:2.5的TFA、Tis和水组成的混合溶液。
9.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，所述乙酰化试剂为乙酸酐和吡啶；优选地，所述乙酸酐和吡啶的摩尔比为3:1.1。
10.如权利要求1至4任意一项所述的固相片段缩合制备自组装肽RADA16的方法，其特征在于，将全保护肽片段与全保护肽树脂偶联时，所述全保护肽片段与全保护肽树脂摩尔比为5:1～1:1，优选地为3:1；所述全保护肽片段与缩合剂的摩尔比为1:1～1:3，优选地为1:1.1。
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| WO2023222057A1 (zh) | 2023-11-23 |
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |