CN110237865A - 一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料及其制备与应用，角蛋白纳米花材料的制备方法包括角蛋白纳米花的制备及磷酸银的负载；该材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。与现有技术相比，本发明中材料的制备过程简单，操作性好，回收率高，环保高效，易于从溶液中分离，且Keratin‑nanoflower@Ag3PO4具有优异的类过氧化物酶催化活性，可以作为一种新颖的模拟酶，替代过氧化氢氧化酶在生物检测、临床诊断和免疫分析中广泛使用；利用本发明中的Keratin‑nanoflower@Ag3PO4对血清中尿酸进行比色检测，检测过程简单快捷，经济环保，且对尿酸的比色检测无需标记，检测范围宽，选择性好，即使当干扰物质的浓度为尿酸浓度3.3倍时，该方法仍然可以高效地检测出尿酸。
Description
技术领域
本发明属于尿酸检测技术领域，涉及一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料及其制备与应用。
背景技术
尿酸的测定方法目前已超过200种，主要分为化学试剂比色法、酶分析法、荧光法、毛细管电泳法、电化学法、化学发光法和高效液相色谱法等。然而，由于仪器昂贵、样品制备过程复杂、耗时长，这些方法都面临着不可克服的缺点。其中，高效液相色谱法需要特殊的设备，检测时间较长，样品中干扰因素多，使得分离效果差；而化学试剂比色法操作步骤冗杂，尤其是样品的前处理过程非常复杂，另外，所需要的试剂较多，引起了测定结果存在偏差，计算结果复杂；酶分析法技术含量高，特异性强。目前，市面上的尿酸检测试剂盒，例如广州兆康生物科技有限公司、中生北控生物科技股份有限公司、郑州万华生物技术有限公司等制造的试剂盒，所用试纸条的价格较高，对于日常生活检测不够经济实惠。因此，建立快速高效、简单准确、经济实惠的尿酸检测方法成为近几年关注的热点。
最初，中国科学院生物物理研究所阎锡蕴研究小组发现四氧化三铁纳米颗粒具有类过氧化物酶催化活性，并利用这一特性，设计了两种免疫检测方法，实现了对乙肝病毒表面抗原和肌钙蛋白的检测。随后，汪尔康等人利用四氧化三铁纳米颗粒类过氧化物酶特性，实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测。此外，各种无机纳米系统也展示出了比辣根过氧化物酶更加稳定的催化特性，是新型的模拟酶。然而，基于纳米材料的人工模拟酶在生物催化的应用中仍然存在许多缺陷，比如合成量小、合成过程复杂、不确切的物理和化学性质等，限制了其进一步应用。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料及其制备与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)角蛋白纳米花的制备：向角蛋白(keratin)溶液中加入铜盐，混合均匀后进行自然沉降反应，经离心、洗涤、干燥，即得到所述的角蛋白纳米花(Keratin-nanoflower)；
2)负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备：将角蛋白纳米花溶解后，加入银盐，混合均匀后进行震荡反应，经离心、洗涤、干燥，即得到所述的负载磷酸银的角蛋白纳米花(Keratin-nanofower@Ag3PO4)材料。
进一步地，步骤1)中，所述的角蛋白溶液的制备方法为：将角蛋白加入至磷酸缓冲溶液中，所述的磷酸缓冲溶液的pH值为7-8。
进一步地，步骤1)中，所述的铜盐为硫酸铜；步骤2)中，所述的银盐为硝酸银。
进一步地，步骤1)中，所述的自然沉降反应过程中，温度为20-30℃，时间为60-80h；步骤2)中，所述的震荡反应过程中，反应时间为10-15h。
进一步地，步骤1)中，所述的干燥过程中，温度为30-40℃，时间为8-16h。
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料，该材料采用所述的方法制备而成。
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的应用，所述的材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。
进一步地，所述的检测过程为：先以负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，利用过氧化氢将TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)氧化为蓝色的TMBox，之后利用尿酸将蓝色的TMBox还原为无色的TMB；反应结束后，根据最终产物溶液的吸光度(波长为652nm)，计算得到尿酸的含量。检测尿酸含量的线性范围为3-100μM。在3.0×10-6-1.0×10-4mol/L浓度范围内，尿酸浓度与吸光度(A)线性相关度高，线性回归方程为A＝-0.00275C+0.609，R2＝0.999，检测限为9.4×10-7mol/L。
进一步地，所述的反应过程在醋酸-醋酸钠缓冲溶液(HAc-NaAc pH＝4.0)中进行，所述的负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的质量浓度为4.76-142.8μg/mL(优选为119μg/mL)，所述的TMB的摩尔浓度为10-400μmol/L(优选为95μmol/L)。
进一步地，所述的反应过程中，温度为20-80℃(优选为60℃)，时间为1-10min(优选为8min)，pH值为2-9(优选为4)。
本发明以角蛋白为无机组分，三水磷酸铜为骨架，通过自组装合成角蛋白纳米花，然后负载磷酸银纳米颗粒，组合的功能性复合材料具有独特的三维结构，且同时具有较高的类过氧化酶催化活性。
本发明制备得到一种具有优异催化性能、生物相容性和水分散性的花状结构keratin-nanoflower@Ag3PO4，其可用于血清中尿酸的比色检测分析。本发明中keratin-nanoflower@Ag3PO4的制备方法简单高效、回收率高、安全环保，具有类辣根过氧化物酶活性。与现有的检测手段相比，本发明利用keratin-nanoflower@Ag3PO4作为催化剂对尿酸进行比色检测，先将TMB氧化为蓝色的TMBox，之后利用尿酸在氧气存在的条件下，将TMBox还原为TMB，以便根据最终产物溶液在特定波长下的吸光度求出样品中尿酸的含量。该比色检测尿酸的方法无需标记，也无需昂贵的大型仪器，操作简单，快速高效，经济环保，可视化，具有高的灵敏度和特异性，即使当干扰物质的浓度为尿酸浓度的3.3倍时，该方法仍然可以高效的检测出尿酸，选择性好，对尿酸的检测具有较宽的线性范围，能够实现可视化检测。
本发明制备的Keratin-nanoflower@Ag3PO4，合成的过程操作简单，经济环保，只需要在避光条件下，进行自然沉降反应及震荡反应即可，与其他的材料合成方法相比，其条件简单，无需其他气体保护，这样安全系数更高；并且与其它具有单一的类过氧化物酶活性的纳米模拟酶相比，具有优异的催化活性、生物相容性，在水中的分散性好。
其中，“类过氧化物酶”是指显示出过氧化物酶催化活性的物质。具体地，本发明的类过氧化物酶催化氧化还原反应，并以过氧化物作为电子受体，从而氧化底物TMB。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明Keratin-nanoflower@Ag3PO4的制备过程简单，操作性好，回收率高，环保高效，易于从溶液中分离，且Keratin-nanoflower@Ag3PO4具有优异的类过氧化物酶催化活性，可以作为一种新颖的模拟酶，替代过氧化氢氧化酶在生物检测、临床诊断和免疫分析中广泛使用；
2)利用本发明中的Keratin-nanoflower@Ag3PO4对血清中尿酸进行比色检测，检测过程简单快捷，经济环保，且对尿酸的比色检测无需标记，检测范围宽(3.0×10-6-1.0×10-4mol/L)，检测限为9.4×10-7mol/L，选择性好，即使当干扰物质的浓度为尿酸浓度3.3倍时，该方法仍然可以高效地检测出尿酸；
3)利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4的类过氧化物酶特性，取代了固有的天然酶，不但大大降低了试剂的成本，而且改善了工作环境，使纳米模拟酶在较高温度下也可进行检测。
附图说明
图1为本发明中Keratin-nanoflower@Ag3PO4的合成过程示意图；
图2为本发明中Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测尿酸的原理图；
图3为实施例1中制备得到的Keratin-nanoflower以及Keratin-nanoflower与AgNO3不同质量比形成的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的扫描电镜图，其中，a、b为Keratin-nanoflower的扫描电镜图，c、d为Keratin-nanoflower@Ag3PO4(1:1)的扫描电镜图，e、f为Keratin-nanoflower@Ag3PO4(1:2)的扫描电镜图，g、h为Keratin-nanoflower@Ag3PO4(1:3)的扫描电镜图；
图4为实施例1中制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的X射线衍射图；
图5为实施例1中制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4材料的N2吸附-解吸等温线图及孔径分布曲线图(插图)；
图6为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4在不同温度下进行尿酸检测的吸光度折线图；
图7为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4在不同pH下进行尿酸检测的吸光度折线图；
图8为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4在不同浓度下进行尿酸检测的吸光度折线图；
图9为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4在不同反应时间下进行尿酸检测的吸光度折线图；
图10为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4进行尿酸检测的图谱，其中，A为尿酸检测对应的照片，B为尿酸检测的紫外吸收图谱，C为尿酸检测紫外吸收的折线图，C中插图为尿酸检测的线性图；
图11为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4进行尿酸检测的选择性比色检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
如图1所示，Keratin-nanoflower@Ag3PO4的合成过程如下：
(1)Keratin-nanoflower纳米花的制备
①准确称取3mg角蛋白(keratin)溶解在PBS磷酸缓冲溶液(0.1M，pH＝7.4)中；
②混合均匀后，向上述溶液中加入200μL(120mM)CuSO4溶液，将溶液旋转摇匀，然后将离心管转移至25℃的电热恒温水槽中，自然沉降反应72小时；
③8000rpm离心3min后移除上清液，并用蒸溜水洗涤沉淀物三次，最后将所得沉淀物置于真空干燥箱内，35℃干燥12小时。
(2)Keratin-nanofower@Ag3PO4的制备
①准确称取上述合成的Keratin-nanoflower(5mg)分散在去离子水中；
②再称取15mg AgNO3分散在去离子水中；
③分散好的溶液，将②加入①中震荡反应12小时，离心、洗涤、35℃真空干燥，得到灰绿色的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的样品。
其中，以上样品的制备必须在避光环境中进行。
图3为制备得到的Keratin-nanoflower以及Keratin-nanoflower与AgNO3不同质量比形成的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的扫描电镜图，由图3可以看出：采用本实施例中的制备方法，可得到形貌结构良好、分散性、均一性好的纳米花。
图4为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的X射线衍射图，由图4可以看出，在12.8°、20.5°、29.5°、33.7°、37.2°、47.0°、53.5°有Cu3(PO4)2·3H2O很明显的衍射峰，在33.3°、36.5°、52.6°、57.2°、61.6°有Ag3PO4的衍射峰，它们分别对应的晶面是(210)，(211)，(222)，(321)和(400)。
图5为制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4的比表面积和孔径图，由图5可以看出，Keratin-nanoflower@Ag3PO4的比表面积大小为60.34m2/g，孔径大小为7.75nm，说明该材料具有大的比表面积和大的孔径，有利于反应分子附着和通过。
实施例2：
对Keratin-nanoflower@Ag3PO4催化过氧化氢氧化其底物反应的条件进行优化，其中，Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测尿酸的原理图如图2所示。
利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测尿酸的步骤如下：
实施例2.1：
反应温度对Keratin-nanoflower@Ag3PO4溶液比色检测尿酸的影响
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.00)于1.5mL离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液(5.0mM)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2.0mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)分别取部分步骤(1)中所得的混合液在(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)水浴锅中反应8min；
(3)通过离心机将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
实验结果如图6所示，从图中可以看出，在652nm处的吸光度随着温度的升高先升高后降低，为了使Keratin-nanoflower@Ag3PO4在最佳的条件下工作，故选择了最大吸光度所对应的温度60℃为反应的最佳温度。
实施例2.2：
反应pH对Keratin-nanoflower@Ag3PO4溶液比色检测尿酸的影响
(1)分别取360μL pH＝2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M)于离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液(3mM)、20μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应8min；
(3)通过外加磁场将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
实验结果如图7所示，从图7中可以看出652nm处的吸光度随着pH的升高先升高后降低，为了使Keratin-nanoflower@Ag3PO4在最佳的条件下工作，故选择了最大吸光度所对应的pH＝4.0为反应的最佳pH。
实施例2.3：
Keratin-nanoflower@Ag3PO4浓度对比色检测尿酸的影响
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.0)于离心管中，依次向离心管中加入不同浓度的Keratin-nanoflower@Ag3PO4(0mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL)、过氧化氢水溶液(5.0mM)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2.0mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应8min；
(3)通过外加磁场将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
实验结果如图8所示，从图中明显可以看出随着Keratin-nanoflower@Ag3PO4浓度增加，吸光度先增加，后有下降趋势，综合选取Keratin-nanoflower@Ag3PO4溶液的浓度为2.5mg/mL为最佳浓度。
实施例2.4：
反应时间对Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测尿酸的影响
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.0)于离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液(5.0mM)、20μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应不同的时间(1-10min)；
(3)通过外加磁场将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
实验结果如图9所示，由图9可以看出，随着反应时间的增加，溶液在652nm波长处的吸光度先成线性关系增加，后面趋于平稳，综合选取最佳反应时间为8min。
实施例3：
Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测尿酸
根据实施例2中优化得到的最佳实验条件，利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色测定尿酸，步骤如下：
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.00)于1.5mL离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液(5.0mM)、20μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2.0mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应8min；
(3)分别加入不同浓度的尿酸溶液(1μM、2μM、3μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、80μM、100μM、120μM、150μM、180μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM)，37℃水浴条件下反应2min；
(4)通过离心机将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4对尿酸的检测结果如图10所示。从图10中可以看出，利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4对尿酸的检测限为9.4×10-7mol/L，检测的线性范围为3×10-6-1.0×10-4mol/L。尿酸浓度与吸光度(A)线性相关度高(R2＝0.999)，线性回归方程为A＝-0.00275C+0.609。
实施例4：
Keratin-nanoflower@Ag3PO4选择性比色检测尿酸、柠檬酸、草酸、甘氨酸、葡萄糖、L-半胱氨酸、Na+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、K+
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.0)于1.5mL离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液5.0mM、20μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2.0mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应8min；
(3)在离心管中分别加入待测的尿酸、柠檬酸、草酸、甘氨酸、葡萄糖、L-半胱氨酸、Na+、Ca2+、Zn2+、Fe3+和K+在37℃水浴条件下反应2min；
(4)通过离心机将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；
(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。
利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4对尿酸的选择检测结果如图11柱形图所示。图11中，从左到右依次是尿酸、柠檬酸、草酸、甘氨酸、葡萄糖、L-半胱氨酸、Na+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、K+，尿酸浓度为300μM，其他干扰物浓度为1mM。从图11中柱状图中可以看出，尿酸的柱状高度比其它对照物的要高出许多，表明本发明所使用的方法对尿酸的检测选择性高、特异性好。
实施例5：
Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色检测血清中尿酸
根据实施例2中优化得到的最佳实验条件，利用Keratin-nanoflower@Ag3PO4比色测定血清中尿酸，步骤如下：
(1)取360μL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2M，pH＝4.0)于1.5mL离心管中，依次向离心管中加入20μL Keratin-nanoflower@Ag3PO4(2.5mg/mL)、20μL过氧化氢水溶液5.0mM、20μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，2.0mM)，将上述溶液混合均匀；
(2)将步骤(1)中所得的混合液在60℃水浴锅中反应8min；
(3)在血清样品中加入三种不同浓度的尿酸标准溶液；
(4)分别在离心管中依次加入10μL前处理过的加标血清样品，37℃水浴锅中反应2min；
(5)通过离心将Keratin-nanoflower@Ag3PO4与反应液分离；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液的紫外吸收光谱。最后，根据尿酸比色检测的标准曲线计算血清中尿酸的含量。
表1比色检测血清中尿酸的结果
由表1可以看出，在人类血清中加入不同浓度的UA进行回收检测。加标样品回收率为92.95％-101.68％，相对标准偏差(RSD)小于3％，说明该比色法具有检测血清中UA的能力。为了进一步验证Keratin-nanoflower@Ag3PO4的适用性，将其与现有的商业化可用ELISA测定方法进行比较。两种方法的相对误差在6.16％和10.0％之间，验证了制备得到的Keratin-nanoflower@Ag3PO4在临床应用中的可行性。
实施例6：
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料，其制备方法，包括以下步骤：
1)角蛋白纳米花的制备：将角蛋白加入至pH值为7的磷酸缓冲溶液中，得到角蛋白溶液；向角蛋白溶液中加入硫酸铜，混合均匀后，在30℃下进行自然沉降反应60h，经离心、洗涤、干燥，即得到角蛋白纳米花；
2)负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备：将角蛋白纳米花溶解后，加入硝酸银，混合均匀后进行震荡反应15h，经离心、洗涤，在30℃下干燥16h，即得到负载磷酸银的角蛋白纳米花材料。
该负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。
检测过程为：先以负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，利用过氧化氢将TMB氧化为TMBox，之后利用尿酸将TMBox还原为TMB；反应结束后，根据最终产物溶液的吸光度，计算得到尿酸的含量。其中，反应过程在缓冲溶液中进行，负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的质量浓度为142.8μg/mL，TMB的摩尔浓度为400μM。反应过程中，温度为20℃，时间为10min，pH值为2。
实施例7：
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料，其制备方法，包括以下步骤：
1)角蛋白纳米花的制备：将角蛋白加入至pH值为8的磷酸缓冲溶液中，得到角蛋白溶液；向角蛋白溶液中加入硫酸铜，混合均匀后，在20℃下进行自然沉降反应80h，经离心、洗涤、干燥，即得到角蛋白纳米花；
2)负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备：将角蛋白纳米花溶解后，加入硝酸银，混合均匀后进行震荡反应10h，经离心、洗涤，在40℃下干燥8h，即得到负载磷酸银的角蛋白纳米花材料。
该负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。
检测过程为：先以负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，利用过氧化氢将TMB氧化为TMBox，之后利用尿酸将TMBox还原为TMB；反应结束后，根据最终产物溶液的吸光度，计算得到尿酸的含量。其中，反应过程在缓冲溶液中进行，负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的质量浓度为142.8μg/mL，TMB的摩尔浓度为10μM。反应过程中，温度为80℃，时间为1min，pH值为9。
实施例8：
一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料，其制备方法，包括以下步骤：
1)角蛋白纳米花的制备：将角蛋白加入至pH值为7.5的磷酸缓冲溶液中，得到角蛋白溶液；向角蛋白溶液中加入硫酸铜，混合均匀后，在25℃下进行自然沉降反应70h，经离心、洗涤、干燥，即得到角蛋白纳米花；
2)负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备：将角蛋白纳米花溶解后，加入硝酸银，混合均匀后进行震荡反应12h，经离心、洗涤，在35℃下干燥12h，即得到负载磷酸银的角蛋白纳米花材料。
该负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。
检测过程为：先以负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，利用过氧化氢将TMB氧化为TMBox，之后利用尿酸将TMBox还原为TMB；反应结束后，根据最终产物溶液的吸光度，计算得到尿酸的含量。其中，反应过程在缓冲溶液中进行，负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的质量浓度为75μg/mL，TMB的摩尔浓度为180μM。反应过程中，温度为50℃，时间为8min，pH值为6。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)角蛋白纳米花的制备：向角蛋白溶液中加入铜盐，混合均匀后进行自然沉降反应，经离心、洗涤、干燥，即得到所述的角蛋白纳米花；
2)负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备：将角蛋白纳米花溶解后，加入银盐，混合均匀后进行震荡反应，经离心、洗涤、干燥，即得到所述的负载磷酸银的角蛋白纳米花材料。
2.根据权利要求1所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的角蛋白溶液的制备方法为：将角蛋白加入至磷酸缓冲溶液中，所述的磷酸缓冲溶液的pH值为7-8。
3.根据权利要求1所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的铜盐为硫酸铜；步骤2)中，所述的银盐为硝酸银。
4.根据权利要求1所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的自然沉降反应过程中，温度为20-30℃，时间为60-80h；步骤2)中，所述的震荡反应过程中，反应时间为10-15h。
5.根据权利要求1所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的干燥过程中，温度为30-40℃，时间为8-16h。
6.一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料，其特征在于，该材料采用如权利要求1至5任一项所述的方法制备而成。
7.一种如权利要求6所述的负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的应用，其特征在于，所述的材料作为催化剂，用于尿酸的检测中。
8.根据权利要求7所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的应用，其特征在于，所述的检测过程为：先以负载磷酸银的角蛋白纳米花材料作为催化剂，利用过氧化氢将TMB氧化为TMBox，之后利用尿酸将TMBox还原为TMB；反应结束后，根据最终产物溶液的吸光度，计算得到尿酸的含量。
9.根据权利要求8所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的应用，其特征在于，所述的反应过程在缓冲溶液中进行，所述的负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的质量浓度为4.76-142.8μg/mL，所述的TMB的摩尔浓度为10-400μmol/L。
10.根据权利要求8所述的一种负载磷酸银的角蛋白纳米花材料的应用，其特征在于，所述的反应过程中，温度为20-80℃，时间为1-10min，pH值为2-9。
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