CN111504987A - 一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法 - Google Patents

一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：1)将金属离子加入至二胺氧化酶溶液中，配制无机杂化纳米花酶分散液；2)将二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在45‑55℃下反应10‑30min，得到反应液；3)加入辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值，得到二胺类生物胺的浓度。与现有技术相比，本发明有以下优点：1)操作过程简单，专业要求不高；2)实验结果可直接用肉眼判断，简单明了；3)得到结果快速，整个过程在25min左右可以得到结果，适合现场检测；4)无机杂化纳米花酶的酶活比普通液酶提高了85.27％。

Description

一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法
技术领域
本发明属于生物胺检测技术领域，涉及一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法。
背景技术
生物胺是一类非挥发性具有生物活性的低分子含氮有机碱，根据氨基数目可分为单胺和二胺，其中二胺类生物胺主要包括组胺、腐胺等。生物胺主要是通过游离的氨基酸在细菌中脱羧酶的催化作用下形成，因此富含氨基酸的食品中往往存在一定量的生物胺，如乳制品、发酵酒类、腌制水产品和肉制品等。
低浓度的生物胺是生物体内的正常活性成分，在生物细胞中具有重要的生理功能，但是摄入高浓度的生物胺，对人体具有毒性作用。其中，组胺对人类健康的影响最大。食用高浓度的组胺会导致各种症状，包括恶心、呕吐、腹泻、红疹、口腔灼热感和皮肤瘙痒等。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究确定组胺的危害作用水平为500mg/kg(食品)，要求进口水产品组胺不得超过50mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100mg/kg；其它食品中组胺不得超过1000mg/kg。腐胺多存在于腐败的食品中，腐胺的增加不仅会对风味产生负面影响，还会对食品安全和人体健康造成潜在威胁。食用含有大量腐胺的食物会导致严重的毒理学后果。
近年来，许多分析方法被开发用于检测此类生物胺，应用最为广泛的为高效液相色谱法、毛细管气相色谱法、毛细管区带电泳法、离子交换色谱法等，这些分析方法的优点是分离效果好、检出限低，但缺点也同样明显，例如仪器昂贵、操作的专业性强、步骤复杂、需要大量的有机溶剂等。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用无机杂化纳米花酶快速检测组胺、腐胺等二胺类生物胺的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将金属离子加入至二胺氧化酶溶液中，配制无机杂化纳米花酶分散液；
2)将二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在45-55℃下反应10-30min，得到反应液；
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值，进而得到二胺类生物胺溶液中二胺类生物胺的浓度。
进一步地，步骤1)中，所述的金属离子包括Co2+或Ca2+中的一种或两种。
进一步地，步骤1)中，所述的二胺氧化酶溶液的制备过程为：将二胺氧化酶加入至浓度为0.05-1mol/L、pH为7-7.5的PBS缓冲液中，配制成浓度为0.1-10mg/mL的溶液。
进一步地，步骤1)中，所述的无机杂化纳米花酶分散液的制备过程具体为：将金属离子加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置2-4天，之后离心、水洗，得到沉淀物(无机杂化纳米花酶)，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液。
进一步地，所述的金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为100-140mmol/L；离心过程中，转速为7000-8000r/min；所述的无机杂化纳米花酶分散液的浓度为0.1-10mg/mL。
进一步地，所述的二胺类生物胺包括组胺或腐胺中的一种或两种。
进一步地，当二胺类生物胺为组胺时，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液的浓度为2.5-150mmol/L；当二胺类生物胺为腐胺时，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液的浓度为5-200mmol/L。
进一步地，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:(40-60)。
进一步地，步骤3)中，所述的辣根过氧化物酶溶液的浓度为0.1-10mg/mL，所述的TMB显色溶液的浓度为0.4-0.6mg/mL，所述的稀盐酸的浓度为1.8-2.2mol/L；所述的辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为(45-55):(150-250):(45-55):100。
进一步地，步骤4)中，在440-460nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
本发明利用无机杂化纳米花酶快速检测组胺、腐胺等二胺类生物胺，先利用二胺氧化酶制成的无机杂化纳米花酶对二胺类生物胺进行降解反应，生成过氧化氢和醛类物质，后加入辣根过氧化物酶(HRP)和TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色(过氧化氢可以在有辣根过氧化物酶的情况下和TMB反应产生蓝色物质)，最后加入稀盐酸终止反应(溶液由蓝色变为黄色)并通过比色法获得检测结果。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)利用无机杂化纳米花酶-比色法检测组胺、腐胺等二胺类生物胺，具有操作步骤简单、专业要求不高、不需要大型仪器、成本低廉的优点，实验结果可直接用肉眼判断，简单明了；
2)本发明可以在25min左右快速得到检测结果，并可同时进行定性和定量分析，适合现场检测；
3)二胺氧化酶在杂化了金属离子的无机骨架上吸附形成花状的无机杂化纳米花酶，具有稳定的纳米花结构，同时大大提高了酶与生物胺底物的作用比表面积，因此无机杂化纳米花酶的活性可比普通游离酶提高85.27％，稳定性也明显增强。
附图说明
图1为实施例1中制备得到的无机杂化纳米花酶的SEM图；
图2为实施例1中游离酶和Co2+杂化纳米花酶进行检测时的吸光度对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为0.55mol/L、pH为7.2的PBS缓冲液中，配制成浓度为5.5mg/mL的溶液；
将金属离子(Co2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置3天，之后离心、水洗三次，得到紫色的无机纳米晶体蛋白复合物沉淀，即为无机杂化纳米花酶(如图1所示)，将该沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为120mmol/L；离心过程中，转速为7500r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为5.2mg/mL。
2)将二胺类生物胺(腐胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在50℃下反应10min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积分别为100μL、50μL；二胺类生物胺溶液的浓度为10mmol/L。
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为5mg/mL，TMB显色溶液(用双蒸水配制)的浓度为0.5mg/mL，稀盐酸的浓度为2mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积分别为50μL、200μL、50μL、100μL。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在450nm处测定吸光度值.
实际检测时，先测出待测的二胺类生物胺溶液在终止反应后的吸光度值，之后根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
对相同浓度的腐胺溶液进行检测，使用相同浓度二胺氧化酶的游离酶和Co2+杂化纳米花酶对应的吸光度如图2所示，通过计算可以发现，本实施例中蛋白质-Co2+杂化纳米花酶的酶活性相比游离酶提高了85.27％。
实施例2：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为0.05mol/L、pH为7.5的PBS缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/mL的溶液；
将金属离子(Co2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置4天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为100mmol/L；离心过程中，转速为8000r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为0.1mg/mL。
2)将二胺类生物胺(组胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在55℃下反应10min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:60；二胺类生物胺溶液的浓度为2.5mmol/L；
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为0mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.4mg/mL，稀盐酸的浓度为2.2mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为45:250:45:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在460nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
实施例3：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为1mol/L、pH为7的PBS缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液；
将金属离子(Ca2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置2天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为140mmol/L；离心过程中，转速为7000r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为10mg/mL。
2)将二胺类生物胺(组胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在45℃下反应30min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:40；二胺类生物胺溶液的浓度为150mmol/L；
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为0.1mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.6mg/mL，稀盐酸的浓度为1.8mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为55:150:55:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在440nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
实施例4：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为0.5mol/L、pH为7.2的PBS缓冲液中，配制成浓度为5mg/mL的溶液；
将金属离子(Co2+及Ca2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置3天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为125mmol/L；离心过程中，转速为7500r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为5mg/mL。
2)将二胺类生物胺(组胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在50℃下反应20min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:50；二胺类生物胺溶液的浓度为80mmol/L；
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为5mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.5mg/mL，稀盐酸的浓度为2mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为50:200:50:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在450nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
实施例5：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为0.05mol/L、pH为7.5的PBS缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/mL的溶液；
将金属离子(Co2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置4天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为100mmol/L；离心过程中，转速为8000r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为0.1mg/mL。
2)将二胺类生物胺(腐胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在55℃下反应10min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:60；二胺类生物胺溶液的浓度为5mmol/L。
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为10mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.4mg/mL，稀盐酸的浓度为2.2mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为45:250:45:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在460nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
实施例6：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为1mol/L、pH为7的PBS缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液；
将金属离子(Ca2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置2天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为140mmol/L；离心过程中，转速为7000r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为10mg/mL。
2)将二胺类生物胺(腐胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在45℃下反应30min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:40；二胺类生物胺溶液的浓度为200mmol/L。
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为0.1mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.6mg/mL，稀盐酸的浓度为1.8mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为55:150:55:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在440nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
实施例7：
一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，包括以下步骤：
1)二胺氧化酶溶液的制备：将二胺氧化酶加入至浓度为0.5mol/L、pH为7.2的PBS缓冲液中，配制成浓度为5mg/mL的溶液；
将金属离子(Co2+及Ca2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置3天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液；金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为110mmol/L；离心过程中，转速为7500r/min；无机杂化纳米花酶分散液的浓度为5.6mg/mL。
2)将二胺类生物胺(腐胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在50℃下反应20min，得到反应液；二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:50；二胺类生物胺溶液的浓度为100mmol/L。
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；其中，辣根过氧化物酶溶液的浓度为5mg/mL，TMB显色溶液的浓度为0.5mg/mL，稀盐酸的浓度为2mol/L；辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为50:200:50:100。
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值：在450nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将金属离子加入至二胺氧化酶溶液中，配制无机杂化纳米花酶分散液；
2)将二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在45-55℃下反应10-30min，得到反应液；
3)将辣根过氧化物酶溶液及TMB显色溶液加入至反应液中，显色后加入稀盐酸终止反应，得到样品；
4)将样品置于分光光度计中检测吸光度值。
2.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的金属离子包括Co2+或Ca2+中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的二胺氧化酶溶液的制备过程为：将二胺氧化酶加入至浓度为0.05-1mol/L、pH为7-7.5的PBS缓冲液中，配制成浓度为0.1-10mg/mL的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的无机杂化纳米花酶分散液的制备过程具体为：将金属离子加入至二胺氧化酶溶液中，在室温下放置2-4天，之后离心、水洗，得到沉淀物，将沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液。
5.根据权利要求4所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，所述的金属离子在二胺氧化酶溶液中的浓度为100-140mmol/L；离心过程中，转速为7000-8000r/min；所述的无机杂化纳米花酶分散液的浓度为0.1-10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，所述的二胺类生物胺包括组胺或腐胺中的一种或两种。
7.根据权利要求6所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，
当二胺类生物胺为组胺时，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液的浓度为2.5-150mmol/L；
当二胺类生物胺为腐胺时，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液的浓度为5-200mmol/L。
8.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的二胺类生物胺溶液与无机杂化纳米花酶分散液的体积比为100:(40-60)。
9.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的辣根过氧化物酶溶液的浓度为0.1-10mg/mL，所述的TMB显色溶液的浓度为0.4-0.6mg/mL，所述的稀盐酸的浓度为1.8-2.2mol/L；所述的辣根过氧化物酶溶液、TMB显色溶液、稀盐酸与二胺类生物胺溶液的体积比为(45-55):(150-250):(45-55):100。
10.根据权利要求1所述的一种利用无机杂化纳米花酶快速检测二胺类生物胺的方法，其特征在于，步骤4)中，在440-460nm处测定吸光度值，根据测出的吸光度值，在标准曲线上读出二胺类生物胺的浓度，或利用标准曲线拟合方程计算得到二胺类生物胺的浓度。
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