CN1199986C

CN1199986C - 三价铁卟啉及衍生物－短肽化合物及其合成方法

Info

Publication number: CN1199986C
Application number: CN 02144902
Authority: CN
Inventors: 李惟; 刘亚丽; 郭莉莉
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2022-12-11
Also published as: CN1424322A

Abstract

本发明的三价铁卟啉及衍生物-短肽化合物及其合成方法属生物技术领域。化合物组成包括血红素或亚血红素、短肽；血红素或亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连；肽链中含有组氨酸残基，肽链长为1-15个氨基酸。制备方法是：以血红素或亚血红素、氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺为溶剂，工艺过程包括溶胀-脱保护-偶联-脱保护偶联循环-血红素或亚血红素偶联-切割。三价铁卟啉及衍生物-短肽化合物在体外测活体系、亚细胞水平、及组织器官水平均具有较好的抗氧化活性，同时又是一类具有过氧化物酶活性的新化合物。产品的纯度较高，毒性小；对过氧化氢的稳定性好；更容易被机体吸收，具有很高的生物利用度。

Description

三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物及其合成方法

技术领域

本发明属生物技术领域，特别涉及一种过氧化物模拟酶，以及这种过氧化物模拟酶的合成方法。

背景技术

白内障已经成为当今世界上主要的致盲性眼病之一，其患病人口每年仍呈上升趋势。由于氧化损伤机理被越来越多的证明，各种外源性抗氧化剂及抗氧化的中药制剂已被用于白内障的治疗。

过氧化物酶(POD)广泛存在于动物、植物及需氧微生物中，它主要能够催化下类反应：，因此在机体活性氧的代谢中起着重要作用。根据催化基团的不同将过氧化物酶分为两类：一类以硒代半胱氨酸为催化基团，如谷胱甘肽过氧化物酶；另一类以铁卟啉为催化基团，如抗坏血酸过氧化物酶、微过氧化物酶等。

与本发明相近的背景技术是以铁卟啉为辅基的微过氧化物酶，包括由细胞色素C(Cyt C)水解而来的八肽(MP-8)、九肽(MP-9)、十一肽(MP-11)。它们均含有共价结合的血红素，并在肽段中含有一个组氨酸残基，人们发现它们是一类很好的过氧化物酶模拟物。它们具有较好的抗氧化活性，而且已经在体外白内障诱导模型中得到了验证。

以MP-9为例说明微过氧化物酶的结构，其组成包括血红素、短肽；结构如A所示，血红素与短肽间的连接方式是血红素上的两个乙烯基与肽链上的两个半胱氨酸的巯基以硫醚键相连；肽链组分中含有组氨酸残基，具体组成是半胱氨酸—丙氨酸—谷氨酰胺—半胱氨酸—组氨酸—苏氨酸—缬氨酸—谷氨酸—赖氨酸，即肽链由九个氨基酸残基组成。

人们将它们作为过氧化物酶的模拟物，作了大量的研究，其制备方法也以MP-9为例简述如下：以细胞色素C(Cyt C)为原料，通过酶解及纯化得到；具体工艺过程包括：制备活化的Sepharose 4B—制备粗品MP-9—Sephadex G-50柱层析—Biogel P2柱层析，得到纯化的MP-9。

已有的MP-8、MP-9和MP-11是由广泛存在于生体内的Cyt C在体外经酶解得到的含有血红素辅基的小肽片段。由于Cyt C在生物体内在各种酶的参与下共同完成它的生物合成，因此MP-8、MP-9和MP-11上的血红素分子与小肽之间的特定共价连接方式在体外很难用化学方法合成。由于微过氧化物酶人工合成困难，提纯过程步骤繁多，费时费力，纯度不高且成分复杂，在体内易降解，因此限制了它们的应用。

发明内容

由于MP-8、MP-9及MP-11均由Cyt C的体外酶解及进一步纯化而得到，使三者的制备和纯化过程步骤繁多，费时费力；得到的产品纯度不高，且成分复杂，限制了药用价值；不易做结构改造，限制了结构的多样性，也就限制了它们的更广泛应用。本发明要解决微过氧化物酶存在的不足，对背景技术的微过氧化物酶结构作了相应的改造，通过固相肽合成法，人工合成出高纯度的具有过氧化物酶活性的新化合物—三价铁卟啉及衍生物—短肽，为将来进一步将其开发成药物打下基础。

本发明所说的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物包括血红素—短肽、亚血红素—短肽。其组成包括血红素或亚血红素、短肽；血红素或亚血红素与短肽间的连接方式是血红素或亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连；肽链中含有组氨酸残基，其余氨基酸残基可以是20种氨基酸中的任何一种，肽链长为1～15个氨基酸。

上述结构中肽链中含有的活性基团为亚血红素或血红素和组氨酸。

上述结构可以是单体，即血红素或亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接，两种单体形式为同分异构体，结构如B.C所示；也可以是双体，双体形式为血红素或亚血红素上的两个羧基均与肽链连接，结构如D所示。肽链中除组氨酸外，其他氨基酸均可换成20种氨基酸中的一种，各种氨基酸为L-型、D-型或β-结构均可。

本发明的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物的制备方法是：以血红素或亚血红素、氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，工艺过程包括溶胀—脱保护—偶联—脱保护偶联循环—血红素或亚血红素偶联—切割。所说的溶胀是将接肽树脂和DMF加入柱反应器中，室温振摇，接肽树脂溶胀后抽干，用DMF洗涤后再抽干；所说的脱保护是脱去接肽树脂上的芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，方法是在溶胀后的接肽树脂中加入脱Fmoc保护基溶液，室温振摇，抽干后用DMF洗涤再抽干；所说的偶联是向柱反应器中加入一种氨基酸衍生物和缩合剂，再加入DMF，避光室温振摇，反应0.3-20小时，抽干后用DMF振摇洗涤再抽干；所说的脱保护偶联循环是交替重复脱保护和偶联过程，偶联重复次数由短肽的链长决定，每次偶联所加入的氨基酸衍生物原料由短肽的组成决定，脱保护的重复次数比偶联重复次数多一次；所说的血红素或亚血红素偶联是加入与氨基酸衍生物等摩尔数的血红素或亚血红素和缩合剂，避光室温振摇，反应0.3-20小时，抽干后用DMF振摇洗涤再抽干；所说的切割是脱氨基酸侧链保护基及从接肽树脂上裂解肽，即向抽干后的柱反应器中加入切割试剂，在(25--20)℃振荡(1-5)小时，过滤除去接肽树脂，滤液抽真空浓缩，浓缩液加入乙醚/石油醚振荡，置于(0--20)℃放置0.2-2小时，离心，倒去上清，沉淀真空干燥，得产品。

上述工艺过程中，接肽树脂可以使用Fmoc-NH-SAL树脂、PAL树脂、Wang树脂、Fmoc-酰胺树脂。氨基酸衍生物可以是Fmoc-lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH等。接肽树脂与氨基酸衍生物的摩尔比为1∶(2-5)。氨基酸偶联及血红素或亚血红素偶联使用的缩合剂可以是苯并三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)，按摩尔比2∶(1-3)∶(2-6)混合制成；氨基酸衍生物与缩合剂按摩尔比为1∶(1-1.2)。切割试剂主要成分是三氟乙酸。脱Fmoc保护基溶液可以是(15-25)％的呱啶/DMF溶液；所说的用DMF振摇洗涤再抽干需要反复进行(5-8)次，每次振摇(2-6)分钟。

为了得到纯品，在切割工艺过程之后，还需进行纯化过程。所说的纯化是采用高效液相色谱层析纯化，收集主峰。A泵溶液为0.1％的三氟乙酸水溶液，B泵溶液为0.1％的三氟乙酸、(60-80)％乙腈水溶液，进行梯度洗脱——以总流速(1-5)ml/分钟，在(10-60)分钟内，A泵流速由(100-60)％改变为(50-20)％，B泵流速由(0-40)％改变为(50-80)％，同时采用双波长监测，波长为214nm和385nm。

体外测活实验表明，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物可以在抗坏血酸存在下清除体系中的过氧化氢，具有过氧化物酶的活性；同时三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物在保护心肌线粒体抵抗氧化损伤作用的研究中，进一步在亚细胞水平上验证三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物的抗氧化功能。在更进一步的实验中，建立体外诱导白内障模型体系，从形态学观察，眼晶状体透明度的显微照相结果，早期生化指标检测和眼晶状体可溶性蛋白质组分电泳图谱分析几方面，在组织器官水平上验证了三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物对体外培养眼晶状体的抗白内障保护作用。综合以上实验结果，三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物在体外测活体系、亚细胞水平、及组织器官水平均具有较好的抗氧化活性，同时又是一类具有过氧化物酶活性的新化合物。并且，产品的纯度较高，毒性小；对过氧化氢的稳定性好；更容易被机体吸收，通过各种膜组织进入机体细胞中，具有很高的生物利用度。因此三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物将会成为有效的预防和治疗白内障的新的具有酶学活性的化合物。

本发明的制备方法基于肽合成方法，因此工艺简便易行，节省原材料，省时省力，尤其是多肽自动合成仪的使用，使得肽合成实现了自动化。能够按设计要求合成出任何想要的肽序列，有利于确定结构与功能的关系，优化出最适短肽化合物。得到的产品产率较高、纯度较高，有广泛的药物开发应用前景。

具体实施方式

实施例1、肽链中活性基团组氨酸(His)与亚血红素或血红素最适相对位置的确定

本发明的亚血红素-九肽(DhHP-9)中的亚血红素与肽链的连接方式与MP-9中不同，因此His与亚血红素在一级结构及空间结构上的相对位置也与MP-9中不同，这样就需要确定一下DhHP-9中His与亚血红素(Dh)的最适相对位置。为此用SP-3多肽自动合成仪合成了一系列亚血红素-短肽：Dh-H、Dh-A-H、Dh-A2-H、Dh-A3-H、Dh-A4-H、Dh-A5-H、Dh-A6-H。

体外测活实验表明：亚血红素与His之间隔一个Ala的Dh-A-H酶比活力最高，在数值上接近天然MP-9水平，其后随着Ala数目的增多，酶活力逐渐下降。D-A-H这一结构与MP-9中血红素与His的相对位置比较相似，说明组氨酸与亚血红素之间隔一个氨基酸是最适位置。

对其它亚血红素-短肽、血红素-短肽也是如此，即组氨酸与亚血红素或血红素之间隔一个氨基酸是最适位置。

实施例2、最适短肽的设计

根据测活等实验结果设计了最适短肽：单体亚血红素-六肽(DhHP-6：Deuterohemin-His-Peptide，Dh-AHTVEK)和血红素-六肽。使用多肽自动合成仪按本发明的工艺过程进行合成，“脱保护偶联循环”进行五次。体外测活实验表明，DhHP-6的酶比活力(U/μmol)已经达到了天然MP-9水平。同时DhHP-6分子中将血红素替换成亚血红素，肽链比MP-9少三个氨基酸，所以分子量小于天然MP-9，每μg DhHP-6的比活力高于天然MP-9，是比较理想的过氧化物酶模拟物。

实施例3、单体亚血红素-A(D)-HTVEK和单体血红素-β-AHTVEK的合成

引入(D)-H和β-A，用SP-3多肽自动合成仪合成了单体亚血红素-A(D)-HTVEK和单体血红素-β-AHTVEK，体外测活均有活性。

实施例4、双体形式亚血红素-短肽的合成

由于亚血红素分子中含有两个羧基，选择取代率大的树脂，控制亚血红素和树脂的比例(1∶1-2)，用SP-3多肽自动合成仪合成了双体。体外测活表明有过氧化物酶的活力。

实施例5亚血红素—九肽(DhHP-9：Dueterohemin-AAQAHTVEK)的合成

在MP-8、MP-9及MP-11中，MP-9的活力最高，所以以MP-9为模板分子，设计了DhHP-9，与MP-9相比，我们将MP-9中的半胱氨酸改为Ala以减少Cys的巯基与Fe³⁺配位带来的复杂影响。另外由于血红素上的烯基很容易被过氧化物氧化，限制了自身对过氧化物的稳定性，用亚血红素替代血红素，这样就消除了酶模拟物对过氧化物的不稳定性。

我们选择了Fmoc作为N^α保护基，利用Bop-HOBT活化酯法活化氨基酸衍生物及亚血红素的羧基。短肽合成完成后，亚血红素的羧基同样利用Bop-HOBT活化酯法活化，然后与树脂上暴露的肽的N端反应，合成亚血红素—九肽。

用人工化学合成法合成DhHP-9具体过程为：

(1)溶胀。125mg树脂和3mlDMF加入柱反应器中，室温振摇30min，溶胀后抽干，DMF洗涤5次，每次振摇3min，抽干。

(2)脱保护。加3ml 20％呱啶/DMF溶液，室温振摇30min，脱树脂上的Fmoc保护基，抽干，DMF洗5次，每次振摇3min，抽干。

(3)偶联。向柱反应器中加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、Bop、HOBT、NMM，其摩尔比为2∶2∶2∶3，再加入3mlDMF，避光室温振摇反应过夜，抽干，DMF洗5次，每次振摇3min，抽干。

(4)脱保护偶联循环。脱去N端的Fmoc保护基，方法如(2)，然后进入接下一个氨基酸的循环，至加完最后一个氨基酸为止。

(5)三价铁卟啉及衍生物的偶联。脱去九肽N端的Fmoc保护基，加入与氨基酸衍生物等摩尔数的亚血红素及缩合剂，避光，室温振荡反应过夜，抽干，DMF洗5次，每次振摇3min，抽干。

(6)切割。脱氨基酸侧链保护基及从树脂上切割肽：向抽干后的反应器中加入3ml切割试剂，-20℃反应2小时，过滤除去树脂，滤液抽真空，浓缩液加20ml乙醚/石油醚(1∶2，v∶v)，振荡，-20℃放置0.5小时，离心，小心倒去上清，重复一次，沉淀真空干燥，保存，得褐色产品，产率约为85％。

Claims

1、一种三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物，其组成包括血红素或亚血红素、短肽；肽链中含有组氨酸残基，肽链长为1-15个氨基酸；其特征在于，血红素或亚血红素上的羧基与肽链上的氨基以酰胺键相连。

2、按照权利要求1所述的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物，其特征在于，结构是单体或双体；所说的单体是血红素或亚血红素上的两个羧基之一与肽链连接；所说的双体是血红素或亚血红素上的两个羧基均与肽链连接。

3、按照权利要求1或2所述的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物，其特征在于肽链中的组氨酸与亚血红素或血红素的相对位置是二者之间隔一个氨基酸。

4、按照权利要求1或2所述的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物，其特征在于，所说的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物是亚血红素—六肽或血红素—六肽。

5、按照权利要求3所述的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物，其特征在于，所说的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物是亚血红素—六肽或血红素—六肽。

6、一种权利要求1的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物的制备方法，以血红素或亚血红素、氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺为溶剂；工艺过程包括溶胀、脱保护、偶联、脱保护偶联循环、血红素或亚血红素偶联、切割；其特征是，所说的切割是，向抽干后的柱反应器中加入切割试剂三氟乙酸，在25～-20℃振荡1～5小时，过滤除去接肽树脂，滤液抽真空浓缩，浓缩液加入乙醚/石油醚振荡，置于0～-20℃放置0.2～2小时，离心，倒去上清，沉淀真空干燥，得产品。

7、按照权利要求6所述的的三价铁卟啉及衍生物—短肽化合物的制备方法，其特征是，在切割工艺过程之后，进行纯化处理；所说的纯化是采用高效液相色谱层析纯化，收集主峰；同时采用双波长监测。