CN105823744B - 半胱氨酸检测方法、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半胱氨酸检测方法、检测试剂盒及应用。所述试剂盒包含：用作过氧化物酶模拟物的金核铂壳纳米粒子；过氧化物酶模拟物的特征底物；以及，辅助试剂，包含在以所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸孵育时所用吐温‑20、磷酸盐缓冲溶液和金核铂壳纳米粒子催化所述氧化特征底物时所需的柠檬酸钠缓冲溶液。该检测方法主要依据该试剂盒实施。利用本发明的试剂盒及检测方法，可实现对于半胱氨酸的高灵敏检测，例如，对半胱氨酸检测的线性范围为0.01‑20uM，灵敏度可达到10nM，并具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于生物、环境、食品等样品中半胱氨酸的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种半胱氨酸检测方法，具体涉及一种基于纳米模拟酶活性调控的半胱氨酸比色检测方法，属于灵敏分析技术领域。
背景技术
酶是一类生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质。可以在适宜的环境中催化化学反应，但是由于酶固有的特性，其应用也受到了一些限制，比如蛋白酶容易变性和水解，而且高成本和严格的使用条件也限制了它们的应用。因此，开发一种具有类似催化活性的模拟酶尤为重要。
纳米模拟酶是一类非蛋白、人工合成的纳米结构，具有与天然酶有相似的催化性能。自2007年阎锡蕴等首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)具有内在的过氧化物酶特性以来，纳米粒子作为模拟酶的研究备受人们关注。与天然酶相比，纳米模拟酶的制备、纯化和储存都比较容易，且价格低廉，能够在比较苛刻的化学环境中使用。因此，纳米模拟酶的开发应用具有很高的市场前景。其中，基于纳米模拟酶如何实现半胱氨酸的检测，也是业界研发人员关注的重点之一。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种半胱氨酸检测方法，其方便快速、成本较低、灵敏度高、稳定性高。
本发明的另一目的在于提供一种半胱氨酸检测试剂盒，其基于高效稳定的纳米材料模拟酶而构建，并可以简单、灵敏、低成本地检测半胱氨酸。
本发明的另一目的在于提供上述半胱氨酸检测方法或半胱氨酸检测试剂盒在检测半胱氨酸中的应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例公开了一种半胱氨酸检测方法，包括如下步骤：
(1)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合，孵育；
(2)向步骤(1)的混合溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)将金核铂壳纳米粒子和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合、孵育后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的半胱氨酸浓度。
在一些较为优选的实施方案之中，所述检测方法可以包括如下步骤：
(1)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合，室温下孵育10min以上；
(2)取步骤(1)最终所获混合溶液，加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，反应5min以上，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合、孵育后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的半胱氨酸浓度。
本发明实施例还公开了上述半胱氨酸检测方法中所用的半胱氨酸检测试剂盒，包括：
用作过氧化物酶模拟物的金核铂壳纳米粒子；
过氧化物酶模拟物的特征底物，
以及，辅助试剂，包含在以所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸孵育时所用磷酸盐缓冲溶液、吐温-20和金核铂壳纳米粒子催化所述特征底物时所需的柠檬酸钠缓冲溶液。
优选的，所述金核铂壳纳米粒子中金核的粒径为15-30nm，铂壳的厚度为 3-5nm。
更为优选的，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为22-40nm。
优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为5-50mM，pH值为5.0-8.0；
和吐温-20的浓度为0.005％-0.05％；
和/或所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
进一步的，所述特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM。
更进一步的，所述过氧化物酶模拟物的特征底物可选自，但不限于3,4-二羟基苯乙酸，四甲基联苯胺(TMB)，邻苯二胺(OPD)，2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)。
相应地，本发明实施例还公开了上述半胱氨酸检测方法或半胱氨酸检测试剂盒于检测半胱氨酸中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点至少在于：
(1)本发明通过将不同浓度的半胱氨酸与金核铂壳纳米粒子 (Au@PtNPs)结合，不同程度地抑制金核铂壳纳米模拟过氧化物酶的催化活性，并基于此原理开发了高灵敏的半胱氨酸检测方法，其对半胱氨酸检测的线性范围为0.01-20uM，灵敏度可达到5.0nM。
(2)本发明的半胱氨酸检测方法及检测试剂盒具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于环境、食品等样品中半胱氨酸的检测。
附图说明
图1a-图1b是本发明实施例1合成的金核铂壳纳米粒子的TEM图；
图2是本发明实施例1中金核铂壳纳米过氧化物模拟酶浓度与催化底物 TMB和H2O2反应的吸光值曲线图；
图3是本发明实施例1中所获半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线图；
图4是本发明实施例1中对于不同氨基酸的选择性的测试图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
本发明提供的金核铂壳纳米粒子(Au@Pt NPs)具有很高的类过氧化物酶的催化活性。与过氧化物酶相比，Au@Pt NPs模拟酶对于TMB-H2O2等显色体系具有更高的催化效率，对环境的耐受性更高。半胱氨酸是一种含有巯基的氨基酸，能够和Au@Pt NPs结合，并导致其类过氧化物酶催化活性的下降；不同半胱氨酸浓度与Au@Pt NPs作用，通过底物TMB-H2O2显色，一定范围内的半胱氨酸浓度和反应体系的吸光值呈负相关。基于以上发现，本案发明人建立了本发明的检测半胱氨酸的比色检测方法，该方法具有高灵敏，高选择、低成本等优点。
本发明实施例公开了一种半胱氨酸检测方法，包括如下步骤：
(1)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合，孵育；
(2)向步骤(1)的混合溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)将金核铂壳纳米粒子和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合、孵育后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的半胱氨酸浓度。
在一些较为优选的实施方案之中，所述检测方法可以包括如下步骤：
(1)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液与磷酸盐缓冲溶液充分混合，室温下孵育10min以上；
(2)取步骤(1)最终所获混合溶液，加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，反应5min以上，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合、孵育后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的半胱氨酸浓度。
本发明实施例还公开了上述半胱氨酸检测方法中所用的半胱氨酸检测试剂盒，包括：
金核铂壳纳米粒子，用作过氧化物酶模拟物；
过氧化物酶模拟物的特征底物，
以及，辅助试剂，包含在以所述金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸孵育时所用磷酸盐缓冲溶液、吐温-20和金核铂壳纳米粒子催化所述特征底物时所需的柠檬酸钠缓冲溶液。
本发明实施例还公开了上述半胱氨酸检测方法或半胱氨酸检测试剂盒于检测半胱氨酸中的应用。
优选的，所述金核铂壳纳米粒子中金核的粒径为15-30nm，铂壳的厚度为 3-5nm。
更为优选的，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为15-30nm。
优选的，所述吐温-20浓度为0.005％-0.05％；
磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为5-50mM，pH值为5.0-8.0；
和/或所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
进一步的，所述特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM。
更进一步的，所述过氧化物酶模拟物的特征底物可选自，但不限于3,4-二羟基苯乙酸，四甲基联苯胺(TMB)，邻苯二胺(OPD)，2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)。
以下为具体实施例：
实施例1
(1)利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为15nm的金纳米粒子溶液，取 30ml合成的金纳米溶液(3nM)和10ml,1.0mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)混合于洁净的锥形瓶里置于磁力搅拌器上搅拌并加热至80℃，然后向混合溶液中缓慢加入 10ml，5mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80℃继续搅拌30min以保证溶液中的K2PtCl6完全被还原，即得到粒径约为22nm的金核铂壳纳米粒子，如图1a-图1b所示的TEM图。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释100倍，与吐温-20充分混合，使其浓度为0.005％，取10ul加入酶标板中，再分别加入10ul， 100mM的磷酸盐缓冲液，以及80μL不同浓度(0-80uM)的半胱氨酸溶液室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入52μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)、29μL，1.0mM的TMB溶液、19μL，2.2M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。由此方法获得半胱氨酸的检测标准曲线如图3所示，检测灵敏度可达到5.0nM，检测线性范围为 0.01-20uM。
(4)血清中的半胱氨酸的检测：将人血清用超纯水稀释500倍，用 0.22μm微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)和(2)方法测试样品，参照步骤(3)的标准曲线，可计算出血清中半胱氨酸的含量。
另外，参照步骤(1)-(3)的操作及基本相同的反应条件，还对其它氨基酸进行了比对性的检测，其最终检测结果可参阅图4(其中半胱氨酸和同型半胱氨酸的浓度为1.0μM，谷胱甘肽和其它氨基酸的浓度为10μM)。
实施例2
(1)利用柠檬酸钠还原法合成平均粒径为30nm的金纳米粒子溶液，取 30ml合成的金纳米溶液(60pM)和10ml,1.0mM六氯铂酸钾(K2PtCl6)混合于洁净的锥形瓶里置于磁力搅拌器上搅拌并加热至80℃，然后向混合溶液中缓慢加入10ml，5mM的还原剂-抗坏血酸，溶液颜色由酒红色逐渐变为棕色，使混合溶液保持80℃继续搅拌30min以保证溶液中的K2PtCl6完全被还原，即得到粒径约为40nm的金核铂壳纳米粒子。
(2)将步骤(1)中得到的金核铂壳纳米溶液稀释200倍，与吐温-20充分混合，使其浓度为0.05％，取10ul加入酶标板中再分别加入10ul，100mM的磷酸盐缓冲液，以及80μL不同浓度(0-80uM)的半胱氨酸溶液室温条件下震荡孵育10～40min。
(3)向步骤(2)中孵育好的混合溶液中依次加入52μL柠檬酸檬酸钠缓冲溶液(0.04M，pH4.0)、29μL，0.5mM的TMB溶液、19μL，1.1M的H2O2溶液，震荡均匀后测定反应10min时650nm处的吸光值。依据本实例所获得半胱氨酸的检测结果，亦可得出与实施例1相近之标准曲线。
(3)血清中的半胱氨酸的检测：将人血清用超纯水稀释500倍，用 0.22μm微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)和(2)方法测试样品，参照步骤(3)的标准曲线，可计算出血清中半胱氨酸的含量。
以上实施例1-2中，所涉及的原料，如金核铂壳纳米粒子的前驱体、及其它试剂均可通过市售途径获取。
本发明的各实施例中的纳米粒子制备方法，在下述参考文献的基础上改动：Biosensors and Bioelectronics 70(2015)194–201。
需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种半胱氨酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后将一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液与浓度为5-50mM、pH值为5.0-8.0磷酸盐缓冲溶液充分混合，室温下孵育10min以上，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为22-40nm，其中金核的粒径为15-30nm，铂壳的厚度为3-5nm；
（2）取步骤（1）最终所获混合溶液，加入pH值为4.0-5.0的柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，所述混合反应体系中特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM，反应5min以上，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线，其中步骤（1）最终所获得的混合溶液中所含吐温-20的浓度为0.005%-0.05%，所述过氧化物酶模拟物的特征底物选自3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐中的任意一种或两种以上的组合；
（3）将金核铂壳纳米粒子和吐温-20充分混合，然后和待测溶液及磷酸盐缓冲溶液混合、孵育后，再加入柠檬酸钠缓冲溶液和过氧化物酶模拟物的特征底物，均匀混合形成混合反应体系，所述混合反应体系中特征底物的浓度为0.1mM-10.0mM，测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的半胱氨酸浓度。
2.如权利要求1所述的半胱氨酸检测方法中所用的半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于包括：
用作过氧化物酶模拟物的金核铂壳纳米粒子，所述金核铂壳纳米粒子的粒径为22-40nm，其中金核的粒径为15-30nm，铂壳的厚度为3-5nm；
过氧化物酶模拟物的特征底物，
以及，辅助试剂，包含在以所述吐温-20、金核铂壳纳米粒子与半胱氨酸孵育时所用磷酸盐缓冲溶液和金核铂壳纳米粒子催化所述特征底物时所需的柠檬酸钠缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5.0-8.0，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.0-5.0。
3.根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：所述过氧化物酶模拟物的特征底物选自3,4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2,2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐中的一种或两种以上的任意组合。
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