CN116970584B - 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116970584B CN116970584B CN202311208299.5A CN202311208299A CN116970584B CN 116970584 B CN116970584 B CN 116970584B CN 202311208299 A CN202311208299 A CN 202311208299A CN 116970584 B CN116970584 B CN 116970584B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- solution
- peroxidase
- mimic
- peroxidase mimic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 81
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 claims abstract description 46
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 claims abstract description 46
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 60
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 claims description 20
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims description 15
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 5
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N (E)-acetamiprid Chemical compound N#C/N=C(\C)N(C)CC1=CC=C(Cl)N=C1 WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N 0.000 claims description 4
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005875 Acetamiprid Substances 0.000 claims description 4
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 claims description 4
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 claims description 4
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 claims description 4
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BHTJEPVNHUUIPV-UHFFFAOYSA-N pentanedial;hydrate Chemical compound O.O=CCCCC=O BHTJEPVNHUUIPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RPQXVSUAYFXFJA-HGRQIUPRSA-N saxitoxin Chemical compound NC(=O)OC[C@@H]1N=C(N)N2CCC(O)(O)[C@@]22N=C(N)N[C@@H]12 RPQXVSUAYFXFJA-HGRQIUPRSA-N 0.000 claims description 4
- RPQXVSUAYFXFJA-UHFFFAOYSA-N saxitoxin hydrate Natural products NC(=O)OCC1N=C(N)N2CCC(O)(O)C22NC(N)=NC12 RPQXVSUAYFXFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 abstract description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- -1 amino modified tetrodotoxin Chemical class 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100037412 Germinal-center associated nuclear protein Human genes 0.000 description 1
- 101710194542 Germinal-center associated nuclear protein Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
- C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用,涉及多肽材料及生物比色传感技术领域。本发明提供了一种多肽过氧化物酶模拟物的制备方法。本发明还提供了多肽过氧化物酶模拟物的应用。本发明采用上述的多肽过氧化物酶模拟物,作为类过氧化物酶,在H2O2条件下,与TMB发生显色反应,将溶液吸光度变化与河豚毒素浓度关联,从而建立比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及多肽材料及生物比色传感技术领域,尤其是涉及一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用。
背景技术
天然酶能够高效率地催化各种生化反应,具有高底物特异性,但同时稳定性差、储存条件苛刻、纯化成本高等问题也限制了它的应用。纳米酶是一类具有独特性能的纳米材料,纳米酶克服了许多天然酶固有的缺陷,受到了广泛关注。纳米酶的组成材料丰富,包括碳材料、金属和金属氧化物纳米材料、金属有机框架(MOF)以及其他生物分子材料都可以用来构建纳米酶,同时纳米酶的用途广泛,可以用于检测多种物质。
多肽材料易于合成,生物相容性好,同时多肽自组装纳米材料可形成更为有序的结构,具备良好的热稳定性、机械稳定性等优点,但他们主要通过非共价相互作用结合,本质上比共价键弱。此外,多肽材料缺乏生物识别单元,因此不能选择性的与物质结合,达到特异性检测目标物的目的。
因此,本发明提供一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用,本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物通过共价作用结合,结构更为稳定,并且可以在表面修饰核酸适配体,以实现特异性检测的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用,以多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2条件下,与TMB发生显色反应,将溶液吸光度变化与河豚毒素浓度关联,从而建立比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
为实现上述目的,本发明提供了一种多肽过氧化物酶模拟物的制备方法,包括以下步骤:
S1、将血红素溶解于二甲亚砜中,得到血红素溶液;
S2、将L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸溶解于六氟异丙醇中,得到多肽溶液;
S3、将多肽溶液与戊二醛水溶液混合,立即向其中加入上述血红素溶液,静置反应,得到多肽过氧化物酶模拟物溶液;
S4、反应结束后,将所得产物体系进行离心洗涤,得到多肽过氧化物酶模拟物。
优选的,所述步骤S1中血红素溶液的浓度为0.5~10mg/mL,步骤S2中多肽溶液的浓度为50~150mg/mL,步骤S3中戊二醛水溶液的浓度为0.1~0.5%。
优选的,所述步骤S3中多肽溶液、戊二醛水溶液和血红素溶液的体积比为(1~10):(50~100):(5~15),静置反应时间为24h。
本发明还提供了上述制备方法制备的多肽过氧化物酶模拟物。
本发明还提供了上述的多肽过氧化物酶模拟物在特异性检测中的应用。
上述的应用,具体步骤如下:
a、将多肽过氧化物酶模拟物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺水溶液混合,之后向其中加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液,活化;
b、然后将步骤a中的溶液与氨基修饰的核酸适配体溶液混合,静置反应,得到核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物;
c、以核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2存在条件下,与显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺发生显色反应,用于检测。
优选的,所述多肽过氧化物酶模拟物中L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、核酸适配体的用量比为(100~500μg):(10~100μmoL):(10~20μmoL):(0.002~0.1μmoL)。
优选的,所述步骤a中活化时间为30min,步骤b中静置反应时间为20h。
优选的,所述步骤b中核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示所示。
优选的,检测的对象包括河豚毒素、石房蛤毒素、冈田酸、黄曲霉毒素B1、啶虫脒。
本发明所述的一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用的优点和积极效果是:
1、本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物结构简单,易于合成,反应条件温和,具有类过氧化物酶活性,且可以在表面修饰核酸适配体,能够实现对河豚毒素的检测。
2、本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物中含有的血红素使得多肽过氧化物酶模拟物具有过氧化物酶活性,多肽中含有的羧基基团使得多肽过氧化物酶模拟物可以与氨基修饰的核酸适配体共价结合,当河豚毒素存在时,伸展的核酸链与河豚毒素结合,使纳米酶表面活性位点减少,酶活性下降,从而实现对河豚毒素的检测。
3、本发明以多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2存在条件下,与显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应,将溶液吸光度差值变化与河豚毒素浓度关联,从而建立起比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
下面通过附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例中的多肽过氧化物酶模拟物(FF/GA-HNPs)制备及应用流程图;
图2为本发明实施例中制备的FF/GA-HNPs的TEM图像;
图3为本发明实施例中制备的FF/GA-HNPs的类过氧化物酶活性测试结果图;
图4为本发明实施例中制备的Apt-FF/GA-HNPs测定不同浓度河豚毒素时的UV-vis光谱;
图5为本发明实施例中制备的Apt-FF/GA-HNPs特异性检测河豚毒素测试结果图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。除非另外定义,本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。除非另外说明,本发明所使用的仪器及试剂均常规市购所得。
进一步的,本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物可以检测河豚毒素、石房蛤毒素、冈田酸、黄曲霉毒素B1、啶虫脒等,通过更换核酸适配体,就可以检测相应物质。待检测物质的核酸适配体序列如表1所示。
表1核酸适配体序列
适配体名称 | 核酸序列(5’-3’)及修饰基团 |
河豚毒素 | NH2-AAAAATTTCACACGGGTGCCTCGGCTGTCC(SEQ ID NO.1) |
石房蛤毒素 | GGTATTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGTAGATGGCTCTAACTCTCCTCT(SEQ ID NO.2) |
冈田酸 | GGTCACCAACAACAGGGAGCGCTACGCGAAGGGTCAATGTGACGTCATGCGGATGTGTGG(SEQ ID NO.3) |
黄曲霉毒素B1 | GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA(SEQ ID NO.4) |
啶虫脒 | CTGACACCATATTATGAAGA(SEQ ID NO.5) |
本发明以检测河豚毒素为例,进行详细的说明。
本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物的制备方法,如图1所示,包括以下步骤:
S1、将血红素溶解于二甲亚砜中,得到血红素溶液,浓度为1mg/mL。
S2、将L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸(FF)溶解于六氟异丙醇中,得到多肽溶液,浓度为100mg/mL。
S3、将多肽溶液与戊二醛水溶液(浓度为0.12%)混合,立即向其中加入血红素溶液,静置反应24h,得到多肽过氧化物酶模拟物溶液。
其中多肽溶液、戊二醛水溶液和血红素溶液的体积比优选为1:100:10。
S4、反应结束后,将所得产物体系进行离心洗涤,得到多肽过氧化物酶模拟物;离心洗涤采用的洗涤液优选为超纯水,离心洗涤的次数优选为2~3次。
多肽过氧化物酶模拟物结构简单,易于合成,反应条件温和,具有类过氧化物酶活性,且可以在表面修饰核酸适配体,借此实现特异性检测检测。
本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物中含有的血红素,使得多肽过氧化物酶模拟物具有过氧化物酶活性,多肽中含有的羧基基团使得多肽过氧化物酶模拟物可以与氨基修饰的核酸适配体共价结合,当河豚毒素存在时,伸展的核酸链与河豚毒素结合,使纳米酶表面活性位点减少,酶活性下降。
多肽过氧化物酶模拟物应用于检测时的步骤如下:
a、得到多肽过氧化物酶模拟物后,将所得多肽过氧化物酶模拟物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)水溶液混合,之后向其中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)水溶液,活化30min。
b、将步骤a中得到的溶液与氨基修饰的河豚毒素核酸适配体溶液混合,静置反应20h,得到核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物。
反应结束后,将所得产物体系进行离心洗涤,得到核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物。离心洗涤采用的洗涤液优选为水,离心洗涤的次数优选为2~3次。
其中多肽过氧化物酶模拟中L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸(FF)、EDC溶液中的EDC、NHS溶液中的NHS与河豚毒素核酸适配体用量比优选为500μg:80μmol:20μmol:0.005μmol。
以多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2存在条件下,与显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应,将溶液吸光度差值变化与河豚毒素浓度关联,从而建立起比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
在本发明中,河豚毒素具体是基于类过氧化物酶活性进行检测,其中,河豚毒素的检测限为1.08ng/L。
下面结合实施例对本发明提供的多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物(Apt-FF/GA-HNPs)的制备。
将4mg FF溶于40μL六氟异丙醇中,与4mL浓度为0.12%的戊二醛水溶液混合,然后立即加入浓度为1mg/mL的血红素溶液,血红素溶液的溶剂为二甲亚砜,静置反应24h后,将所得产物进行离心洗涤三次,得到多肽过氧化物酶模拟物(FF/GA-HNPs),最后加入超纯水制成分散液,使得分散液中FF的浓度为5mg/mL。
将200μL EDC溶液(400mM)、200μL NHS溶液(100mM)加入100μL上述分散液中,活化30min后,加入50μL-河豚毒素适配体溶液(100μM),反应20h后,离心并用超纯水洗涤三次,得到适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物(Apt-FF/GA-HNPs)。
图1为实施例1中适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物(Apt-FF/GA-HNPs)的制备及应用流程图。如图1所示,首先,利用L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸(FF)和戊二醛(GA)共价组装封装血红素,获得了具有优异过氧化物酶活性的多肽纳米酶,之后,利用EDC活化FF中的羧酸基团,随后加入NHS与羧基偶联,形成NHS酯,生成的NHS酯与带氨基的核酸适配体结合,生成稳定的化合键,得到适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物(Apt-FF/GA-HNPs)。
当河豚毒素存在时,核酸适配体与河豚毒素结合,酶表面的活性位点减少,使得酶活性下降,检测体系以TMB作为底物,利用紫外信号的变化,实现了对河豚毒素的定量检测。
图2为实施例1制备的FF/GA-HNPs的TEM图像,由图2可以看出FF/GA-HNPs制备成功,纳米酶呈球形,颗粒尺寸在200nm左右。
实施例2
FF/GA-HNPs的类过氧化物酶活性测试。
FF/GA-HNPs具有类过氧化物酶活性,具体的,类过氧化物酶可以催化H2O2分解产生羟基自由基,氧化TMB,使得溶液变蓝,由图3可知,在652nm处存在明显的吸收峰。
具体步骤为:首先,将20μL浓度为50mM的TMB溶液,10μL浓度为10M的H2O2溶液与1mLHac-NaAc缓冲液(pH=4.5)混合,之后加入20μL的FF/GA-HNPs水分散液,室温下反应30min,利用紫外-可见分光光度计进行测试,FF/GA-HNPs水分散液中FF浓度为25mg/mL。按照上述方法设置对照组以及空白组,其中对照组是将FF/GA-HNPs替换为FF/GANPs(FF/GA-HNPs按照实施例1方法制备得到,不同之处在于将血红素溶液替换为二甲亚砜),并且分别将TMB和H2O2替换为水,空白组是将FF/GA-HNPs替换为水。图3为实施例1制备的FF/GA-HNPs的类过氧化物酶活性测试结果图,由图3可知,FF/GA-HNPs具有过氧化物酶催化活性,并且比其他对照组活性要强。
实施例3
Apt-FF/GA-HNPs检测河豚毒素。
FF/GA-HNPs具有类过氧化物酶活性,在其表面修饰特定的核酸适配体,可以用于特异性检测目标物,所述核酸适配体序列如表1所示。
以Apt-FF/GA-HNPs作为类过氧化物酶,在H2O2存在条件下,与显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应,将溶液吸光度差值变化与河豚毒素浓度关联,从而建立起比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
下面以河豚毒素为例进行具体的说明。
首先将不同浓度的河豚毒素水溶液与1mL Hac-NaAc缓冲液(pH=5.5)混合,之后加入10μL的Apt-FF/GA-HNPs水分散液(Apt-FF/GA-HNPs水分散液中FF的浓度为25mg/mL),孵育30min;孵育结束后,将10μL浓度为50mM的TMB溶液,10μL浓度为10M的H2O2溶液加入上述溶液,静置反应30min后,利用紫外-可见分光光度计测试其吸光度;所述河豚毒素的最终浓度为0、10、15、20、30、40、60、80、100、200、300、400ng/mL。结果如图4所示,由图4可知,溶液的吸光度随着河豚毒素浓度的增加而降低,因此可以利用Apt-FF/GA-HNPs实现对河豚毒素的定量检测,同时经检测可知,河豚毒素的检测限为1.08ng/mL。
实施例4
Apt-FF/GA-HNPs特异性检测河豚毒素。
本发明中的Apt-FF/GA-HNPs可用于特异性检测河豚毒素,具体的,核酸适配体能够对特定靶点表现出高亲和力和高选择性,在FF/GA-HNPs表面修饰河豚毒素的核酸适配体,可用于特异性检测河豚毒素。
下面进行具体说明。
将河豚毒素、谷胱甘肽、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、脯氨酸、赖氨酸分别与1mL Hac-NaAc缓冲液(pH=5.5)混合,上述溶液的最终浓度均为400ng/mL,之后加入10μL的Apt-FF/GA-HNPs水分散液(Apt-FF/GA-HNPs水分散液中FF的浓度为25mg/mL),孵育30min。孵育结束后,将10μL浓度为50mM的TMB溶液,10μL浓度为10M的H2O2溶液加入上述溶液,静置反应30min后,利用紫外-可见分光光度计测试其吸光度。结果如图5所示,由图5可知,溶液的吸光度差值在河豚毒素存在时发生显著的变化,表明Apt-FF/GA-HNPs对河豚毒素的特异性识别能力,可以利用Apt-FF/GA-HNPs实现对河豚毒素的特异性检测。
因此,本发明采用上述的一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用,以多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2条件下,与TMB发生显色反应,将溶液吸光度变化与河豚毒素浓度关联,从而建立比色传感平台,用于检测河豚毒素的浓度。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种多肽过氧化物酶模拟物在检测中的应用,其特征在于,所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的,
多肽过氧化物酶模拟物的制备方法包括以下步骤:
S1、将血红素溶解于二甲亚砜中,得到血红素溶液;
S2、将L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸溶解于六氟异丙醇中,得到多肽溶液;
S3、将多肽溶液与戊二醛水溶液混合,立即向其中加入上述血红素溶液,静置反应,得到多肽过氧化物酶模拟物溶液;
S4、反应结束后,将所得产物体系进行离心洗涤,得到多肽过氧化物酶模拟物;
应用的具体步骤如下:
a、将多肽过氧化物酶模拟物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺水溶液混合,之后向其中加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液,活化;
b、然后将步骤a中的溶液与氨基修饰的核酸适配体溶液混合,静置反应,得到核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物;
c、以核酸适配体修饰的多肽过氧化物酶模拟物作为类过氧化物酶,在H2O2存在条件下,与显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺发生显色反应,用于检测。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述步骤S1中血红素溶液的浓度为0.5~10mg/mL,步骤S2中多肽溶液的浓度为50~150mg/mL,步骤S3中戊二醛水溶液的浓度为0.1~0.5%。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述步骤S3中多肽溶液、戊二醛水溶液和血红素溶液的体积比为(1~10):(50~100):(5~15),静置反应时间为24h。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:应用时多肽过氧化物酶模拟物中L-苯丙氨酸-L苯丙氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、核酸适配体的用量比为(100~500μg):(10~100μmoL):(10~20μmoL):(0.002~0.1μmoL)。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述步骤a中活化时间为30min,步骤b中静置反应时间为20h。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述步骤b中核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:检测的对象包括河豚毒素、石房蛤毒素、冈田酸、黄曲霉毒素B1、啶虫脒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311208299.5A CN116970584B (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311208299.5A CN116970584B (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116970584A CN116970584A (zh) | 2023-10-31 |
CN116970584B true CN116970584B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=88485204
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311208299.5A Active CN116970584B (zh) | 2023-09-19 | 2023-09-19 | 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116970584B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002207026A (ja) * | 2001-01-10 | 2002-07-26 | Shimadzu Corp | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス |
CN1424322A (zh) * | 2002-12-11 | 2003-06-18 | 吉林大学 | 三价铁卟啉及衍生物-短肽化合物及其合成方法 |
CN103163127A (zh) * | 2013-03-06 | 2013-06-19 | 上海交通大学 | 利用血红素辣根过氧化物酶催化比色检测三价砷的方法 |
CN105352919A (zh) * | 2015-08-31 | 2016-02-24 | 湖南科技大学 | 双色荧光含金碳点的制备及该碳点在可视化检测的应用 |
CN109876152A (zh) * | 2019-03-02 | 2019-06-14 | 北京化工大学 | 一种短肽/氯化血红素纳米颗粒及其制备方法 |
WO2021019196A1 (en) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | University Of Dundee | Analyte biosensing |
CN116328840A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-06-27 | 南京大学 | 一种基于血红素的嵌合寡肽-dna模拟酶与应用 |
-
2023
- 2023-09-19 CN CN202311208299.5A patent/CN116970584B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002207026A (ja) * | 2001-01-10 | 2002-07-26 | Shimadzu Corp | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス |
CN1424322A (zh) * | 2002-12-11 | 2003-06-18 | 吉林大学 | 三价铁卟啉及衍生物-短肽化合物及其合成方法 |
CN103163127A (zh) * | 2013-03-06 | 2013-06-19 | 上海交通大学 | 利用血红素辣根过氧化物酶催化比色检测三价砷的方法 |
CN105352919A (zh) * | 2015-08-31 | 2016-02-24 | 湖南科技大学 | 双色荧光含金碳点的制备及该碳点在可视化检测的应用 |
CN109876152A (zh) * | 2019-03-02 | 2019-06-14 | 北京化工大学 | 一种短肽/氯化血红素纳米颗粒及其制备方法 |
WO2021019196A1 (en) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | University Of Dundee | Analyte biosensing |
CN116328840A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-06-27 | 南京大学 | 一种基于血红素的嵌合寡肽-dna模拟酶与应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Self-Assembling Peptide Artificial Enzyme as an Efficient Detection Prober and Inhibitor for Cancer Cells;Meiling Lian et al.;ACS Appl. Bio Mater;第2卷;第2190页左栏第1段 * |
光学适配体传感器在赭曲霉毒素A 检测中的应用研究进展;田风玉 等;食品与发酵工业;第45卷(第4期);第242-249、262页 * |
核酸适配体氯化血红素比色法检测牛奶中的氯霉素;孙怀霞 等;集美大学学报(自然科学版);第26卷(第1期);第22页摘要 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116970584A (zh) | 2023-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fang et al. | Preparation of magnetic chitosan nanoparticles and immobilization of laccase | |
CN113789366B (zh) | CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用 | |
US20140154737A1 (en) | Cross-linked poly-e-lysine particles | |
CN112553189B (zh) | 一种基于磁性层状双金属氢氧化物和酶-dna复合物构建多模式催化系统的方法 | |
Cao et al. | PEI-crosslinked lipase on the surface of magnetic microspheres and its characteristics | |
CN115920965B (zh) | 一种制备纳米金复合双金属有机骨架纳米酶的方法及其过氧化物酶活性的应用 | |
CN109030802B (zh) | 一种一体化颗粒型固定化酶生物传感器及其制备方法和应用 | |
CN109897884B (zh) | 一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物及制备方法 | |
CN114414514A (zh) | 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 | |
CN111118111A (zh) | 一种葡萄糖的快速检测方法 | |
CN114479111B (zh) | 一种用于固定化辣根过氧化物酶的新型载体 | |
Luo et al. | Manipulation of the bioactivity of glucose oxidase via raft‐controlled surface modification | |
CN116970584B (zh) | 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 | |
Itoyama et al. | Spacer effects on enzymatic activity of papain immobilized onto porous chitosan beads | |
Li et al. | Biomimetic enzyme MOF-NADH-mediated and 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine-based colorimetric assay for formaldehyde detection | |
CN109682804B (zh) | 一种纳米卟啉催化剂及利用其催化tmb显色的方法 | |
CN113929082B (zh) | 一种制备水稻秸秆碳量子点纳米酶的方法及其过氧化物酶活性的应用 | |
Pollak et al. | Immobilization of synthetically useful enzymes by condensation polymerization | |
Wang et al. | Mimicry of peroxidase by co-immobilization of 1-allylimidazole and hemin on N-isopropylacrylamide-based hydrogel | |
Pundir et al. | Immobilization of Arthrobacter sarcosine oxidase onto alkylamine and arylamine glass and its application in serum sarcosine determination | |
Schilke et al. | Activation of immobilized lipase in non‐aqueous systems by hydrophobic poly‐dl‐tryptophan tethers | |
CN115254196B (zh) | 谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用 | |
US4206286A (en) | Immobilization of proteins on inorganic supports | |
CN113772829B (zh) | 基于淀粉基纳米材料固定化生物酶微反应器及其应用 | |
CN111154749B (zh) | 一种磁性dna隔室封装双酶的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |