IT202000007162A1 - Procedimento e kit per rilevare un analita in un campione - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell?invenzione industriale dal titolo:
?Procedimento e kit per rilevare un analita in un campione?
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell'invenzione
La presente descrizione si riferisce a procedimenti per determinare un analita in un campione. In particolare, la descrizione si riferisce a procedimenti e kit per rilevare perossido di idrogeno o almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno in un campione.
Sfondo dell?invenzione
Il riconoscimento ed il dosaggio di bio-marcatori per la prevenzione, la diagnosi precoce e la valutazione dello stato di salute ? un argomento di interesse mondiale. Le attuali tecniche comunemente accessibili per l?analisi di questi marcatori prevedono campionamenti invasivi, quali prelievi di sangue, da parte di personale specializzato in strutture attrezzate, come gli ambulatori o farmacie opportunamente allestite. Parallelamente alla comparsa della telemedicina e all?affinarsi degli approcci terapeutici, sta aumentando l?esigenza di monitoraggio e di analisi a distanza in autonomia, con l?obiettivo di ottenere risultati in tempo reale. La crescente necessit? di monitorare costantemente alcuni parametri o di eseguire test di prescreening a basso costo hanno portato alla rapida diffusione di test remoti o point-of-care (POC). Tali tecniche POC vantano brevi tempi di esecuzione, non richiedono strumentazione e non sono invasive, al punto che trovano applicazione anche nell?autocontrollo/autoanalisi. In questo contesto, particolare interesse rivestono i metodi basati sul campionamento non invasivo di fluidi diagnostici. La saliva ? un utile strumento diagnostico in quanto facile da campionare, ricca in composizione, e molti dei suoi costituenti sono correlati in concentrazione con i valori ematici.
Un target di grande interesse in questo ambito ? il perossido di idrogeno (H2O2), che riveste un ruolo importante sia come primo indicatore dello stato di stress ossidativo sia come secondo messaggero nell?ambito di reazioni enzimatiche, per riconoscimento e dosaggio di bersagli biomolecolari o inquinanti ambientali. La quantificazione del perossido pu? essere, quindi, destinata sia a valutare la carica di ROS che grava sull?organismo, ma anche come prodotto stechiometrico della conversione di indicatori di stati patologici o fisiologici quali antigeni, carboidrati, lipidi o metaboliti circolanti. Questi target possono essere quantificati grazie a reazioni catalizzate da enzimi di tipo ossidasi che, oltre alla forma ossidata dell?analita bersaglio, forniscono come prodotto secondario H2O2 a partire da H2O ed O2.
I metodi POC sviluppati per queste applicazioni si basano principalmente sul cambiamento di colore di soluzioni o supporti solidi. Alla base di queste tecnologie vi ? l?impiego di nanoparticelle, tipicamente di metalli nobili.
? noto che le nanoparticelle di oro vantano propriet? ottiche in termini di risonanza plasmonica di superficie localizzata (localized surface plasmon resonance; LSPR) strettamente correlate alla forma e dimensioni delle stesse, per cui ad oggi se ne possono sintetizzare una variet? di forme con propriet? plasmoniche uniche per ogni tipo di particella. Processi che modificano la morfologia, come accade per l?erosione (o etching) hanno un forte impatto sulle propriet? plasmoniche di queste particelle, che si traduce in un cambio delle propriet? macroscopiche (in termini di colore di sospensioni comprendenti tali nanoparticelle). L?erosione della nanoparticella causa infatti una riduzione della sua taglia e, di conseguenza, una riduzione dell?intensit? del picco plasmonico caratteristico; questo, per di pi?, pu? subire anche dei significativi spostamenti in termini di lunghezza d?onda durante tale processo.
Questo fenomeno pu? essere sfruttato in tecnologie POC qualora l?erosione sia controllata e correlata alla presenza di un analita di interesse in soluzione. Come si ? detto, un analita di particolare interesse ? il perossido di idrogeno; questo composto ? in grado di promuovere l?erosione di nanoparticelle metalliche (nanosensori) in soluzione, permettendo un cambiamento morfologico e/o dimensionale delle stesse ed una conseguente variazione nell?intensit? e/o posizione del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata di tali nanoparticelle. Procedimenti ad oggi noti di rimodellamento di nanoparticelle di oro mediante fenomeni di erosione ossidativa possono prevedere l?impiego di nanoparticelle rivestite e protette da uno o pi? agenti cappanti; tali procedimenti possono presentare lo svantaggio per cui il fenomeno di rimodellamento avviene in intervalli temporali molto lunghi, di alcune ore o giorni. Inoltre, oltre a un cambiamento morfologico delle particelle si pu? verificare una significativa riduzione della loro dimensione che non consente l?apprezzamento di una variazione colorimetrica visiva ma comporta la necessit? di condurre analisi strumentali specifiche. Altri procedimenti possono prevedere la possibilit? di rilevare la presenza di perossido di idrogeno in un campione mediante variazione colorimetrica indotta dall?erosione di nanoparticelle. Nanoparticelle impiegabili in tali procedimenti possono essere sintetizzate in presenza di argento ed essere rivestite da un agente cappante organico, quale il polivinilpirrolidone (PVP). Inoltre, tali procedimenti possono prevedere lunghi periodi di tempo per la rilevazione colorimetrica e l?impiego di reagenti, quali basi forti come l?idrossido di sodio, che alla luce dell?elevato potere corrosivo necessitano di specifici presidi di protezione per l?utilizzo.
Scopo e sintesi dell'invenzione
La presente invenzione ha come oggetto un procedimento semplice, sensibile e rapido per la determinazione colorimetrica di un analita in un campione.
Secondo la presente descrizione tale scopo viene raggiunto grazie ad un procedimento avente le caratteristiche formanti oggetto delle rivendicazioni allegate. Le rivendicazioni formano parte integrante dell?insegnamento qui somministrato in relazione al procedimento descritto.
Il procedimento qui descritto consente di rilevare la presenza di un analita in un campione, in cui l?analita ? selezionato tra perossido di idrogeno e/o almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il procedimento comprendendo le fasi di: i) fornire un substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile,
ii) porre a contatto detto substrato con:
- il campione da sottoporre al rilevamento di detto analita, - almeno un componente selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, ammine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele,
iii) rilevare una variazione di colore di detto substrato dopo un periodo di tempo T1,
in cui una variazione di colore di detto substrato dopo il periodo di tempo T1 indica la presenza di detto analita nel campione.
Preferibilmente, quando l?analita ? almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il substrato ? posto a contatto inoltre con almeno un enzima ossidasi, specifico per detto composto.
In una o pi? forme di attuazione, detto substrato pu? essere un substrato liquido oppure un substrato solido.
Preferibilmente, il campione ? un campione liquido.
La presente descrizione fornisce inoltre un kit per la rilevazione di un analita in un campione, in cui l?analita ? selezionato tra perossido di idrogeno e almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il kit comprendendo:
- un substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile,
- almeno un composto selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, ammine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele, - opzionalmente almeno un enzima ossidasi.
Il kit pu? inoltre comprendere una soluzione tampone comprendente almeno un acido.
Vantaggiosamente, la rilevazione del colore del substrato comprendente le nanoparticelle pu? essere condotta mediante ispezione visiva.
Breve descrizione delle figure
Il procedimento verr? ora descritto dettagliatamente con riferimento ai disegni allegati, dati a puro titolo di esempio non limitativo, in cui:
- la figura 1 rappresenta un meccanismo di catalisi enzimatica con formazione di perossido di idrogeno come prodotto secondario;
- la figura 2 rappresenta un esempio di conduzione del procedimento oggetto della presente descrizione in cui il substrato comprendente le nanoparticelle ? un substrato liquido posto a contatto con il campione e con un sale di alogenuro (rappresentati da una goccia); quando perossido di idrogeno ? presente nel campione si forma l?agente di erosione, quale ad esempio acido ipobromoso, indicato con la sigla generica HXO;
- la figura 3 rappresenta uno schema di conduzione del procedimento oggetto della presente descrizione secondo una forma di attuazione in cui il substrato comprendente le nanoparticelle ? un substrato solido posto a contatto con il campione e il composto in grado di generare l?agente di erosione (rappresentati da una goccia);
- la figura 4 ? relativa a immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di nanoparticelle di oro ramificate osservate prima (sinistra) e dopo (destra) la conduzione del procedimento su un campione contenente H2O21 mM. A dimostrazione che la risposta colorimetrica ? dovuta al solo processo di erosione e rimodellamento non catalizzato, si pu? osservare che il processo ? limitato alla sola superfice delle nanoparticelle, in particolare alle ramificazioni; non si osserva diminuzione di dimensione delle nanoparticelle;
- la figura 5 riguarda un saggio comparativo in cui si sono messe a confronto tre diverse tipologie di nanoparticelle. Nelle condizioni del procedimento descritto solo le nanoparticelle ramificate (nanostelle) rispondono alla presenza di perossido di idrogeno con un notevole spostamento plasmonico nei 5 minuti previsti dal saggio,
- la figura 6 ? una immagine che riguarda un esperimento di confronto di un procedimento condotto impiegando nanoparticelle di forma diversa: dall?alto nella prima fila (pozzetti A1-A4) nanoparticelle ramificate, sotto (pozzetti B1-B4) nanobarre e, infine (pozzetti C1-C4) nanosfere,
- la figura 7 rappresenta lo spostamento plasmonico (da destra verso sinistra) durante la conduzione del procedimento descritto originato dall?ossidazione enzimatica di glucosio presente in un campione di saliva. In soli 5, minuti le nanoparticelle presentano un notevole cambiamento di colore senza per? riduzione dell?intensit? del segnale. Il meccanismo di erosione-rimodellamento conduce a nanoparticelle aventi un alto coefficiente di estinzione molare permettendo una chiara visualizzazione del risultato;
- la figura 8 rappresenta lo spostamento plasmonico di un campione in cui non avviene modellamento delle nanoparticelle. La sola erosione delle nanoparticlle causa riduzione dell?intensit? ottica, mentre nelle condizioni operative del procedimento oggetto della presente descrizione si ha un meccanismo bi-modale che permette di mantenere una chiara riposta colorimetrica.
Descrizione dettagliata
Nella descrizione che segue, vengono forniti numerosi dettagli specifici per permettere una comprensione approfondita di forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici o con altri procedimenti, componenti, materiali ecc. In altri casi, non sono mostrate/mostrati o descritte/descritti dettagliatamente strutture, materiali od operazioni ben note/noti per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a ?una (aggettivo numerale) forma di realizzazione? o ?una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in riferimento alla forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Cos?, le forme delle espressioni ?in una (aggettivo numerale) forma di realizzazione? o ?in una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione? in vari punti in tutta la presente descrizione non sono necessariamente tutte riferite alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione. I titoli forniti in questa sono solo per comodit? e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
La presente descrizione ha per oggetto un procedimento rapido per la determinazione colorimetrica di un analita, ad esempio perossido di idrogeno o un composto in grado di generare perossido di idrogeno. Il procedimento sfrutta un fenomeno di erosione selettiva ed esclusiva di nanoparticelle ramificate, preferibilmente di oro e prive di agenti cappanti combinato con un rimodellamento di tali nanoparticelle. Il procedimento consente di determinare la presenza di un analita sulla base di una variazione colorimetrica apprezzabile ad occhio nudo senza la necessit? di impiegare specifiche strumentazioni da laboratorio. Il procedimento presenta i vantaggi di essere economico, presentare tempi brevi di esecuzione, di non necessitare di presidi di protezione per la sua esecuzione ed ? dunque adatto come test remoto o point-of-care (POC).
La descrizione fornisce un procedimento per rilevare un analita in un campione, in cui l?analita ? selezionato tra perossido di idrogeno e almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno,
il procedimento comprendendo le fasi di:
i) fornire un substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile,
ii) porre a contatto detto substrato con:
- il campione da sottoporre al rilevamento di detto analita, - almeno un componente selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, ammine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele,
iii) rilevare una variazione di colore di detto substrato dopo un periodo di tempo T1,
in cui una variazione di colore di detto substrato dopo il periodo di tempo T1 indica la presenza di detto analita nel campione.
In una o pi? forme di attuazione, il substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile pu? essere un substrato liquido oppure un substrato solido.
Il substrato liquido pu? essere ad esempio una soluzione acquosa comprendente le nanoparticelle ramificate.
Il substrato solido pu? essere un substrato di un materiale in grado di trattenere le nanoparticelle. Il substrato solido pu? comprendere o essere costituito da materiale polimerico sintetico o naturale. Il materiale pu? essere selezionato nel gruppo costituito da poliammidi (Nylon), Polivinilidenfluoruro (PVDF), derivati della cellulosa, preferibilmente acetato di cellulosa, esteri di cellulosa, nitrocellulosa. Il substrato solido, inoltre, pu? presentare uno spessore compreso fra 10 ?m e 5 mm, preferibilmente fra 50 ?m e 500 ?m.
Al fine di fornire il substrato solido comprendente le nanoparticelle, il substrato solido viene addizionato di una soluzione di nanoparticelle, preferibilmente nella misura di 10-60 ?L ogni 10 mm<2>, per una quantit? depositata finale preferibilmente compresa fra 2 ? 10<-12 >e 10<-15 >moli/mm<2>. La soluzione comprendente le nanoparticelle viene depositata sul substrato e mantenuta sul substrato fino completo assorbimento dallo stesso. Segue una fase di asciugatura del substrato. Allo stesso modo, opzionalmente in una fase successiva, il substrato pu? essere addizionato inoltre con una soluzione comprendente enzima ossidasi.
Quando l?analita da rilevare ? almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il substrato pu? essere posto in contatto inoltre anche con almeno un enzima del gruppo ossidasi.
Il procedimento consente di determinare in un campione il perossido di idrogeno o almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, preferibilmente in presenza di enzimi ossidasi. Il composto in grado di generare perossido di idrogeno in presenza di enzimi ossidasi ? un composto comprendente almeno un gruppo ossidrile (OH-). I composti in grado di generare perossido di idrogeno possono essere selezionati tra molecole di interesse biochimico quali zuccheri monosaccaridi, ad esempio glucosio, lipidi, prodotti metabolici, ad esempio lattato, ormoni, ad esempio cortisolo, disaccaridi, ad esempio saccarosio e maltosio, per cui si impiega un enzima attivante il gruppo (-OH) o accoppiato in generale. Preferibilmente, tale composto in grado di generare perossido di idrogeno ? glucosio.
Preferibilmente, tale composto genera perossido di idrogeno tramite una reazione di ossidazione del gruppo ossidrile OH- operato da un enzima del gruppo ossidasi. L?enzima ossidasi sar? un enzima in grado di reagire con lo specifico analita di interesse (ad esempio l?enzima sar? glucosio ossidasi se l?analita di interesse ? glucosio).
Preferibilmente, il campione ? un campione liquido.
In una o pi? forme di attuazione, il campione pu? essere selezionato tra almeno un liquido biologico, acque, prodotti di origine alimentare. Preferibilmente, il liquido biologico pu? essere selezionato tra saliva, siero, urina, sudore.
Quando il campione ? un campione di acqua, esso pu? essere selezionato tra acque meteoriche superficiali, acque meteoriche sotterranee, acque derivate da fiumi, da torrenti. Nel caso di un campione derivato da materiale alimentare, tale campione pu? essere selezionato tra bevande, infusi, bibite, sport o energy drink. Tali campioni possono essere utilizzati nel procedimento descritto sia come estratti o concentrati, sia omogeneizzati o chiarificati. Tali campioni possono provenire da campioni solidi quali materie prime o lavorati dell?industria agro-alimentare.
In una o pi? forme di attuazione, il campione pu? essere ottenuto mediante tecniche di campionamento note nell?arte e mantenuto, se sottoposto a conservazione, ad una temperatura appropriata. Ad esempio, con riferimento ad un campione di acqua da fiume, possono essere impiegate le comuni tecniche di campionamento per l?analisi di acque e la conservazione del campione a una temperatura compresa tra 4?C e 40 ?C, preferibilmente tra 10?C e 30?C.
Nel caso di un campione biologico esso pu? essere sottoposto al procedimento contestualmente al prelievo ma anche a seguito di opportuna conservazione, preferibilmente a una temperatura controllata compresa fra 0?C e 4?C.
In una o pi? forme di attuazione, la quantit? di campione da porre a contatto con il substrato pu? essere compresa tra 10 ?L e 1000 ?L, preferibilmente tra 50 ?L e 500 ?L.
In una o pi? forme di attuazione, l?almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno in presenza di enzimi ossidasi pu? essere selezionato tra monosaccaridi, preferibilmente glucosio, disaccaridi, preferibilmente saccarosio e maltosio, lipidi, preferibilmente colesterolo, acidi carbossilici, preferibilmente acido lattico e derivati, ormoni, preferibilmente cortisolo.
Le nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile possono essere selezionate tra nanoparticelle ramificate di oro e nanoparticelle ramificate di argento.
Tali nanoparticelle ramificate ? anche chiamate nell?ambito della presente descrizione nanoparticelle a forma di stella o nanoparticelle stellate o nanostelle - sono preferibilmente nanoparticelle di oro ramificate. Con il termine ?nanoparticelle ramificate? si intende indicare nanoparticelle che comprendono un corpo sferico e almeno una ramificazione che protrude dal corpo, preferibilmente conica monocristallina. Preferibilmente, tali nanoparticelle comprendono una pluralit? di ramificazioni (o protuberanze). La lunghezza di ciascuna ramificazione che protrude dal corpo sferico ? inferiore alla lunghezza del raggio del corpo sferico.
Preferibilmente, le nanoparticelle impiegabili nel procedimento descritto non presentano sulla superficie agenti cappanti, quali agenti cappanti citotossici, preferibilmente selezionati tra molecole organiche tioliche, tensioattivi, tra cui bromuro di esadeciltrimetilammonio (CTAB), polivinilpirrolidone (PVP). esadeciltrimetilammonio (CTAB), glicole polietilenico (PEG), sieroalbumina bovina (BSA), argento nitrato.
In una o pi? forme di attuazione, dette nanoparticelle ramificate presentano un diametro compreso tra 1 nm e 200 nm, preferibilmente tra 15 nm e 100 nm, pi? preferibilmente tra 20 nm e 80 nm. Il valore indicato del diametro ? riferito all?intera particella, comprensiva di corpo e ramificazioni.
In una o pi? forme di attuazione, dette nanoparticelle ramificate presentano un corpo sferico e ramificazioni che protrudono da detto corpo. La lunghezza media delle ramificazioni che protrudono dal corpo pu? essere compresa tra 4 nm e 60 nm. Tali nanoparticelle garantiscono una risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR) con una lunghezza d?onda ( ?max) compresa fra 560 nm e 700 nm.
Tali nanoparticelle ramificate possono essere realizzate mediante il procedimento descritto, ad esempio, nel documento WO2012/077043A2.
Il substrato liquido pu? comprendere nanoparticelle ramificate in una concentrazione compresa fra 1 fM e 100 nM, preferibilmente fra 0,01 nM e 2 nM. Tale concentrazione ? espressa come numero di particelle per litro di soluzione.
Il substrato solido pu? comprendere una quantit? di nanoparticelle ramificate compresa fra 2 ? 10<-12 >e 10<-15 >moli/mm<2>.
In una o pi? forme di attuazione, il procedimento pu? prevedere di porre a contatto il substrato comprendente le nanoparticelle con una soluzione tampone contenente almeno un acido. Tale acido pu? essere selezionato nel gruppo costituito da acido citrico, acido fosforico, acido 2-(N-morfolino) -etansulfonico (MES), acido acetico, relativi sali, preferibilmente sali alcalini di sodio o potassio. Tale soluzione tampone potr? contenere almeno un acido in una concentrazione compresa tra 1 mM e 100 mM, preferibilmente pari 20 mM. In una o pi? forme di attuazione, il pH del substrato posto a contatto inoltre con una soluzione tampone contenente almeno un acido pu? essere compreso tra 4 e 7, preferibilmente tra 4,5 e 6.
L?almeno un componente selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, ammine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele reagisce a determinare la formazione di un agente di erosione quando il campione comprende perossido di idrogeno o quando nel campione si forma perossido di idrogeno. Alogenuri e pseudoalogenuri utilizzabili sono fluoruri, bromuri, cloruri, ioduri, tiocianati (ad esempio, ione tiocianato (SCN-)). Alogenuri e alogenuri possono essere impiegati sottoforma di sali di alogenuri. Preferibilmente, l?alogenuro ? un bromuro, pi? preferibilmente bromuro di potassio. Ammine aromatiche comprendono 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Un altro composto impiegabile ? l?acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) o ABTS.
Tali componenti possono essere contenuti in una soluzione acquosa. Tali componenti sono in grado di reagire con il perossido di idrogeno presente nel campione dando origine a un prodotto di reazione, qui anche definito ?agente di erosione?. Tale componente pu? essere impiegato in una concentrazione compresa tra 1 mM e 5M. Quando impiegato nel substrato liquido, tale componente pu? essere impiegato preferibilmente in una concentrazione compresa tra 1 mM e 200 mM, pi? preferibilmente tra 1 mM e 50 mM.
Quando l?analita di interesse ? un composto in grado di generare perossido di idrogeno in presenza di enzimi ossidasi, il substrato viene posto in contatto inoltre, con almeno un enzima ossidasi, specifico per tale composto. Tale enzima pu? essere selezionato ad esempio tra glucosio ossidasi, lattato ossidasi, colesterolo ossidasi. Quando l?analita di interesse ? glucosio, l?enzima ? glucosio ossidasi.
In una o pi? forme di attuazione, l?enzima pu? essere contenuto nel substrato solido comprendente le nanoparticelle ramificate; l?enzima pu? essere anche contenuto nel substrato liquido comprendente le nanoparticelle ramificate.
In una o pi? forme di attuazione, l?enzima pu? essere posto a contatto con il substrato nella fase ii) contestualmente con il campione e l?almeno un composto in grado di generare l?agente di erosione. Tale enzima pu? essere posto a contatto con il substrato nella fase ii) contestualmente con il campione e l?almeno un composto in grado di generare l?agente di erosione ad esempio sottoforma di soluzione acquosa in cui l?enzima ? presente in una concentrazione fino a 2 mg/mL.
La concentrazione dell?enzima pu? essere compresa tra 1 e 300 unit? enzimatiche (U)/mL, preferibilmente fra 1,5 e 4 U/mL quando impiegato in substrato liquido.
In una o pi? forme di attuazione, quando il substrato ? un substrato liquido, il procedimento pu? comprendere inoltre una fase di agitare detto substrato dopo la fase ii) ovvero dopo che esso ? stato posto a contatto con il campione, l?almeno un composto in grado di generare l?agente di erosione e opzionalmente l?enzima ossidasi. Tale fase pu? consentire di ottenere una sospensione omogenea e pu? essere condotta mediante l?impiego di un agitatore, oppure per scuotimento manuale o tramite un dispositivo usa e getta di miscelazione. Tale fase di agitazione pu? essere condotta per un periodo di tempo compreso tra 10 secondi e 20 secondi, preferibilmente 20 secondi.
A seguito di un periodo di tempo T1, la rilevazione di una variazione di colore del substrato comprendente le nanoparticelle ramificate pu? essere condotta mediante ispezione visiva e consentir? di determinare la presenza dell?analita nel campione. In particolare, una variazione del colore di detto substrato dopo il tempo T1 indica la presenza dell?analita nel campione.
Il periodo di tempo T1 pu? essere compreso tra 3 minuti e 20 minuti.
Quando l?analita di interesse ? perossido di idrogeno, il periodo di tempo T1 pu? essere compreso preferibilmente fra 4 minuti e 7 minuti, pi? preferibilmente 5 minuti.
Quando l?analita di interesse ? un composto in grado di generare perossido di idrogeno, preferibilmente in presenza di un enzima ossidasi, il tempo T1 pu? essere compreso fra 5 minuti e 20 minuti, preferibilmente 15 minuti.
Durante il periodo di tempo T1, e come illustrato nell?esempio di Figura 2 il perossido di idrogeno presente nel campione reagisce con l?alogenuro e determina la formazione di un composto (o agente di erosione) che erode gli atomi del metallo nobile (ad esempio oro) che sono presenti sulle punte delle ramificazioni delle nanoparticelle.
Nell?esempio illustrato in Figura 2, le nanoparticelle sono contenute in substrato liquido, ad esempio una soluzione acquosa. La variazione di colore della soluzione acquosa dopo il periodo di tempo T1 indica la presenza dell?analita nel campione.
La Figura 3 illustra un esempio analogo, in cui il substrato comprendente le nanoparticelle ramificate ? un substrato solido, ad esempio un disco di poliammide. Il substrato viene posto a contatto con il campione e con il composto in grado di generare l?agente di erosione (indicati in figura con una goccia). Una variazione del colore del substrato indicher? la presenza dell?analita nel campione.
Nel procedimento oggetto della presente descrizione si verifica un fenomeno di erosione delle nanoparticelle in presenza di perossido di idrogeno accompagnato ad un vero e proprio rimodellamento delle stesse secondo un principio di maturazione di Ostwald che si verifica successivamente all?erosione. Tale fenomeno si realizza su nanoparticelle che non presentano agenti cappanti, quali ad esempio CTAB.
Dopo che gli atomi alle punte sono stati erosi ad opera dell?agente di erosione, questi vengono ridistribuiti sulla superficie delle nanoparticelle secondo due reazioni complementari:
Riduzione: H2O2 2AuBr2<- >= 2Au 2H<+ >+ 4Br<- >+ O2
Ossidazione: H2O2 2H<+ >+ 2Au 4Br<- >= 2AuBr2<- >+ 2H2O
Gli atomi del metallo nobile, ad esempio gli atomi di oro si ridistribuiscono sulla superficie delle nanoparticelle stesse determinando una variazione morfologica delle stesse. Le nanoparticelle ramificate assumono una morfologia sferica ma non vanno incontro a variazioni della loro dimensione. Le nanoparticelle sferiche cos? ottenute presentano dimensioni paragonabili alle dimensioni delle nanoparticelle ramificate di partenza, come mostrato in Figura 4, con un notevole coefficiente di estinzione molare. Questa variazione morfologica non associata a una variazione dimensionale permette uno spostamento del picco di risonanza plasmonica superficiale localizzata. Come mostrato nelle figure 5 e 7, il picco rilevato a seguito della variazione morfologica delle nanoparticelle ramificate presenta un?intensit? paragonabile a quella del picco rilevato prima di tale variazione.
Lo spostamento (shift) del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata che si verifica conducendo le fasi del procedimento descritto si attesta a 640/610 nm del valore di lunghezza d?onda iniziale a 530/570 nm dopo circa 300 secondi, comportando un cambiamento del colore della sospensione dal colore blu al colore viola al rosso/fucsia.
Vantaggiosamente, la rilevazione della variazione del colore pu? essere effettuata mediante ispezione visiva.
Il procedimento oggetto della presente descrizione consente di determinare il perossido di idrogeno in campioni di natura diversa, quali ad esempio fluidi biologici, mediante l?utilizzo di un nanosensore (le nanoparticelle ramificate) colorimetrico, basato sullo shift della banda plasmonica di nanoparticelle di oro ramificate, indotto da modifiche morfologiche delle stesse in presenza del perossido di idrogeno.
In particolare, il procedimento si basa sul fenomeno di erosione e rimodellamento di nanoparticelle ramificate senza perdita di intensit? della banda plasmonica (grazie ad un fenomeno di ri-modellamento globale, non pura corrosione) con la possibilit? di indurre tale cambiamento solo attraverso la corrosione di nanostrutture superficiali di piccole dimensioni (spessore pochi nanometri) e massa totale molto limitata (le cuspidi di superficie delle ramificazioni). Questo fenomeno consente di indurre un evidente cambiamento di colore in intervalli temporali molto ristretti (dell?ordine di qualche minuto, ad esempio 5 minuti). A parit? di entit? di corrosione e quindi a parit? di quantit? di perossido di idrogeno contenuto nel campione, inoltre, l?impiego di nanoparticelle ramificate determina uno shift plasmonico notevolmente pi? evidente rispetto a quanto si osserva impiegando nanoparticelle di forma diversa (quali ad esempio nanobarre o nanosfere). Ci? risulta in una variazione di colore apprezzabile a occhio nudo, con il vantaggio pertanto di poter condurre il procedimento senza richiedere strumentazioni di laboratorio. Il procedimento, che pu? essere facilmente condotto anche da utenti non addestrati, si presta pertanto ad essere utilizzato come test remoto o point-of-care (POC).
Per esempio, una corrosione dell?ordine del 10% della massa totale di oro comporta un ri-modellamento a struttura sferica praticamente completo nel caso di nanoparticelle ramificate con pieno spostamento colorimetrico. Nel caso di nanobarre o nanosfere si ha solo un lieve decremento di intensit? (di circa 10%) accompagnato da un lieve cambiamento colorimetrico; nel caso specifico delle nanosfere (nanoparticelle non non ramificate) e delle nanobarre la variazione colorimetrica non ? rivelabile ad occhio nudo.
Le particelle ramificate utilizzate come nanosensori nel procedimento descritto presentano un caratteristico picco plasmonico nel campo del visibile dovuto alla presenza di ramificazioni con cuspidi superficiali di dimensioni di pochi nanometri, che ne determinano lunghezza d?onda (colore) ed intensit?. Tali nanoparticelle presentano una elevata energia di superficie che le rende instabili e facilmente erodibili; inoltre, la massa delle cuspidi superficiali ? significativamente inferiore rispetto alla massa esposta a erosione nel caso di nanobarre o nanosfere (prive di ramificazioni) affinch? sia apprezzabile una risposta colorimetrica. Considerando che sono i vertici delle cuspidi superficiali delle ramificazioni a conferire le caratteristiche ottiche, la loro dissoluzione comporta un notevole spostamento del plasmone verso lunghezze d?onda tipiche delle particelle sferiche prive di ramificazioni in un tempo di risposta di pochi minuti con un repentino e evidente cambiamento di colore.
Il procedimento descritto consente di ottenere i risultati descritti grazie alla combinazione di condizioni operative che consentono non solo l?erosione delle particelle ma anche una variazione morfologica delle stesse, variazione morfologica che non implica riduzioni significative dell?intensit? del picco plasmonico. Un ruolo fondamentale con riferimento a questo aspetto ? determinato dalla caratteristica per cui le nanoparticelle ramificate non presentano rivestimenti superficiali, quali agenti cappanti come CTAB, PVP, PEG, BSA, agenti direzionanti la geometria quali l?argento nitrato.
Il procedimento descritto quindi pu? essere usato per determinare il perossido di idrogeno in un campione ma anche composti che generano perossido di idrogeno a seguito di una reazione di ossidazione.
ESEMPI
Nel seguito verranno forniti alcuni esempi non limitativi di diverse forme di realizzazione del procedimento oggetto della presente descrizione.
1.1 Campione acquoso contenente perossido di idrogeno
La descrizione che segue fornisce un esempio del procedimento condotto impiegando nanoparticelle ramificate contenute in una soluzione liquida quale substrato. In particolare, le nanoparticelle sono state poste a contatto con un campione acquoso contenente perossido di idrogeno e bromuro di potassio, come ad esempio descritto nel seguito.
A un campione acquoso (500 ?L) contenente perossido di idrogeno 1 mM ? stato aggiunto il 10% (%v/v) di un tampone acetato (sodio acetato/acido acetico) 100 mM pH 4,5 (CH3COONa, Acetic acid sodium salt, Sigma-Aldrich S1429, CH3CO2H Glacial acetic acid CAS 64-19-7 ACS reagent, ?99.7%, Sigma-Aldrich 695092); di seguito una soluzione comprendente nanoparticelle ramificate (nanostelle) di oro (diametro compreso tra 60 e 80 nm) 10% (% v/v) (concentrazione pari a 0,1 nM nella soluzione liquida finale); un sale di alogeno, bromuro di potassio (KBr; Potassium bromide, CAS 7758-02-3, Sigma-Aldrich 221864) 10% (% v/v) (concentrazione pari a 10 mM nella soluzione liquida finale ottenuta).
La soluzione ottenuta ? stata osservata per 5 minuti registrandone periodicamente gli spettri Ultravioletto-Visibile (UV-VIS). In particolare, 200 microlitri della soluzione ottenuta come descritto sono stati miscelati in una piastra trasparente con 96 pozzetti (96 multiwell trasparent flatbottom), la piastra ? stata inserita in un lettore (Tecan Spark? multimode microplate reader), l?assorbanza ? stata letta ogni 15 secondi per 5 minuti a 23?C con 4 secondi di agitazione prima di ogni lettura (medium amplitude).
Un campione della soluzione ottenuta ? stato inoltre sottoposto a caratterizzazione al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). In particolare, 3 microlitri del campione sono stati trasferiti su apposita griglia TEM quale supporto posta sotto vuoto per 2 ore prima dell?acquisizione delle immagini con un microscopio TEM JEOL JEM-1400Plus -Analytical 120 kV.
1.2 Campione di saliva
In maniera analoga, il procedimento ? stato testato per la sua capacit? di rilevare perossido di idrogeno originatosi come prodotto secondario di un enzima specifico di un analita d?interesse. Nell?esempio ? stata rilevata la presenza di perossido di idrogeno prodotto dall?enzima glucosio ossidasi. In questo caso, il procedimento ha consentito di rilevare la presenza di glucosio disciolto in un campione di saliva.
Per il test sperimentale, il campione di saliva ? stato adulterato con glucosio (Glucose Standard Solution, 1 mg/mL, Sigma-Aldrich G6918) fino ad una concentrazione finale di 3 mg/dL.
A 100 ?L di tale campione di saliva sono stati aggiunti in sequenza 10% (%v/v) di tampone acetato 100 mM pH 4.5 contenente un enzima ossidasi pari a 10 u/mL, il 10% (%v/v) di nanoparticelle di oro contenute in una soluzione liquida acquosa (fino ad una concentrazione di 0,1 nM nella soluzione finale) ed il 10% (%v/v) di un sale di alogeno, quale bromuro di potassio (KBr) fino ad una concentrazione di 500 mM nella soluzione finale. La soluzione ottenuta viene mantenuta a 37?C registrando gli spettri UV-VIS per 5 minuti, come descritto nella sezione precedente.
1.3 Campioni di confronto
Le condizioni operative descritte nell?Esempio 1.1 sono state impiegate per la conduzione del procedimento su campioni acquosi di confronto contenenti perossido di idrogeno (H2O2) 1 mM. Per i campioni di confronto il procedimento ? stato condotto utilizzando nanoparticelle di oro di forma sferica (prive di ramificazioni) o a barra (nanobarre, nanorods). Tali nanoparticelle presentano un diametro maggiore di circa 50 nm con un aspect ratio di circa 2,7.
Per la conduzione di test colorimetrici inoltre, il perossido di idrogeno ? stato utilizzato nei campioni in quattro differenti concentrazioni ovvero 1 mM, 1,5 mM e 2 mM. Sono stati anche utilizzati campioni di controllo privi di perossido di idrogeno.
1.4 Analisi del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata condotto con nanoparticelle sferiche prive di ramificazioni.
A 100 ?L di un campione di saliva sono stati aggiunti in sequenza 10% (%v/v) di acido cloridrico 2M (Hydrochloric acid, 36,5-38,0%, BioReagent, for molecular biology CAS 7647-01-0 Sigma-Aldrich H1758) contenente un enzima ossidasi pari a 10 u/mL, una soluzione 10% (%v/v) comprendente nanoparticelle sferiche di oro prive di ramificazioni (diametro: 35 nm) fino ad una concentrazione di 0,05 nM ed 10% (%v/v) di un sale di alogeno, bromuro di potassio (KBr) fino ad una concentrazione di 50 mM. Il campione ? stato mantenuto a 37?C e sono stati registrati gli spettri UV-VIS come descritto nelle sezioni precedenti.
1.5 Campione di saliva contenente glucosio
La descrizione che segue fornisce un esempio del procedimento condotto impiegando nanoparticelle ramificate contenute in un substrato solido, ovvero un dischetto di poliammide, quale substrato. Il substrato comprende inoltre l?enzima ossidasi (glucosio ossidasi). Il substrato solido contenente le nanoparticelle e l?enzima ? stato posto a contatto con un campione di saliva addizionato di glucosio e bromuro di potassio, come descritto nel seguito.
Un substrato solido di poliammide (Whatman nylon membranes) di spessore compreso tra 100 ?m e 200 ?m e di 13 mm di diametro ? stato arricchito con una soluzione di nanoparticelle ramificate di oro, in particolare con 400 ?L di una soluzione di nanoparticelle con una concentrazione compresa tra 40-50 pM. Le nanoparticelle hanno un diametro di circa 60 nm. Il substrato solido, in particolare, viene addizionato di una soluzione di nanoparticelle nella misura di 10-60 ?L ogni 10 mm<2>, per una quantit? depositata finale compresa fra 2? 10<-12 >e 10<-15 >moli/mm<2>.
La soluzione comprendente le nanoparticelle ? stata depositata sul substrato ponendo il filtro su un holder e lasciando la soluzione a contatto con il substrato fino completo assorbimento.
Il substrato arricchito ? stato asciugato sotto alto vuoto e conservato in condizioni di bassa umidit?. In un secondo step, il substrato ? stato arricchito con enzimi ossidasi (glucosio ossidasi) mediante deposizione di 50 ?L di una soluzione comprendente l?enzima ossidasi in una quantit? pari a 1 mg/mL.
Un volume noto di saliva (100 ?L) ? stato addizionato di una soluzione standard di D(+)Glucosio con lo scopo di renderlo positivo per la concentrazione di interesse (1,5 mg/dL). Il campione ? stato poi addizionato di 40 ?L di bromuro di potassio (KBr) 5M. La soluzione ottenuta ? stata depositata sul substrato. In 10 minuti l?enzima ha convertito la molecola biologica di interesse (glucosio) in perossido di idrogeno, che in presenza di bromuro di potassio ha innescato il rimodellamento delle nanoparticelle. Ci? ha determinato una variazione di colore del substrato, da un colore dal blu a un colore viola/rosso, visibile ad occhio nudo. La velocit? e l?intensit? del cambio di colore possono essere correlate alla concentrazione di analita. Il procedimento pu? favorire inoltre essere sottoposto ad applicazioni semi-quantitative per monitore la quantit? oltre la presenza del target.
RISULTATI
La Figura 4 ? una immagine ottenuta al microscopio elettronico a trasmissione che mostra l?evoluzione morfologica delle nanoparticelle ramificate di oro utilizzate nel procedimento dell?esempio alla sezione 1.2. Le immagini mostrano un significativo cambiamento morfologico delle nanoparticelle che da una morfologia ramificata, a stella, assumono una morfologia sferica. Al contrario, il diametro del corpo delle particelle non subisce variazioni significative; il diametro rilevato prima e dopo il periodo di tempo T1 ? compreso tra 80 nm e 100 nm (Figura 4). Un risultato analogo ? stato osservato per le nanoparticelle impiegate nel procedimento condotto come nell?Esempio 1.1. I fluidi biologici, quali la saliva nell?esempio in questione, presentano proteine che possono presentare un effetto protettivo/stabilizzante aumentando di conseguenza la sensibilit? del procedimento. Le immagini TEM della figura 4 mostrano la modificazione morfologica di nanoparticelle ramificate relative al campione di saliva descritto alla sezione 1.2.
La Figura 5, relativa all?esempio 1.3, mostra che il procedimento condotto utilizzando nanoparticelle ramificate risulta il pi? sensibile, in cui si osserva lo spostamento del picco plasmonico. Tale spostamento, monitorato per un totale di 60 minuti, non si verifica quando il procedimento ? condotto con nanoparticelle sferiche prive di ramificazioni o nanobarre.
La Figura 6 mostra i risultati di una analisi colorimetrica condotta a valle di procedimenti condotti impiegando nanoparticelle ramificate e nanoparticlle di confronto, come descritto nell?esempio 1.3. I campioni contenuti nei pozzetti della fila identificata con la lettera A sono i campioni contenenti nanoparticelle ramificate secondo il procedimento dell?invenzione (in particolare, A1 corrisponde al campione di controllo privo di perossido di idrogeno, A2, A3, A4 corrispondono a campioni con perossido di idrogeno nelle concentrazioni pari a 1 mM, 1,5 mM e 2 mM rispettivamente). I campioni contenuti nei pozzetti della fila identificata con la lettera B sono i campioni contenenti nanobarre (in particolare, B1 corrisponde al campione di controllo privo di perossido di idrogeno; B2, B3, B4 corrispondono ai campioni di controllo con perossido di idrogeno nelle concentrazioni, rispettivamente, pari a 1 mM, 1,5 mM e 2 mM). I campioni contenuti nei pozzetti della fila identificata con la lettera C sono i campioni contenenti nanosfere prive di ramificazioni (in particolare, C1 corrisponde al campione di controllo privo di perossido di idrogeno; C2, C3, C4 corrispondono ai campioni di controllo con perossido di idrogeno nelle concentrazioni, rispettivamente, pari a 1 mM, 1,5 mM e 2 mM).
Come si pu? apprezzare dalla figura e dalle coordinate RGB, solamente il procedimento condotto secondo l?invenzione determina una variazione colorimetrica della sospensione apprezzabile con una ispezione visiva, ad occhio nudo.
La Figura 7, ottenuta da un campione di saliva come descritto nella sezione 1.2, mostra come lo spostamento del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata mantenga, nel corso del rilevamento (detection), un?intensit? paragonabile a quella iniziale, grazie all?azione combinata di erosione e successiva rideposizione degli atomi di oro sulla superficie della nanoparticella attraverso un fenomeno di maturazione di Ostwald. Tale fenomeno determina un rimodellamento della morfologia della nanoparticella ramificata senza un sostanziale cambiamento dimensionale della stessa.
La Figura 8 relativa all?analisi di un campione sottoposto a un procedimento come descritto alla sezione 1.4, mostra una diminuzione d?intensit? del picco plasmonico in un saggio in cui avviene erosione senza per? rimodellamento della superficie delle nanoparticelle attraverso maturazione di Ostwald. In questo caso, le nanoparticelle sferiche non ramificate subiscono una entit? di erosione che pu? comportare, in alcuni casi, il dimezzamento del diametro della particella stessa. In questo caso, il meccanismo di erosione ad opera di ioni bromuro e perossido di idrogeno comporta una drastica riduzione delle dimensioni delle nanoparticelle. Questa modifica sostanziale comporta, a sua volta, una notevole decrescita dell?intensit? del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata mano a mano che il processo erosivo procede, rendendo necessaria una rilevazione colorimetrica di tipo strumentale in quanto la variazione del colore non ? apprezzabile ad occhio nudo.
Sorprendentemente, pur utilizzando nanoparticelle ramificate prive di agenti cappanti protettivi o di surfattanti, il procedimento descritto si avvale di un fenomeno di erosione limitato alle cuspidi delle ramificazioni, senza interessare il corpo delle particelle stesse. Il procedimento prevede uno spostamento del picco di risonanza plasmonica di superficie localizzata in termini di lunghezza d?onda con la peculiarit? che l?intensit? del picco stesso rimane pressoch? inalterata nel corso della rivelazione. Vantaggiosamente il rilevamento dell?analita di interesse (perossido di idrogeno) avviene in tempi molto brevi, di circa 5 minuti senza la necessit? di impiegare reagenti quali basi forti come l?idrossido di sodio descritti nella tecnica nota.
Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, i particolari di costruzione e le forme di realizzazione potranno essere ampiamente variati senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione cos? come definito dalle rivendicazioni che seguono.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per rilevare un analita in un campione, in cui l?analita ? selezionato tra perossido di idrogeno e/o almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il procedimento comprendendo le fasi di: i) fornire un substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile, ii) porre a contatto detto substrato con: - il campione da sottoporre a rilevamento di detto analita, - almeno un componente selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, ammine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele, iii) rilevare una variazione di colore di detto substrato dopo un periodo di tempo T1, in cui una variazione di colore di detto substrato dopo il periodo di tempo T1 indica la presenza di detto analita nel campione.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui quando detto analita ? almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, detto substrato ? posto a contatto inoltre con almeno un enzima ossidasi, preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da glucosio ossidasi, lattato ossidasi, colesterolo ossidasi.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui l?almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno ? selezionato tra monosaccaridi, preferibilmente glucosio, disaccaridi, preferibilmente saccarosio e maltosio, lipidi, preferibilmente colesterolo, acidi carbossilici, preferibilmente acido lattico e derivati, ormoni, preferibilmente cortisolo.
- 4. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui dette nanoparticelle ramificate sono selezionate tra nanoparticelle di oro ramificate e/o nanoparticelle di argento ramificate.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui dette nanoparticelle ramificate presentano un corpo sferico e ramificazioni che protrudono da detto corpo, in cui la lunghezza di tali ramificazioni ? preferibilmente compresa tra 4 nm e 60 nm.
- 6. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui dette nanoparticelle ramificate sono prive di agenti cappanti e/o agenti surfattanti, preferibilmente selezionati tra bromuro di esadeciltrimetilammonio (CTAB), polivinilpirrolidone (PVP), glicole polietilenico (PEG), sieroalbumina bovina (BSA), argento nitrato.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui detti alogenuri e pseudoalogenuri sono selezionati nel gruppo costituito da fluoruri, bromuri, cloruri, ioduri, tiocianati, relativi sali e dette ammine aromatiche comprendono 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui detto substrato ? posto a contatto inoltre in detta fase ii) con una soluzione tampone contenente almeno un acido, preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da acido citrico, acido fosforico, acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico (MES), acido acetico, relativi sali.
- 9. Procedimento secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui detto substrato comprendente dette nanoparticelle ramificate ? selezionato tra un substrato liquido, preferibilmente una soluzione acquosa, e un substrato solido, preferibilmente un materiale comprendente, pi? preferibilmente costituito da, materiale polimerico sintetico e/o naturale.
- 10. Kit per la rilevazione di un analita in un campione, in cui l?analita ? perossido di idrogeno e/o almeno un composto in grado di generare perossido di idrogeno, il kit comprendendo: - un substrato comprendente nanoparticelle ramificate di almeno un metallo nobile, - almeno un composto selezionato tra alogenuri, pseudoalogenuri, amine aromatiche, acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico), relative miscele, - opzionalmente almeno un enzima ossidasi specifico per detto composto in grado generare perossido di idrogeno e/o una soluzione tampone contenente almeno un acido.
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2020
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2021
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021198820A1 (en) | 2021-10-07 |
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