CN109897884B - 一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于葡萄糖氧化酶‑中空二氧化锰的双功能酶复合物体系(H‑GOD‑MnO2)，由中空二氧化锰(H‑MnO2)与葡萄糖氧化酶(GOD)通过酰胺反应偶联合成，本发明所构建的双功能酶复合物不但保留了葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖的活性，而且同时具备了二氧化锰的金属类过氧化物酶活性，相比于单一的酶更具温度稳定性，能够实现原位的串联反应提高检测的灵敏度，保证葡萄糖检测中的最低检测限。对比天然酶来说，具有反应时间短、成本低、耐温、耐酸碱等性能优势。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰有机无机杂化纳米串联体系双功能酶复合物(H-GOD-MnO2)的制备及应用，包括中空二氧化锰纳米粒杂化体系H-GOD-MnO2的制备方法，以及在葡萄糖检测，人血清葡萄糖检测的考察。属于生物医用材料、体外血糖检测领域。
背景技术
自然界的生命现象很多都与酶的参与有关。2007年，阎锡蕴院士首次报道了纳米四氧化三铁具有类过氧化物酶的催化活性，并且首先提出了纳米酶的概念。纳米酶是指无机纳米材料与天然酶具有相类似的反应机理和酶动力学参数。近年来，文献报道纳米酶，如纳米四氧化三铁(Fe3O4)，二氧化锰(MnO2)等具有过氧化物酶常与游离的葡萄糖氧化酶合用，实现了葡萄糖的比色检测，被广泛研究并应用于葡糖糖的检测。基于MnO2纳米片的非共价固定化负载葡萄糖氧化酶(GOD)构建的自指示比色葡萄糖探针技术能够做到葡萄糖的灵敏检测。但是，非共价固定技术在用于葡萄糖检测时，操作需要分别依次加入GOD及氧化物酶，在检测过程增加系统误差。因此，需要寻求一种结合纳米酶与自然酶的新型酶固定技术用于葡萄糖监测，同时降低系统误差。
酶固定技术是用物理或化学手段，将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。经固定化的酶与游离酶相比具有串联催化效率高、稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点。常用的酶固定方法有物理吸附法，包埋法，以及化学的交联法和生物矿化法以及载体偶联法。物理吸附法操作简单，但酶与载体结合不牢，极易脱落；包埋法通过凝胶及半渗透膜的原理进行酶固定，只有小分子的底物和产物可以通过高聚物扩散，故包埋法是适用于小分子底物和产物的酶，对那些底物和产物是大分子的酶则不适合；交联法是利用双功能试剂与酶分子形成共价键，常用的交联剂戊二醛等制备的共价固定化酶活力较低；通过一锅生物矿化的方法将金属氧化物与酶复合固定，此方法对二氧化锰的固定量及矿化位点选择的问题，一般情况通过pH调节至碱性条件，蛋白孔径打开，矿化在蛋白内部的金属氧化物，对酶的活性及酶与底物的接触面存在限制。本发明中所使用共价偶联技术属于化学手段，将葡萄糖氧化酶与二氧化锰类酶通过化学偶联，提高了酶固定后的稳定性，且使用的二氧化锰纳米粒为中空，与其他形貌的纳米球，纳米片相比，增加了反应的比表面积，提高了酰胺偶联的反应效率以及串联反应的催化效率。
串联反应的催化过程如图1b所示，在有葡萄糖存在的条件下，葡萄糖与复合物中葡萄糖氧化酶反应生成葡萄糖酸和双氧水H2O2，同时，在偏酸性条件下，产物H2O2与复合物中二氧化锰反应，生成锰离子，同时氧化无色的3 3'5 5'-四甲基联苯胺TMB，成蓝色溶液，实现比色以及定量吸光度值的测定。TMB显色值与葡萄糖的浓度呈相关关系，从而实现葡萄糖及血糖浓度的检测。
发明内容
本发明的目的是提供H-GOD-MnO2双功能酶克服现有葡萄糖氧化酶(GOD)与氧化物模拟酶分次滴加使用，流程复杂及稳定性不足的技术缺陷，提供将非均相高比表面反应界面改善成串联反应提高催化效率，及降低检测限的技术改进方法。本发明的另一目的是提供H-GOD-MnO2双功能酶用于葡萄糖及血糖浓度检测的方法。该方法具有反应时间短，显色快等催化效果，以及成本低、温度、酸碱适用范围广等优于天然单一酶的优点。
本发明目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物，它是通过中空二氧化锰与葡萄糖氧化酶通过酰胺反应偶联合成。
进一步的，所述的一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物呈中空球状，平均粒径为200-300nm。
一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物，其制备方法包括如下步骤：
步骤一：中空二氧化锰纳米球的制备，将160mg高锰酸钾加入到0.1mol的盐酸溶液中搅拌2分钟，然后加入336mg(0.1mol)的柠檬酸；继续搅拌30分钟后，继续加入160mg高锰酸钾搅拌30分钟；第三次加入160mg高锰酸钾搅拌5分钟；将上述反应溶液离心，所得沉淀用5-10重量份的去离子水纯化，重复三次，即得中空二氧化锰纳米球；
步骤二：双功能酶复合物的制备，将葡萄糖氧化酶(GOD)用pH＝7.4的PBS缓冲液配制得到5-15mg/mL的溶液A；
步骤三：取步骤一中制得的中空二氧化锰纳米球10-30mg，与2-12mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合加入0.5-3mL的pH＝7.4PBS缓冲液中，5min后加入1-6mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续室温反应0.5h，得到分散液B；
步骤四：将溶液A加入到溶液B，继续反应2h，将溶液放置4℃过夜，去离子水洗涤后冷冻干燥；即得H-GOD-MnO2双功能酶复合物。
优选的，所述的催化剂EDC与NHS的摩尔比大于4：1。
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物，将其用于制备葡萄糖浓度或血糖浓度检测的试剂。
本发明是在使用游离酶效率低的情况下发明的，本发明的优点在于：
1.本发明制备了一种中空二氧化锰纳米球，制备方法简单，产量高，可实现批量生产；
2.本发明制备了一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰有机无机杂化双功能酶复合物(H-GOD-MnO2)反应条件温和，制备简单，可操作性强，能进一步满足应用，是一种理想的酶固定技术；
3.葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物是一种纳米串联体系，相比于单独的酶及单独的纳米金属氧化物催化(分开依次加入)，能够实现原位的串联反应提高检测的灵敏度和检测效率；
4.葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物相比于天然生物酶，具有稳定性高，耐酸碱，耐高温等特点，可重复使用。
本发明中将不同材料杂化集成，通过非功能基团的化学键偶联反应，将葡萄糖氧化酶与中空二氧化锰在中性环境中偶联，既实现了共价偶联的稳定优势，在酶稳定性表面反应及酶与底物的接触效率方面具有明显优势。本发明中基于中空二氧化锰通过酰胺键偶联固定葡萄糖氧化酶，实现高效催化的串联反应体系目前尚未报道。该体系的杂化纳米酶具有稳定性高，反应时间短，检测限低，灵敏度高，成本低廉和可规模生产的优势。
附图说明：
图1为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物的制备过程及作用原理图。
图2为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物的扫描电镜(SEM)图。
图3为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物的傅里叶红外(FTIR)图。
图4为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物的X射线光电子能谱分析(XPS)全谱图。
图5为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物GOD的负载量考察图。
图6为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测，不同显色时间考察图。
图7为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测，不同TMB浓度显色考察图。
图8为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测，不同pH环境显色考察图。
图9为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测，不同温度环境显色考察图。
图10为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测线性考察图，其中(A)为葡萄糖氧化酶与中空二氧化锰分别使用用于葡萄糖检测的线性图，(B)为葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测的线性图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
本发明实施使用的主要试剂和仪器：葡萄糖氧化酶(来源于黑曲霉，阿拉丁Aladdin)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，麦考林MACKLIN，98.5％)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，麦考林MACKLIN，98％)、3 3'5 5'-四甲基联苯胺(TMB，麦考林MACKLIN，98％)、傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Scientific Nicolet iS5)、TA-Q500热失重分析仪(美国TA公司)、多标记微孔板检测仪(美国PerkinElmer公司)
实施例1
涉及的中空二氧化锰纳米纳米粒及葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶偶联复合物的制备。
中空二氧化锰纳米粒的制备：将160mg高锰酸钾加入到0.1mol的盐酸溶液中，溶液呈紫色，搅拌2分钟，然后加入336mg(0.1mol)的柠檬酸；20分钟后，溶液颜色由紫色变为土黄色，搅拌第30分钟，继续加入160mg高锰酸钾，溶液在1分钟后变为酒红色，随即有沉淀生成，搅拌第40分钟，反应体系溶液呈棕色；第60分钟，第三次加入160mg高锰酸钾，立即有棕色沉淀产生，继续搅拌5分钟；将上述反应溶液离心，所得沉淀用5-10重量份的去离子水纯化，重复三次，即得中空二氧化锰纳米球，产率为42％。
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物的制备(如图1a所示)：将葡萄糖氧化酶(GOD)用3mLpH＝7.4的PBS缓冲液配制得到5mg/mL的淡黄色溶液A；将30mg H-MnO2纳米花和12mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合加入3mL的pH＝7.4PBS缓冲液中，5min后加入6mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续室温反应0.5h，得到深棕色分散液B；将溶液A加入到分散液B中，继续反应2h，将溶液放置4℃过夜，去离子水洗涤后冷冻干燥；即得GOD负载量为15％的H-GOD-MnO2双功能酶复合物。如图2所示，H-GOD-MnO2双功能酶复合物粒径在250nm左右，呈中空纳米球状。
根据上述方法，合成了葡萄糖氧化酶实际负载量5％～15％的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物。
实施例2
本发明对葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物进行理化表征。
1.傅里叶变换红外光谱实验
称取适量的中空二氧化锰及葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物，与一定量的溴化钾混合，压片，经过红外线烤灯干燥后，进行检测，如图3所示，1550cm-1新的吸收峰归属于氮-氢单键(-N-H)，结果标明，这一双功能酶复合物的成功制备。
2.X射线光电子能谱分析(XPS)试验
取适量的中空二氧化锰及葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物，如图4所示，H-MnO2与H-GOD-MnO2的XPS分析全谱图，通过与功能化前的中空二氧化锰纳米粒相比，碳(C1s)峰增强，出现新的氮(N1s)峰。结果标明，这一双功能酶复合物的成功复合。
3.热失重(TGA)实验
称取适量的理论负载量为10％，30％，50％的中空二氧化锰及葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物，使用测试参数设置为：25-800℃，升温速率为1℃，氮气保护，测定样品的热失重曲线，结果发现如图5所示，在高于450℃为二氧化锰的分解峰，172-460℃阶段为葡萄糖氧化酶的失重区间，实际葡萄糖氧化酶的负载量分别为：6.95％，8.86％，12.85％。
实施例3
本专利中用于葡萄糖/血糖检测所使用的组分及比例
表1本专利中非复合物用于葡萄糖/血糖检测所使用的组分及比例
表2本专利中复合物用于葡萄糖/血糖检测所使用的组分及比例
a.葡萄糖的浓度参考各实施例中的具体浓度；
b.葡萄糖氧化酶(b1)和二氧化锰(b2)的浓度及葡萄糖氧化酶-中空二氧化锰(b)的浓度以与游离酶当量的实际负载量计算数值一致；
c.缓冲液除实施例6中要求的不同pH值以外，其他为酸性环境pH＝4。
实施例4
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测时间的考察。向100μL的50μM的葡萄糖溶液中加入200μL，500μg/mL当量的双功能酶复合物H-GOD-MnO2溶液，然后加入pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液500μL，最后加入TMB乙醇溶液200μL，在设定的时间点(30分钟以内每隔3分钟，共300分钟)观察溶液的颜色变化及通过多标记微孔板检测仪测定吸光度值的变化。结果如图6所示，在0-18分钟，反应体系由淡蓝色逐渐加深，在18-30分钟显蓝色，反应液颜色最为稳定，在30-300分钟颜色逐渐变浅为淡蓝色至无色，颜色与检测仪测得的吸光度值一致。这一结果表明，本发明在用于葡萄糖及血糖检测时，溶液测定时间应保持在18-30分钟，以20分钟为最佳。
实施例5
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测显色剂TMB溶度的考察。
向9份100μL的50μM的葡萄糖溶液中加入200μL，500μg/mL当量的双功能酶复合物H-GOD-MnO2溶液，然后加入pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液500μL，最后依次分别加入溶度为5000，2500，1250，625，312，156，78，39，19μM的TMB乙醇溶液200μL，显色20分钟，显色1.5小时，显色2.5小时，观察溶液的颜色变化及通过多标记微孔板检测仪测定吸光度值的变化。结果如图7所示，显色20分钟，当浓度低于1250μM，溶液颜色逐渐由蓝色(1250μM)变为蓝绿(625μM)，浅绿(312μM)，深黄(156μM)，黄色(78μM)，浅黄(39μM)，无色(19μM)；当浓度高于1250μM，显色为蓝色，显色1.5小时及显色2.5小时，高浓度2500μM-5000μM范围内蓝色显色不稳定。颜色与检测仪测得的吸光度值一致。这一结果表明，本发明在用于葡萄糖及血糖检测时，所使用的显色剂TMB溶度考虑为1250μM。
实施例6
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测pH环境的考察。
向6份100μL的50μM的葡萄糖溶液中分别加入200μL，500μg/mL当量的双功能酶复合物H-GOD-MnO2溶液，然后依次分别加入500μLpH＝4.0，pH＝5.0的乙酸钠缓冲溶液，pH＝6.0，pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，pH＝8.0，pH＝9.0的Tris-盐酸缓冲液，最后加入TMB乙醇溶液200μL，显色20分钟，观察各pH环境下溶液的颜色及通过多标记微孔板检测仪测定各pH环境下的吸光度值。结果如图8所示，反应体系在pH＝4.0的环境下颜色呈稳定蓝色，且吸光度值最高，pH＝5.0，溶液呈现不稳定蓝色，有沉淀生成，随着pH值的增加颜色逐渐变浅，pH＝6.0，溶液呈蓝绿色，pH＝7.0，溶液呈淡绿色，pH＝8.0，溶液呈淡黄色，pH＝9.0，溶液呈无色。颜色与检测仪测得的吸光度值一致。这一结果表明，本发明在用于葡萄糖及血糖检测时，所使用的缓冲液体系为pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液。
实施例7
葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物耐温实验的考察。
H-GOD-MnO2溶液的准备：即取200μL，500μg/mL当量的双功能酶复合物H-GOD-MnO2溶液，分别置于30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的温度环境中静置10分钟。向5份100μL的50μM的葡萄糖溶液中分别加入以上准备液，然后依次加入pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液500μL，最后加入TMB乙醇溶液200μL，显色20分钟，观察各样品存放温度下的颜色及通过多标记微孔板检测仪测定吸光度值。结果如图9所示，随着存放温度的提高，H-GOD-MnO2的活性降低(30-60℃)，即TMB的显色越深，在50℃时，H-GOD-MnO2与30℃酶的活性相当；60℃时，酶失活严重。说明H-GOD-MnO2酶具有一定的耐温性能。
实施例8
葡萄糖氧化酶、二氧化锰，及葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于葡萄糖检测线性对比考察。
取100μL一系列浓度的葡萄糖工作溶液，然后加入100μLpH＝7.4的PBS缓冲液配制得到的1mg/mL的GOD溶液，然后加入100μL，400μg/mL的纳米金属氧化物MnO2溶液，然后加入pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液500μL，最后加入TMB溶液200μL，通过多标记微孔板检测仪测定各样品的吸光度值。分开加入游离葡萄糖氧化酶和二氧化锰作为对照方法，如图10(A)所示，得到的工作曲线为：在20-100μM的工作浓度范围内，y＝-0.0003x+0.4259,R2＝0.9491。
取100μL一系列浓度的葡萄糖工作溶液，然后加入200μL，pH＝7.4的PBS缓冲液配制得到的H-GOD-MnO2溶液，然后加入pH＝4.0的乙酸钠缓冲溶液500μL，最后加入TMB溶液200μL，通过多标记微孔板检测仪测定各样品的吸光度值。实验组结果，如图10(B)所示，得到的工作曲线为：在0-20μM的工作浓度范围内，y＝-0.0056x+0.3719,R2＝0.9778，具有更低的检测限。
实施例9
检测临床正常血清样本的血糖浓度。
取100μL临床正常血清样本(稀释100倍)，分别使用实施例7中的A,B两种方法进行检测。同时与血糖仪测定结果相比，结果如表3所示，使用葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物测定的数值与临床值一致性更高。
表3为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于检测临床样本结果对比表格
实施例10
检测临床糖尿病病人血清样本的血糖浓度。
取100μL临床糖尿病病人血清样本(稀释100倍)，取100μL临床正常血清样本(稀释100倍)，分别使用实施例7中的A，B两种方法进行检测。同时与血糖仪测定结果相比，结果如表4所示，使用葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物测定的数值与临床值一致性更高。
表4为本发明的葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰双功能酶复合物用于检测临床血糖异常样本结果对比表格
由上述技术方案可知，本发明所述的葡萄糖氧化酶-纳米金属氧化物颗粒复合物H-GOD-MnO2具有类过氧化物酶的功能，可催化TMB溶液由无色变为蓝色，检测血清样品中的葡萄糖浓度，不同浓度的葡萄糖对H-GOD-MnO2催化反应的程度不同，颜色变化深浅不一，符合优良的类酶特征。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物，其特征是：由中空二氧化锰与葡萄糖氧化酶通过酰胺反应偶联合成，其制备方法为包括如下步骤：
步骤一：中空二氧化锰纳米球的制备，将160mg高锰酸钾加入到0.1mol的盐酸溶液中搅拌2分钟，然后加入336mg0.1mol的柠檬酸；继续搅拌30分钟后，继续加入160mg高锰酸钾搅拌30分钟；第三次加入160mg高锰酸钾搅拌5分钟；将上述反应溶液离心，所得沉淀用5-10重量份的去离子水纯化，重复三次，即得中空二氧化锰纳米球H-MnO2；
步骤二：将葡萄糖氧化酶GOD用pH＝7.4的PBS缓冲液配制得到5-15mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液A；
步骤三：取步骤一中制得的中空二氧化锰纳米球10-30mg，与2-12mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合加入0.5-3mL的pH＝7.4PBS缓冲液中，5min后加入1-6mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续室温反应0.5h，得到分散液B；
步骤四：将溶液A加入到分散液B，继续反应2h，将溶液放置4℃过夜，去离子水洗涤后冷冻干燥；即得H-GOD-MnO2双功能酶复合物。
2.根据权利要求1所述的一种基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物，其特征是：所述的双功能酶复合物呈中空球状，平均粒径为200-300nm。
3.根据权利要求1所述的基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物的制备方法，其特征是：所述的催化剂EDC与NHS的摩尔比大于4：1。
4.根据权利要求1的方法制得的基于葡萄糖氧化酶/中空二氧化锰的双功能酶复合物在制备用于葡萄糖浓度或血糖浓度检测的试剂的应用。
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