CN108362879A

CN108362879A - 一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法

Info

Publication number: CN108362879A
Application number: CN201810031882.6A
Authority: CN
Inventors: 罗林; 徐振林; 杨金易; 孙远明; 雷红涛; 沈玉栋; 王弘
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明公开了一种基于铂‑金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法，包括如下步骤：S1.将铂‑金纳米颗粒标记到组胺单克隆抗体上，制成铂‑金标抗体纳米探针；S2.向已包被有组胺抗原的酶标板中加入待测样品与S1的纳米探针，通过竞争免疫分析模式形成抗原及铂‑金标抗体的免疫复合物；S3.向酶标板中加入含3,3',5,5'‑四甲基联苯胺与过氧化氢的显色底物液显色，并用硫酸终止；S4.用酶标仪对其450 nm的吸收进行测定，实现对样品中组胺的定量测定。本发明方法具有操作间便、灵敏度高、稳定性好、样品通量高等优势，适用对食品中组胺快速、高通量筛查，具有较大的应用前景。

Description

一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，更具体地，公开了一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法。

背景技术

组胺（Histamine）是游离组氨酸在组氨酸脱羧酶的催化下发生脱羧反应形成的，是一种具有毒性的生物胺，广泛存在于各种生物体及食品中，主要为水产品，尤其是青皮红肉特征的中上层海水鱼及其加工产品。研究表明，若过量摄入组胺会引起头痛恶心、反胃呕吐、腹泻、心悸、瘙痒性皮疹、血压变化等一系列的过敏反应。摄入8～40 mg组胺会产生轻微的中毒症状，超过40 mg产生中等中毒症状，超过100 mg产生严重中毒症状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究，确定组胺的危害作用水平为500 mg/kg（食品）。近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。因此，组胺含量对于保障消费者健康具有十分重要的意义，目前国内外把组胺列为水产品的必检项目。

目前国内外检测组胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析技术具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。酶联免疫分析技术（ELISA）自1971年建立以来，便凭借其快速、灵敏、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和应用，逐步发展成为当前应用最广泛的免疫分析方法之一。然而，传统ELISA中用到的天然蛋白质酶具有稳定性差—酶活易受外界环境（pH，温度）的影响，保存条件严苛，制备纯化程序繁琐等缺点（Gao et al，2013），如果克服这些缺点，那么酶联免疫分析的性能将可能被进一步的提高。因此，人们在努力地寻找天然蛋白酶的各类替代品（即人工模拟酶）用于免疫分析。纳米科学和纳米技术的出现，为人工模拟酶的发展开阔了新的视野。纳米材料由于它们具有比表面积大等优点使他们成为很吸引人的高效催化剂。到目前为止，很多纳米材料已经被发现具有模拟酶的催化活性。比如Fe₃O₄、Co₃O₄、CeO₂纳米颗粒V₂O₅纳米线、氧化石墨烯及Au、Pt纳米材料等已经被发现具有本质的类过氧化物酶活性（Gao et al，2007；Asati et al，2009；Mu et al，2012；Xie et al，2012）。这些纳米材料由于超高的比表面积，催化活性高，稳定性好，引起学者们广泛兴趣并被用来代替天然酶直接催化相应的底物。Su等人（2012）发现ZnFe₂O₄类过氧化物酶活，并将其用于构建比色测定葡萄糖的方法。Dong等人（2012）证明Fe₃O₄与氧化石墨烯复合材料具有优异的类过氧化物酶性质，将其用于葡萄糖检测。

贵金属Pt、Au纳米颗粒由于具有很强的催化活力及良好的生物相容性，在生物医学领域得到广泛应用。其可以与蛋白质形成强的键合作用，常用来标记生物大分子进行生物分析。而铂-金双金属纳米颗粒（Pt-Au NPs），由于其超过高的比表面积，及两种金属之间的协同效应，其催化活力较单一贵金属纳米材料的催化活力更高，可以催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显蓝色（Ataee-Esfahani et al，2013）。

目前，还未见有将Pt-Au双金属纳米颗粒作为信号探针用来检测组胺的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中组胺检测存在的缺陷和不足，通过利用铂-金纳米颗粒催化活性高、稳定性高等特点，利用铂-金双金属纳米颗粒作为模拟酶，建立一种无酶、高灵敏且性能稳定的免疫分析方法，该方法具有操作简单、灵敏度高、快速方便等优势，可实现食品中组胺快速检测。

本发明的第一个目的是提供一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法。

本发明的第二个目的是提供一种组胺免疫分析检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法，包括如下步骤：

S1.用铂-金纳米颗粒标记组胺单克隆抗体，制备铂-金标组胺抗体纳米探针；

S2.向已包被有组胺抗原的酶标板中加入待测样品与S1的纳米探针，温育，通过竞争免疫分析模式形成抗原及铂-金标抗体的免疫复合物；

S3.向酶标板中加入含3,3',5,5'-四甲基联苯胺与过氧化氢的底物显色液显色；

S4.用酶标仪对其450 nm的吸收进行测定，实现对样品中组胺的定量测定。

本发明通过将铂-金双金属纳米颗粒代替传统辣根过氧化物酶标记组胺抗体，作为信号探针，预先包被在酶标板上的组胺抗原与样品中的游离抗原竞争与铂-金标抗体结合形成抗原抗体免疫复合物。酶标板上形成抗原-铂-金标抗体复合物的量与样品中的组胺呈负相关，加入显色底物液，随着样品中组胺浓度的提高，显色反应的颜色又深变为浅，转化为吸光值，即可实现对样品中组胺的定量检测。

优选地，所述S1包括如下步骤：将铂-金纳米颗粒溶液调节pH 8～9，然后加入组胺单克隆抗体，4ºC下孵育5h～7h，再加入PBS（0.01M，pH 7.4，含10% BSA），封闭铂-金多余位点，4ºC孵育过夜，最后离心除去游离的抗体，再用PBS（0.01M，pH7.4，10% BSA）复溶，4ºC保存备用。

更优选地，所述铂-金纳米颗粒的粒径为30～50nm。

更优选地，所述铂-金纳米颗粒溶液的浓度为5～30 mM，组胺单克隆抗体的浓度2～10 mg/mL。

更优选地，所述铂-金纳米颗粒溶液与组胺单克隆抗体的体积比为50:1。

优选地，S2所述待测样品与的纳米探针的体积比为1：1；

优选地，S2所述纳米探针的原浓度为5 μg/mL，工作浓度为0.5～0.05μg/mL。

优选地，，其特征在于，所述铂-金纳米颗粒制备方法为：将K₂PtCl₄和HAuCl₄混合，加入泊洛沙姆F127，超声使其溶解后，再加入抗坏血酸做还原剂，混合溶液在30ºC下水浴超声反应5～7h，产物经离心分离后，用乙醇与水反复洗多次以除去残留的泊洛沙姆F127，用水复溶备用。

优选地，S2所述组胺抗原的浓度为0.01～1 mg/mL。

优选地，S2所述温育时间为0.5～1.5 h（优选40 min）。

优选地，S3所述底物显色液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为0.8 mmol/L，过氧化氢浓度为2.0 mmol/L。

优选地，S3所述显色时间为为5～30 min（优选15 min）。

优选地，S3加入底物显色液后再加入终止液终止显色反应。

优选地，所述终止液为1mol/L H₂SO₄。

本发明还请求保护上述免疫分析方法在制备组胺免疫分析检测试剂盒中的应用。

一种组胺免疫分析检测试剂盒，所述试剂盒包含铂-金双金属纳米颗粒溶液，组胺单克隆抗体，酶标板，组胺抗原，底物显色液和终止液。

优选地，所述试剂盒还包含铂-金双金属纳米颗粒标记组胺单克隆抗体所需试剂，组胺抗原包被酶切板所需试剂。

优选地，所述试剂盒还包含待测样品前处理所需试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种将铂-金双金属纳米颗粒作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶应用于比色免疫分析检测组胺的方法，具有检测线低、灵敏度和稳定性高等优点；通过使用无机纳米材料作为模拟酶，克服了传统生物活性酶标记方法中生物酶易失活、易变性等缺点；与辣根过氧化物酶相比，铂-金双金属纳米颗粒是一种无机纳米材料，它性能更稳定、制备方法更简单、成本更低、标记抗体更容易，并且易于大规模制备，在免疫分析检测中有着巨大的应用前景。

附图说明

图1为铂-金双金属纳米颗粒的透射电镜图。

图2为组胺抗体（a）、铂纳米颗粒（b）和铂-金标抗体纳米探针复合物（c）的紫外吸收光谱。

图3为基于铂-金双金属纳米颗催化特性的组胺免疫分析的示意图。

图4为基于铂-金双金属纳米颗催化特性的免疫分析检测组胺的标准工作曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

组胺单克隆抗体为本实验室制备，与公开的专利（ZL201410338095，一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用）中的一致。

实施例1

1、铂-金双金属纳米颗粒的制备

将0.9 mL K₂PtCl₄（20 mM）、0.1mL HAuCl₄（20 mM）混合，加入10 mg Pluronic F127，超声使其溶解后，再加入1.0 mL抗坏血酸（100 mM）做还原剂，混合溶液在30ºC下水浴超声反应5h，产物经10000r/min离心20min分离，用乙醇与水反复洗5次以除去残留的PluronicF127，用0.9 mL水复溶备用。

从图1可以看出，所制备的铂纳米颗粒为粒径约为50 nm的多孔纳米结构，表面是为均匀分布着5 nm左右Pt纳米颗粒构成。

2、铂-金标抗体纳米探针复合物的制备

将上述制备的铂-金纳米颗粒溶液稀释至20 mM，取1.0 mL用0.1M的碳酸钾调节pH值8～9，然后向其中加入20 μL组胺单克隆抗体（5.35 mg/mL），4ºC下孵育5h，再加入40 μL PBS（0.01M，pH 7.4，含10% BSA），封闭铂-金多余位点，4ºC孵育过夜，而后12000r/min 离心30min除去游离的抗体或蛋白，用1.0 mL PBS（0.01M，pH7.4，10% BSA）复溶，4ºC保存备用。通过对抗体，铂-金双金属纳米颗粒及偶联后Pt-Au-mAb进行紫外光谱扫描。

由图2可以发现，Pt-Au-mAb同时具有抗体在280 nm左右的吸收峰及Pt-Au在520nm左右具有的特征吸收峰，表明Pt-Au-mAb偶联成功。

3、工作曲线的建立

用包被缓冲液（碳酸缓冲液，50 mM，pH 9.6）将包被抗原稀释成每孔100 μL，放置于37℃水浴箱过夜。洗涤2次，倾倒标版孔内的液体，在自动洗板机上分别洗涤2次，每孔加洗涤液300μL，洗完后拍干。每孔加入120 μL封闭液（PBS含1% BSA），至于37 ℃过夜封闭，甩干孔内的液体，放置于37℃烘箱烘干。酶标板每一列第一个孔开始从浓度低到浓度高（0～10mg/L）加入梯度稀释的组胺溶液，每孔加入50 μL。每孔加入所选定的浓度Pt-Au-mAb，每孔50 μL（每孔总溶液为100 μL），37℃条件下反应40 min，倾去孔内液体，在自动洗板机上洗涤5次。每孔加入100 μL显色液，放置于37℃下显色15 min。每孔加入50 μL的终止液（1mol/L H₂SO₄）终止显色反应。用酶标仪测定每个孔在450 nm 处的吸光值。根据测定得到数据结果，记组胺浓度为0的孔测得的吸收值为B₀，其他药物浓度的孔的吸光值为B。以组胺浓度作为横坐标，B/B₀为纵坐标，用Origin软件进行四参数拟合，得到的IC₅₀值，最低检测限（LOD）和线性范围等。工作曲线见图3，其中线性范围（IC₂₀~IC₈₀）为153.4 ng/mL～836.2 ng/mL，IC₅₀为358.1 ng/mL，检测限（IC₁₀）为91.0 ng/mL。较现有的组胺ELISA方法比(Chemometrics and intelligent laboratory systems. 2006;80(2):186-97; Journalof Agricultural and Food Chemistry. 2014;62(51):12299-308.），灵敏度相当，样品不需要衍生化，样品前处理大大简化，检测仅需一步竞争反应，检测时间缩短至50 min 左右。

4、加标法检测组胺添加样品

从当地市场上购买冷冻鳕鱼，取肉5g左右置于离心管中，加入等量的超纯水。用自制的振荡器反复震荡2～10 min，得到鱼肉匀浆液，然后4000～48000 rpm离心5～20 min。取上清液即为待测样液，并按实施例3所描述的步骤对其组胺进行测定，按下述步骤检测待测样液的组胺浓度。同时取3份5 g鱼肉，分别按10.0、50.0、200.0 mg/kg水平添加组胺，并按实施例3所述步骤对其组胺进行测定。按公式：回收率（%）=（添加后测定值-空白值）/添加量×100%计算回收率。

结果如表1所示，本次添加回收率在96.0%～104.2%之间，变异系数低于14.5%，说明该方法测定组胺具有很好的准确性及稳定性。

表1 本发明方法测定组胺添加样品的回收率

实施例2

1、铂-金双金属纳米颗粒的制备

与实施例1相同；

2、铂-金标抗体纳米探针复合物的制备

基本与实施例1相同，唯一不同的是，将铂-金纳米颗粒溶液稀释至5 mM，加入20 μL组胺单克隆抗体（终浓度5.35 mg/mL）。

3、工作曲线的建立

与实施例1相同。

实施例3

1、铂-金双金属纳米颗粒的制备

与实施例1相同；

2、铂-金标抗体纳米探针复合物的制备

基本与实施例1相同，唯一不同的是，将铂-金纳米颗粒溶液稀释至30 mM，加入20 μL组胺单克隆抗体（终浓度5.35 mg/mL）。

3、工作曲线的建立

与实施例1相同。

对比例1

1、铂-金双金属纳米颗粒的制备

与实施例1相同；

2、铂-金标抗体纳米探针复合物的制备

基本与实施例1相同，唯一不同的是，将铂-金纳米颗粒溶液稀释至40 mM，加入20 μL组胺单克隆抗体（终浓度5.35 mg/mL）。

3、工作曲线的建立

与实施例1相同；但是空白值很高，检测灵敏度下降，IC₅₀值较实施例1升高近5倍。可能由于铂-金纳米颗粒过量，未标记上抗体的铂-金纳米颗粒残余过多引起空白值过高。

对比例2

1、铂-金双金属纳米颗粒的制备

与实施例1相同；

2、铂-金标抗体纳米探针复合物的制备

基本与实施例1相同，唯一不同的是，将铂-金纳米颗粒溶液稀释2 mM，加入20 μL组胺单克隆抗体（终浓度5.35 mg/mL）。

3、工作曲线的建立

与实施例1相同；但是，检测颜色信号较实施例1减弱许多并且检测灵敏度也较实施例1降低，IC₅₀值提高了近3倍。原因可能是铂-金纳米颗粒用量太少，每个抗体上标记上的铂-金纳米颗粒太少，颜色信号减弱，同时，抑制等量信号需要的组胺浓度提高，对组胺检测的敏感度下降。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种基于铂-金双金属纳米颗粒类过氧化物酶特性的组胺免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2.向已包被有组胺抗原的酶标板中加入待测样品与S1的纳米探针，通过竞争免疫分析模式形成抗原及铂-金标抗体的免疫复合物；

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括如下步骤：将铂-金纳米颗粒溶液调节pH8～9，然后加入组胺单克隆抗体，4ºC下孵育5h～7h，再加入PBS（0.01M，pH 7.4，含10% BSA），封闭铂-金多余位点，4ºC孵育过夜，最后离心除去游离的抗体，再用PBS（0.01M，pH7.4，10% BSA）复溶，4ºC保存备用。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述铂-金纳米颗粒溶液的浓度为5~30mM，组胺单克隆抗体的浓度2~10 mg/mL；铂-金纳米颗粒溶液与组胺单克隆抗体的体积比为50:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铂-金纳米颗粒制备方法为：将K₂PtCl₄和HAuCl₄混合，加入泊洛沙姆F127，超声使其溶解后，再加入抗坏血酸做还原剂，混合溶液在30ºC下水浴超声反应5～7h，产物经离心分离后，用乙醇与水反复洗多次以除去残留的泊洛沙姆F127，用水复溶备用。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述组胺抗原的浓度为0.01～1 mg/mL。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物显色液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为0.8 mmol/L，过氧化氢浓度为2.0 mmol/L。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3加入底物显色液后再加入终止液终止显色反应，所述终止液为1mol/L H₂SO₄。

8.一种组胺免疫分析检测试剂盒，其特征在于，包含铂-金双金属纳米颗粒溶液，组胺单克隆抗体，酶标板，组胺抗原，底物显色液和终止液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含铂-金双金属纳米颗粒标记组胺单克隆抗体所需试剂，组胺抗原包被酶切板所需试剂。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含待测样品前处理所需试剂。